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Disruption of the complex gastrointestinal ecosystem between the resident microflora and the colonic epithelial cells has been associated with increased inflammation and altered cell growth. Possible endpoints of this disturbance are IBD and CRC. The data presented in this thesis, entitled "PPARgamma as molecular target of epithelial functions in the gastrointestinal tract", shed further light on the underlying molecular mechanisms contributing to the well ordered homeostasis of this gastrointestinal ecosystem. Except for elucidating important roles for mesalazine and the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN in a) the modulation of cellular growth, b) the induction of APs, and c) the control of NFkappaB signalling in CRC cells, the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma und VDR as "gatekeepers" in these intricate regulatory mechanisms were established. Future work will be engaged in analysing whether these in vitro findings are also physiologically relevant in regard to prevention and therapy of gastrointestinal diseases. Within the scope of this work, in Paper I and II it could be demonstrated that butyrate and mesalazine act via PPARgamma to induce their anti-proliferative and pro-apoptotic actions along the caspase signalling pathway. Activation of the intrinsic and extrinsic signalling trail and the down-regulation of anti-apoptotic proteins are responsible for increased caspase-3 activity caused by butyrate. In contrast, mesalazine merely activates this cascade via the extrinsic trail and the IAPs. Moreover, a signal transduction pathway leading to increased cell death via p38 MAPK - PPARgamma - caspase-3 in response to butyrate was unveiled. In addition, there is strong evidence that mesalazine-mediated pro-apoptotic and growth-inhibitory abilities are controlled by PPARgamma-dependent and -independent mechanisms which appear to be triggered at least in part by the modulation of the tumor suppressor gene PTEN and the oncoprotein c-myc, respectively. In Paper III and IV the induction of the APs HBD-2 and LL-37 in response to the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN was pinpointed. Regarding the molecular events of this regulation, the data presented in this thesis provide strong evidence for the involvement of VDR in HBD-2- and LL-37-induced gene expression, while the participation of PPARgamma was excluded. Moreover, the role for p38 MAPK and TGF-beta1 in the up-regulation of LL-37 caused by butyrate was established. In contrast, SFN-mediated induction of HBD-2 is modulated via ERK1/2 signalling. The findings in Paper V clearly refer to the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma and VDR in butyrate-mediated suppression of inducible NFkappaB activation dependent on the stimulated signalling pathway caused by LPS or TNFalpha. Moreover, an inhibitory role for VDR in the regulation of basal NFkappaB activation was revealed. On the contrary, a modulating role for PPARgamma on basal NFkappaB could be debarred. Altogether the data presented in this thesis not only provide new insights in the understanding of the fundamental gastrointestinal physiology regulated by nuclear hormone receptors, but also may offer opportunities for the development of potential drug targets and therapeutic strategies in the treatment of IBD and CRC.
Crohn´s disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are idiopathic inflammatory disorders. Environmental factors, infectious microbes, ethnic origin, genetic susceptibility, and a dysregulated immune system can result in mucosal inflammation. However, the etiology of both CD and UC still remains largely unclear. Inflammatory bowel diseaserelated animal models suggest that a combination of genetic susceptibility factors and altered immune response driven by microbial factors in the enteric environment may contribute to the initiation and chronification of the disease. The intestinal immune system represents a complex network of different lymphoid and non-lymphoid cell populations as well as humoral factors. In inflammatory bowel disease, the controlled balance of the intestinal immune system is disturbed at all levels. In CD, naïve T cells preferably differentiate into Th1 or Th17 producing cells, while in UC, these cells differentiate into aberrant Th2 cells. Overall, in active inflammatory bowel disease effector T cell activity (Th1, Th17, Th2) predominates over regulatory T cells. Animal models of intestinal inflammation are indispensable for our understanding of the pathogenesis of CD and UC. When chosen appropriately, these models proved to be a helpful tool to investigate pathophysiological mechanisms, as well as to test emerging therapeutic options in the preclinical phase. 2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) and oxazolone are the two major chemicals applied to induce Th1- and Th2-skewed intestinal inflammation, respectively. Colitis can be induced in susceptible strains of mice by intrarectal instillation of the haptenating substances TNBS or oxazolone in ethanol, which is necessary for an initial desintegration of the epithelial barrier. TNBS or oxazolone are believed to haptenize colonic autologous or microbiotic proteins rendering them immunogenic to the host immune system. While TNBS administration in the presence of ethanol results in a transmural infiltrative disease in the entire colon based on an IL-12/IL-23 driven, Th1-or Th17 mediated response, oxazolone instillation finally leads to a colitis caused by a polarized Th2 IL-13-dominated lymphocyte response. Rectal oxazolone instillation in ethanol produces a more superficial inflammation that affects the distal half of the colon rather than the