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Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.
Ziel dieser Dissertation war es, die biologische Rolle der Autophagie für die Entwicklung, Alterung und mitochondriale Qualitätskontrolle in dem Ascomyceten Podospora anserina zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Der Verlust einer funktionalen Autophagie-Maschinerie ist in P. anserina mit einem Defekt der Sporen-Entwicklung bzw. -Keimung charakterisiert.
2. Es konnten drei Methoden zur Untersuchung der Autophagie in P. anserina etabliert werden: 1) Die Verwendung eines Gfp::PaAtg8-Stamms ermöglicht die Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der Autophagosomen-Anzahl; 2) Die phänotypische Charakterisierung des PaAtg1-Deletionsstamms unter verschiedenen Stressbedingungen (z. B. Stickstoffmangel, Rapamycin) liefert Hinweise auf eine mögliche Autophagie-abhängige Stressadaption; 3) Die Verwendung des „GFPcleavage assays“ ermöglicht einen quantitativen Nachweis genereller und selektiver Autophagie (hier: Mitophagie).
3. In zwei voneinander unabhängigen Experimenten wurde ein altersabhängiger Anstieg der Autophagie für P. anserina demonstriert: Das Autophagie-Niveau nimmt in gealterten P. anserina-Kulturen zu. Gleichzeitig resultiert der Verlust der Autophagie in ∆PaAtg1 in eine reduzierte Lebensspanne. Unter Stressbedingungen (hier: Stickstoffmangel) wird dieser positive Einfluss der Autophagie auf die Lebensspanne im Wildtyp sogar noch verstärkt.
4. Der unerwartet „gesunde“ Phänotyp der PaSod3-Deletionsmutante ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Der Mitophagie wurde eine besondere Rolle als Kompensationsmechanismus für den Verlust von PaSOD3 zugeteilt, da das Mitophagie-Niveau in dieser Mutante erhöht ist. Am Beispiel dieser Mutante, für die ein erhöhter Superoxid-Ausstoß nachgewiesen wurde, konnte eine Dosis-abhängige Wirkung von ROS in P. anserina identifiziert werden. Eine geringe zelluläre ROSMenge verursacht eine mitohormetische Reaktion, die eine Induktion der Mitophagie zur Folge hat und sich positiv auf den Organismus auswirkt. Übersteigt die zelluläre ROS-Dosis einen kritischen Punkt, kommt es zur Induktion des autophagischen Zelltods und damit zum vorzeitigen Tod des Individuums.
5. Der Verlust der PaCLPXP-Protease führt zu Beeinträchtigungen in der Funktion und Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette. Dieses Defizit im Energiemetabolismus wird über eine Induktion der AOX, vor allem aber über eine ZUSAMMENFASSUNG 127 gesteigerte Autophagie kompensiert. Die deutlich verlängerte Lebensspanne der verschiedenen PaClpXP-Deletionsmutanten (∆PaClpX, ∆PaClpP und ∆PaClpXP) ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Interessanterweise konnte keine kompensatorische Funktion der Autophagie oder Mitophagie für den Verlust der mitochondrialen i-AAA-Protease PaIAP in P. anserina nachgewiesen werden.
Autophagie/Mitophagie stellt einen übergeordneten Qualitätskontrollmechanismus in P. anserina dar, der den Organismus sehr effektiv vor zellulären Schäden und Dysfunktionen bewahrt und einen positiven Einfluss auf die Alterung, Entwicklung und Energieversorgung einnimmt.
Lizards of Paraguay: an integrative approach to solve taxonomic problems in central South America
(2018)
Paraguay is located in the center of South America with drier and warmer climatic conditions in the western part of the country, and more temperate and humid in the eastern region. Biogeographically, Paraguay is a key spot in South America, where several ecoregions converge. In my study, I sampled most of the ecoregions of Paraguay. The main objective of my work is to solve taxonomic problems, identified through genetic barcoding analyses, in the central region of South America. To achieve this objective, I used selected taxa of the Paraguayan Squamata as models taking into consideration the crucial geographic position of the country, plus the scarce available genetic data of Paraguayan reptiles.
