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Um sich an ändernde Umwelteinflüsse und metabolische Bedürfnisse anpassen zu können, ist es für Zellen essenziell, dass Boten-RNA (engl. messenger RNA, mRNA) stetig und schnell nach der Translation abgebaut wird. In Prokaryoten ist dafür der Proteinkomplex Degradosom verantwortlich, in dem Endo- und Exoribonukleasen RNase E und PNPase das RNA-Transkript in kleinere Fragmente und schließlich einzelne Nukleotide spalten. Die DEAD-Box Helikase RhlB im Komplex dient zusätzlich dazu, mögliche Sekundärstrukturen in der RNA zu entfalten, welche sonst die weitere Degradation behindern würden. Es konnte gezeigt werden, dass RhlB’s sehr geringe katalytische Aktivität – gemessen durch ATP-Verbrauch und Rate an entwundener RNA – signifikant durch die allosterische Bindung an Komplexpartner RNase E erhöht wird. Gleichzeitig deuten andere Studien darauf hin, dass RhlB eine mögliche Selektivität für doppelsträngige RNA-Substrate mit 5‘-Einzelstrang-Überhängen aufweist.
Diese Arbeit liefert neue Erkenntnisse in Bezug auf die Kommunikation zwischen den Degradosom-Komponenten RhlB und RNase E aus E. coli, indem das potenzielle Wechselspiel zwischen RhlBs RNA-Selektivität und der allosterischen Aktivierung durch RNase E untersucht wurde. Der vielseitige Einsatz NMR-spektroskopischer Techniken sowie die Verwendung kurzer RNA-Substrate mit spezifischen Strang-Eigenschaften ermöglicht es, mit einen ungewöhnlichen, RNA-zentrierten Ansatz an diese unzureichend verstandene Protein-Interaktion heranzugehen.
Zunächst wurden hierzu eine Reihe kurzer doppelsträngiger RNA-Konstrukte hergestellt, die sich nicht nur in ihren Einzelstrang-Merkmalen unterscheiden, sondern auch die thermodynamischen Anforderungen eines DEAD-Box Helikase Substrats erfüllen, und gleichzeitig eine ausreichende NMR-spektroskopische Signal-Zuordnung erlauben. Die thermale Stabilität, das Faltungsverhalten sowie die 1H Imino-protonen- und 13C HSQC-Zuordnungen aller geeigneten Konstrukte wurden erfolgreich bestimmt.
Um den Einfluss spezifischer RNA-Substrate sowie die Bindung zweier verschiedener RNase E Fragmente auf RhlBs ATP-Umsatzrate zu untersuchen, wurde sich zunächst eines photometrischen Phosphat-Assays bedient. Damit konnte deutlich gezeigt werden, dass RhlB in Abwesenheit des Komplex-Partners nicht in der Lage ist, signifikante Mengen an ATP umzusetzen, unabhängig davon, welches RNA-Konstrukt eingesetzt wird. Die Bindung der RNase E Fragmente erhöhte signifikant die ATP-Hydrolyse-Rate der Helikase, wobei die größte Aktivierung für den RNA-Duplex mit 5‘-Einzelstrang sowie ein einzelsträngiges Substrat zu beobachten ist. Da diese Ergebnisse deutlich eine RNA-Abhängigkeit beim ATP-Umsatz der Helikase zeigen, wurde untersucht, ob diese Unterschiede ihren Ursprung bereits in der Bindung der spezifischen RNA-Substrate haben. Mittels einer Mischapparatur, die es erlaubt die enzymatische Reaktion direkt im Spektrometer zu initiieren sowie zeitaufgelöster 31P NMR-Experimente konnte die allosterische Aktivierung der ATP-Hydrolyse-Rate von RhlB auch unter NMR-spektroskopischen Messbedingungen nachgewiesen werden.