whole colon. Therapeutic modulation of the disturbed immune response in patients with inflammatory bowel disease still represents a complex challenge in the clinic. Currently, none of the therapeutic measure are disease specific and they generally target the pathophysiology downstream of the driving immunpathology. So, there is still the need to develop a tailored approach to prevention of the initiation and perpetuation of the inflammatory cascade before tissue injury occurs. One important aspect of this approach might involve the induction or re-establishment of immunological tolerance. FTY720 following rapid phosphorylation to FTY-P by endogenous sphingosine kinases acts as a sphingosine-1-phosphate (S1P) receptor agonist and represents the prototype of a new generation of S1P receptor modulators. While changing currently its proposed mode of action still focus on the fact, that FTY720 effectively inhibits the egress of T-cells from lymph nodes, thereby reducing the number of antigen-primed/restimulated cells that re-circulate to peripheral inflammatory tissues. However, recent studies indicate, that its immunomodulatory properties might be more complex and exerted not only via interactions with other S1P receptor subtypes but also via a direct modulation of the inflammatory capacity of dendritic cells (DC) resulting in a modified regulation of T cell effector functions as well as in an induction of regulatory T cells and function. 1,25(OH)2D3, the active form of vitamin D, is a secosteroid hormone that has in addition to its central function in calcium and bone metabolism pronounced immune regulatory properties. The biological effects of calcitriol are mediated by the vitamin D receptor (VDR), a member of the superfamily of nuclear hormone receptors. A number of studies identified calcitriol/VDR as prominent negative regulators of Th1-type immune responses, whereas Th2 responses are not affected or even augmented. These effects have been mainly explained by direct activities on lymphocytes, subsequent studies clearly supported a role of calcitriol in modulating monocyte differentiation or DC maturation. However, to translate the immunosuppressive capacities of calcitriol into an effective immunointervention, a great challenge was the design of structural analogs of calcitriol that are devoid of adverse effects related to hypercalcemic activity. The intense study of the 25-oxa series generated a large number of calcitriol analogs exhibiting substantial dissociation between possible immunomodulatory capacities and undesired hypercalcemia. Especially, the combination of the 22-ene modification with the 25-oxa element as realized in ZK156979 yielded a very promising set of new analogs for further characterization in animal models resembling human autoimmune diseases. So, the overall aim of the studies presented here was to evaluate strategies of enhancing regulatory immunity in mouse models of Th1- and Th2-mediated colitis as a new therapeutic approach. To this end we used FTY720, 22-ene-25-oxa vitamin D (ZK156979), as well as the combination of calcitriol and dexamethasone to evaluate the respective pro-tolerogenic potential in intestinal inflammation models in mice. First, to induce Th1-mediated colitis a rectal enema of TNBS was given to Balb/c mice. FTY720 was administered i.p. from day 0-3 or 3-5. FTY720 substantially reduced all clinical, histopathologic, macroscopic, and microscopic parameters of colitis analyzed. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a down-regulation of IL-12p70 and subsequent Th1 cytokines. Importantly, FTY720 treatment resulted in a prominent up-regulation of FoxP3, IL-10, TGFβ and CTLA4. Moreover, we observed a significant increase of CD25 and FoxP3 expression in isolated lamina propria CD4+ T cells of FTY720-treated mice. The impact of FTY720 on regulatory T cell induction was further confirmed by concomitant in vivo blockade of CTLA4 or IL-10R which significantly abrogated its therapeutic activity. Thus, our data provide new and strong evidence that besides its well-established migratory properties FTY720 down-regulates proinflammatory signals while simultaneously inducing the functional activity of CD4+CD25+ regulatory T cells. In a second approach, the rectal instillation of oxazolone yielded a Th2-mediated colitis. Treatment with FTY720 prominently reduced the clinical and histopathologic severity of oxazolone-induced colitis, abrogating body weight loss, diarrhea, and macroscopic and microscopic intestinal inflammation. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a prominent reduction of the key Th2 effector cytokines IL-13, IL-4 and IL-5. Moreover, FTY720 inhibited GATA3 and T1/ST2 expression, which represent distinct markers for Th2 differentiation and Th2 effector function. Thus, our data are supportive for the view that FTY720 exhibits beneficial prophylactic as well as therapeutic effects in Th2-mediated experimental colitis by directly affecting Th2 cytokine profiles, probably by reducing GATA3 and T1/ST2. Recently, we described 22-ene-25-oxa-vitamin D (ZK156979) as a representative of a novel class of low calcemic vitamin D analogs showing prominent immunomodulative capacities. Here, we used the Th1-mediated TNBS colitis to test its anti-inflammatory properties in vivo. We found that treatment with ZK156979 clearly inhibited the severity of TNBS-induced colitis without exhibiting calcemic effects. Both early and late treatment abrogated all the clinical macroscopic and microscopic parameters of colitis severity; in addition we observed a clear down-regulation of the relevant Th1 cytokine pattern including the T-box transcription factor, T-bet. On the other hand, application of ZK156979 increased local tissue IL-10 and