The collecting activities were performed in the framework of a barcoding inventory project of the Paraguayan herpetofauna and carried out mostly in rural areas searching for animals in different types of habitats using active search as the sampling technique.
For genetics, the extraction of DNA was performed with DNeasy® Blood & Tissue Kit of Qiagen® for sets of few samples, and the fiber glass plate protocol for sets of 96 samples. I assessed the quality of sequences after amplification in agarose gel electrophoresis. The first marker sequenced was 16S mtDNA, used for barcoding analysis. A DNA barcode is a genetic identifier for a species. Once a taxonomic problem was detected, I generate more gene sequences to target the issue.
All the analyses to test phylogenetic hypotheses (based on single genes or concatenated datasets) were performed under Maximum Likelihood and Bayesian approaches. To root the phylogenetic trees, I chose the available taxon (or taxa) most closely related to the respective studied group as outgroups. For the general tree of Paraguayan Squamata, based on barcodes of 16S, I chose Sphenodon punctatus.
I generated a total of 142 sequences of 64 species of Squamata from Paraguay (Appendix I). The final alignment of 615 bp comprised 249 samples. The best substitution model for the Barcoding dataset based on the gene 16S was GTR+G, according to the BIC.
To complement molecular evidence generated with the ML grouping of 16S barcodes, I took a morphological approach based on voucher specimens collected during fieldwork (usually the same specimens that I used for genetic analysis), supplemented by the revision of museum collections.
Summarizing my results, samples of Colobosaura exhibit large genetic distances, and accordingly I revalidated Colobosaura kraepelini (Appendix II). Tropidurus of the spinulosus group show two clades and among them there is little genetic and morphological variation, I synonymized T. tarara and T. teyumirim with T. lagunablanca, and T. guarani with T. spinulosus (Appendix III). I detected the presence of candidate species of Homonota, and I restricted the name H. horrida for Argentina, and described two new species of Homonota (Appendices IV and V), and a new species of Phyllopezus also in the Family Phyllodactylidae (Appendix VI).
In this work I present the most comprehensive analysis of genetic samples of Squamata from Paraguay. The results obtained here will be useful to help to clarify further taxonomic issues regarding the squamate fauna from the central region of South America. Moreover, the data generated for this study will have a positive impact in a larger geographic context, beyond Paraguayan borders.
Regarding the conservation of the Paraguayan reptiles, and considering the taxonomic changes accomplished here, it is important to note that many species lack legal protection. In Paraguay, the major problem for conservation is habitat loss due to extensive crop farming. Thus, currently, the protected areas are the best strategy for conservation of biodiversity in the country. However, many such areas face legal problems (e.g., lack of official measurements, management plans, forest guards, infrastructure, etc.) so that the maintenance of their biodiversity over time is not guaranteed.
In conclusion, in this study I present contributions on the taxonomy of mostly lizards from Paraguay. Due to lack of samples, I was not able to deal with a deep taxonomic revision of the country's snakes. Based on my results, I can argue that analyses of Xenodontini and Pseudoboini are currently a pressing research issue. This barcoding project may continue since some colleagues in Paraguay are interested in collaboration. Given that the sequenced specimens are yet a small portion of the actual diversity of Paraguay, it will be of utmost importance to continue and expand these studies that will further improve our taxonomic knowledge. Furthermore, it is desirable to have Paraguayan scientists not only involved, but to see them taking the lead of high quality taxonomic research.
Diatoms contribute largely to the total primary production of the ecosphere and are key players in global biogeochemical cycles. Their chloroplasts are surrounded by four membranes owing to their secondary endosymbiotic origin. Their thylakoids are arranged into three parallel bands and differentiation of thylakoid membranes into grana or stroma is not observed. The fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins act as the light harvesting proteins and play a role in photoprotection during excess light as well. The diatom genome encodes three different families of antenna proteins. Family I are the classical light harvesting proteins called "Lhcf". Family II are the red algae related Lhca-R1/2 proteins called "Lhcr" and family III are the photoprotective LI818 related proteins called "Lhcx".
All known Fcps have a molecular weight in the range of 17-23 kDa. They are membrane proteins and have shorter loops and termini compared to LHCs of higher plants and are therefore extremely hydrophobic. This makes the isolation of single specific Fcps using routine protein purification techniques difficult.
