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Photobleaching is a major challenge in fluorescence microscopy, in particular if high excitation light intensities are used. Signal-to-noise and spatial resolution may be compromised, which limits the amount of information that can be extracted from an image. Photobleaching can be bypassed by using exchangeable labels, which transiently bind to and dissociate from a target, thereby replenishing the destroyed labels with intact ones from a reservoir. Here, we demonstrate confocal and STED microscopy with short, fluorophore-labeled oligonucleotides that transiently bind to complementary oligonucleotides attached to protein-specific antibodies. The constant exchange of fluorophore labels in DNA-based STED imaging bypasses photobleaching that occurs with covalent labels. We show that this concept is suitable for targeted, two-color STED imaging of whole cells.
The knob-associated histidine-rich protein (KAHRP) plays a pivotal role in the pathophysiology of Plasmodium falciparum malaria by forming membrane protrusions in infected erythrocytes, which anchor parasite-encoded adhesins to the membrane skeleton. The resulting sequestration of parasitized erythrocytes in the microvasculature leads to severe disease. Despite KAHRP being an important virulence factor, its physical location within the membrane skeleton is still debated, as is its function in knob formation. Here, we show by super-resolution microscopy that KAHRP initially associates with various skeletal components, including ankyrin bridges, but eventually colocalizes with remnant actin junctions. We further present a 35 Å map of the spiral scaffold underlying knobs and show that a KAHRP-targeting nanoprobe binds close to the spiral scaffold. Single-molecule localization microscopy detected ~60 KAHRP molecules/knob. We propose a dynamic model of KAHRP organization and a function of KAHRP in attaching other factors to the spiral scaffold.
The knob-associated histidine-rich protein (KAHRP) plays a pivotal role in the pathophysiology of Plasmodium falciparum malaria by forming membrane protrusions in infected erythrocytes, which anchor parasite-encoded adhesins to the membrane skeleton. The resulting sequestration of parasitized erythrocytes in the microvasculature leads to severe disease. Despite KAHRP being an important virulence factor, its physical location within the membrane skeleton is still debated, as is its function in knob formation. Here, we show by super-resolution microscopy that KAHRP initially associates with various skeletal components, including ankyrin bridges, but eventually colocalizes with remnant actin junctions. We further present a 35 Å map of the spiral scaffold underlying knobs and show that a KAHRP-targeting nanoprobe binds close to the spiral scaffold. Single-molecule localization microscopy detected ~60 KAHRP molecules/knob. We propose a dynamic model of KAHRP organization and a function of KAHRP in attaching other factors to the spiral scaffold.
Die Plasmamembran eukaryotischer Zellen dient als Barriere zwischen dem Inneren einer Zelle und ihrer Umgebung. Eine wichtige Aufgabe von Proteinen, die sich in der Plasmamembran befinden, besteht in der Erkennung der Umgebung, der Übermittlung dieser Informationen über die Plasmamembran in das Innere einer Zelle und der Einleitung einer zellulären Antwort. Membranrezeptoren binden Liganden, was zu ihrer Aktivierung und der Rekrutierung von intrazellulären Proteinen führt. Funktionelle Signalkomplexe werden gebildet und leiten einen Informationstransfer durch die Zellmembran ein, so dass die Expression bestimmter Gene stimuliert oder unterdrückt wird. Eine Störung der Signalinitiierung und -übertragung tritt bei vielen Krankheiten auf, so dass Membranproteine ein wichtiges Ziel in der Medikamentenentwicklung sind.
In dieser Arbeit wird die Fragestellung bearbeitet, wie der Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1) in funktionelle Komplexe in der Plasmamembran einer intakten Zelle organisiert ist. TNFR1 besitzt vier cysteinreiche Domänen (CRDs) in seiner extrazellulären Region. Die erste und von der Plasmamembran am weitesten entfernte CRD ist die Pre-Ligand Assembly Domain (PLAD). Kristallstrukturen zeigten, dass sich in einem TNFR1-Dimer zwei PLAD in unmittelbarer Nähe befinden. Crosslinking-Experimente berichteten über mehrere oligomere Zustände von TNFR1; die Ergebnisse unterschieden sich nach Art und Konzentration des Crosslinkers. In der nativen Umgebung einer intakten Zelle wurde der oligomere Zustand von TNFR1 bisher nicht bestimmt. Der kanonische Ligand für TNFR1 ist der Tumornekrosefaktor alpha (TNF), ein Homotrimer, welches in löslicher oder membrangebundener Form vorliegt. Nach der Bindung von TNF an TNFR1 bilden sich Rezeptortrimere. Diese Proteinkomplexe rekrutieren intrazellulär Proteine und bilden einen funktionellen Membrankomplex, der intrazelluläre Signalkaskaden aktiviert. Die kanonische Signalweiterleitung erfolgt durch den nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells (NF-B), welcher Zellteilung oder Entzündung induziert. TNFR1 kann auch andere Signalwege wie beispielsweise Apoptose durch einen zytosolischen Komplex und die Procaspase-8, oder Nekroptose durch das Nekrosom und die mixed lineage kinase domain-like (MLKL)-Domäne einleiten. Die Dysregulation von TNFR1 ist bei einer Vielzahl von Krankheiten zu finden. Erhöhte TNFR1-Expressiosraten treten bei acquired immune deficiency syndrome (AIDS), multipler Sklerose und verschiedenen Krebsarten auf.