IL-4. Finally, as a new approach we evaluated the pro-tolerogenic potential of calcitriol and dexamethasone in acute Th1-mediated colitis. Calcitriol and/or dexamethasone were administered i.p. from day 0-3 or from day 3-5 following the instillation of the haptenating agent. The combination of these steroids most effectively reduced the clinical and histopathologic severity of TNBS colitis. Th1-related parameters were down- while Th2 markers like IL-4 and GATA3 were up-regulated. Clearly distinguishable from known steroid effects calcitriol in particular promoted regulatory T cell profiles as indicated by a marked increase of IL-10, TGFß, FoxP3 and CTLA4. Furthermore, analysis of DC mediators responsible for a pro-inflammatory differentiation of T cells revealed a clear reduction of IL-12p70, and IL23p19 as well as IL-6 and IL-17. Thus, our data suggest the concept of a steroid-sparing application of calcitriol derivatives in inflammatory bowel disease. Furthermore, the data presented suggest that early markers of inflammatory DC and Th17 differentiation might qualify as new target molecules for both calcitriol as well as for selective immune modulating vitamin D analogs. In conclusion the data of these published investigations added to the substantial progress in understanding the biology of tolerogenic DC and regulatory T cells with respect to their roles in health and disease achieved in the past years. This has led to an increasing interest in the possibility of using DC and regulatory T cells as biological therapeutics to preserve and restore tolerance to self antigens and alloantigens. Especially DC may be helpful to exert their important roles in directing tolerance and immunity by modulation of subpopulations of effector T cells and regulatory T cells. The data demonstrated in the present studies may assist to define the divergent implications of new therapeutic concepts for the treatment of inflammatory bowel disease, especially with regard to a possible auspicious impact on pro-tolerogenic DC and regulatory T cell functions. However, further studies are needed to fulfil our understanding of the complex immunomodulatory profiles of FTY720 as well as of calcitriol and its low calcemic analog ZK156979, thus accelerating their entry into the clinic as new therapeutic options for the cure of inflammatory bowel disease.
Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
Die 5-LO ist ein Schlüsselenzym der LT-Biosynthese. Sie katalysiert in einem ersten Schritt zunächst die Umsetzung freigesetzter AA zu 5-HPETE und wandelt diese anschließend in LTA4 um. LT sind starke Entzündungsmediatoren, die an entzündlichen und allergischen Reaktionen des Körpers beteiligt sind. Sie lösen eine Immunantwort aus und können zur Entstehung von Asthma bronchiale, allergischer Rhinitis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und verschiedenen Krebserkrankungen beitragen [28]. NFS gehören zur Klasse der michaelreaktiven Verbindungen und inhibieren die 5-LO durch Interaktion mit katalytisch aktiven Cysteinresten in der Nähe der Substrateintrittspforte. Diese Tatsache macht michaelreaktive Verbindungen innerhalb der Entzündungsforschung zu einer interessanten Substanzklasse. Michaelreaktive Verbindungen besitzen eine durch Elektronenzug aktivierte Doppelbindung. Hierdurch verfügen diese Wirkstoffe über elekrophile Eigenschaften, wodurch sie leicht mit Nukleophilen reagieren können. Cysteine bestehen aus nukleophilen Thiolgruppen, die mit einer positiv polarisierten Doppelbindung, wie sie in michaelreaktiven Verbindungen vorliegt, reagieren können. Diese Tatsache kann sie zu effektiven und nachhaltigen Enzymaktivitätsmodulatoren machen. In dieser Arbeit wurde eine große Bandbreite verschiedenster michaelreaktiver Verbindungen auf ihre Fähigkeit untersucht, die 5-LO über Michael-Addition an ihren Cysteinen zu inhibieren. Zum einen wurden Pflanzeninhaltsstoffe mit antiinflammatorischen Eigenschaften, zugelassenene Wirkstoffe mit Michael-Akzeptorfunktion und zum anderen Verbindungen, die durch gezielte Struktursuche ausgewählt wurden, untersucht. Die Testung verschiedenster Strukturen sollte Aufschluss über strukturelle Voraussetzungen für die 5-LO-Inhibition durch Interaktion mit Cysteinen liefern. Hierfür wurden die Substanzen zunächst im intakten Zellsystem und schließlich am aufgereinigten Enzym (r5LO-wt) auf ihre 5-LO-inhibierenden Eigenschaften untersucht. Nachfolgende Messungen an r5LO-4C, deren vier prominente Cysteine durch Serin mutiert wurden, zeigten an, ob die Inhibition der 5-LO-Produktbildung cysteinabhängig war. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ganz bestimmte strukturelle Eigenschaften des Michael-Akzeptors, Voraussetzung für eine Interaktion mit den Cysteinen der 5-LO sind. Vor allem Verbindungen mit chinoidem Grundgerüst stellten sich als thiolreaktive Verbindungen heraus, die die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibierten. Weiterhin zeigten die erhaltenen Ergebnisse, dass die strukturelle Umgebung um die aktivierte Doppelbindung des Michael-Akzeptors enorme Auswirkungen auf die Thiolreaktivität hatte. TQ hemmte die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit Cysteinen, wohingegen die 5-LO-Inhibition durch Embelin unabhängig von Cysteinen zu sein schien. Eine daraufhin durchgeführte MALDI-MS-Analyse bestätigte die Bindung von NAPQI und TQ an die Cysteine 416 und 418. Durch diese Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass eine Reihe antiinflammatorisch wirksamer, natürlich vorkommender Verbindungen wie TQ, Plumbagin, Primin und auch synthetisch generierte Verbindungen wie AA861, CDDO, Methyl-BQ, Methoxy-BQ, Methoxy-Nitrostyren, NAPQI und OH-BQ die 5-LO über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibieren.