The purification of a specific Fcp containing complex has not been achieved so far and until this is done several questions concerning light harvesting antenna systems of diatoms cannot be answered. For e.g. Which proteins interact specifically? Are various Fcps differently pigmented? Which pigments interact with each other and how? Which proteins contribute to photosystem specific antenna systems? Can pure Fcps be reconstituted into crystals like LHCII proteins? In order to answer these questions specific Fcp containing complexes have to be purified. ...
Time-resolved spectroscopic analysis of fucoxanthin-chlorophyll proteins and isolated carotenoids
(2011)
The aim of this thesis was to elucidate the excitation energy transfer in the fucoxanthin-chlorophyll proteins (FCPs) isolated from the diatom Cyclotella meneghiniana in detail and to clarify the role of the different pigments contained. In a first step the excited state dynamics of the free pigments were studied by means of time-resolved absorption spectroscopy. The FCPs contain three different carotenoid species. Besides the main light-harvesting carotenoid fucoxanthin (fx) the xanthophyll cycle pigments diadinoxanthin (ddx) and diatoxanthin (dtx) are found in substoichiometric amounts. Fx is contained in an unusual carotenoid-to-chlorophyll ratio of about one. In case of ddx and dtx, changing the solvent polarity showed no significant effects on the absorption spectrum and the excited state dynamics were hardly influenced. In contrast, a solvent dependence is observed in the absorption spectrum and excited state dynamics of fx. The S1 lifetime depends strongly on the solvent polarity and an additional broad excited state absorption band red shifted compared to the S1 excited state absorption appears. The occurrence of the described features can be explained with an intramolecular charge transfer state, which is stabilized in a polar environment and appears only in carotenoids with a conjugated carbonyl group. Despite its rather short excited state lifetimes of less than 200 fs (S2) and 30-60 ps (S1), fx acts as a very efficient energy donor in the FCPs. The ultrafast energy transfer dynamics of the isolated proteins FCPa and FCPb were investigated in a comprehensive study using transient absorption in the visible and NIR spectral region complemented with polarized transient absorption spectroscopy. The excitation energy transfer was not influenced significantly by changing the light conditions during the growth, which yields an altered amount of ddx and dtx. It can be concluded that the contribution of the xanthophyll cycle pigments to the energy transfer is not significant. The altered oligomerization state results in a more efficient energy transfer for the trimeric FCPa, which is also reflected in different Chl a fluorescence quantum yields. Thus, an increased quenching in the higher oligomers of FCPb can be assumed. The observed dynamics change drastically for two different excitation wavelengths λ = 500 nm and λ = 550 nm, which both lead to the population of the S2 excited state of individual carotenoids, namely blue and red absorbing fx molecules. The differing absorption maxima result from distinct microenvironments within the protein. For FCPa an additional slow time constant of 25 ps was found after excitation at 500 nm. By means of polarized transient absorption spectroscopy applied to FCPa different transition dipole moments for the S1 and the ICT state of fx could be identified. Based on the presented studies a detailed model explaining the excitation energy transfer pathways could be developed. In agreement with the faster overall transfer rate which is also evident in the anisotropy data in case of 550 nm excitation, upon excitation at 500 nm one slow transfer channel is active. It can be attributed to a blue absorbing fx not strongly associated with a Chl a molecule. Most likely excitation energy transfer takes place between the S1/ICT states of two different fx molecules before the energy is transferred to Chl a. Additional transient absorption experiments with an improved time resolution were performed to investigate the oscillations observed. These coherent effects superimposed the kinetics of isolated carotenoids as well as FCPs within the first 500 fs. The oscillations showed a very unusual damping behavior and vanished already after two oscillation periods. In case of fx, the solvent environment as well as the excitation wavelengths had an influence on the oscillations. The frequencies of the oscillations were 70-100 cm^-1 for fx in solvents with varying polarity and 50-80 cm^-1 for the FCPs. These results could further confirm the assumption that the red absorbing fx molecules are located in a more polar environment within the protein compared to the blue absorbing fx. To clarify the origin of the oscillations in more detail, further experiments with a controlled chirp of the applied pulses and comparison between different carotenoids in various solvents are required. This approach promises to give further insight in the excited state dynamics and to answer the question whether dark states are involved. Right now, the coherent excitation of the strongly coupled excited states 1Bu+ (S2) and 1Bu- resulting in electronic quantum beats and the existence of an additional short lived excited state absorption (S2-SN2) in the visible spectral region are the most reasonable explanations for the occurrence of the coherent effects in the transient absorption spectra of carotenoids.
