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Molekulare Werkzeuge können in der Wissenschaft unter anderem dazu verwendet werden, biochemische Prozesse gezielt zu untersuchen, um sie somit besser zu verstehen. Dabei handelt es sich zum Beispiel, um kleine chemische Moleküle, die gezielt für ihr Anwendungsgebiet konzipiert worden sind. Mit Ihnen lassen sich z.B. Interaktionen zwischen (Makro-)Molekülen regulieren, chemische Gleichgewichte lokal verändern oder auch Botenstoffe zielgerichtet freisetzen. Die Effekte dieser temporären Einwirkung auf verschiedenste biologische Systeme können hilfreiche Erkenntnisse struktureller, funktioneller oder systematischer Art für die entsprechenden Forschungsgebiete liefern.
Um die interdisziplinären Problemstellungen zielgerichtet mit den entsprechend zugeschnittenen Werkzeugen zu adressieren, ist es dabei jedoch absolut notwendig, dass ein umfassendes und über die Grenzen der jeweiligen Fachgebiete hinaus gehendes Verständnis der jeweiligen Fragestellungen entwickelt wird.
Viele der bisher bekannten Werkzeuge benötigen für ihren Einsatz bis heute noch relativ harsche Reaktionsbedingungen, haben ein eingeschränktes Anwendungsfeld oder lassen sich nicht ausreichend Zeit- & Ortsaufgelöst „aktivieren“. Die Möglichkeit Licht als externes Trigger-Signal zu verwenden, um die entsprechenden molekularen Werkzeuge zu aktivieren (oder auch zu deaktivieren), überwindet genau diese Defizite und bringt neben der hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung noch viele weitere Vorteile mit sich. Im Rahmen meiner Doktorarbeit ist es mir gelungen gemeinsam mit meinen Kooperationspartnern neue lichtaktivierbare molekulare Werkzeuge von Grund auf zu designen, zu synthetisieren, sie auf ihre photochemischen Eigenschaften zu untersuchen und sie anzuwenden. Durch die interdisziplinäre Zusammenarbeit mit Doktoranden aus der Organischen, Theoretischen und Physikalischen Chemie, konnte ein umfassendes Bild dieser neuen Substanzklassen aufgezeigt werden. Die verschiedenen Arten lichtaktivierbarer Werkzeuge sollen im Verlauf dieser Arbeit genauer herausgearbeitet werden. Generell kann man in drei grundlegenden Klassen von lichtaktivierbaren Werkzeugen unterscheiden: 1. irreversibel photolabile Schutzgruppen, 2. photoaktivierbare Label und 3. reversibel lichtschaltbare Photoschalter.
Auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen, auch photoaktivierbare Schutzgruppen oder Photocages genannt, ist es uns gelungen eine neue Spezies von Molekülen zu identifizieren, die dazu in der Lage sind, nach photochemischer Anregung eine spezifische Bindung innerhalb ihres molekularen Gerüsts zu spalten. Möglich gemacht wurde dies, indem wir den sog. „uncaging Prozess ganz neu gedacht“ haben und mit der Unterstützung von Theorie und Spektroskopie unsere Ergebnisse in einer Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie (SAR) festhalten konnten. Aus einer Substanzbibliothek von diversen theoretisch berechneten Kandidaten, wurden die vielversprechendsten Verbindungen anschließend synthetisiert und photochemisch charakterisiert. Nach initialen Untersuchungen und den daraus hervorgehenden Erkenntnissen, wurden weitere molekulare Struktur auf die Optimierungen der photochemischen Eigenschaften hin theoretisch berechnet und anschließend im Labor realisiert. Daraus resultierend entwickelten wir einen Photocage, der mit einer hohen Quantenausbeute mit Licht von über 450 nm photolysierbar ist und ebenfalls dazu in der Lage ist Neurotransmitter wie z.B. Glutamat zielgerichtet und lichtaktiviert freizusetzen. Eine weitere Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie wurde im Rahmen dieser Arbeit mit dem Isatin-Gerüst als potentiell neue photolabile Schutzgruppe durchgeführt.
Ebenfalls konnten in einer dritten Studie auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen Untersuchungen am Coumarin-Grundgerüst zeigen, dass eine systematische Einschränkung der Relaxationspfade im Molekül eine Verbesserung der photochemischen Eigenschaften mit sich bringen kann.