I-kappaB-Kinase epsilon - ein neues Zielprotein für die Pharmakotherapie bei Schmerz und Entzündung?
(2010)
Der Transkriptionsfaktor NF-kappaB spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Immunantworten, Apoptose und Entzündungen sowie bei der Entstehung und Verarbeitung von Schmerzen. Ein pharmakologischer Eingriff in die NF-kappaB-Aktivierungskaskade könnte daher eine Schmerzhemmung bewirken und so Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien für pathophysiologische Schmerzen liefern. Die NF-kappaB-Signalübertragungskaskade bietet verschiedene Angriffspunkte für Pharmaka, wobei zurzeit IkappaB Kinasen (IKK) als hoffnungsvolle Zielmoleküle im Fokus der Untersuchungen stehen. Verschiedene IKKs regulieren die Aktivität von NF-kappaB über die Phosphorylierung des inhibitorischen Proteins IkappaB oder über die direkte Phosphorylierung von NF-kappaB. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der neu entdeckten IKK epsilon bei der Schmerzentstehung und -verarbeitung sowie deren Eignung als neues Zielmolekül für die Schmerztherapie näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass IKK epsilon konstitutiv in Geweben der Maus, welche an der Entstehung und Verarbeitung von Schmerzen beteiligt sind, exprimiert ist. Im Rückenmark konnte die Lokalisation von IKK epsilon in den schmerzrelevanten Laminae I und II des Dorsalhorns nachgewiesen werden und auch in den Hinterwurzelganglien (Dorsal Root Ganglia (DRG’s)) war IKK epsilon in kleinen, nozizeptiven Neuronen exprimiert. Nach peripherer entzündlich-nozizeptiver Stimulation mit Formalin oder Zymosan kam es im Lumbalmark und den DRG’s zu einem signifikanten Anstieg der IKK epsilon-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Diese Beobachtungen machten eine Beteiligung von IKK epsilon an der Prozessierung von Schmerz sehr wahrscheinlich. Um die Rolle von IKK epsilon während der Schmerzentstehung und -verarbeitung besser beurteilen zu können wurde das Verhalten von IKK epsilon defizienten Mäusen in akuten und inflammatorischen Schmerzmodellen charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass der Knockout von IKK epsilon zu einem signifikant verringerten nozizeptiven Verhalten im Formalintest und einer Hemmung der mechanischen Hyperalgesie nach Zymosaninjektion im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen führte. Gleichzeitig konnte kein Unterschied im akut nozizeptiven Verhalten festgestellt werden. Der Knockout von IKK epsilon hatte demnach keine Auswirkung auf den akuten physiologischen Nozizeptorschmerz, zeigte jedoch eine Verbesserung bei pathophysiologischen Schmerzen. Das verringerte nozizeptive Verhalten der IKK epsilon defizienten Mäuse im Formalintest ging mit einer Hemmung der NF-kappaB-Aktivierung im Rückenmark einher. Auch konnte eine verringerte mRNA-Expression der NF-kappaB-abhängigen Gene Cyclooxygenase-2 (COX-2), Matrixmetalloprotease-9 (MMP-9) und induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), die an der Regulation von Entzündungsschmerzen beteiligt sind, im Rückenmark und den DRG’s nachgewiesen werden. Da IKK epsilon bisher hauptsächlich mit der Aktivierung des TypI Interferon-Signalweges in Zusammenhang gebracht wurde, wurde außerdem geprüft, ob es nach Injektion mit Formalin zu einer Aktivierung des Trankriptionsfaktors Interferon-regulierender Faktor (IRF)-3 in Wildtyp-Mäusen kommt, was nicht beobachtet werden konnte. Der Knockout von IKK epsilon scheint demnach seine antinozizeptive Wirkung direkt über eine fehlende Aktivierung von NF-kappaB zu entfalten, wonach IKK epsilon eine bedeutendere Rolle als bisher angenommen bei der Aktivierung von NF-kappaB spielt. Dies konnte durch in vitro Daten untermauert werden. Der Knockdown von IKK epsilon in Makrophagen-Zellkultur mit spezifischer siRNA verhinderte die Phosphorylierung von NF-kappaBp65 am Serinrest 536 nach Stimulation mit LPS. Anhand der vorliegenden Daten lässt sich also schlussfolgern, dass IKK epsilon an der Schmerzentstehung und verarbeitung bei Entzündungen beteiligt zu sein scheint. Eine Hemmung dieser Kinase könnte demnach ein neues, lohnendes Ziel für die Entwicklung neuer Medikamente für die Schmerztherapie sein.