Light is one of the most important abiotic factors for plant physiological processes. In addition to light intensity, the spectral quality of light can also influence the plant morphology and the content of secondary metabolites. In the horticultural industry, artificial light is used in to enable year-round production of herbs, ornamental plants and vegetables in winter terms.
Until today, discharge lamps like high-pressure sodium (HPS) lamps, emitting predominantly orange and red light and high amounts of infrared radiation, are the most common lamp systems in greenhouses. In the last decades, light-emitting diodes (LEDs) emerged as an efficient alternative light source. LEDs have the advantage of distinct adjustments to the light spectrum. For a usage in horticultural industry LEDs are often too expensive. Furthermore, reduced plant growth can occur due to incorrectly adjusted light spectra and lower leaf temperatures caused by the lack of infrared radiation.
In a research project (LOEWE, funding no. 487/15-29) funded by the Hessen State Ministry of Higher Education, Research and Arts, Microwave plasma lamps (MPL) were tested as new light sources for horticultural industry and plant research. The electrodeless lamp systems emit light in similar properties like sun light. The aim of the study was to determine the influence of artificial sunlight of the MPL on the accumulation of secondary metabolites, plant architecture and plant physiology of three different species (coleus, basil and potted roses). The MPL was compared with other light systems such as commercial HPS lamps, LEDs or ceramic metal halide lamps (CDM). In addition to morphological parameters such as plant height, internode length or fresh and dry weight, the phenolic content of leaves grown under the respective light sources were examined.
Overall an increased far-red light content in the emission spectra of the MPL showed high influence on the plant architecture which was observed in all three plant species. Artificial sunlight from MPL induced stem elongation in coleus and basil plants, compared to the other tested light sources. In potted roses a reduced branching degree was observed under MPL light compared to HPS grown plants.
In addition to the impact of far-red light also the blue light content of the emission spectra was found to be a strong influencing factor for plant physiological processes. A positive correlation between blue light content and leaf thickness was determined in coleus cultivated under MPL, LED, HPS and CDM lamps. Low blue light content in HPS emission spectra resulted in shade-adapted leaves with low photosynthetic capacity and susceptibility to high irradiances. Blue light was assumed to increase phenolic metabolites in basil and rose leaves. Furthermore, the different light treatments resulted in an alteration of the composition of essential oils of basil.
Experiments with coleus plants demonstrated that besides light color also the infrared radiation, had an influence on secondary metabolites by causing different leaf temperatures. Coleus plants grown with MPL showed the lowest content of phenolic compounds such as rosmarinic acid per dry weight. Infrared radiation resulted in a faster plant development indicated by increased biomass production and higher leaf formation rate as observed in coleus and basil plants.
The results obtained in this study show that the influence of leaf temperature should always be considered when comparing different lamp systems. Especially when LEDs are compared to discharge lamps an overestimation of light color can be a consequence since also infrared radiation influences the content of phenolic compounds and plant growth.
Reaktive Sauerstoffspezies lösen molekular Schäden aus und werden als möglicher Auslöser des Alterungsprozesses gesehen. Sie sind allerdings auch wichtige Signalgeber, deren Einfluss in den letzten Jahren immer mehr Beachtung findet. Im der vorliegenden Arbeit wurde die Signalwirkung von ROS auf das Alternsmodell P. anserina untersucht. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden.
1. Die H2O2–Konzentration im Extrazellularraum und im Cytoplasma steigt bei PQ-Stress und während des Alterns an.
2. Bei PQ-Stress und während des Alterns treten Ähnlichkeiten der globalen Transkriptregulation auf, die vermutlich durch die angestiegene H2O2-Konzentration ausgelöst werden.