Da die Ergebnisse des ATPase Assays deutlich eine RNA-Abhängigkeit bei der ATP-Umsatz-Rate der Helikase zeigen, wurde zusätzlich untersucht, ob diese Unterschiede ihren Ursprung in den Affinitäten für die verschiedenen RNA-Substrate haben und ob diese durch die Bindung von RNase E and RhlB beeinflusst werden. Um im gleichen Zuge zu überprüfen, ob die Bindung der RNA an RhlB die RNA-Konformation oder Basenpaarung ändert, werden 1H NMR-Titrationsexperimente durchgeführt. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass RhlB eine inhärente Präferenz für Duplexe mit 5‘-Überhang gegenüber Konstrukten mit 3‘-Überhang oder stumpfen Enden besitzt, was sich in einer erhöhten Affinität zeigt. Zusätzlich offenbaren die Messungen, dass RNase Es allosterische Bindung selektiv die Affinität gegenüber Konstrukten mit Einzelstrang-Überhang erhöht, während die Affinität zu RNA Duplexen ohne Überhang sogar verringert wird. Diese Ergebnisse liefern erstmals einen Nachweis, dass RNase E aktiv Einfluss auf RhlBs RNA-Bindung nimmt. Weder die Bindung der RNA and RhlB noch an den RhlB/RNase E Komplex scheint die Basenpaarung oder Konformation der RNA-Substrate zu beeinflussen, da lediglich eine homogene Peak-Verbreitung aller Imino-Protonen-Signale im 1H NMR-Spektrum beobachtet werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der tonische BZR-Signalweg im Burkitt Lymphom näher untersucht werden. Ziel war die Identifizierung von Zielstrukturen, die für die Zellen essentiell für die Aufrechterhaltung des tonischen Signalwegs sind und gleichzeitig die Viabilität der Zellen fördern. Durch die Identifizierung noch unbekannter Zielstrukturen wäre man in der Lage, neue Behandlungsstrategien zu entwickeln oder bereits bestehende zu optimieren. Des Weiteren sollte die Signaltransduktion in der B-ALL, die über einen Vorläufer des BZRs, dem prä-BZR vermittelt wird, hinsichtlich eines tonischen Überlebenssignals untersucht werden.
Durch massenspektrometrische Analysen der tonischen BZR-Signaltransduktion im Burkitt Lymphom, die für die Viabilität der Zellen essentiell ist und die Ergebnisse eines Inhibitorscreens konnte HSP90 als potenzielle neue Zielstruktur im Burkitt Lymphom identifiziert werden.
So konnte gezeigt werden, dass Burkitt-Lymphom-Zellen nach Inhibition der Chaperonfunktion von HSP90 durch zwei auf dem Markt bereits verfügbare Inhibitoren einen Zellzyklusarrest erfahren, der letztlich zur Apoptose der Zellen führt. Dieser Effekt wurde auf einen Verlust des (tonischen) BZR-Signals zurückgeführt, der überwiegend durch den aktiven lysosomalen Abbau von SYK nach HSP90-Inhibition zustande kommt. Demnach führte die Überexpression einer HSP90-resistenten Variante von SYK (TEL-SYK) zu einer Aufhebung der apoptotischen Effekte nach HSP90-Inhibition. Zudem wurde SYK als Interaktionspartner von HSP90 (HSP90-Klientprotein) im Burkitt Lymphom und die für die Interaktion essentielle Phosphorylierungsstelle (pY197 in HSP90α bzw. pY192 in HSP90β) identifiziert bzw. validiert.
Das therapeutische Potenzial der HSP90-Inhibitoren im Burkitt Lymphom offenbarte sich ferner durch den Vergleich der Wirkungseffektivität in gesunden B-Zellen mit der in Tumorzellen. So zeigten HSP90-Inhibitoren eine erhöhte Affinität zu Tumorzellen. Bei verwendeten Konzentrationen der Inhibitoren, die bereits eine apoptotische Wirkung in Tumorzellen hervorriefen, waren gesunde B-Zellen resistent.
In der B-ALL konnte durch den Knockdown von CD79a und der Inhibition von SYK eine tonische Antigenrezeptor-Signalleitung identifiziert werden, die wie im Burkitt Lymphom über den PI3K/AKT-Signalweg vermittelt wird. Durch die Kombination der im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse und weiterführende Analysen (wie zum Beispiel durch Inhibitor- oder CRISPR/Cas-Screens) kann so eine Identifizierung von potenziellen Zielstrukturen mit therapeutischem Nutzen in der B-ALL erfolgen.
