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Fokus meiner Doktorarbeit ist die Anwendung und Entwicklung NMR-spektroskopischer Methoden zur Charakterisierung zeitabhängiger Strukturänderungen von Biomolekülen – von lokalen dynamischen Veränderungen bis zur vollständigen Rückfaltung von Proteinen – und fasst die Ergebnisse meiner drei wichtigsten PhD-Projekte zusammen.
In meinem ersten Projekt habe ich die Leistung eines Temperatursprung-Probenkopfs – mit dem Proben mit hoher Salzkonzentration schnell erwärmt werden können – mithilfe einer Hochfrequenzspule technisch optimiert. Die optimierten Radiofrequenz-Bestrahlungsparameter, Lösungsmittel-bedingungen und der reduzierte Arbeitszyklus führten zu einem Temperatursprung von 20 °C in 400 ms. Ich habe eine Cystein-freie Mutante von Barstar hergestellt, die nach Zugabe von Harnstoff bei 0 °C kalt denaturiert werden kann, während sie ihren gefalteten Zustand bei 30 °C hält. Dadurch wurde auch ermöglicht, dass der Rückfaltungsprozess hunderte Male ohne Abbau oder Aggregation wiederholt werden kann. Die Kombination von reversibler Rückfaltung und rascher Temperaturänderung des kalt denaturierten Barstars ermöglichte die Entwicklung eines neuen kinetischen Experiments, bei dem der Rückfaltungsprozess von Barstar mit einem zweidimensionalen Echtzeit-NMR in hoher Zeitauflösung untersucht wird. Die vollständige Rückgratresonanzzuweisung wurde sowohl für den gefalteten als auch für den kalt denaturierten Zustand von Barstar durchgeführt und ergab, dass in der denaturierten Form beide Prolin-Reste einen gemischten Konformationszustand aufweisen. Dabei befindet sich die Tyr47-Pro48-Amidbindung im ungefalteten Zustand hauptsächlich in trans-, während im gefalteten Zustand in der seltenen cis-Konformation. Das neue hochauflösende kinetische Experiment zeigte, dass die Rückfaltung von Barstar durch die trans-cis-Isomerisierung der Tyr47-Pro48-Amidbindung verlangsamt wird, was sowohl die Sekundärstruktur als auch die Bildung der Tertiärstruktur beeinflusst. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte ich einen plausiblen Faltungsmechanismus für den langsamen Faltungsweg von kalt denaturiertem Barstar skizzieren. Durch Änderung der Zeitparameter des Heizungszyklus wurde erreicht, dass die Tyr47-Pro48-Amidbindung im ungefalteten Zustand in der cis-Konformation bleibt und daher der schnelle Faltungsweg dominant wird. Das Starten des Magnetisierungstransfers vor der Temperaturänderung ermöglichte die Aufzeichnung eines Spektrums, das den entfalteten Zustand mit dem gefalteten Zustand korreliert. Dieses Spektrum ermöglichte quantitative Analysen des schnellen Faltungsweges und lieferte sogar indirekte Hinweise auf einen Zwischenzustand. Diese Methode aus Kombination von schnellem Temperatursprung und Kaltdenaturierung zeigt ein hohes Potenzial, Proteinfaltung auf atomarer Ebene experimentell zu untersuchen und ein tieferes Verständnis verschiedener Faltungswege zu erlangen.