Ibuprofen gehört zu den am meisten verwendeten nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) und ist in niedriger Dosierung von 200-400 mg als sogenanntes OTC (over the counter) Analgetikum frei erhältlich. Obwohl es in den meisten Fällen als razemische Mischung aus S- und R-Ibuprofen verabreicht wird, ist mittlerweile auch das reine S-Ibuprofen (Dexibuprofen) als Medikament erhältlich. Während S-Ibuprofen ein potenter COX-Inhibitor ist, zeigt R-Ibuprofen in den klinisch relevanten Konzentrationen keine COX-Hemmung. Seit längerem ist bekannt, dass NSAIDs bei einer kontinuierlichen Einnahme über mehrere Jahre die Initiierung und Proliferation von Tumoren hemmen. Die Hemmung der Cyclooxygenase wird dabei als ein wichtiger Mechanismus für die antikarzinogene Wirkung angesehen, doch für viele NSAIDs sind auch schon COX unabhängige Mechanismen beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung zweier Tumorzelllinien mit unterschiedlicher COX-2 Expression und dem Einsatz von beiden Ibuprofen Enantiomeren untersucht, inwieweit COX unabhängige Mechanismen für die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen verantwortlich sind. Sowohl die COX-2 defizienten HCT-15 als auch die COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen wurden durch Behandlung mit S- oder R-Ibuprofen in ihrer Proliferaton gehemmt. Dabei führte die Behandlung mit S- und R-Ibuprofen für 24 h zu einem G1-Zellzyklusblock und nach 72 h zu einem signifikanten Anstieg von apoptotischen Zellen, was im Western-Blot Assay durch eine verminderte Cyclin A und B Expression, einer erhöhten Expression des Zellzyklusinhibitors p27KIP1 und PARP-Spaltung bestätigt wurde. Dabei zeigten beide Enantiomere in den Tumorzellen eine gleich starke antiproliferative und apoptotische Wirkung. Eine Messung der intrazellulären S- und R-Ibuprofen Konzentrationen ergab außerdem, dass in den verwendeten Tumorzellen keine unidirektionale Konfigurationsinversion von R- zu S-Ibuprofen stattgefunden hat. In den COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen waren die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen schwächer ausgeprägt als in den HCT-15 Zellen, was jedoch auf eine niedrigere intrazelluläre S- bzw. R-Ibuprofen Konzentration zurückzuführen war. Diese Ergebnisse zeigen auf jeden Fall, dass COX unabhängige Mechanismen bei der antikarzinogenen Wirkung von S- und R- Ibuprofen eine Rolle spielen. Dass auch COX abhängige Mechanismen an der antikarzinogenen Wirkung von Ibuprofen beteiligt sind, konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Abnahme an PGE2 nach S-Ibuprofen Behandlung in den COX-2 exprimierenden Tumorzellen beobachtet. In welchem Ausmaß aber die COX Hemmung an der antikarzinogenen Wirkung von S-Ibuprofen in den COX-2 exprimierenden (Hemmung der PGE2 Synthese) und möglicherweise auch in den COX-2 defizienten Zellen (Anstieg an Arachidonsäure und daraus resultierend an Ceramid) beteiligt war, konnte anhand der Ergebnisse nicht geklärt werden. Es kann jedoch angenommen werden, dass S-Ibuprofen zumindest in den COX exprimierenden HCA-7 Zellen sowohl über COX Hemmung als auch über COX unabhängige Mechanismen antiproliferativ und apoptotisch wirkt. Auch im Tumormodell der Maus wurde bei einer täglichen i.p. Applikation von 15 mg/kg S- oder R-Ibuprofen eine Hemmung des Tumorwachstums beobachtet. Dabei betrug die unidirektionale Inversion von R- zu S-Ibuprofen ca. 54 %. Die Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen führte in beiden Zelllinien außerdem zu einer Akkumulation des Tumorsuppressors p53, der an der Regulierung von Zellzyklus und Apoptose beteiligt ist. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht, ob S- und R-Ibuprofen die Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 und dessen Zielgene vermitteln. Verwendet wurde eine HCT-116 Zelllinien, in der beide p53 Allele durch homologe Rekombination inaktiviert waren (p53-/-). Im Gegensatz zu den HCT-116 p53wt Zellen führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53 defizienten Zellen zu keinem signifikanten G1-Zellzyklusblock und auch die Apoptoserate war in diesen Zellen deutlich geringer als in p53wt Zellen. In vivo zeigte eine tägliche i.p. Injektion von 15 mg/kg S- bzw. R-Ibuprofen bei den Mäusen mit p53-/- Tumoren keine signifikante Wachstumshemmung. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HCT-116 p53wt Tumore durch die R-Ibuprofen Behandlung signifikant gehemmt, und auch die mit S-Ibuprofen behandelten Tieren zeigten deutlich kleinere Tumore als die Gruppe mit den p53 defizienten Tumoren. Nach der Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde in beiden HCT-116 Zelllinien eine erhöhte Expression des Membranrezeptors p75NTR beobachtet. Außerdem führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53wt Zellen, im Gegensatz zu den p53 defizienten Zellen, zu einer vermehrten Bax Expression und einem Anstieg an Bax Protein in der mitochondrialen Fraktion. Schließlich wurde gezeigt, dass die erhöhte p53 Konzentration in den Zellen zumindest teilweise über den p75NTR Rezeptor reguliert wird, da durch die externe Zugabe des Liganden NGF die Ibuprofen induzierte Akkumulation von p53 in den HCT-116 p53wt Zellen wieder aufgehoben wurde. Da in vitro in den HCA-7 Zellen nicht nur die Behandlung mit S-Ibuprofen, sondern auch die mit R-Ibuprofen zu einer Hemmung der PGE2 Synthese führte, wurde im dritten Teil der Arbeit die Wirkung von S- und R-Ibuprofen auf die Expression der PGE-Synthasen und auf die mPGES-1 Aktivität untersucht. Dabei wurden HeLa Zellen verwendet, deren mPGES-1 Expression durch die Zugabe von IL-1ß und TNF-alpha stimmuliert wurde. Nach gleichzeitiger Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde keine Inhibierung der mPGES-1, mPGES-2 oder cPGES Expression beobachtet. Auch die Enzymaktivität von mPGES-1 wurde weder durch die Inkubation mit S-Ibuprofen noch mit R-Ibuprofen beeinflußt. Die bei der Inkubation mit R-Ibuprofen auftretende Hemmung der PGE2 Synthese konnte in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend erklärt werden und bietet somit einen interessanten Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen.