3. Die Transkriptmenge von SODs und die Gesamt-SOD-Aktivität sind bei PQ-Stress leicht herunterreguliert. Transkripte für PaCCP1 und PaCATB treten dagegen bei PQ-Stress vermehrt auf und auch die Gesamt-Katalase-Aktivität steigt an. Dies deutet darauf hin, dass der Fokus des enzymatischen Abbaus von ROS bei PQ-Stress nicht im Abbau von Superoxid-, sondern von Wasserstoffperoxid liegt.
4. Bei PQ-Stress steigt die Transkriptmenge von Schlüsselgenen der Carotinoid-Biosynthese.
5. Transkripte von mitochondrial lokalisierten Proteinen werden bei PQ-Stress stark hochreguliert, die Menge an Mitochondrien nimmt allerdings nicht zu. Dies deutet auf einen verstärkten Abbau mitochondrialer Proteine, gefolgt von einer Neusynthese hin.
6. Bei PQ-Stress sinkt die Expression von Genen, die für den Kupferimport benötig werden. Dies wird höchstwahrscheinlich durch die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors GRISEA ausgelöst. Es kommt zu einem Kupfermangel, der eine verstärkte alternative PaAOX-abhängige Atmung auslöst und dafür sorgt, dass kupferabhängige Prozesse, wie die Melanin- und Sterigmatocystin-Synthese transkriptionell herunterreguliert werden. Durch die verringerte Transkriptmenge von Kupferimportern bei PQ-Stress kommt es zu starken Gemeinsamkeiten in der globalen Genregulation von PQ-gestressten Kulturen und der Kupfer-depletierten Mutante grisea.
7. Kupfer und PQ haben einen synergistisch negativen Effekt auf Wuchsrate und Lebensspanne von P. anserina. Bei hohen Kupfer und Superoxid-Konzentrationen kommt es vermutlich zur verstärkten Bildung von Hydroxyl-Radikalen, wodurch molekulare Schäden entstehen. Durch eine verringerte Kupferkonzentration wird der Organismus bei PQ-Stress möglicherweise vor der Bildung von Hydroxyl-Radikalen geschützt.
Insgesamt haben die Untersuchungen gezeigt, dass ROS wichtige Signalmoleküle sind, die einen starken Einfluss auf die Regulation von Transkripten haben. Viele dieser transkriptionellen Regulationen führen zu physiologischen Veränderungen. Der Fokus der Regulationen liegt unter den verwendeten Bedingungen im Schutz vor den schädlichen Effekten von ROS.
Octanoic acid (C8 FA) is a medium-chain fatty acid which, in nature, mainly occurs in palm kernel oil and coconuts. It is used in various products including cleaning agents, cosmetics, pesticides and herbicides as well as in foods for preservation or flavoring. Furthermore, it is investigated for medical treatments, for instance, of high cholesterol levels. The cultivation of palm oil plants has surged in the last years to satisfy an increasing market demand. However, concerns about extensive monocultures, which often come along with deforestation of rainforest, have driven the search for more environmentally friendly production methods. A biotechnological production with microbial organisms presents an attractive, more sustainable alternative.
Traditionally, the yeast Saccharomyces cerevisiae has been utilized by mankind in bread, wine, and beer making. Based on comprehensive knowledge about its metabolism and genetics, it can nowadays be metabolically engineered to produce a plethora of compounds of industrial interest. To produce octanoic acid, the cytosolic fatty acid synthase (FAS) of S. cerevisiae was utilized and engineered. Naturally, the yeast produces mostly long-chain fatty acids with chain lengths of C16 and C18, and only trace amounts of medium-chain fatty acids, i.e. C8-C14 fatty acids. To generate an S. cerevisiae strain that produces primarily octanoic acid, a mutated version of the FAS was generated (Gajewski et al., 2017) and the resulting S. cerevisiae FASR1834K strain was utilized in this work as a starting strain.