Photoaktivierbare Label werden in den verschiedensten Bereichen der Wissenschaft angewendet. Meist erlauben jedoch die chemischen Moleküle nur eine begrenzte „Beobachtungszeit“ der biochemischen Prozesse aufgrund der effizienten und damit schnellen Relaxationspfade zurück in den Grundzustand. Zu Beginn der durchgeführten Untersuchungen, bestand unsere Idee darin, die selektive Prä-IR-Anregung mit Hilfe eines UV/vis-Pulses (entsprechend der VIPER-Spektrokopie) in ein langlebiges Triplett-Signal eines geeigneten Chromophors zu überführen, welches anschließend für die Beobachtung vergleichsweise lang-lebiger biochemischer Prozesse verwendet werden könnte. Aus dieser Idee heraus entwickelten wir einen Chromophor, der neben einer Absorption im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, zusätzlich eine IR-adressierbare funktionelle Gruppe, sowie die Eigenschaft, ein effizientes Inter-System-Crossing (ISC) nach photochemischer Anregung durchzuführen, besaß. Zu unserem Erstaunen zeigte dieses Derivat jedoch nach erfolgreicher Synthese nicht das erwartete Verhalten. Ein weiteres Beispiel für die hochgradige Komplexität der Photochemie.
Mit Hilfe von theoretischen und spektroskopischen Methoden konnten dennoch viele hilfreiche Erkenntnisse aus dieser Studie für zukünftige Untersuchungen aufgedeckt werden.
Ebenso war es während meiner Promotion eines der Ziele, den Schaltprozess des sog. Fulgid-Photoschalters genauer zu untersuchen und somit besser zu verstehen. Hierbei handelt es sich um ein ausgesprochen beständiges, photochemisch reversibel schaltbares Molekül, auch wenn dies vielleicht auf den ersten Blick ein Widerspruch in sich zu sein scheint. Es gelang uns diesen Photoschalter, genauer gesagt seine Photo-Isomere, auf dem Gebiet der chemischen Aktinometrie zu etablieren.
Dafür waren zahlreiche Messungen diverser Reaktivitäten (photochemische Reaktions-Quantenausbeuten) in verschiedenste Wellenlängenbereiche vom Nah-UV-Bereich bis hin zur 700 nm Grenze erforderlich. Außerdem wurden alle Werte mit der Referenzmessung einer Photodiode bzw. je nach Wellenlängenbereich auch mit der klassischen Ferri-Oxalat-Aktinometrie verglichen. Im Anschluss daran fokussierte ich mich weiter auf die einzelnen Photo-Isomere und ihre einzigartige chemische Struktur. Mit Hilfe der chiralen HPLC gelang es uns die einzelnen Photo-Isomere voneinander zu isolieren und diese mit verschiedensten photochemischen und theoretischen Methoden „genauer unter die Lupe“ zu nehmen. Die aus dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse bereiten den Weg für diverse, zukünftige spektroskopische Anwendungen dieses Photoschalters.
mRNS ist einer der wichtigsten Informationsträger in lebenden Zellen. Mit ihr wird die in der DNS gespeicherte Information zu aktiven Zellprozessen umgesetzt. Dabei finden erste regulatorische Prozesse, die den Phänotyp eines Organismus bestimmen können, bereits über Strukturelemente auf der mRNS statt. Diese, als Riboschalter bezeichneten Strukturen, können spezifisch, kleine Moleküle binden und dadurch ihre Struktur ändern. Durch diese dynamische Änderung der Struktur, in An- oder Abwesenheit des Liganden, wird reguliert, ob nachfolgende Gene vom Ribosom abgelesen werden können. Der Cd1-Riboschalter aus Clostridium Difficile ist schon während der Transkription aktiv und ein Teil des regulatorischen Netzwerkes, das bestimmt, ob das Bakterium einen mobilen oder stationären Lebensstil einnimmt. Das zentrale Signalmolekül in diesem Netzwerk ist der sekundäre Botenstoff c-di-GMP, der gleichzeitig auch der Ligand des Cd1-Riboschalters ist. In der folgenden Arbeit wurde der zeitliche und strukturelle Ablauf des Cd1 Regulationsmechanismus und die Bindung von c-di-GMP untersucht. Auch ohne einen Riboschalter in der Sequenz ist strukturierte mRNS ein interessanter Forschungsgegenstand. Wie die Covid-19 Pandemie und die Forschungen, mRNS Abschnitte als Krebsmedikamente zu gebrauchen, zeigen, gewinnt RNS immer mehr an Bedeutung für die medizinische Forschung und Anwendung. Mit dieser Motivation im Hintergrund wurden drei weitere RNS Projekte bearbeitet. Im ersten wurde ein 19F-Screening für die Erkennung von RNS bindenden Fragmenten etabliert. Im zweiten wurde ein RNS Doppelstrang untersucht, der mit Hilfe verschiedener, kovalent gebundener Spiropyrane reversibel gefaltet und entfaltet werden sollte. Im abschließenden Projekt wurden im Rahmen der COVID-19-NMR Initiative zwei Sekundärstrukturelemente der Covid-19 RNS untersucht.
