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Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Teilaspekte des S1P-Signalsystems näher untersucht. Der erste Teil der Arbeit geht der Frage nach, welche Störungen das Ausschalten der S1P-Lyase in der Ca2+-Homöostase verursacht. Die Messung der zellulären Lipidkonzentrationen ergab in Sgpl1-/--MEFs einen sechsfach höherer Wert für S1P und einen doppelt so hohen Wert für Sphingosin als in den Sgpl1+/+-MEFs. [Ca2+]i wurde an Einzelzellen mit Hilfe des Proteinfarbstoffs Cameleon untersucht, wobei [Ca2+]i-Anstiege durch den SERCA-Inhibitor Thapsigargin induziert wurden. So konnte gezeigt werden, dass sowohl in Sgpl1+/+-MEFs als auch in Sgpl1-/--MEFs zwei verschiedene Subtypen existieren, die sich hinsichtlich Geschwindigkeit und Ausmaß des [Ca2+]i-Anstiegs unterscheiden. Die basale [Ca2+]i war im Subtyp der Sgpl1-/--MEFs mit einem schnellen und kurzen [Ca2+]i-Anstieg signifikant erhöht, während das Maximum des Thapsigargin-induzierten [Ca2+]i-Anstiegs im Subtyp der Sgpl1-/--MEFs mit einem langsamen und langen [Ca2+]i-Anstieg signifikant erhöht war. Die AUC des Zeitverlaufs nach der Stimulation mit Thapsigargin war in beiden Subtypen der Sgpl1-/--MEFs signifikant erhöht, was bedeutet, dass der Ca2+-Gehalt der Thapsigargin-sensitiven Speicher in Sgpl1-/--MEFs höher als in Wildtyp-MEFs war.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Aspekte der Modulation des S1P-Signalsystems durch das Sphingosin-Analogon cis-4-Methylsphingosin näher untersucht. Die Messung der Lipidkonzentrationen von cis-4-Methylsphingosin und dem Phosphorylierungsprodukt cis-4-Methyl-S1P erfolgte dabei in HEK-293-Zellen und deren Überständen mittels LC-MS/MS. Hierbei wurde erstmals cis-4-Methyl-S1P im Zellkulturüberstand nachgewiesen, was bedeutet, dass cis-4-Methylsphingosin nach der intrazellulären Phosphorylierung sezerniert werden kann. Dieser Mechanismus bildet die Grundlage dafür, dass cis-4-Methylsphingosin nicht nur intrazellulär wirken, sondern ebenso wie FTY720 als S1P-Rezeptor-Modulator fungieren kann. Der dritte und umfangreichste Teil der Arbeit befasst sich mit der Regulation der SK1 durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Um die Rolle von Gαq/11-Proteinen bei der Ansteuerung der SK1 durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren weiter zu analysieren, wurde zunächst die Rezeptor-induzierte Translokation der SK1 in MEFs untersucht, die sowohl in Gαq als auch in seinem Homolog Gα11 doppelt defizient waren (Gαq/11 -/--MEFs). Die SK1-Translokation war nur nach Transfektion mit Gαq möglich. Um Hinweise auf die strukturellen Erfordernisse für die SK1-Ansteuerung durch Gαq zu erhalten, wurde der Einfluss verschiedener Gαq-Mutanten auf die Translokationshalbwertszeit der SK1 untersucht. So waren alle untersuchten Mutanten in der Lage, die SK1-Translokation in Gαq/11-/--MEFs zu vermitteln. Die Expression der Gαq-W263D-Mutante führte dabei zu einer signifikant verlangsamten SK1-Translokation. Die durch Gαq-T257E-vermittelte Translokation war erst nach mehreren Minuten feststellbar. Die Abhängigkeit der SK1-Translokation von Gαq wurde auf zellulärer Ebene durch Coexpression einer katalytisch inaktiven Mutante der G-Protein gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2) als Gαq-scavenger in HEK3-Zellen nachgewiesen. Dies führte zu einer vollständigen Inhibierung der Carbachol-induzierten SK1-Translokation. Hingegen führte die Überexpression der SK1 in den M3-Rezeptor exprimierenden HEK-293-Zellen zu einer reduzierten Carbachol-induzierten Aktivierung der PLCβ. Dieser Effekt war unabhängig von der katalytischen Aktivität der SK1. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die SK1 mit den Effektoren GRK2 und PLCβ um gemeinsame Bindungsstellen der aktivierten G-Protein Untereinheit Gαq konkurriert. Zusätzlich wurde die direkte Interaktion zwischen Gαq und SK1 auf Proteinebene mittels optischer Thermophorese nachgewiesen. Dazu wurde die humane SK1 als N-terminal getaggtes His6-MBP-Fusionsprotein exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass die mit dem Fluoreszenzfarbstoff NT647-markierte hSK1 (hSK1*) mit dem TNF Rezeptor-assoziiertem Faktor 2 (TRAF2), nicht jedoch mit dem N-terminalen Fragment des TRAF family member-associated NF-kappa-B activator (TANK) interagierte. Sowohl inaktives Gαq als auch [AlF4]--aktiviertes Gαq interagierten mit der hSK1* mit einem vergleichbaren kD-Wert. Auch mit NT-647-markiertes Gαq interagierte mit der hSK1 sowohl in der inaktiven als auch in der [AlF4]--aktivierten Form, wohingegen es nicht mit TANK oder TRAF2 interagierte.