The goal of this thesis was to develop and implement strategies to improve the production level of this strain. The current mode of quantification of octanoic acid includes labor-intensive, low-throughput sample preparation and measurement – a main obstacle in generating and screening for improved strain variants. To this end, a main objective of this thesis was the development of a biosensor. The biosensor was based on the pPDR12 promotor, which is regulated by the transcription factor War1. Coupling pPDR12 to GFP as the reporter gene on a multicopy plasmid allowed in vivo detection via fluorescence intensity. The developed biosensor enabled rapid and facile quantification of the short- and medium-chain fatty acids C6, C7 and C8 fatty acids (Baumann et al., 2018). This is the first biosensor that can quantify externally supplied octanoic acid as well as octanoic acid present in the culture supernatant of producer strains with a high linear and dynamic range. Its reliability was validated by correlation of the biosensor signal to the octanoic acid concentrations extracted from culture supernatants as determined by gas chromatography. The biosensor’s ability to detect octanoic acid in a linear range of 0.01-0.75 mM (≈1-110 mg/L), which is within the production range of the starting strain, and a response of up to 10-fold increase in fluorescence after activation was demonstrated.
A high-throughput FACS (fluorescence-activated cell sorting) screening of an octanoic acid producer strain library was performed with the biosensor to detect improved strain variants (Baumann et al., 2020a). For this purpose, the biosensor was genomically integrated into an octanoic acid producer strain, resulting in drastically reduced single cell noise. The additional knockout of FAA2 successfully prevented medium-chain fatty acid degradation. A high-throughput screening protocol was designed to include iterative enrichment rounds which decreased false positives. The functionality of the biosensor on single cell level was validated by adding octanoic acid in the range of 0-80 mg/L and subsequent flow cytometric analysis. The biosensor-assisted FACS screening of a plasmid overexpression library of the yeast genome led to the detection of two genetic targets, FSH2 and KCS1, that in combined overexpression enhanced octanoic acid titers by 55 % compared to the parental strain. This was the first report of an effect of FSH2 and KCS1 on fatty acid titers. The presented method can also be utilized to screen other genetic libraries and is a means to facilitate future engineering efforts.
In growth tests, the previously reported toxicity of octanoic acid on S. cerevisiae was confirmed. Different strategies were harnessed to create more robust strains. An adaptive laboratory evolution (ALE) experiment was conducted and several rational targets including transporter- (PDR12, TPO1) and transcription factor-encoding genes (PDR1, PDR3, WAR1) as well as the mutated acetyl-CoA carboxylase encoding gene ACC1S1157A were overexpressed or knocked out in producer or non-producer strains, respectively. Despite contrary previous reports for other strain backgrounds, an enhanced robustness was not observable. Suspecting that the utilized laboratory strains have a natively low tolerance level, four industrial S. cerevisiae strains were evaluated in growth assays with octanoic acid and inherently more robust strains were detected, which are suitable future production hosts.
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The growing number of infections with multi-resistant bacteria or the current COVID-19 pandemic put compounds with therapeutic properties into the public focus. Non-ribosomal peptides (NRPs) are natural products that are already marketed as antibiotics, cytotoxic agents or immunosuppressants. Their biological activities rely on the structural diversity including non-proteinogenic amino acids (AAs), heterocycles or modifications like methylation or acylation.