The post-transcriptional modification of the canonical nucleoside uridine into its rotational isomer pseudouridine occurs in non-coding as well as coding RNA and is the most abundant post-transcriptional modification in all kingdoms of life. While the occurrence of pseudouridine has been linked to the enhancement of stability and the codon-anticodon interaction in tRNAs, enhancement of the translation efficiency in rRNAs, regulatory functions in spliceosomal snRNA and nonsense codon suppression in mRNA, its exact role in many RNAs is still ambiguous. The uridine to pseudouridine isomerization can either be catalyzed by one of various standalone pseudouridylases or it can be performed in an RNA-guided manner by H/ACA ribonucleoproteins. In eukaryotes, the guide RNA always adapts a conserved bipartite, double-hairpin conformation. Each hairpin contains an internal RNA-loop motif, which can recruit a specific substrate RNA via base pairing. The catalytically active RNP is formed by the interactions of the guide RNA with four proteins. While Cbf5 forms the catalytically active center, Nop10 and Nhp2 perform auxiliary functions and Gar1 is involved in substrate turnover. Up until now, most structural knowledge about H/ACA RNPs has been derived from archaeal complexes, while the exact structure-function-relationships between RNA and proteins in eukaryotic RNPs is still ambiguous. While archaeal H/ACA RNPs share many similarities with eukaryotic RNPs and act as good model system, there are also many differences between them like eukaryotic specific protein domains as well as the overall bipartite complex structure, dictated by the snoRNA. Investigating pseudouridylation by eukaryotic H/ACA RNPs opens up a broad area of research and helps to gain a better understanding of this enzyme class – especially since malfunction of H/ACA RNPs has been linked to the genetic disease Dyskeratosis congenita as well as several types of cancer.
The main goal of this thesis was to gain new insights into the RNA/protein interactions in the eukaryotic snR81 H/ACA snoRNP from Saccharomyces cerevisiae on a structural as well as dynamical level. In the first part of this thesis, the main goal was to in vitro prepare a functionally active snR81 H/ACA RNP. The guiding snoRNA was prepared by in vitro transcription and purification, while the Saccharomyces cerevisiae proteins were recombinantly expressed from Escherichia coli. Apart from the full length, bipartite snR81 snoRNP, several sub-complexes of the RNP were reconstituted. Therefore, snoRNA constructs were designed and prepared, which only contained a single hairpin motif of the complex. Furthermore, snoRNA constructs in which the apical hairpin stem was replaced by a stable tetraloop were prepared, to investigate the influence of the apical stem on protein binding and activity. Also, for the eukaryotic proteins, a shortened version of Gar1 (Gar1Δ) was utilized, which lacks the eukaryotic specific RGG domains, that have been characterized as accessory RNA binding motifs. Reconstituted snoRNPs were utilized in catalytic activity assays, monitoring the turnover rate of uridine to pseudouridine. For this purpose, radioactively labeled substrate RNAs were prepared by phosphorylation and splinted ligation of oligonucleotides and were objected to reconstituted H/ACA RNPs under single as well as multiple turnover conditions. In the second part of this thesis, the RNA/protein interactions were dissected via single molecule FRET spectroscopy. Therefore, the snoRNA was labeled with an acceptor fluorophore via NHS ester/amine-reaction. Furthermore, the snoRNA contained a biotin-handle, allowing immobilization of the complex during the experimental time-window of the spectroscopic analysis. Eukaryotic specific protein Nhp2 was labeled with a donor fluorophore via “click” chemistry, which included the chemical synthesis and incorporation by genetic code expansion of non-canonical amino acids. The interactions of Nhp2 with the different snoRNA constructs (standalone-hairpins “H5” and “H3”, as well as hairpins lacking the apical binding motif “H5Δ” and “H3Δ”) were monitored on a single molecule level.
In summary, it was possible to gain new insights into the complex structure and the dynamical behavior of the still sparsely characterized eukaryotic H/ACA RNPs. Especially, new knowledge could be obtained about the hairpin specific behavior on the bipartite RNA complex structure, including the rather ambiguous role of the protein Nhp2 and the contribution of the eukaryotic specific features of Gar1 in their interaction with the guide/substrate RNA.
