Targeted cell entry of lentiviral vectors

Zielgerichteter Zelleintritt lentiviraler Vektoren

  • Lentiviral vectors mediate gene transfer into dividing and most non-dividing cells. Thereby, they stably integrate the transgene into the host cell genome. For this reason, lentiviral vectors are a promising tool for gene therapy. However, safety and efficiency of lentiviral mediated gene transfer still needs to be optimised. Ideally, cell entry should be restricted to the cell population relevant for a particular therapeutic application. Furthermore, lentiviral vectors able to transduce quiescent lymphocytes are desirable. Although many approaches were followed to engineer retroviral envelope proteins, an effective and universally applicable system for retargeting of lentiviral cell entry is still not available. Just before the experimental work of this thesis was started, retargeting of measles virus (MV) cell entry was achieved. This virus has two types of envelope glycoproteins, the hemagglutinin (H) protein responsible for receptor recognition and the fusion (F) protein mediating membrane fusion. For retargeting, the H protein was mutated in its interaction sites for the native MV receptors and a ligand or a single-chain antibody (scAb) was fused to its ectodomain. It was hypothesised that the retargeting system of MV can be transferred to lentiviral vectors by pseudotyping human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) derived vector particles with the MV glycoproteins. As the unmodified MV glycoproteins did not pseudotype HIV vectors, two F and 15 H protein variants carrying stepwise truncations or amino acid (aa) exchanges in their cytoplasmic tails were screened for their ability to form MV-HIV pseudotypes. The combinations Hcd18/Fcd30, Hcd19/Fcd30 and Hcd24+4A/Fcd30 led to most efficient pseudotype formation with titers above 10exp6 transducing units /ml, using concentrated particles. The F cytoplasmic tail was truncated by 30 aa and the H cytoplasmic tail was truncated by 18, 19 or 24 residues with four added alanines after the start methionine in the latter case. Western blot analysis indicated that particle incorporation of the MV glycoproteins was enhanced upon truncation of their cytoplasmic tails. With the MV-HIV vectors high titers on different cell lines expressing one or both MV receptors were obtained, whereas MV receptor-negative cells remained untransduced. Titers were enhanced using an optimal H to F plasmid ratio (1:7) during vector particle production. Based on the described pseudotyping with the MV glycoprotein variants, HIV vectors retargeted to the epidermal growth factor receptor (EGFR) or the B cell surface marker CD20 were generated. For the production of the retargeted vectors MVaEGFR-HIV and MVaCD20-HIV, Fcd30 together with a native receptor blind Hcd18 protein, displaying at its ectodomain either the ligand EGF or a scAb directed against CD20 were used. With these vectors, gene transfer into target receptor-positive cells was several orders of magnitude more efficient than into control cells. The almost complete absence of background transduction of non-target cells was e.g. demonstrated in mixed cell populations, where the CD20-targeting vector selectively eliminated CD20-positive cells upon suicide gene transfer. Remarkably, transduction of activated primary human CD20-positive B cells was much more efficient with the MVaCD20-HIV vector than with the standard pseudotype vector VSV-G-HIV. Even more surprisingly, MVaCD20-HIV vectors were able to transduce quiescent primary human B cells, which until then had been resistant towards lentiviral gene transfer. The most critical step during the production of MV-HIV pseudotypes was the identification of H cytoplasmic tail mutants that allowed pseudotyping while retaining the fusion helper function. In contrast to previously inefficient targeting strategies, the reason for the success of this novel targeting system must be based on the separation of the receptor recognition and fusion functions onto two different proteins. Furthermore, with the CD20-targeting vector transduction of quiescent B cells was demonstrated for the first time. Own data and literature data suggest that CD20 binding and hyper-cross-linking by the vector particles results in calcium influx and thus activation of quiescent B cells. Alternatively this feature may be based on a residual binding activity of the MV glycoproteins to the native MV receptors that is insufficient for entry but induces cytoskeleton rearrangements dissolving the post-entry block of HIV vectors. Hence, in this thesis efficient retargeting of lentiviral vectors and transduction of quiescent cells was combined. This novel targeting strategy should be easily adaptable to many other target molecules by extending the modified MV H protein with appropriate specific domains or scAbs. It should now be possible to tailor lentiviral vectors for highly selective gene transfer into any desired target cell population with an unprecedented degree of efficiency.