The biosynthesis of NRPs is carried out by non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs). These multifunctional megaenzymes show a modular architecture like in an assembly-line. Each module is thereby responsible for the incorporation and modification of one AA and therefore contains different catalytic domains. The adenylation (A) domain recognizes and activates its specific substrate in an ATP-dependent manner which is transferred to a 4’-phosphopantetheine cofactor post-translationally attached to the thiolation (T) domain. Peptide bond formation between two T domain bound substrates catalysed by the condensation (C) domain transfers the growing peptide chain to the following module. Such a C-A-T module can be extended with optional domains to integrate structural diversity and a terminal thioesterase (TE) domain usually releases the peptide via hydrolysis or intramolecular attack of nucleophiles. Inspired by the modular architecture, NRPS engineering deals with the modification of NRPs in order to increase biological activities, circumvent bacterial resistances or create de novo peptides. This can be achieved by mutasynthesis or modification of the substrate binding pocket as well as single and multiple domain substitution. However, the few successful approaches led to impaired enzymes and did not establish a general applicable guideline. In the first publication as part of this work, the development of such a guideline comprising three rules is addressed. First, the A-T-C tridomain named exchange unit (XU) is seen as a catalytic unit instead of a module. When using them as building blocks, the C domain’s specificity for the AA of the following XU has to be considered as second rule. Third, a conserved WNATE motif within the C-A linker depicts the fusion point of the XUs. Upon heterologous expression of the cloned plasmids in E. coli and high performance liquid chromatography coupled mass spectrometry-based analysis of the extracts, the ambactin-producing NRPS from Xenorhabdus was reprogrammed with one and two XUs. This only leads to a moderate loss of production titre or an even higher one when the AA configuration was changed by introducing a dual condensation/epimerization (C/E) domain. The pentamodular GameXPeptide-producing NRPS was reconstructed using up to five XUs of four different NRPSs and even completely de novo synthetases were created. The second publication describes the exchange unit condensation domain (XUC) concept and relies on a fusion point between the two subdomains (N-terminal CDsub and C-terminal CAsub) of the C domain’s V-shaped pseudodimeric structure which generates A-T didomains with flanking CAsub and CDsub. These hybrid C domain-forming building blocks depict an improvement to the XU concept by avoiding the drawback of C domain specificity. This allows a more flexible NRPS engineering that can e.g. enable peptide library design. Furthermore, beside a combination of both concepts within one NRPS and a transfer to Bacillus NRPSs, the use of XUC with relaxed A domain specificity allowed further peptide modifications by introducing non-natural AAs. The third publication deals with aldehyde and alcohol-generating reductase (R) domains which depict an alternative for peptide release in NRPSs. A promoter exchange in X. indica identified a pyrazine-producing NRPS with a minimal architecture of an A, T and R domain and was therefore termed ATRed. R domains were additionally used in engineered NRPSs to produce pyrazinones and derivatives thereof by XU substitution although most constructs failed to show production. Beyond that, an R domain has been shown to replace a TE domain in wild type synthetases leading to slightly modified NRPs and the postulated biosynthesis was incidentally revised. Furthermore, an NRPS with terminal R domain was engineered to produce a free peptide aldehyde, which are known to be potent proteasome inhibitors. For the above mentioned ATReds, the presence of up to three coding regions was further identified in 20 different Xenorhabdus strains but only six of them were verified to produce pyrazines. All ATReds share variable sequence similarities among each other and were subsequently divided into three subtypes. One subtype is supposed to perform the pyrazine biosynthesis via a non-canonical catalytic triad.
Die oxygene Photosynthese bildet den Grundpfeiler des heutigen Ökosystems unseres Planeten. Neben den gut untersuchten Landpflanzen bilden Mikroalgen eine äußerst bedeutende Organismengruppe der phototrophen Lebewesen. Zu den Mikroalgen zählen die Diatomeen, welche sich beispielsweise durch eine Silikatschale und spezielle Lichtsammelkomplexe auszeichnen und für einen Großteil der marinen Primärproduktion verantwortlich sind. Die stoffwechselphysiologischen Grundlagen des ökologischen Erfolgs der Kieselalgen sind bislang noch unzureichend erforscht. Ein Vertreter der zentrischen Diatomeen, Cyclotella, wurde bereits zur Jahrtausendwende zur biochemischen Charakterisierung der Diatomeen Photosynthese verwendet (Eppard und Rhiel, 1998; Eppard und Rhiel, 2000), das Genom des Organismus aber erst vor kurzem sequenziert (Traller et al., 2016). Die Sequenzierung des Genoms konnte einige Gene für Lichtsammelproteine identifizieren, die Homologie zu den LhcSR-Proteinen aus C. reinhardtii aufweisen, welche nachweislich eine photoprotektive Funktion besitzen (Peers et al., 2009). Diese sogenannten Lhcx-Proteine der Diatomeen sind in den zwei Gruppen der Kieselalgen, den zentrischen und pennaten Diatomeen zu finden, unterscheiden sich aber in ihren jeweiligen Lhcx-Kandidaten. So können in der pennaten Diatomee P. tricornutum vier lhcx-Gene ausgemacht werden, während die zentrische Kieselalge T. pseudonana sechs lhcx-Gene besitzt und C. cryptica vier verschiedene lhcx-Kandidaten genomisch aufweist (Armbrust et al., 2004; Bowler et al., 2008; Traller et al., 2016). Die beschriebenen Diatomeen weisen alle eine Homologie im Lhcx1 auf, während sich die übrigen Lhcx-Kandidaten zwischen pennaten und zentrischen Diatomeen unterscheiden. Ein zwischen T. pseudonana und C. cryptica konserviertes Lhcx ist das Lhcx6_1, welches 2011 das erste Mal massenspektrometrisch an Photosystemen von T. pseudonana nachgewiesen wurde (Grouneva et al., 2011) und in weiteren Massenspektrometrie-gestützten Untersuchungen in beiden zentrischen Diatomeen an Photosynthese-Komplexen gefunden werden konnte (Gundermann et al., 2019; Calvaruso et al., 2020). Die Funktion des Lhcx6_1 ist bislang unklar.