Bei der Untersuchung des Cd1-Riboschalters konnten folgende Ergebnisse erzielt werden. Es wird gezeigt, dass die Bindung von c-di-GMP an das Cd1-Aptamer ein konzentrationsabhängiges Magnesiumverhältnis braucht. Dieses Verhältnis wurde ausgehend von initialen Messungen als 1/40 (RNS/Ligand) bestimmt. Spätere ITC Messungen geben aber Hinweise darauf, dass dieses Verhältnis bei niedrigen RNS Konzentrationen höher liegt und bei größeren RNS Konzentrationen niedriger. Die Bestimmung des Start- und Endpunktes der c-di-GMP Bindung wird in Unterkapitel 3.1.2 behandelt. Es wurde ermittelt, dass Cd1 bei 83 Nukleotiden eine alternative schwach Ligand bindende Konformation einnimmt, die wahrscheinlich durch eine P1 Helix bis zum Erreichen von Cd1-87 stabilisiert wird. Ab Cd1-87 bildet sich die reguläre von der Literatur vorhergesagte Bindetasche. Das Ende der c-di-GMP Bindung wird mit Cd1-148 erreicht, auch wenn hier noch Reste der Reportersignale für Bindung zu sehen sind. Diese Reste werden aber aller Wahrscheinlichkeit nach durch eine Cd1-83 entsprechende Konformation der Bindetasche erzeugt. In Kapitel 3.2 wird gezeigt, wie durch NMR Messungen die Zuordnung der Sekundärstruktur des Cd1-Riboschalters vollzogen wurde. Durch diese Messungen konnte bestätigt werden, dass in allen Längen eine P2 und P3 Helix vorhanden ist. Im Aptamer wird die Ligandbindung durch zwei Interaktionen zwischen P2 und P3 stark stabilisiert und der untere Abschnitt der P3 erst dann nicht mehr dynamisch, wenn c-di-GMP gebunden wird. Durch x-filter Experimente und Mutationen konnte nachgewiesen werden, dass C87 das basenpaarende Nukleotid an einem G des Liganden ist. Die Anwesenheit des HP1 Stamms konnte in den Längen 147, 148 und 160 nachgewiesen werden, wobei besonders der Vergleich der NOESY Spektren von Cd1-147 und Cd1-148 die Änderung der Sekundärstruktur hin zum Antiterminator zeigen. Der Verlauf der Bindungsaffinitäten wurde auch durch ITC Messungen an Cd1-83, 86, 87, 88, 135 und 146 bestätigt. Für die volle Länge (Cd1-160) des Riboschalters konnte gezeigt werden, dass der Terminatorstamm ausgeformt ist. Die erreichten Ergebnisse wurden in einem Modell zusammengefasst und der zeitliche Verlauf der Cd1 Regulation simuliert. Aus der Simulation ist zu erkennen, dass Cd1, wie erwartet, Ligand abhängig schaltet. Dabei ist der Aus-Zustand bei hoher Ligandkonzentration zu 90% populiert und der An-Zustand zu 100% bei niedriger Konzentration. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsgeschwindigkeit bei hohen Ligandkonzentrationen einen starken Einfluss auf die Regulationseffizienz des Riboschalters hat. So ist bei einer Transkriptionsgeschwindigkeit von 100 nt/s nach 1 s eine Gleichverteilung von An- und Aus-Zustand zu erkennen. Dieses Verhalten kann durch einen Stopp der Transkription an der potentiellen Pausierstelle U141-145 aufgehoben werden. Unter den Rahmenbedingungen des Modells erwiesen sich Transkriptionsgeschwindkeiten von um die 20 nt/s als optimal und bei niedrigen Ligandkonzentrationen hatte die Transkriptionsgeschwindigkeit faktisch keine Auswirkungen auf die Regulation. Ein interessantes Ergebniss der Modellierung ergab sich aus der Notwendigkeit der Verwendung einer Rate für konkurrenzlose Basenpaarschließungen. Hier konnte gezeigt werden, dass eine Rate von 400 nt/s ausreicht um einen voll funktionsfähigen Riboschalter zu beschreiben.
Beim 19F Bindungsscreenings von 101 Fragmenten, die alle ein oder mehrere 19F Atome besaßen, an Cd1-98 wurden 9 Fragmente gefunden die an Cd1-98 binden. Diese sind größtenteils planar mit Ausnahme von 2 Fragmenten bei denen die eine Hälfte des Moleküls nicht aromatisch ist. Des Weiteren besitzen alle Fragmente, außer einem, mindestens eine Aminogruppe im Molekül. Die daraus resultierende Vermutung, dass die Fragmente in die RNS interkalieren, konnte durch RNS beobachtende NMR Messungen nicht überprüft werden, da keine Signaländerung im Imino-Bereich zu erkennen war. Durch Verdrängungsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Fragmente, nicht wie c-di-GMP, die RNS Faltung homogenisieren und auch nicht in der Bindetasche gebunden werden.