Photolabile Schutzgruppen haben sich im Laufe der letzten Jahre als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung und Regulation biologischer Prozesse etabliert. Dabei wird die photolabile Schutzgruppe auf geeignete Weise mit Biomolekülen verknüpft, sodass deren Funktion temporär deaktiviert wird. Durch Bestrahlen mit Licht geeigneter Wellenlängen wird die photolabile Schutzgruppe entfernt und die Aktivität des Biomoleküls bzw. des zu beobachtenden Prozesses wiederhergestellt. Die Grundlagen der Verwendung photolabiler Schutzgruppen im biologischen Kontext wurden in zwei Pionierarbeiten 1977 von J.W. ENGELS und 1978 von J.F. HOFFMAN gelegt. Davon ausgehend haben sich zahlreiche Anwendungen photolabiler Schutzgruppen für biologisch interessante Molekülklassen entwickelt. Auf dem speziellen Gebiet der Nukleinsäuren wurden in den letzten Jahren einige fundamentale Mechanismen entdeckt und aufgeklärt, die nicht zuletzt auch therapeutisch interessante Anwendungsmöglichkeiten für photolabile Schutzgruppen bieten. Hierbei stellt das An-/Aus-Schaltverhalten von Nukleinsäuren jedoch ein nicht-triviales Problem dar. Selbst der gezielte Einbau einer einzelnen photolabilen Schutzgruppe in ein multifunktionales Oligonukleotid führt in der Regel nämlich nicht zu einer vollständigen Deaktivierung dessen. Ein multipler Einbau photolabiler Schutzgruppen entlang der Sequenz eines funktionellen Oligonukleotids schaltet die Hintergrundaktivität im deaktivierten Zustand zwar vollständig aus, allerdings müssen in diesem Fall hohe Bestrahlungsintensitäten bzw. –dauern für das Entfernen aller photolabilen Modifikationen angewendet werden. Dadurch geht zum einen die Zeitauflösung der lichtgeschalteten Prozesse verloren, nicht zuletzt erhöht sich dabei aber auch das Risiko von lichtinduzierten Schäden am biologischen System. Das Kernthema der vorliegenden Dissertation war es daher, neue Architekturen für den Aufbau photoaktivierbarer Oligonukleotide zu entwickeln.
Das erste große Projekt basierte auf der Annahme, dass sich Duplexstrukturen, die für die Funktion vieler Nukleinsäuremechanismen fundamental sind, durch Zyklisierung von Oligonukleotiden global destabilisieren und damit effizienter photoaktivieren lassen, als durch lokalen Einbau einzelner photolabiler Schutzgruppen in Oligonukleotide. Hierzu wurden geeignete Alkin-Modifikationen an photolabile Nitrobenzyl- und Cumarin-Schutzgruppen angebracht und diese an die Nukleobasen verschiedener DNA-Bausteine geknüpft. Es ist daraufhin gelungen, Oligonukleotide mit je zwei photolabilen Alkin-Modifikationen herzustellen und diese intrasequentiell über eine Cu(I)-katalysierte Click-Reaktion mit einem Bisazid-Linker zu zyklisieren. Die so erhaltenen Oligonukleotide wiesen dramatisch erniedrigte Schmelzpunkte gegenüber den nativen Duplexen, sowie gegenüber den zweifach photolabil geschützten Oligonukleotiden auf. Dabei wurde außerdem festgestellt, dass Zyklisierungsparameter wie die Linkerlänge, -polarität und –flexibilität und die Wahl der photolabilen Schutzgruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Duplexstabilität hat. Über einen Bereich von Ringgrößen zwischen ca. 11-21 Nukleotiden wurden die niedrigsten Duplexstabilitäten beobachtet. Sehr kleine, sowie große Ringe ab 30 Nukleotiden wiesen dagegen höhere Stabilität auf.
Da mit dem entwickelten Zyklisierungskonzept auch mehrere Ringstrukturen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz aufgebaut werden können, wurde im nächsten Schritt eine photoaktivierbare Variante des C10-Aptamers hergestellt, welches selektiv gegen Burkitt’s Lymphomzellen bindet. Dieses 90-mer DNA-Oligonukleotid wurde an drei Stellen photolabil Alkin-modifiziert und infolge mit einem Trisazid-Linker zu einer bizyklisierten Struktur verknotet. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten konnte demonstriert werden, dass das durch eine solche „Photo-Klammer“ deaktivierte C10-Aptamer keine Bindungsaffinität gegenüber Burkitt’s Lymphomzellen aufweist, die Bindungsaktivität jedoch nach Belichten wiederhergestellt werden kann. Mit Atomkraftmikroskopie-Experimenten ist es darüber hinaus gelungen, die Photoaktivierung des verknäuelten C10-Aptamers mit molekularer Auflösung abzubilden. Mit diesem Ergebnis können nun lange funktionelle Oligonukleotide auf definierte Weise photoaktivierbar gestaltet werden, insbesondere auch dann, wenn keine (Informationen über) funktionelle Sekundärstrukturen existieren.