In meinem zweiten Projekt – das Teil einer interdisziplinären Forschung war – konzentrierte ich mich auf die NMR-spektroskopische Charakterisierung von Nukleinsäuren, die mit einer photolabilen Schutzgruppe modifiziert wurden. Zuerst wurde mithilfe homonuklearer Korrelationsexperimente eine vollständige Protonresonanzzuweisung erreicht. Danach wurde die relative Konfiguration der photolabilen Schutzgruppen bestimmt basierend auf einer dreidimensionalen Modellstruktur und spezifischer NOE-Korrelationen. Des Weiteren wurde ein Strukturmodell unter Verwendung von NOE-Einschränkungen berechnet. Dieses Strukturmodell zeigte eine eingeschränkte Rotation um die CN-Bindung zwischen dem Käfig und der Nukleobase. Das Modell zeigte auch, dass der Käfig in der Hauptrille positioniert ist und nicht in das Lösungsmittel herausklappt. Im Vergleich zu einem zuvor charakterisierten NPE-Käfig führte die erhöhte Größe zu einer weiteren Senkung des Schmelzpunkts, zeigte jedoch einen geringeren Schmelzpunktunterschied zwischen der S- und der R-Konfiguration des Käfigs, wobei die S-Konfiguration zu einer größeren Reduktion des Schmelzpunktes führt. Dieser Trend wurde weiter untersucht und durch ein Screening unterstützt. Durch selektive Wasserinversions-Rückgewinnungsexperimente konnte ich auch zeigen, dass der Käfig die lokale Stabilität nur bis zu einer Entfernung von zwei benachbarten Basenpaaren von der Modifikationsstelle verringert. Die NOE-Daten dienten auch als guter Bezugspunkt, um die Qualität molekulardynamischer Simulationen zu testen, mit denen zusätzliche Käfigdesigns untersucht wurden. Die Kombination aus Synthese, NMR-Spektroskopie und MD-Simulationen ermöglichte bis jetzt die detaillierteste Untersuchung des Effekts vom Einbau eines einzelnen Käfigs zur Destabilisierung der DNA-Sekundärstruktur. Dabei wurden Einschränkungen des möglichen Designs aufgedeckt, aber auch die Entwicklung einer neuen, effizienteren Struktur ermöglicht.
Mein drittes Projekt konzentrierte sich auf die Charakterisierung eines RNA-Modellsystems. NMR-spektroskopische Daten von kleinen RNA-Modellsystemen – wie NOE, skalare Kopplungen, kreuzkorrelierte Relaxationsraten und RDC – sind eine unschätzbare Referenz für MD-Simulationen, obwohl die Menge der verfügbaren Literaturdaten – bis jetzt – sehr begrenzt ist. ...
Die Genexpression in prokaryotischen Organismen unterliegt einer Vielzahl von Regulationsmechanismen, deren Aufgabe darin besteht, die Zelle an sich ändernde Umweltbedingungen anzupassen, um so das Überleben des prokaryotischen Organismus zu gewährleisten. Eine Reihe von Hitzeschock- und Virulenzgenen unterliegen temperaturabhängiger Regulation, mit dem Ziel, die Zelle an die sich ändernde Umgebung anzupassen. Die Messung der Temperatur erfolgt dabei über temperatursensitive RNA-Elemente, sogenannte RNA-Thermometer, die sich üblicherweise in der 5’-untranslatierten Region der Gene befinden, die sie regulieren. Sie unterdrücken die Translationsinitiation, indem sie die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bei niedrigen Temperaturen über Basenpaarung blockieren und dadurch die Bindung des Ribosoms verhindern. In Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit wurde die thermodynamische Stabilität der temperatursensitiven Haarnadelschleife 2 des Salmonella FourU RNA-Thermometers über einen breiten Temperaturbereich analysiert. Freie Enthalpie-, Enthalpie- und Entropie-Werte für die Basenpaaröffnung der einzelnen Nukleobasen innerhalb der RNA wurden über die temperaturabhängige Messung von Iminoprotonen-Austauschraten mittels NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Austauschraten wurden für die Wildtyp-RNA und die A8C-Mutante bestimmt und miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass die Wildtyp-RNA durch das außergewöhnlich stabile Basenpaar G14-C25 stabilisiert