Um molekulare Mechanismen in biologischen Prozessen zu verstehen, ist es unerlässlich biologisch aktive Verbindungen zu kontrollieren. Dabei spielt besonders die Aktivierung bzw. Desaktivierung von Genabschnitten eine zentrale Rolle in der gegenwärtigen chemischen, biologischen und medizinischen Forschung. Nukleinsäuren sind dabei offenkundige Zielmoleküle, da sie die Genexpression auf unterster Ebene regulieren und auf vielfältige Art und Weise an biologischen Prozessen beteiligt sind. Um solch eine genaue Steuerung zu erreichen, werden Nukleinsäuren häufig photolabil modifiziert und unter die Kontrolle von Licht gebracht. Da hochentwickelte Technologien es erlauben Photonen bestimmter Energie unter präziser räumlicher und zeitlicher Auflösung zu dosieren, ist Licht als nicht invasives Triggersignal ein besonders geeignetes Werkzeug um molekulare Prozesse zu kontrollieren.
Die Verwendung photolabiler Schutzgruppen („cage“) ermöglicht es, diese lichtaktivierbaren Nukleinsäuren („caged compound“) herzustellen. Üblicherweise werden Oligonukleotide damit an funktionsbestimmenden Stellen versehen, woraufhin die Funktion der Oligonukleotide unterdrückt wird. Die biologische Aktivität kann durch Bestrahlung mit Licht wieder hergestellt werden, da die photolabile Schutzgruppe durch den Lichtimpuls abgespalten wird. Neben der zeitweiligen Maskierung der Nukleinsäureaktivität existiert auch eine Methode, die als „photoaktivierbarer Strangbruch“ (‘‘caged strand break‘‘) bezeichnet wird. Dabei werden mit Hilfe von photolabilen Linkern (‘‘Verknüpfer‘‘) lichtinduzierte Strangbrüche in Oligonukleotiden ausgelöst, um so beispielsweise die Struktur eines Nukleinsäurestrangs zu zerstören. Die Idee der photoaktivierbaren Strangbrüche ist nicht neu, dennoch werden photolabile Schutzgruppen überwiegend nach der erstgenannten Strategie verwendet. Im Rahmen dieses Promotionsvorhabens wurden neue photosensitive Linkerbausteine für Oligonukleotide entwickelt und hergestellt, welche sich vor allem im Hinblick auf die Anwendbarkeit in lebenden biologischen Systemen von den bisherigen photolabilen Linkern unterscheiden.
Im ersten Projekt wurde ein nicht-nukleosidischer, photolabiler Linker, basierend auf dem Cumaringrundgerüst, entwickelt. Das Ziel war hier, vor allem, einen zweiphotonenaktiven Linker für biologische Anwendungen und Zweiphotonen-Fragestellungen nutzbar zu machen. Bisherige Zweiphotonen-Linker konnten hauptsächlich nur für Proteinverknüpfungen bzw. Neurotransmitter verwendet werden oder mussten chemisch umständlich (z.B. Click-Chemie) und postsynthetisch in Oligonukleotide eingeführt werden. Der neu entwickelte Zweiphotonen-Linker wurde als Phosphoramiditbaustein für die Oligonukelotid-Festphasensynthese synthetisiert, was einen problemlosen und automatisierten Einbau garantiert. Mit einem modifizierten Oligonukleotid konnten die photochemischen Eigenschaften des Linkers bestimmt und mit Hilfe eines fluoreszenzbasierten Verdrängungsassays und Lasertechniken der Zweiphotonen-Effekt visualisiert werden. Dazu wurde ein Hairpin-DNA-Strang hergestellt, welcher eine Linkermodifikation im Bereich der Loopregion enthält. Durch eine Thiolmodifikation am 5‘-Ende des Oligonukleotidstranges war es möglich, diesen in einem Maleimid-funktionalisierten Hydrogel zu fixieren. Ein DNA-Duplex mit einem Fluorophor/Quencherpaar und einer korrespondierenden Sequenz zum modifizierten Hairpin-Strang wurde ebenfalls dem System zugegeben, allerdings wurde dieser nicht fixiert, um Diffusion zu ermöglichen. Durch die räumliche Nähe des Fluorophors zum Quencher konnte im unbelichteten Zustand zunächst keine Fluoreszenz gemessen werden. Mit einem (Femtosekunden-)gepulsten Laser und dem damit verbundenen Bindungsbruch im Hairpin-Strang durch Zweiphotonen-Effekte wurde es dem fluoreszierenden Strang des DNA-Duplex ermöglicht, sich vom Quencher-Strang zu lösen und an den fixierten Strang zu hybridisieren. Das Photolyse-Ereignis konnte so in ein lokales Fluoreszenzsignal übersetzt und detektiert werden.
Der eindeutige Beweis, dass es sich tatsächlich um ein Zweiphotonen-induziertes Ereignis handelt, konnte durch die dreidimensional aufgelöste Photolyse und über die quadratische Anhängigkeit des Fluoreszenzsignals von der eingestrahlten Laserleistung erbracht werden.