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Investigation of co-translational protein folding using cryo-EM and solid-state NMR enhanced by DNP
(2020)
Die zelluläre Proteinbiosynthese findet am Peptidyltransferase-Zentrum innerhalb der großen ribosomalen Untereinheit statt. Die neu synthetisierte Polypeptidkette passiert den ribosomalen Exit-Tunnel, der 80-100 Å lang und 10-20 Å breit ist. Proteinfaltung findet kotranslational statt, während die Peptidkette durch den ribosomalen Tunnel geschleust wird. Zu welchem Ausmaß die Proteine ihre native Struktur noch am Ribosom gebunden annehmen, steht im Fokus aktueller Studien. Verschiedene Methoden, die naszierende Proteinkette am Ribosom zu arretieren und die Faltung des Proteins untersuchen zu können, wurden entwickelt. Zur Herstellung von Ribosom naszierenden Proteinkomplexen (RNCs) in vivo werden Arrestierungspeptide (APs) verwendet. Ein oft genutztes AP ist die 17 Aminosäuren lange SecM Sequenz des E. coli Sekretionsmonitors, das C-Terminal an das zu untersuchende Protein kloniert werden kann und dadurch die Peptidkette am Ribosom behält. RNCs wurden mittels verschiedener Methoden untersucht, einschließlich Proteolyse-Experimenten, enzymatischen Aktivitätsmessungen, FRET, Cryo-EM und NMR-Spektroskopie. Alle Methoden zeigten auf, dass sich die Proteine kotranslational falten und auch am Ribosom eine funktionale Struktur annehmen können. Außerdem konnte eine Peptidkette eine α-Helix innerhalb des Ribosoms ausbilden. Ebenso wurden nicht-native kompakte Strukturen innerhalb der Vestibule detektiert.
Die Translation ist ein nicht-uniformer Prozess und der genetische Code degeneriert mit bis zu sechs Codons, die eine einzelne Aminosäure kodieren. Die Verteilung dieser synonymen Codons ist nicht zufällig und sie werden mit verschiedenen Frequenzen innerhalb eines ORFs verwendet. Codons mit einer höheren tRNA Häufigkeit werden schneller eingebaut als Codons, die seltener verwendet werden. Diese seltenen Codons sind häufig zwischen Proteindomänen oder Sekundärstrukturelementen platziert und könnten daher zur Separierung von Faltungsevents dienen. Dass der Austausch von synonymen Codons nicht ohne Folgen ist, zeigten verschiedene Studien. Buhr et al. (2016) zeigte, dass der synonyme Austausch die Translationsgeschwindigkeit, aber auch die Proteinkonformation des bovinen Augenlinsenproteins γB crystallin (GBC) beeinflusst. Während die unmodifizierte Gensequenz aus B. taurus in E. coli langsamer translatiert wurde und zu einem vollständig reduzierten GBC Protein (U) führte, wurde die harmonisierte Genvariante, die der Codon-Verwendung in E. coli angepasst war, schneller exprimiert und resultierte in einem teilweise oxidierten GBC Protein (H). Dieser Befund war der Ausgangspunkt für diese Doktorarbeit.
Die gemessenen Oxidationsunterschiede basieren auf der unterschiedlichen Translationsgeschwindigkeit der beiden Gensequenzen. Die N-terminale Domäne (NTD) des Zweidomänen-Proteins GBC enthält sechs der insgesamt sieben Cysteinreste. Nur in dieser Domäne wurde Oxidation detektiert und die drei Cysteine Cys18, Cys22 und Cys78 bilden eine Ansammlung mit einem Abstand von 5.4-6.4 Å. Um zu untersuchen, ob die Unterschiede bereits nach der Translation der NTD ausgebildet werden, wurde ein Ein-Domänen-Konstrukt hergestellt. Dieses Konstrukt beinhaltete die Aminosäuren 1-82, aber nicht den Peptidlinker, der beide Domänen verbindet. Allerdings wurden bei der Translation der ersten 70 Aminosäuren die meisten Translationspausen detektiert. Das 2D 1H-15N HSQC wies anhand der unterschiedlichen chemischen Verschiebung der Signale auf eine gefaltete Proteinstruktur hin. Daher konnte sich die NTD ohne Beteiligung der CTD eigenständig falten. Zugabe von DTT zu beiden Proteinvarianten U und H führte zu keinem messbaren Effekt. Im Gegensatz zu dem Volllängen-Protein, in dem die Variante H teilweise oxidiert war, war die NTD der Variante H vollständig reduziert.