Diese Arbeit konnte das Lhcx6_1 aus C. meneghiniana charakterisieren und Antikörper-gestützt genauer lokalisieren, eine nicht dynamische Phosphorylierung der Thylakoidmembran-Proteine der zentrischen Diatomee nachweisen und die molekularbiologische Zugänglichkeit des Organismus optimieren. qRT-PCR gestützte Expressions-Analysen konnten eine unerwartete Expression des lhcx6_1-Gens aufdecken. Dieses weist, im Vergleich zum Lhcx1, keine Starklicht induzierte Expression auf. Die Expression des Gens konnte nach wenigen Stunden Schwachlicht als maximal bestimmt werden, während sie im Starklicht abnimmt. Das Muster der Genexpression glich im Schwachlicht eher der des lhcf1-Gens. Die Sequenzierung des lhcx6_1 aus C. meneghiniana identifizierte eine verlängerte N-terminale Sequenz des Proteins, welche Homologie zu den minoren Antennen aus A. thaliana besitzt und Teil des reifen Proteins ist. Mittels eines C-terminalen Epitops wurde ein Antikörper gegen das Lhcx6_1 entworfen, welcher das Protein in C. meneghiniana spezifisch nachweisen kann. Die Isolation von Thylakoidmembranen der zentrischen Diatomee und weitergehende Aufreinigung mittels Saccharosedichtegradienten und lpBN-PAGE konnten die Lokalisation des Lhcx6_1 eingrenzen. Das Protein zeigt dabei keine Unterschiede in seiner Lokalisation nach Inkubation in Schwach-, Stark- und Fernrot-Licht und ist vorrangig mit Photosystem I assoziiert. In geringerer Menge konnte es zudem an Photosystem II nachgewiesen werden, während der immunologische Nachweis in Lichtsammelkomplexen (FCPs) minimale Mengen erbrachte. Ferner konnte eine Phosphorylierung des Lhcx6_1 an Threonin-Resten nachgewiesen werden, während die meisten anderen Thylakoidmembran-Proteine mittels Phospho-Serin Antikörper detektiert werden konnten. Weder die Phosphorylierung des Lhcx6_1, noch der anderen Thylakoidmembran-Proteine, zeigt eine dynamische Regulation, im Stile einer state-transition ähnlichen Kinase auf. Die Qualität des Umgebungslichts führte zu keinerlei Unterschieden in Phosphorylierungsmustern. Weiterführende Untersuchungen der Lhcx6_1-Phosphorylierung mittels Phos-tag PAGE identifizieren eine unphosphorylierte und eine einfach phosphorylierte Form des Proteins. Dabei kann an PSI ausschließlich die phosphorylierte Version des Lhcx6_1 gefunden werden. Im Zuge der Arbeit konnte zudem erstmalig die Elektroporation und Konjugation für C. meneghiniana als Transformations-Methoden etabliert werden, während das Protokoll für die biolistische Transformation optimiert wurde. Die Elektroporation erbrachte die höchste Transformationseffizienz. Molekularbiologische Unterfangen eines Lhcx6_1-Knockdowns mittels Antisense-RNA erzielten zunächst, aufgrund der starken Gegenregulation der Diatomee, keinen Erfolg...