Die generelle Kompatibilität des Cumarin-Linkers mit biologischen Systemen konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden. Dazu wurde eine Transkriptionsfaktor-DNA Decoy-Strategie entwickelt, in der Linker-modifizierte DNA Decoys an regulatorische Transkriptionsfaktoren binden und diese aber auch photochemisch wieder freisetzen können („catch and release-Strategie“). Zellkulturexperimente, um mit dieser Methode das Transkriptionsfaktor-gesteuerte und endogene Gen für Cyclooxygenase-2 (COX2) zu regulieren, lieferten keine aussagekräftigen Ergebnisse. Daher wurden die verwendeten Zellen dahingehend manipuliert, sodass sie das Protein GFP (grün fluoreszierendes Protein) in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Transkriptionsfaktors exprimieren. Das so durch die Zellen verursachte Fluoreszenzsignal steht in direkter Abhängigkeit zur Decoy-Aktivität. Mit Hilfe modifizierter GFP-Decoys konnte hierbei eine Regulation auf Transkriptionsebene in biologischen Organismen erreicht werden. Mit dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), einer molekularbiologischen in vitro-Analysetechnik, wurden die Interaktionen zwischen modifizierten Decoys und dem Transkriptionsfaktor untersucht.
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Die vorliegende Arbeit mit dem Titel Multiphoton Processes and Photocontrol of Biochemical Reaction Pathways befasst sich mit verschiedenen Strategien zur Implementierung von optischer Kontrolle in biochemisch relevanten Systemen. Auf systemischer Ebene wurde einerseits die Licht-getriebene Natriumpumpe Krokinobacter Eikastus Rhodopsin 2 (KR2) vor dem Hintergrund optogenetischer Anwendungen untersucht, und andererseits die Optimierung der wichtigsten photochemischen Parameter von photolabilen Schutzgruppen (PPG, engl. photolabile protecting group) angestrebt. Von der technisch-photophysikalischen Seite wurde ein weiterer Fokus auf den Aktivierungs- und Deaktivierungsschritt gelegt. Hierbei wurden vor allem Mehrphotonen-Prozesse betrachtet, die entweder durch simultane Absorption zweier Photonen zu einer spezifischen hoch-energetischen Anregung führen, oder durch sequentielle Absorption eine sukzessive Aktivierung und Deaktivierung eines Systems bewerkstelligen können. Auch wenn der Schwerpunkt dieser schriftlichen Arbeit auf den spektroskopischen Ergebnissen liegt, waren alle hier diskutierten Projekte stark kollaborativ und umfassten eine große Bandbreite verschiedener Techniken. Dies spiegelt den interdisziplinären Charakter vieler aktueller Fragestellungen in der photochemischen Forschung wider, die - in vielen Fällen - letztlich auf medizinische oder pharmazeutische Fortschritte abzielen.
Zunächst wurde die lichtgetriebene Natriumpumpe KR2 untersucht, die durch ihre mögliche Anwendung als optogenetisches Werkzeug bekannt wurde. In einer vergleichenden Studie der Natrium- und Protonenpumpmodi von KR2 konnten wichtige mechanistische Prinzipien für die Funktionalität des Proteins identifiziert werden. Dazu gehört die direkte Beteiligung spezifischer Strukturmerkmale wie die Aminosäure N112 und/oder der ECL1-Domäne am Ionen-Translokationsweg, sowie das enge Zusammenspiel zwischen dem Retinal und seinem Gegenion D116. Gleichzeitig bot diese IR-Studie einen der ersten mechanistischen Einblicke in den Protonenpump-Photozyklus in KR2, der deutlich weniger erforscht war. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Glaubitz wurden die strukturellen Veränderungen des Chromophors und seiner Umgebung während der verschiedenen Photointermediate mittels DNP-verstärkter Festkörper-NMR und optischer Spektroskopie näher untersucht. Hier trugen zeitaufgelöste IR-Messungen in der HOOP (engl. hydrogen out of plane)-Moden-Region dazu bei, die dynamischen Veränderungen der Chromophorkonfiguration und -Verdrillung zu verfolgen. Es konnte gezeigt werden, dass Retinal im O-Intermediat tatsächlich zu seiner all-trans-Konfiguration reisomerisiert wird, aber im Vergleich zu seiner Dunkelzustandskonfiguration deutlich stärker verdreht vorliegt.
Dies wurde auch durch die Ergebnisse im nahen UV-Bereich bestätigt, welcher bei der Charakterisierung von mikrobiellen Rhodopsinen oft ausgelassen wird. Die neu gefundene Signatur erwies sich als SBS (engl. second bright state) der 13-cis-Konfiguration des Retinals, die mit der Bildung des O-Intermediats in KR2 verschwindet. Neben der offensichtlichen Verwendung als spektraler Marker wurde der SBS-Übergang auch bezüglich seiner Anwendbarkeit für optische Kontrollexperimente untersucht. Ähnlich wie beim BLQ (engl. blue light quenching)-Effekt war es möglich, den KR2-Dunkelzustand durch Anwendung von fs-Pulsen im nahen UV - ausgehend von einem photostationären Zustand - zu regenerieren. Durch Variation der Probenbedingungen war es möglich, gezielt K (pH~5) oder M (pH~9) anzusteuern, was sich auch in unterschiedlichen Deaktivierungs-Dynamiken äußerte. Diese Ergebnisse können zusammen mit dem hier vorgeschlagenen experimentellen Konzept als Grundlage für komplexere Multiphotonen-Sequenzen im Zusammenhang optogenetischer Fragestellungen verwendet werden.