Zusätzlich sollte geklärt werden, ob auch mögliche Disulfidbrücken im Inneren des Ribosoms ausgebildet werden können. Dann könnte in beiden Genvarianten eine anfängliche Disulfidbrücke ausgebildet werden und durch die unterschiedliche Translationsgeschwindigkeit die Disulfidbrücke in der langsamen Genvariante im E. coli Zytosol reduziert werden, während diese in der schneller translatierten Variante von der CTD geschützt wird. Um zu untersuchen, ob in der Tat Disulfidbrücken im ribosomalen Tunnel ausgebildet werden können, wurden GBC-Fragmente mittels der SecM Sequenz an das Ribosom arretiert und diese RNCs mittels theoretischer Simulation, Festkörper-NMR, Massenspektrometrie und Cryo-EM gemessen.
Theoretische Simulation mittels flexible-mecanno zeigten, dass der ribosomale Tunnel groß genug für die Ausbildung verschiedenster Disulfidbrücken ist. In einem U32SecM Konstrukt, das vier Cysteine und die SecM Sequenz beinhaltet, konnten alle theoretisch möglichen Disulfidbrücken gebildet werden.
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This PhD thesis is dedicated to the extension of the portfolio of nuclear magnetic resonance (NMR) methods to characterize ribonucleic acids (RNAs). Only within the last few decades it has been realized that the cellular role of RNA goes well beyond the central dogma of molecular biology. In fact, RNA takes part in numerous cellular processes, executes numerous functions and acts either as a single player or in larger complexes, mostly RNA-protein complexes (RNPs) such as the ribosome or the spliceosome. This versatility in RNA function is coupled to a structural variety and the ability to adopt multiple long-lived and intricate conformations. Due to this high molecular complexity special demands are placed on the methods that are required for RNA structural characterization. With the ability to capture dynamics at atomic resolution and to measure under close to native conditions, NMR spectroscopy is undoubtedly a prime method for this purpose.
A general introduction to the current state of research, selected achievements as well as challenges in the field of NMR spectroscopy on RNA is given in Chapter I. This thesis is further composed of three independent chapters covering the three separate projects, which form the main body of work within the course of this thesis.
The imino group found in two of the four RNA nucleobases is generally considered to be the most powerful reporter group in the process of the NMR spectroscopic characterization of RNA. Its resonance assignment provides key information for a rapid determination of the RNA’s secondary structure. This is possible, since the imino proton can only be detected, if it is protected from rapid solvent exchange through hydrogen bonding interactions or, in rare cases, steric shielding. Consequently, information on flexible regions of RNA that are not protected against solvent exchange cannot be derived using this NMR spy. It is a key finding of the thesis that nucleobase interactions can also be mapped through the amino groups, as they similarly take part in base pairing or RNA-ligand interactions. Notably, solvent exchange of the amino protons is always slower compared to the imino proton. Thus, 1H,15N resonances of the amino group can be detected even for dynamic regions of RNA. Moreover, focusing on characterizing amino groups of RNA nucleobases increases the number of available reporters as amino groups are present in three out of four RNA nucleobases.
However, there is a reason that up to work conducted in this thesis, amino groups have not been used for monitoring RNA nucleobases: the rate of the C-NH2 bond rotation is most often close to the chemical shift differences of the two non-identical amino proton resonances, in particular for guanosines and adenosines, amino resonances regularly remain elusive in NMR spectra. Therefore, we developed experiments that excite double quantum (DQ) coherences of the two amino group protons and that further utilize 13C-detection. Results on these experiments are discussed in Chapter II and show that the rotational exchange can be avoided by evolving double quantum instead of single quantum (SQ) coherence in the indirect dimension of a 13C-detected C(N)H-HDQC experiment. The new experiment enables the detection of a full set of sharp amino resonances. The advantages of this experiment are immediately apparent when comparing the number of observable imino resonances in a classic 1H,15N-HSQC spectrum with the number of amino resonances obtained in the 13C-detected C(N)H-HDQC spectrum of the same RNA.