LC-MS/MS-Systeme haben sich in den vergangenen Jahren trotz der hohen Anschaffungskosten von mehreren hunderttausend Euro zu einer Standardmethode in analytischen Laboratorien entwickelt und bieten im Vergleich zu herkömmlicher HPLC mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren eine höhere Sensitivität und bessere Selektivität. Aufgrund dieser Vorteile war es das Ziel dieser Arbeit, verschiedene LC-MS/MS-Methoden zu entwickeln, mit der Eicosanoide sensitiv und selektiv in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten quantifiziert werden können und diese Assays dann in biologischen Fragestellungen einzusetzen. Ein Problem der Eicosanoidanalytik mittels LC-MS/MS besteht in der Strukturähnlichkeit vieler Prostaglandine, die große Schwierigkeiten während einer Methodenentwicklung verursachen. Zwei sehr wichtige Prostaglandine, PGE2 und PGD2, besitzen das gleiche Fragmentspektrum und können nicht über das Selektionsprinzip des Tandem-Massenspektrometers quantifiziert werden, sondern müssen vor der Detektion chromatographisch getrennt werden. Die chromatographischen Bedingungen, die für eine Trennung von PGE2 und PGD2 nötig sind, gehen allerdings mit einem erheblichen Empfindlichkeitsverlust des Massenspektrometers einher. Die beste Empfindlichkeit wurde mit einem neu entwickelten Säulenmaterial, Synergi Hydro-RP, erreicht, was in allen entwickelten Methoden verwendet wurde. Zur Quantifizierung von PGE2 und PGD2 in Mikrodialysaten (max. Volumen 75 µl) musste eine Empfindlichkeit von mindestens 40 pg/ml PGE2 erreicht werden. Nach der Validierung des Systems konnte eine Quantifizierungsgrenze von PGE2 und PGD2 von 25 pg/ml bzw. 50 pg/ml erreicht werden. Bei Formalin-behandelten Ratten stieg PGE2 innerhalb von 15 Minuten auf 380 pg/ml an, womit frühere Ergebnisse, die auf der Verwendung von Immunoassays basieren, bestätigt werden konnten. Für PGD2 konnte kein Unterschied zu Kontroll-Ratten festgestellt werden und ist deswegen im Gegensatz zu PGE2 nicht an der Nozizeption im untersuchten Modell beteiligt. Mit Hilfe des mPGES-1-Enzym-Assays wurde mPGES-1 als ein weiteres Target für die drei COX-Inhibitoren Celecoxib, R- und S-Flurbiprofen identifiziert. Da mit Celecoxib ab einer Konzentration von 100 µM keine weitere Hemmung der mPGES-1 erreicht werden kann, hemmt Celecoxib die mPGES-1 wohl nicht kompetitiv und bindet nicht im katalytischen Zentrum der mPGES-1. Für Rofecoxib und Paracetamol konnte keine Hemmung der mPGES-1 festgestellt werden. Während der Methodenentwicklung wurde ein Störpeak zwischen PGE2 und PGD2 beobachtet, der in den Versuchen immer im gleichen Verhältnis zu PGE2 gebildet wurde. Mit Hilfe eines Fingerprints wurde dieser Störpeak als 5-trans-PGE2 identifiziert, welches ein bisher nicht beschriebenes Nebenprodukt der mPGES-1 zu sein scheint. In der letzten Methode sollte eine Methode entwickelt werden, mit der PGE2, PGD2, PGF2alpha, 6-keto-PGF1alpha und TXB2 in Humanplasma bestimmt werden können. Im direkten Vergleich war die validierte LC-MS/MS-Methode einem handelsüblichen Immunoassay überlegen. Zum einem waren die Standardabweichungen der LC-MS/MS-Methode wesentlich niedriger und zum anderen waren die Basalwerte des Immunoassays unphysiologisch hoch. In einer Studie wurde der Einfluss einer Mutation (-765G -> C) im Promotor der COX-2 auf die COX-2-Aktivität untersucht, für die eine reduzierte COX-2-Expression um den Faktor 2 in Monozyten beschrieben wurde. Zwischen den 2 Gruppen konnten weder in den Prostaglandin-Konzentrationen, der COX-2-mRNA-Expression noch in der COX-2-Protein-Expression statistische Unterschiede festgestellt werden und stehen damit im Widerspruch zu bisherigen Veröffentlichungen. Die entwickelten LC-MS/MS-Methoden ermöglichen eine bessere Sensitivität und schnellere Analysenzeiten im Vergleich zur HPLC und durch ihre gute Sensitivität kann der Einsatz von problematischen Immunoassays vermieden werden. Im Falle der Mikrodialysemethode, wo PGE2 in einer relativ einfachen Matrix bestimmt werden sollte (ACSF), liefert die LC-MS/MS-Methode die gleichen Ergebnisse. Im Falle von Humanplasma ist der Immunoassay allerdings unbrauchbar. Ein weiterer Vorteil der LC-MS/MS-Methoden gegenüber Immunoassays besteht darin, dass mehrere Prostaglandine in einer einzigen Probe bestimmt werden können. Gegenüber GC-MS und GC-MS/MS-Methoden fehlt den LC-MS/MS-Methoden zwar einiges an Empfindlichkeit, allerdings wird hierfür keine Derivatisierung benötigt.