Im Gegensatz zu den recht großen und komplexen Photorezeptoren bieten unter anderem PPGs einen feineren Weg, um biochemische Reaktionen gezielt zu steuern und auszulesen. In diesem Zusammenhang sind zwei Eigenschaften von großer Bedeutung: Einerseits die Fähigkeit der PPG, Photonen bestimmter Wellenlängen zu absorbieren, und andererseits die Effizienz der gewünschten photochemischen Reaktion. Der letztgenannte Aspekt wurde unter der Hypothese untersucht, dass die Verringerung der konkurrierenden Deaktivierungskanäle in PPGs zu einer höheren Quantenffizienz der Freisetzung führt. Dies wurde an DEACM-basierten Modellverbindungen getestet, die systematisch modifiziert wurden, um verschiedene Deaktivierungsprozesse des angeregten Zustands zu identifizieren. Durch das Hinzufügen eines zusätzlichen sechsgliedrigen Rings wurde die Freisetzungsausbeute im Vergleich zu DEACM um das 2- bis 3-fache erhöht. Dies konnte durch eine weitere Planarisierung des Systems mit einer zusätzlichen Doppelbindung an der C6-Position sogar noch weiter verbessert werden (bis zu einem Faktor von 5-6). Die Anregung des Cumarin-Rückgrats führt zu einem lokal-angeregten Zustand, der sich im Gleichgewicht mit einem Ladungstransferzustand befindet. In Abhängigkeit der lokalen Umgebung, die vor allem durch die Protizität und Polarität des Lösungsmittels bestimmt wird, wird der Ladungstransfercharakter eher stabilisiert oder gar destabilisiert. Die Ladungsverschiebung führt auch zu einer Abschwächung der spaltbaren C-C-Bindung, die eine Voraussetzung für die Freisetzungsreaktion ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der mit der Freisetzungsreaktion verbundene zusätzliche Zerfallskanal zu einer mehr als 2-fachen Verringerung der Lebensdauer des angeregten Zustands in den funktionalisierten PPGs führt. Diese Eigenschaft ist ein vielversprechender photophysikalischer Indikator für die Freisetzung der Abgangsgruppe, der durch spektroskopische oder - mit zusätzlicher räumlicher Auflösung - auch durch mikroskopische Techniken wie in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie ausgelesen werden könnte...
Im Rahmen dieser vorliegenden Thesis wurden verschiedene photosensitive Systeme anhand statischer und zeitaufgelöster optischer Spektroskopiemethoden charakterisiert. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag in der Entwicklung und Untersuchung neuer Quantenpunkt-basierter Hybridsysteme. Es war möglich die optischen Eigenschaften der Quantenpunkte über Optimierung der Syntheseschritte zu variieren und so auf geplante Projekte anzupassen.
Im Projekt „Quantenpunkte als Zwei-Photonen Antenne“ sollten die hohen Zwei-Photonen Einfangquerschnitte von Quantenpunkten ausgenutzt werden um in Kombination mit einer photolabilen Schutzgruppe, ein Uncaging im NIR-Bereich zu realisieren. Es wurden ZnSe/ZnS Partikel synthetisiert, die eine starke Emission im Bereich der Absorption der Schutzgruppe zeigen. Anhand von zeitaufgelösten transienten Absorptionsexperimenten mit einer Anregungswellenlänge bei 775 nm wurde eine Zwei-Photonen Absorption der Partikel nachgewiesen. Jedoch wurden starke Emissionsbeiträge aus Fallenzuständen und eine geringe Stabilität beobachtet. Die Synthese von CdS/ZnS Quantenpunkten lieferte stabile Partikel mit geringer trap state Emission. Diese Partikel wurden in einem Modellhybridsystem als Energiedonoren eingesetzt. Als Akzeptor wurde der Farbstoff Cumarin343 gewählt. In statischen Absorptions- und Emissionsmessungen, zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen sowie in fs-zeitaufgelösten transiente Absorptionsmessungen konnte ein ultraschneller Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung des Hybridsystems beobachtet werden. Über TPiF Messungen wurde die Zwei-Photonen Absorption der Quantenpunkte detektiert. Ein Energietransfer nach Zwei-Photonen Anregung der Quantenpunkte wurde beobachtet. Schließlich wurde ein Hybridsystem aus CdS/ZnS und der photolabilen Schutzgruppe Az-NDBF (Synthese im AK Heckel, Goethe Universität, Frankfurt a. M.) untersucht. Auch in diesem System wurde ein Energietransfer von Quantenpunkt auf die Schutzgruppe nach Ein- und Zwei-Photonen Anregung beobachtet. Anhand von TA Experimenten wurde eine Zeitkonstante von <100 ps für den Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung ermittelt. Es konnte anhand der vorgestellten Resultate gezeigt werden, dass sich Quantenpunkte, aufgrund der guten Anpassung ihrer optischen Eigenschaften generell sehr gut als Antennen für organische Verbindungen eigenen.