Furthermore, based on the newly available resonance assignment of amino groups, we developed a 13C-detected “amino”-NOESY experiment to obtain precious additional structural restraints. The 13C-detected “amino”-NOESY experiment enables the observation of NOE contacts that are not accessible using other 1H-detected NOESY experiment. Among these new NOE contacts are valuable, inter-residual correlations, which are otherwise scarce in RNA due to the proton deficiency of its nucleobases. We showed that the newly obtained NOE contacts are especially important in the structure determination of RNAs with only few NOE restraints. Under such circumstances, the inclusion of the newly obtained amino NOE contacts lead to a significant improvement in the root-mean-square deviation (RMSD) of the three-dimensional structure of the 34 nts GTP class II aptamer. Together the novel 13C-detected NMR experiments developed within this PhD project provide a valuable alternative for the imino-based characterization of nucleobase interactions.
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This dissertation contains two chapters. Each chapter covers a unique topic within RNA sci-ence and is divided in two sub sections, part A and B. Each chapter contains an introduction.
Chapter 1 gives an insight into challenges encountered during sample design and preparation for single molecule Förster energy transfer (smFRET) spectroscopy and offers a solution via a newly establishedestablished workflow to obtain accurate smFRET constructs. Following this workflow, a FRET network could be generated, which allowed a detailed structural dynamics study on H/ACA RNP during catalysis with smFRET spectroscopy. This led to detailed mech-anistic insights into H/ACA RNPs dynamics during catalysis.
Chapter 2 deals with RNA synthetic biology whereby a novel eclectic design strategy for RNA of interest (ROI) release platform is presented, which allows to release a diverse ROI se-quences with single nucleotide precision triggered by an external stimulus. This design strat-egy was used to establish a ROI release system and its powerful performance in in vitro and in vivo applications was shown.
This dissertation contains two chapters. Each chapter covers a unique topic within RNA science and is divided in two sub sections, part A and B. Each chapter contains an introduction.
Chapter 1 gives an insight into challenges encountered during sample design and preparation for single molecule Förster energy transfer (smFRET) spectroscopy and offers a solution via a newly establishedestablished workflow to obtain accurate smFRET constructs. Following this workflow, a FRET network could be generated, which allowed a detailed structural dynamics study on H/ACA RNP during catalysis with smFRET spectroscopy. This led to detailed mechanistic insights into H/ACA RNPs dynamics during catalysis.
Chapter 2 deals with RNA synthetic biology whereby a novel eclectic design strategy for RNA of interest (ROI) release platform is presented, which allows to release a diverse ROI sequences with single nucleotide precision triggered by an external stimulus. This design strategy was used to establish a ROI release system and its powerful performance in in vitro and in vivo applications was shown.
The work of this thesis focuses on the targeting of G-quadruplexes (G4s), wherein several specific and potential ligands were designed, synthesized and characterized for its structural and biological activity. G4s are nucleic acid secondary structures that may form in single-stranded guanine (G)-rich sequences under physiological conditions. Four Guanines (Gs) bind via Hoogsteen-type hydrogen bonds base pairing to yield G-quartets, which in turn stack on top of each other to form the G4. G4s are highly polymorphic, both in terms of strand stoichiometry (forming both inter and intramolecular structures) and strand orientation/topology. The presence of K+ cations specifically supports G4 formation and stability. In the human genome G4 DNA motifs have been found in telomeres, G-rich micro and mini-satellites, up-stream to oncogene promoters and within the ribosomal DNA (rDNA). Human G4 DNA motifs are over-expressed in recombinogenic regions, which are associated with genomic damage in cancer cells.
In the present work, we focus on lead identification with specificity towards the c-MYC promoter G4s. Drug discovery is a highly time consuming and costly process. Lead identification and development are key steps in the drug discovery program. Studies have suggested that a large number of commercially available drugs exhibit deep structural similarity to the lead compounds from which they were developed. Quality lead identification in terms of compounds with high potency and selectivity, favorable physicochemical parameters and in vitro Absorption Distribution Metabolism and Excretion (ADME) parameters are the foremost requirements for the success of the drug discovery process. We herein describe the fragment-based drug design approach for the development of pyrrolidine-substituted 5-nitroindole derivatives as a new class of G4 ligands that exhibit high affinity and selectivity for the c-MYC promoter G-quadruplex. This chapter focuses on the methodology explored whilst finding a suitable hit and its optimization with fragment expansion strategies which undergo efficient G4 binding.