In einem zweiten Projekt wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Michael Lanzer (Heidelberg, Germany) der Expressionsgrad des Proteins VAR2CSA in membranassoziierten knobs bestimmt, welche in Erythrozyten vorkommen, die mit dem Parasiten Plasmodium falciparum infizierten wurden. VAR2CSA gehört zur Proteinfamilie des Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (pfEMP1). Nach einer Infektion wird VAR2CSA zur Wirtszellmembran transportiert und in knobs eingelagert. Patienten, die Sichelzellenanämie-Erythrozyten (HbAS) aufweisen, sind im Gegensatz zu Patienten mit gesunden Erythrozyten (HbAA) immun gegen Malaria. Während die beiden Erythrozytentypen eine unterschiedliche Morphologie der knobs aufweisen, blieb ihre Zusammensetzung in Bezug auf VAR2CSA bisher ungeklärt.
Das Verständnis der Proteinfunktion erfordert eine Beschreibung der molekularen Organisation funktioneller Einheiten in der zellulären Umgebung. Hierfür ist die Fluoreszenzmikroskopie eine geeignete Methode, da sie eine gezielte Markierung von Zielproteinen ermöglicht. Die hohe Sensitivität ermöglicht die Visualisierung einzelner Proteine. Eine Einschränkung in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie ist die Auflösungsgrenze. Strukturelle Elemente, die kleiner als etwa die halbe Anregungswellenlänge sind (für die meisten Anwendungen 200 bis 300 nm) können nicht aufgelöst werden. Die Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte es, diese Auflösungsgrenze zu umgehen und eine räumliche Auflösung von wenigen Nanometern zu erreichen, was die Visualisierung und Charakterisierung einzelner Proteinkomplexe ermöglichte. Eine Art der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie ist die single-molecule localization microscopy (SMLM), die auf der Detektion einzelner Fluorophore, einer genauen Bestimmung ihrer Position (Lokalisation) und der Erzeugung eines rekonstruierten Bildes unterhalb der optischen Auflösungsgrenze basiert. Da die meisten Proben in der Fluoreszenzmikroskopie eine zu hohe räumliche Dichte an Fluorophoren aufweisen, um den Nachweis von einzelnen Fluorophoren zu ermöglichen, werden Verfahren zur Kontrolle der Emission von Fluorophoren eingesetzt. Eine Möglichkeit ist der Einsatz von Fluorophoren, die optisch zwischen einem nicht-fluoreszierenden und einem fluoreszierenden Zustand geschaltet werden können, z.B. photoschaltbare fluoreszierende Proteine in photoactivated localization microscopy (PALM) oder organische Farbstoffe in (direct) stochastic optical reconstruction microscopy ((d)STORM). SMLM erreicht eine räumliche Auflösung von 20 nm, was in den meisten Fällen ausreicht, um einzelne Proteinkomplexe in einer Zelle aufzulösen. Diese räumliche Auflösung ist jedoch nicht ausreichend, um Untereinheiten innerhalb eines Proteinkomplexes zu visualisieren. Zu diesem Zweck wurde SMLM erweitert und die verfügbare kinetische Information genutzt, die bei der Detektion einzelner Fluorophore ausgelesen wird. Viele Fluorophore weisen metastabile Dunkelzustände auf, die eine Lebensdauer von bis zu Sekunden aufweisen. Diese Übergänge erscheinen als "Blinken" der Fluoreszenzemission. In Kombination mit kinetischen Modellen kann aus der Anzahl an Blink-Ereignissen die Anzahl der Fluorophore ermittelt werden. Angewendet auf hochaufgelöste Proteinkomplexe kann die Auflösungsgrenze von hochauflösender Mikroskopie umgangen werden, und die Anzahl der Protein-Untereinheiten in einem hochaufgelösten Proteincluster ermittelt werden. Hierzu wird beispielsweise das photoschaltbare fluoreszierende Protein mEos2 an ein Zielprotein funsioniert (quantitative PALM (qPALM)).
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TNFR1 is a crucial regulator of NF‐ĸB‐mediated proinflammatory cell survival responses and programmed cell death (PCD). Deregulation of TNFα‐ and TNFR1‐controlled NF‐ĸB signaling underlies major diseases, like cancer, inflammation, and autoimmune diseases. Therefore, although being routinely used, antagonists of TNFα might also affect TNFR2‐mediated processes, so that alternative approaches to directly antagonize TNFR1 are beneficial. Here, we apply quantitative single‐molecule localization microscopy (SMLM) of TNFR1 in physiologic cellular settings to validate and characterize TNFR1 inhibitory substances, exemplified by the recently described TNFR1 antagonist zafirlukast. Treatment of TNFR1‐mEos2 reconstituted TNFR1/2 knockout mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with zafirlukast inhibited both ligand‐independent preligand assembly domain (PLAD)‐mediated TNFR1 dimerization as well as TNFα‐induced TNFR1 oligomerization. In addition, zafirlukast‐mediated inhibition of TNFR1 clustering was accompanied by deregulation of acute and prolonged NF‐ĸB signaling in reconstituted TNFR1‐mEos2 MEFs and human cervical carcinoma cells. These findings reveal the necessity of PLAD‐mediated, ligand‐independent TNFR1 dimerization for NF‐ĸB activation, highlight the PLAD as central regulator of TNFα‐induced TNFR1 oligomerization, and demonstrate that TNFR1‐mEos2 MEFs can be used to investigate TNFR1‐antagonizing compounds employing single‐molecule quantification and functional NF‐ĸB assays at physiologic conditions.
CD44v6, a member of the CD44 family of transmembrane glycoproteins is a co-receptor for two receptor tyrosine kinases (RTKs), Met and VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor 2). CD44v6 is not only required for the activation of these RTKs but also for signalling. In order to understand the role of CD44v6 in Met and VEGFR-2 activation and signalling we tested whether CD44v6 binds to their ligands, HGF (hepatocyte growth factor) and VEGF (vascular endothelial growth factor), respectively. FACS analysis and cellular ELISA showed binding of HGF and VEGF only to cells expressing CD44v6. Direct binding of CD44v6 to HGF and VEGF was demonstrated in pull-down assays and the binding affinities were determined using MicroScale Thermophoresis, fluorescence correlation spectroscopy and fluorescence anisotropy. The binding affinity of CD44v6 to HGF is in the micromolar range in contrast with the high-affinity binding measured in the case of VEGF and CD44v6, which is in the nanomolar range. These data reveal a heparan sulfate-independent direct binding of CD44v6 to the ligands of Met and VEGFR-2 and suggest different roles of CD44v6 for these RTKs.
PfEMP1 (erythrocyte membrane protein 1) adhesins play a pivotal role in the pathophysiology of falciparum malaria, by mediating sequestration of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in the microvasculature. PfEMP1 variants are expressed by var genes and are presented on membrane elevations, termed knobs. However, the organization of PfEMP1 on knobs is largely unclear. Here, we use super-resolution microscopy and genetically altered parasites expressing a modified var2csa gene in which the coding sequence of the photoactivatable mEOS2 was inserted to determine the number and distribution of PfEMP1 on single knobs. The data were verified by quantitative fluorescence-activated cell sorting analysis and immuno-electron microscopy together with stereology methods. We show that knobs contain 3.3 ± 1.7 and 4.3 ± 2.5 PfEMP1 molecules, predominantly placed on the knob tip, in parasitized erythrocytes containing wild type and sickle haemoglobin, respectively. The ramifications of our findings for cytoadhesion and immune evasion are discussed.
The human MET receptor tyrosine kinase contributes to vertebrate development and cell proliferation. As a proto‐oncogene, it is a target in cancer therapies. MET is also relevant for bacterial infection by Listeria monocytogenes and is activated by the bacterial protein internalin B. The processes of ligand binding, receptor activation, and the diffusion behavior of MET within the plasma membrane as well as its interconnections with various cell components are not fully understood. We investigated the receptor diffusion dynamics using single‐particle tracking and imaging fluorescence correlation spectroscopy and elucidated mobility states of resting and internalin B‐bound MET. We show that internalin B‐bound MET exhibits lower diffusion coefficients and diffuses in a more confined area in the membrane. We report that the fraction of immobile receptors is larger for internalin B‐bound receptors than for resting MET. Results of single‐particle tracking in cells treated with various cytotoxins depleting cholesterol from the membrane and disrupting the actin cytoskeleton and microtubules suggest that cholesterol and actin influence MET diffusion dynamics, while microtubules do not have any effect.
Single-molecule localization microscopy (SMLM) reports on protein organization in cells with near-molecular resolution and in combination with stoichiometric labeling enables protein counting. Fluorescent proteins allow stoichiometric labeling of cellular proteins; however, most methods either lead to overexpression or are complex and time demanding. We introduce CRISPR/Cas12a for simple and efficient tagging of endogenous proteins with a photoactivatable protein for quantitative SMLM and single-particle tracking. We constructed a HEK293T cell line with the receptor tyrosine kinase MET tagged with mEos4b and demonstrate full functionality. We determine the oligomeric state of MET with quantitative SMLM and find a reorganization from monomeric to dimeric MET upon ligand stimulation. In addition, we measured the mobility of single MET receptors in vivo in resting and ligand-treated cells. The combination of CRISPR/Cas12a-assisted endogenous protein labeling and super-resolution microscopy represents a powerful tool for cell biological research with molecular resolution.