Des Weiteren wurde ein Hybridsystem aus CdSe/ZnS Quantenpunkten und einer Dyade (Verbindung eines DTE Photoschalters und BODIPY Derivats), entworfen und charakterisiert. Ein ultraschneller EET von BODIPY auf den geschlossenen DTE Schalter wurde in vorangegangenen Studien beobachtet. Dieser EET führte zur Löschung der BODIPY-Emission. Sobald der Photoschalter im offenen Zustand vorliegt, findet aufgrund des fehlenden spektralen Überlapps kein EET statt und es wird die BODIPY-Emission detektiert. Die Erweiterung der Dyade um einen Quantenpunkt zeigte nach Anregung des Quantenpunkts dessen Fluoreszenzlöschung. Da die Emissionsbande der Quantenpunkte im Absorptionsbereich des BODIPY Farbstoffes liegt, konnte über statische und zeitaufgelöste Experimente ein ultraschneller EET von CdS/ZnS auf den Farbstoff ermittelt werden. Dies führte zu der Erweiterung des Anregungsspektrums des BODIPY Farbstoffs. Die Kopplung der Dyade an die Quantenpunktoberfläche lieferte eine Verbindung mit dem breiten Anregungsspekrum des Quantenpunkts und der schaltbaren Fluoreszenz der Dyade.
Das Hybridsystem aus CdSe Quantenpunkten und PDI zeigte vom Verhältnis der Quantenpunkte zu gekoppelten PDI Molekülen abhängige Fluoreszenzsignale. In TA Experimenten wurde ein ultraschneller EET ermittelt. Für hohe PDI Konzentrationen wurde ein weiterer EET von höher angeregten Elektronen auf das PDI identifiziert. Neben der EET Charakterisierung konnte ein zusätzlicher Prozess innerhalb des Hybridsystems mit hoher PDI Konzentration beobachtet werden. Auf den EET von Quantenpunkt auf PDI folgt ein ET aus dem Valenzband des Quantenpunkts in das HOMO des PDI*. In vorangegangene Arbeiten zu Hybridsystemen aus CdSe/ZnS und PDI wurde kein ET beobachtet. In dem beschriebenen Projekt konnte der Einfluss einer passivierenden Schale auf die elektronischen Eigenschaften von CdSe Quantenpunkten gezeigt werden.
Im letzten Teil dieser Thesis wurde die spektroskopische Charakterisierung einer NVOC und zweier NDBF Schutzgruppen beschrieben. Es konnten anhand statischer Absorptionsmessungen eine Freisetzungsquantenausbeute für NVOC-Adenin von 1,1 % ermittelt werden. Die Charakterisierung der Schutzgruppen mit einer NDBF Grundstruktur (DMA-NDBF und Az-NDBF) ergab eine Abhängigkeit der Freisetzungs- und Fluoreszenzausbeute von der Polarität des Lösungsmittels. In polarer Umgebung reduzierten sich die Quantenausbeuten deutlich...
The most versatile tool for visualizing endogenous RNA is molecular beacons (MBs). MBs are modified oligonucleotides that consist of a stem-loop structure equipped with a fluorophore and a quencher at the opposite ends. They only give a fluorescent signal when hybridized to the target RNA. Here we present our recent efforts to enhance the spatiotemporal resolution of RNA visualization by refining MBs.
We first asked if we could refine MBs to visualize defined subcellular populations of RNA in living neurons. To achieve this, we utilize visible light-activatable Q-dye MBs to allow only a subcellular fraction to be activated. Here, the fluorophore at the 5’-end was linked to a second quencher via a photolabile coumarin protecting group. Therefore, the MB only gives a fluorescent signal, when activated with visible light and hybridized to the target. This architecture allowed local activation of a hybridized subpopulation in a defined area of the cell. Knowing the exact origin of the activated RNA, we were able to increase the available monitoring time for neuronal mRNA from several minutes (literature known MBs) to more than 14 hours.
We next asked if it would be possible to gain spatiotemporal control over where the MB hybridization events occur. Therefore, we developed photo-tethered MBs where two phosphates in the loop backbone are covalently linked to each other via two photocages. This prevents the MB from hybridization to the target RNA. Only when light is applied, the photo-tethers are cleaved, and the inherent hybridization function of the MB is activated. This architecture allowed us to control the hybridization of photo-tethered MBs in primary cultured neurons.