wird. Dies konnte durch die Untersuchung der Entfaltung der destabilisierenden G14A-C25U-Doppelmutante verifiziert werden. Über CD-spektroskopsiche Untersuchungen konnte der globale Entfaltungsübergang der jeweiligen RNA analysiert werden. Das Mismatch-Basenpaar innerhalb des Wildtyp-RNA-Thermometers (A8-G31) erwies sich als Ursache für die geringere Kooperativität des Entfaltungsübergangs der Wildtyp-RNA im Vergleich zur A8C-Mutante. Enthalpie- und Entropie-Werte für die Basenpaaröffnung einzelner Nukleotide sind für beide RNAs linear korreliert. Die Steigungen dieser Korrelationen stimmen mit den Schmelzpunkten der RNAs überein, die über CD-Spektroskopie bestimmt wurden. Entfaltung der RNA tritt also genau dann auf, wenn alle Nukleotide gleiche thermodynamische Stabilitäten besitzen. Die Resultate sind mit einem Reißverschluss-Mechanismus für die RNA-Helix Entfaltung konsistent und erklärbar, in dem die Stapelinteraktionen der benachbarten Nukleobasen innerhalb der RNA-Helix verantwortlich für die beobachtete Kooperativität sind. Die Ergebnisse weisen auch auf die Wichtigkeit der RNA-Lösungsmittel-Interaktion für die Stabilität der RNA-Struktur hin. So konnten langreichweitige Wechselwirkungen der A8C-Mutation auf die Stabilität der G14-Nukleobase identifiziert werden, die möglicherweise über die Hydrathülle der RNA vermittelt werden. Schließlich konnte für das FourU-Motiv eine Mg2+-Bindestelle identifiziert werden, die die temperaturabhängige Stabilität des RNA-Thermometers beeinflusst. Es besteht also die Möglichkeit, dass Änderungen der intrazellulären Mg2+-Konzentration die Expression des agsA-Gens in vivo modulierend beeinflussen. In Kapitel 3 dieser Arbeit wurden die dynamischen Eigenschaften des Phosphodiesterrückgrats einer perdeuterierten cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA untersucht. Dazu wurden die Relaxationseigenschaften aller 31P-Kerne dieser RNA bei magnetischen Feldstärken von 300, 600 und 900 MHz untersucht. Dipolare Relaxationsbeiträge konnten unterdrückt werden, indem eine perdeuterierte RNA-Probe in einem D2O-Puffer verwendet wurde. Um die 31P-Relaxationsdaten (R1, R2) interpretieren zu können, wurde zusätzlich mittels Festkörper-NMR die Chemische Verschiebungsanisotropie (CSA) der 31P-Kerne des Phosphodiesterrückgrats bestimmt. Die Messungen wurden bei verschiedenen Salzkonzentrationen und unter unterschiedlichen Hydratationsbedingungen durchgeführt. Aus den Daten konnte ein 31P-CSA-Wert von 178.5 ppm im statischen Zustand (S2 = 1) bestimmt werden. Auf der Grundlage der durchgeführten R1- und R2-Messungen wurde eine Modelfree-Analyse durchgeführt, um Informationen über die schnellen Dynamiken des Phosphodiesterrückgrats zu erhalten. Die Resultate zeigen, dass die Dynamiken des Phosphodiesterrückgrats auf der Subnanosekundenzeitskala stärker ausgeprägt sind als die Dynamiken der Ribofuranosylreste und der Nukleobasen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Dynamik einer individuellen Phosphatgruppe zu der jeweiligen 5’-benachbarten Nukleobase korreliert ist. In Kapitel 4 dieser Arbeit wird die Entwicklung neuer Methoden beschrieben, mit denen Torsionswinkelinformation aus der Analyse kreuzkorrelierter Relaxationsraten gewonnen werden können. Im ersten Teil des Kapitels wird die Entwicklung einer neuen NMR-Pulssequenz beschrieben, über die der glykosidische Torsionswinkel Chi in 13C,15N-markierten Oligonukleotiden bestimmt werden kann. Mit dem neuen quantitativen Gamma-HCNCH-Experiment ist es möglich, die dipolaren kreuzkorrelierten Relaxationsraten Gamma-C6H6-C1´H1´ (Pyrimidine) und Gamma-C6H6-C1´H1´ (Purine) zu messen. Die kreuzkorrelierten Relaxationsraten wurden an einer 13C,15N-markierten cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA bestimmt. Die aus den Raten extrahierten Chi-Winkel wurden mit bereits vorhandener Strukturinformation