  • Lentivirale Vektoren können sowohl mitotisch aktive wie auch die meisten mitotisch inaktiven Zellen transduzieren. Dabei integrieren sie das Transfergen stabil ins Wirtszellgenom, weshalb sie sehr gut für die Gentherapie geeignet sind. Allerdings müssen die Effizienz und Sicherheit des lentiviral vermittelten Gentransfers noch weiter optimiert werden. So sollte der Zelleintritt auf die Zielzellpopulation einer bestimmten therapeutischen Anwendung beschränkt sein. Außerdem wären lentivirale Vektoren, die ruhende Lymphozyten transduzieren können, wünschenswert. Allerdings gibt es bis heute, trotz intensiver Forschung auf dem Gebiet des gezielten Zelleintritts (targeting), noch kein effizientes und universell anwendbares targeting-System für lentivirale Vektoren. Der Zelleintritt des Masernvirus (MV) kann dagegen sehr effizient umgeleitet werden. Dieses besitzt zwei Hüllproteine, das Hämagglutinin (H)-Protein, welches Bindung an die MV-Rezeptoren vermittelt, und das für die Membranfusion verantwortliche F-Protein. Um gezielten Zelleintritt vermitteln zu können, wird das H-Protein in den Rezeptorerkennungsregionen mutiert und ein einkettiges Antikörperfragment (scAb) oder ein Ligand an seine Ektodomäne fusioniert. Die vorliegende Arbeit basiert auf der Hypothese, dass das effiziente targeting-System von MV auf lentivirale Vektoren übertragen werden kann, indem vom Humanen Immundefizienz Virus-1 (HIV-1) abgeleitete Vektoren mit den MV-Hüllproteinen pseudotypisiert werden. Da sich mit den unmodifizierten MV-Hüllproteinen keine MV-HIV Pseudotypen erzeugen ließen, wurden 15 H- und 2 F-Proteinvarianten mit stufenweise gekürzten zytoplasmatischen Domänen und Aminosäure(AS)austauschen auf ihre Fähigkeit getestet, HIV Vektoren zu pseudotypisieren. Die Kombinationen Hcd18/Fcd30, Hcd19/Fcd30 und Hcd24+4A/Fcd30 führten zur effizientesten Pseudotypisierung mit Titern der ankonzentrierten Partikel von über 10exp6 transduzierenden Einheiten/ml. Dabei war eine Verkürzung der zytoplasmatischen Domäne des F-Proteins um 30 AS und des H-Proteins um 18, 19 oder 24 AS notwendig, wobei im letzten Fall vier Alanine nach dem Start-Methionin addiert wurden. Westernblotanalysen zeigten, dass die Inkorporation der MV-Hüllproteine in die Vektorpartikel durch die Kürzung der zytoplasmatischen Domänen verstärkt wurde. Erwartungsgemäß spiegelten MV-HIV Vektoren auf unterschiedlichen MV Rezeptor-positiven und -negativen Zelllinien den Tropismus des MV wider. Interessanterweise konnte ihr Titer durch Einstellen eines optimalen Plasmidverhältnisses von H zu F (1:7) in den vektorpartikelproduzierenden Zellen deutlich verbessert werden. Als nächstes wurden HIV Vektoren hergestellt, die zum Zelleintritt den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) bzw. das B-Zell-spezifische Oberflächenmolekül CD20 nutzten. Dafür wurde Fcd30 zusammen mit einem Hcd18-Protein, das für seine nativen Rezeptoren verblindet wurde und an seiner Ektodomäne EGF oder ein scAb gegen CD20 präsentiert, zur Produktion der targeting-Vektoren MVaEGFR-HIV und MVaCD20-HIV eingesetzt. Die Verwendung des EGFR bzw. von CD20 für den Zelleintritt konnte mit Rezeptor-positiven bzw. -negativen Zelllinien bestätigt werden. Dass CD20-negative Zellen nicht transduziert wurden, wurde in Mischkulturen demonstriert, in denen der MVaCD20-HIV Vektor nach Suizidgentransfer selektiv CD20-positive Zellen eliminierte. Bemerkenswerter Weise wurden aktivierte primäre humane B-Zellen vom MVaCD20-HIV Vektor mit einer deutlich höheren Effizienz transduziert als vom Standard-Pseudotypvektor VSV-G-HIV. Noch überraschender war, dass MVaCD20-HIV Vektoren ruhende B-Zellen transduzierten, die sich bis dato als resistent gegen den lentiviralen Gentransfer erwiesen hatten. Als kritischster Schritt der MV-HIV Produktion erwies sich die Identifizierung von H-Varianten, die einerseits Pseudotypisierung erlaubten, andererseits aber noch die Fusionshelferfunktion besaßen. Im Gegensatz zu früheren ineffizienten targeting-Strategien basiert der Erfolg des in dieser Arbeit entwickelten Systems wahrscheinlich auf der Verteilung der Funktionen Rezeptorerkennung und Membranfusion auf zwei unterschiedliche Proteine. Sogar die Transduktion ruhender B-Zellen ist nun möglich. Der zugrundeliegende Mechanismus könnte auf residualer Bindung der MV-Hüllproteine an die MV-Rezeptoren beruhen. Dies bewirkt keinen Zelleintritt, aber könnte für den Gentransfer in ruhende Zellen notwendige Zytoskelettumordnungen verursachen. Alternativ oder zusätzlich könnten MVaCD20-HIV Vektoren durch CD20-Bindung und -Verlinkung einen Kalziumeinstrom und damit B-Zellaktivierung auslösen. Das in dieser Arbeit entwickelte targeting-System erlaubt erstmalig einen gezielten und effizienten Zelleintritt lentiviraler Vektoren in ruhende Lymphozyten. Dies kann als Basis dienen, dieses System auf beliebige andere Zielmoleküle zu übertragen, indem entsprechende Liganden oder scAbs an die Ektodomäne des modifizierten H-Proteins fusioniert werden.

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Metadaten
Author:Sabrina Funke
URN:urn:nbn:de:hebis:30-66784
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2009/06/16
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/05/14
Release Date:2009/06/16
Tag:Pseudotypisierung; Transduktion B Zellen; lentivirale Vektoren; zielgerichteter Zelleintritt
genetransfer; lentiviral vectors; pseudotyping; targeted cell entry; transduction B cells
GND Keyword:Lentiviren; Gentransfer
HeBIS-PPN:213083892
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht