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- 2007 (1)
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In Eukaryonten findet der Prozess des Spleißens im Spleißosom, einer sich permanent reorganisierenden, molekularen Maschine, statt. In diesem Prozess werden die kodierenden Sequenzen, die Exons, von den nicht kodierenden Sequenzen, den Introns, getrennt und zusammengefügt. Durch die permanente Reorganisation des Spleißosoms war es bisher nicht möglich, die dreidimensionale Struktur der unterschiedlichen Komplexe in einer hohen Auflösung zu bestimmen. Tuschl et al. haben ein Ribozym entwickelt. Dieses bildet über den Angriff einer 2'-Hydroxylgruppe eines Adenosins auf das Phosphatrückgrat eines Guanosins ein Lariat. Diese Reaktion ist vergleichbar dem ersten Schritt der Spleißreaktion. In dieser Arbeit wurde das Ribozym vor der Ausbildung der Lariatstruktur charakterisiert. Eine Voraussetzung zur Strukturaufklärung mit NMR ist die Zuordnung der Resonanzen. Die Zuordnung zeigte, dass ein Teil der linearen Form des Ribozyms in zwei Konformationen vorliegt. Hier findet ein langsamer konformationeller Austausch statt, der die Resonanzüberlagerung erhöht und damit die Zuordnung der Signale erschwert. Aus diesem Grund wurden unterschiedliche Isotopen markierte Proben für die Zuordnung verwendet. Zur Verifizierung der Sekundärstruktur wurden neben NMR-Experimenten Mutationsstudien am Ribozym eingesetzt. Das Ribozym bildet zwischen g1-c12 und g17-c27 eine Helix. Die Helix weist neben kanonischen Basenpaarungen auch nicht kanonische Basenpaarungen auf. Die Adenosine am Anfang der Helix interagieren mit Nukleotiden in 3'-Position des branchpoint Adenosins. Dadurch befindet sich das branchpoint Adenosin a48 nahe dem g1. Zwischen diesen beiden Nukleotiden findet die Umesterung statt, in der das Lariat gebildet wird. Nach der Lariatbildung sind in den NMR Spektren nur noch die Resonanzen der kurzen Helices P1 und P2 zu beobachten. Die anderen Resonanzen unterliegen einem konformationellen Austausch. Die Struktur des Ribozyms verändert sich also nach der Lariatbildung beträchtlich. In der Spleißreaktion, aber auch in anderen katalytischen Prozessen besitzt die 2'-Hydroxylgruppe der RNA eine essentielle Funktion. Auch die wesentlichen strukturellen Unterschiede zwischen der RNA und DNA sind auf die 2'-Hydroxylgruppe zurückzuführen. Bislang liegen jedoch nur moleküldynamische Berechnungen und NMR-spektroskopische Untersuchungen an einzelnen Nukleotiden vor, die sich mit der Konformation der 2'-Hydroxylgruppe beschäftigen. In dieser Arbeit wurden erstmals die Konformationen der 2'-Hydroxylgruppen einer dreißig Nukleotide umfassenden RNA, der TAR-RNA, mit Hilfe von 3J-Kopplungen und NOEs bei niedrigen Temperaturen in Lösung ermittelt. Die Konformationsanalyse ergibt, dass die 2'-Hydroxylgruppen der unteren Helix der TAR-RNA in einem konformationellen Gleichgewicht zwischen der O3'- und der Basendomäne vorliegen. In beiden Orientierungen können sich die 2'-Hydroxylgruppen am Aufbau eines Netzwerks aus Wassermolekülen beteiligen, in dem zwei Wassermoleküle die große Furche der RNA Helix überspannen. Durch den Wechsel der 2'-Hydroxylgruppen zwischen der O3'- und Basen-Domäne unterliegt das Netzwerk einer stetigen Reorganisation.