Insgesamt zeigen die erhaltenen Daten, dass die SK1 ein direktes Target von Gαq ist und sie an genau dieselben Gαq-Reste bindet, an die auch die klassischen Effektoren PLCβ, p63RhoGEF und GRK2 binden.
Sphingosine-1-phosphate (S1P) lyase irreversibly cleaves S1P, thereby catalysing the ultimate step of sphingolipid degradation. We show here that embryonic fibroblasts from S1P lyase-deficient mice (Sgpl1−/−-MEFs), in which S1P and sphingosine accumulate, have features of Niemann-Pick disease type C (NPC) cells. In the presence of serum, overall cholesterol content was elevated in Sgpl1−/−-MEFs, due to upregulation of the LDL receptor and enhanced cholesterol uptake. Despite this, activation of sterol regulatory element-binding protein-2 was increased in Sgpl1−/−-MEFs, indicating a local lack of cholesterol at the ER. Indeed, free cholesterol was retained in NPC1-containing vesicles, which is a hallmark of NPC. Furthermore, upregulation of amyloid precursor protein in Sgpl1−/−-MEFs was mimicked by an NPC1 inhibitor in Sgpl1+/+-MEFs and reduced by overexpression of NPC1. Lysosomal pH was not altered by S1P lyase deficiency, similar to NPC. Interestingly, lysosomal Ca2+ content and bafilomycin A1-induced [Ca2+]i increases were enhanced in Sgpl1−/−-MEFs, contrary to NPC. These results show that both a primary defect in cholesterol trafficking and S1P lyase deficiency cause overlapping phenotypic alterations, and challenge the present view on the role of sphingosine in lysosomal Ca2+ homeostasis.
Diverse extracellular signals induce plasma membrane translocation of sphingosine kinase-1 (SphK1), thereby enabling inside-out signaling of sphingosine-1-phosphate. We have shown before that Gq-coupled receptors and constitutively active Gαq/11 specifically induced a rapid and long-lasting SphK1 translocation, independently of canonical Gq/phospholipase C (PLC) signaling. Here, we further characterized Gq/11 regulation of SphK1. SphK1 translocation by the M3 receptor in HEK-293 cells was delayed by expression of catalytically inactive G-protein-coupled receptor kinase-2, p63Rho guanine nucleotide exchange factor (p63RhoGEF), and catalytically inactive PLCβ3, but accelerated by wild-type PLCβ3 and the PLCδ PH domain. Both wild-type SphK1 and catalytically inactive SphK1-G82D reduced M3 receptor-stimulated inositol phosphate production, suggesting competition at Gαq. Embryonic fibroblasts from Gαq/11 double-deficient mice were used to show that amino acids W263 and T257 of Gαq, which interact directly with PLCβ3 and p63RhoGEF, were important for bradykinin B2 receptor-induced SphK1 translocation. Finally, an AIXXPL motif was identified in vertebrate SphK1 (positions 100–105 in human SphK1a), which resembles the Gαq binding motif, ALXXPI, in PLCβ and p63RhoGEF. After M3 receptor stimulation, SphK1-A100E-I101E and SphK1-P104A-L105A translocated in only 25% and 56% of cells, respectively, and translocation efficiency was significantly reduced. The data suggest that both the AIXXPL motif and currently unknown consequences of PLCβ/PLCδ(PH) expression are important for regulation of SphK1 by Gq/11.