Optimierung der Synthese eines neuen photolabil geschützten Nitroxid-Spin-Labels für RNA und DNA
(2023)
Im Rahmen dieser Arbeit konnte, ausgehend von den günstigen Ausgangsverbindungen Desoxyadenosin und Phthalsäureanhydrid, ein neues photolabil geschütztes Nukleotid 1 und sein Dummypartner 2 synthetisiert werden. Positiv zu bemerken ist, dass einige Schritte im Vergleich zu ähnlichen literaturbekannten Reaktionen in Einfachheit, Reinheit oder Ausbeute verbessert wurden. So konnte die Ausbeute der wichtigen Umwandlung des Amins 46 zum Iodid 47 durch den Ersatz des vorherigen DCM/DIM Gemisches durch reines DIM von 15 % auf akzeptable 50 % erhöht werden, was nicht nur Zeit, sondern auch zukünftige Chemikalienmengen einspart. Nicht nur hierbei, sondern auch bei der Nitrierung zu 61 oder auch der Oxidierung zu 63 war es von äußerster Wichtigkeit eine korrekte Temperaturkontrolle durchzuführen, da es sonst zu hohen Ausbeuteverlusten durch ungewollte Nebenreaktionen kommen konnte. Eine sehr interessante Beobachtung war die Kontrolle der Suzuki Miyaura-Kreuzkupplung durch die Anwendung verschieden starker Basen. Während schwache Basen wie KOAc nur zur Miyaura-Borilierung führten, begünstigten starke Basen wie K3PO4 die Suzuki Miyaura-Kreuzkupplung. Die Zusammenführung des Zucker Bausteins 36 und des Isoindolin-Bausteins 37 funktionierte sehr gut, sodass das Nukleotid 1 durch die Schützung der exozyklischen Amingruppe und Phosphorylierung des 3´-OH dargestellt werden konnte.
Die Synthese der 14mer DNA bzw. RNA Sequenzen mit den neuen Nukleotiden 1 und 2 funktionierten mit zufriedenstellenden Ausbeuten, nur die Abspaltung der Pac-Gruppe benötigte etwas harschere Bedingungen von 50 °C in 32 % Ammoniak über Nacht. Die photolabile Schutzgruppe in Strang (V) mDNA-Tetramethyl konnte nun abgespalten und das Nitroxid an Luft reoxidiert werden. Anhand von EPR-Spektren und einer HPLC Analyse ergab sich jedoch eine Abspalteffizienz von nur 70 %. Dies bedeutet, dass für künftige PELDOR Messungen eine Aufreinigung des Spaltgemisches zur Isolierung des Radikal-Strangs von Nöten ist.
Anhand des Schmelzpunkts der verschiedenen Duplexe wurde anschließend die mögliche Anwendung des Nukleotids weiter analysiert. Hierbei stellte sich heraus, dass der Benzolring sowohl in 2 als auch in 1 eine erhebliche Destabilisierung des Duplex erzeugte. Somit ist das neue photolabil geschützte Nukleotid als EPR Sonde in der Mitte von Sequenzen nur bedingt geeignet. Zukünftige Experimente könnten das neue Spin Label nicht in der Mitte, sondern an den Enden der Sequenzen ähnlich anderer Arbeiten[92,94,164] einbauen, wo die Destabilisierung eine geringere Auswirkung hat, oder die Sequenz für eine bessere Stabilisierung verlängern.[164] Bei ausreichenden Duplexstabilitäten könnten hiermit dann PELDOR Messungen durchgeführt werden. Ähnlich starre, sterisch anspruchsvolle Nukleotide zeigten auch ähnliche Schmelzpunkte für ihre Duplexe[120], dennoch wurden sie für weitere Markierungsexperimente verwendet. Hierbei handelte es sich jedoch nicht um EPR Sonden, sondern um Fluoreszenzmarker. Da auch das neue Spin-Label 1 ein großes π-System besitzt, könnte eine komplett neue Herangehensweise die Anwendung als Fluoreszenzmarker sein. Genaue Absorptionsmessungen müssten noch durchgeführt werden, jedoch zeigte das Spin Label sehr stark fluoreszierende Eigenschaften unter der UV-Lampe während der Säulenchromatographie. Hierbei würde die Synthese um einiges kürzer ausfallen, da das EPR-aktive Nitroxid nicht mehr benötigt wird und geschützt werden muss, was Zeit und Chemikalien spart.
Zusammenfassend wurde über eine 22-stufige Synthese ein neues photolabil geschütztes Spin-Label synthetisiert, in ein 14mer integriert, erfolgreich entschützt und mittels EPR-Spektroskopie vermessen. Schmelzpunktmessungen zeigten jedoch eine große Destabilisierung und deuten darauf hin, dass 1 und Nukleotide mit ähnlich Benzolringen nur eingeschränkt als EPR-aktive Nukleotide geeignet sind.