Bei inflammatorischen Schmerzen kann durch Hemmung der COX-2 im Rückenmark die zentrale Sensibilisierung reduziert werden. Da die Hemmung der gesamten COX-2 vermittelten Prostaglandinsynthese jedoch zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen verursacht, wird in jüngster Zeit diskutiert, ob eine selektive Hemmung der PGE2 Synthese auf Ebene der mPGES-1 für die Therapie passagerer Schmerzen sinnvoller ist. Um die funktionellen Rollen von COX-2 und mPGES-1 im Rückenmark zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit die Folgen einer COX-Inhibierung und mPGES-1-Deletion auf den spinalen Eicosanoidmetabolismus, die neuronale Erregbarkeit, die Synthese proinflammatorischer Zytokine und das nozizeptive Verhalten untersucht. Das proinflammatorische Zytokin TNFa induzierte in primären Rückenmarksneuronen eine COX-2- und mPGES-1-Expression und eine erhöhte PGE2 Synthese. Diese Induktion der PGE2 Synthese konnte durch den selektiven COX-2 Inhibitor Rofecoxib und den „selektiven COX-1 Inhibitor“ SC-560 gleichermaßen potent gehemmt werden. Da der Effekt von SC-560 unerwartet war, wurde sein Wirkmechanismus genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen weder die COX-2 und mPGES-1 Expression, die PLA2 Aktivität, die mPGES-1 Aktivität noch den PGE2 Transport hemmte. Durch Experimente mit Zellen aus COX-1-/- Mäusen konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen die COX-2 unabhängig von COX-1 in nanomolaren Konzentrationen inhibiert. Da dieses Ergebnis den postulierten COX-1-selektiven Eigenschaften von SC-560 widersprach, wurde nach der Ursache für den Verlust der COX-1-Selektivität gesucht. Es zeigte sich, dass SC-560 in einer zellfreien in vitro Synthese und im Vollbluttest mit klarer Selektivität COX-1 hemmt. In kultivierten Rückenmarkszellen, RAW-Makrophagen und Blutzellen (Monozyten und Thrombozyten) inhibiert SC-560 allerdings d beide COX-Isoformen potent. Es wurde dadurch deutlich, dass die zelluläre Einbindung von COX-2 sowie ein niedriger Proteingehalt im extrazellulären Medium die halbmaximalen Konzentrationen (IC50) für die COX-2-Hemmung durch SC-560 stark reduzieren kann und hierdurch die COX-1-Selektivität der Substanz verloren geht. Neben einer COX-2 Hemmung verursachte auch eine mPGES-1-Deletion in Rückenmarkskulturen sowie im adulten Rückenmark eine Reduktion der PGE2 Synthese. Überrachenderweise bewirkte jedoch die mPGES-1-Defizienz im Gegensatz zur COX-2 Hemmung durch Etoricoxib im Zymosanmodell keine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie. Um die Ursache für die unterschiedliche antihyperalgetische Wirkung der COX-2-Hemmung und mPGES-1-Deletion zu finden, wurden zunächst die Konsequenzen für die gesamte Prostaglandinsynthese untersucht. Die Analyse mittels LC-MS/MS zeigte, dass im Rückenmark mPGES-1-defizienter Mäuse verstärkt PGI2, PGF2a und PGD2 synthetisiert wird. Da für alle drei Prostaglandine bereits pronozizeptive Effekte beschrieben wurden, wurde die Expression von den entsprechenden Rezeptoren im Rückenmark und die Konsequenzen der Rezeptoraktivierung auf die neuronale Erregbarkeit untersucht. Mittels „calcium imaging“ wurde demonstriert, dass selektive IP Rezeptoragonisten in Rückenmarksneuronen eine PKA und PKC vermittelte Phosphorylierung der NMDA Rezeptoren verursachen und die Aktivierbarkeit der NMDA Rezeptoren sensibilisieren. Eine Verstärkung des NMDA induzierten Calciumeinstromes konnte nach Applikation der anderen Prostaglandine nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen daher, dass in mPGES-1-defizienten Mäusen durch die Umleitung der Prostaglandinsynthese zu Prostacyclin die exzitatorischen NMDA Rezeptoren sensibilisiert und hierdurch die antihyperalgitische Wirkung von PGE2-Synthesehemmung kompensiert werden kann. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen schlussfolgern, dass mPGES-1 als Zielmolekül für die Schmerztherapie eher nicht eignet ist. mPGES-1-defiziente Tiere zeigten in inflammatorischen Schmerzmodellen ein normales nozizeptives Verhalten. Dies kann dadurch erklärt werden, dass es nach einer mPGES-1 Deletion im Rückenmark zwar zur Reduktion der PGE2 Synthese aber auch gleichzeitig zur verstärkten Synthese anderer pronozizeptiv wirkender Prostaglandine kommt.
