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Durch RNAinterferenz (RNAi) läßt sich die Expression eines beliebigen Gens spezifisch unterdrücken. Dafür müssen in das Zytoplasma kurze, doppelsträngige RNA Moleküle (siRNA bzw. shRNA) eingebracht werden, die teilweise komplementäre Sequenzen zu dem Zielgen aufweisen. Um siRNAs mit einer hohen Effizienz und Kopienzahl in die Zielzelle einzubringen, wurden Transfersysteme unterschiedlicher Art entwickelt. Nicht-virale Transfersysteme können nur einen transienten Effekt auslösen - ein Umstand, der für Langzeitstudien eine mehrfache Transfektion bedingt. Zur Lösung dieses Problems wurden retrovirale Vektorsysteme entwickelt, die durch Integration der shRNA-Expressionskassette in das zelluläre Genom eine stabile Unterdrückung eines Zielgens erreichen können. Insbesondere für präklinische Studien in vivo ist jedoch ein System mit erhöhter Transferrate wünschenswert, um in möglichst vielen Zielzellen einen RNAi-Effekt zu bewirken. Sliva et al. konnten zeigen, dass das Murine Leukämie Virus (MLV) theoretisch diese Anforderung erfüllt. Dafür wurde eine shRNA-Expressionskassette in das Virusgenom eingefügt und in vitro ein RNAi-Effekt nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses System nun durch die Verwendung von microRNA-adaptierten shRNAs (shRNAmir) verbessert. In mehreren Publikationen wurde bestätigt, dass shRNAs, die endogenen microRNAs nachempfunden sind, eine höhere Effizienz und niedrigere Toxizität aufweisen. Zunächst wurde die für die genetische Stabilität optimale Orientierung der shRNAmir-Expressionskassette bestimmt. Das Konstrukt in reverser Orientierung wies eine Deletion in der shRNAmir Promotersequenz auf, die wahrscheinlich durch Interferenz mit dem 5’LTR Promoter entstanden ist. Mit dem genetisch stabilen Viruskonstrukt wurden Experimente zur Reduktion der Expression von Markergenen durchgeführt, um die Effizienz der RNAi-Aktivität leicht zu quantifizieren. Dafür wurden humane Fibrosarkom (HT1080) Zellen infiziert, die eGFP oder Luziferase stabil exprimieren.
Mit eGFP- und Luziferase-spezifischen shRNAmir-Expressionskassetten konnte nach Infektion eine Herunterregulation von eGFP auf etwa 20 % und für Luziferase auf unter 10% beobachtet werden. Das Kontrollvirus, das eine unspezifische shRNAmir kodiert, hatte keinen Einfluss auf die Expression beider Markerproteine. Die Kinetik mit der die Markerproteine herrunterreguliert wurden, war abhängig von der Virusdosis. Die Virusdosis hatte aber keinen Einfluß auf die Stärke des RNAi-Effekts, der nach Infektion aller Zellen festgestellt werden konnte. Dieses Ergebnis entspricht der Erwartung an ein replikatives Transfersystems, das je nach applizierter Virusdosis unterschiedlich schnell RNAi in der Zellkultur ausbreitet und induziert. Die Anwendbarkeit dieses RNAi-Transfersystems auch für endogene Gene wurde mit MMP14-spezifischen shRNAmirs gezeigt. Nach Infektion von HT1080 Zellen mit den entsprechenden Viren in HT1080 Zellen konnte eine verringerte Menge an MMP14 mRNA und Protein nachgewiesen werden. Dies konnte funktionell durch eine verringerte Menge an intermediärem MMP2 und durch eine reduzierte Invasivität bestätigt werden. Zudem war die Fähigkeit dieser Zellen subkutane Tumore zu bilden stark eingeschränkt.
Um die Anwendbarkeit dieses Systems für in vivo Applikationen zu zeigen, wurde in Mäuse, die Luziferase-exprimierenden Tumoren trugen, MLV-shLuc oder das Kontrollvirus systemisch appliziert. 21 Tage nach Virusgabe konnte in den Tumoren von MLV-shLuc infizierten Mäusen eine Abnahme der Luziferaseaktivität auf 15 % nachgewiesen werden. Auch in Mäusen, die systemisch applizierte Tumorzellen erhielten, konnte eine Tendenz von RNAi-vermittelter Luziferase-Reduktion beobachtet werden.
Damit wurde in dieser Arbeit ein neuartiges RNAi-Transfersystem geschaffen, das in der Lage ist, auch in vivo einen starken und lang andauernden RNAi-Effekt auszulösen. Die Einzigartigkeit besteht in der Kombination von shRNAmir und Replikations-kompetenten Retroviren. Dadurch konnte eine erweiterte Transferrate von shRNAmir in Tumorzellen erreicht werden, so dass nun Genfunktionsstudien mit sehr hoher Aussagekraft möglich sind.