To target G4 DNA, screenings of numerous heterocycles have been reported including indoles, 7-azaindoles, 1H-indazol-3-yl, benzothiazole, imidazo[1,5-a]pyridine, 2,6- diaminopyrimidin-4-ol, 1H-pyrazolo[4,3 d]pyrimidin-7-amine, morpholino, bis-indoles, 2-hydroxynaphthalene-1,4-dione, 1,4-dihydroxyanthracene-9,10-dione, benzofuran and piperonal derived from several alkaloids. In this part of the thesis, we set out to identify new binders targeting the c-MYC G-quadruplex starting from the indole fragment. Several synthetic strategies are reported to optimize and generate best hits starting from 5-nitro indole derivatives by introducing the secondary cationic linked pyrrolidine side chain. Interestingly, all improved versions of G4-indole fragments 5, 7 and 12 contain this 5-nitro functionality, which may aid in the electrostatic binding and contributes to hydrogen binding interactions of the ligands to G4 DNA. In-silico drug design, biological and biophysical analyses illustrated that the substituted 5-nitro indoles scaffolds show preferential affinity towards the c-MYC promoter G-quadruplex compared to other G-quadruplexes and double stranded DNA. In vitro cellular studies confirm that the substituted indole scaffolds downregulate c-MYC expression in cancer cells and have the potential to induce cell cycle arrest in the G0/G1 phase. NMR analysis suggests that 5, 7, and 12 interacts in a fast exchange regime with the terminal G-quartets (5’ and 3’end) in a 2:1 stoichiometry.
To further optimize the fragment generated in chapter II, a novel series of triazole linked indole derivatives as a potential G quadruplex stabilizers have been described in chapter III. The potential ligands can be obtained through an efficient, convergent, synthetic route in moderate to good yields. The synthesized triazole linked indole derivatives are selective towards c- MYC G4-DNA vs. duplex-DNA. The planarity of the aromatic core and its ability to occupy more surface area by stacking over the G4 greatly affect the ability of the compounds to stabilize the G4. Further biophysical and biological studies revealed that the triazole linked nitro indoles are more promising than the amino indole derivatives.
Additionally, the importance of the nitro functional group has been justified by molecular docking studies, where hydrogen-bonding interactions were observed in between the nitro group and the G4 base pairs of the G-quadruplex. In biological findings, most of the synthesized triazole linked nitro indoles has found to be effective against human carcinoma (cervical) HeLa cell lines. Furthermore, western blot and cell cycle analysis confirms that the novel triazole linked 5-nitro indole derivatives (9b) could down-regulate c-MYC oncogene expression in cancer cells via stabilizing its promoter quadruplex structure, arresting cell cycle in G0/G1 phase. NMR analysis suggests that 9b interacts in slow exchange regime with the terminal G-quartets (5’ and 3’-end).
In chapter IV of the thesis, we have developed the synthetic strategies to generate more potent G4 ligands via Knoevenagel condensation. To investigate novel and selective G4 ligands for cancer chemotherapy, we designed and synthesized a series of azaindolin-2-one derivatives (11, 14, 15, 16 and 22) by attaching cationic pyrrolidine side chains and introducing a fluorine atom into the aromatic chromophore (Fig. 3). Fluorine atoms, with high electronegativity and small size, often exhibit unique properties in functional molecules. The electron-withdrawing effect of fluorine could reduce the electron density of the aromatic chromophore, which might favor a stronger interaction with the electron-rich π-system of the G-quartet. In addition, the introduction of fluorine atoms into small molecules might improve lipophilicity and thus the bioavailability. Fluorescent indicator displacement assay (FID) assays suggests that the synthesized azaindolin-2-one derivatives are selective towards c-MYC G4-DNA vs. duplex-DNA and showed potent anticancer activity against human carcinoma (cervical) HeLa cell lines. They down-regulate c-MYC expression in cancer cells via stabilizing its promoter quadruplex structure, arresting cell cycle in G0/G1 phase. Furthermore, NMR spectroscopy suggests that azaindolin-2-one conjugate interacts with terminal G-quartets as well as with the nearby G-rich tract (G13-G14-G15 and G8-G9-G10) of c-MYC quadruplex in intermediate exchange regime.