Das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) spielt eine essentielle Rolle in der Biosynthese der Leukotriene, bioaktiver Metabolite der Arachidonsäure (AA), die an einer Vielzahl entzündlicher und allergischer Erkrankungen beteiligt sind. Die 5-LO wird bevorzugt in Zellen myeloiden Ursprungs wie Granulozyten, Monozyten oder B-Lymphozyten exprimiert. In die Regulation der zellulären 5-LO-Aktivität in der Epstein-Barr Virus-transformierten B-lymphozytären Zelllinie BL41-E95-A sind Caspasen, Aspartat-spezifische Cysteinproteasen, involviert. Das Passagieren von BL41-E95-A führt zu einer Erhöhung der Proliferationsrate der B-Lymphozyten sowie zu einem deutlichen Verlust der 5-LO-Aktivität, der mit dem Auftreten eines 62 kDa-Spaltproduktes der 5-LO und einer signifikanten Aktivitätserhöhung der Caspase-8 und -6 korreliert. Isolierte humane 5-LO wird durch rekombinante Caspase-6 zwischen Asp170 und Ser171 zu einem 58 kDa-Fragment in vitro gespalten, wobei das Tetrapeptid VEID170 innerhalb der 5-LO als Erkennungsmotiv für den Angriff der Caspase-6 dient. In einigen weiteren untersuchten Zelllinien wie Mono Mac 6 (MM6), RBL-1, PMNL oder HeLa, die nicht den B-Lymphozyten angehören, konnte die 5-LO-Spaltung weder durch das Passagieren von Zellen noch durch die Behandlung mit diversen proapoptotischen Agentien ausgelöst werden. Laut Ergebnissen aus in vitro-Untersuchungen scheinen 5-LO-positive HeLa- bzw. MM6-Zellen einen Faktor zu exprimieren, der die 5-LO direkt oder indirekt vor dem Angriff der Caspase-6 und anschließender Prozessierung schützt. Die in den BL41-E95-A-Zellen beobachtete Aktivierung der Caspasen mit anschließender Prozessierung der 5-LO lässt sich durch zwei Pflanzeninhaltsstoffe supprimieren, das Hyperforin (HP) aus Johanniskraut-Extrakten und das Myrtucommulon (MC) aus Myrte-Blättern. Beide Verbindungen scheinen in B-Lymphozyten zu einer Hemmung der Caspasen-Aktivierung zu führen. Nichtsdestotrotz führt die Behandlung der B-Lymphozyten mit HP bzw. MC zu einem apoptotischen Tod der Zellen. Offensichtlich wird dabei ein (unbekannter) einzigartiger Mechanismus der Apoptose-Induktion ausgelöst. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eine potente Apoptose-induzierende Wirkung des natürlich vorkommenden Myrtucommulons auf Krebszelllinien gezeigt werden. In allen getesteten Krebszelllinien führte Myrtucommulon zum Zelltod, wobei die HL-60-Zellen mit einem IC50-Wert von 3,26 ± 0,51 µM MC am sensitivsten gegenüber MC-Einfluss waren. Zusätzlich konnte in HL-60- und MM6-Zellen nach MC-Behandlung neben einer erhöhten Caspasen-Aktivität und PARP-Spaltung ein signifikanter DNA-Abbau detektiert werden. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die zytotoxische MC-Wirkung eine bemerkenswerte Selektivität für entartete Zelllinien zu besitzen scheint und gegenüber nicht-transfizierten Zellen minimal ist.
Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, beta und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, was zu einer verringerten Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, bera und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, wass zu einer verringerte Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.