verglichen. Sie stimmen bemerkenswert gut mit den Winkeln der Kristallstruktur des Tetraloops überein. Zusätzlich wurde die neue Methode an einer größeren 30mer-RNA, dem „Stemloop D“ (SLD) aus dem Coxsackievirus-B3-Kleeblatt, getestet. Für die SLD-RNA wurde der Effekt von anisotroper Rotationsdiffusion auf die Relaxationsraten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Chi-Winkelbestimmung besonders für Nukleotide in der anti-Konformation sehr genau ist und die Methode eine eindeutige Unterscheidung von syn- und anti-Konformation zulässt. Im zweiten Teil von Kapitel 4 wird die Entwicklung des Gamma-HCCCH-Experiments beschrieben. Hierbei handelt es sich um eine neue NMR-Pulssequenz zur Messung der Gamma-C1´H1´-C3´H3´-Rate in 13C-markierten RNAs. Die Funktionsfähigkeit der neuen Methode wurde an einer cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA demonstriert. Zusätzlich dazu wurden die analytischen Gamma-C1´H1´-C3´H3´(P,nü_max)-, Gamma-C1´H1´-C4´H4´(P,nü_max)- und Gamma-C2´H2´-C4´H4´(P,nü_max)-Abhängigkeiten mathematisch hergeleitet. Die an der 14mer-RNA gemessenen Gamma-C1´H1´-C3´H3´-Raten wurden mit Hilfe der Gamma-C1´H1´-C3´H3´(P,nü_max)-Beziehung analysiert. Die Ergebnisse für die Pseudorotationsphase P sind konsistent mit Referenzwinkeln aus der 14mer-NMR-Struktur und den bereits bekannten (Gamma-C1´H1´-C2´H2´)/(Gamma-C3´H3´-C4´H4´)-Ratenverhältnissen. Die neue Methode liefert zusätzliche Informationen, um Konformation (P, nü_max) und Dynamik S2(C1´H1´-C3´H3´) der Ribosereste in RNA-Molekülen genauer beschreiben zu können. In Kapitel 5 dieser Arbeit wird die Entwicklung des 3D-HNHC-Experiments, einer neuen NMR-Pulssequenz, beschrieben. Dieses Experiment ermöglicht es, die H2-, C2- und N1-Resonanzen in Adenin-Nukleobasen 13C, 15N-markierter RNA-Oligonukleotide miteinander zu korrelieren. Die Funktionsfähigkeit der neuen Methode wurde an einer mittelgroßen, entsprechend markierten 36mer-RNA demonstriert. Die neue Methode vereinfacht die Zuordnung der Kerne der Adenin-Nukleobasen, da Zuordnungsmehrdeutigkeiten aufgrund überlappender Resonanzen in der 1H-Dimension aufgelöst werden können. In Kombination mit dem TROSY-relayed-HCCH-COSY-Experiment liefert das neue 3D-HNHC-Experiment das fehlende Glied für die Zuordnung der Imino-H3-Resonanzen der Uracil-Nukleobasen über das AU-Basenpaar hinweg zu den H8-Resonanzen der Adenin-Nukleobasen.
mRNS ist einer der wichtigsten Informationsträger in lebenden Zellen. Mit ihr wird die in der DNS gespeicherte Information zu aktiven Zellprozessen umgesetzt. Dabei finden erste regulatorische Prozesse, die den Phänotyp eines Organismus bestimmen können, bereits über Strukturelemente auf der mRNS statt. Diese, als Riboschalter bezeichneten Strukturen, können spezifisch, kleine Moleküle binden und dadurch ihre Struktur ändern. Durch diese dynamische Änderung der Struktur, in An- oder Abwesenheit des Liganden, wird reguliert, ob nachfolgende Gene vom Ribosom abgelesen werden können. Der Cd1-Riboschalter aus Clostridium Difficile ist schon während der Transkription aktiv und ein Teil des regulatorischen Netzwerkes, das bestimmt, ob das Bakterium einen mobilen oder stationären Lebensstil einnimmt. Das zentrale Signalmolekül in diesem Netzwerk ist der sekundäre Botenstoff c-di-GMP, der gleichzeitig auch der Ligand des Cd1-Riboschalters ist. In der folgenden Arbeit wurde der zeitliche und strukturelle Ablauf des Cd1 Regulationsmechanismus und die Bindung von c-di-GMP untersucht. Auch ohne einen Riboschalter in der Sequenz ist strukturierte mRNS ein interessanter Forschungsgegenstand. Wie die Covid-19 Pandemie und die Forschungen, mRNS Abschnitte als Krebsmedikamente zu gebrauchen, zeigen, gewinnt RNS immer mehr an Bedeutung für die medizinische Forschung und Anwendung. Mit dieser Motivation im Hintergrund wurden drei weitere RNS Projekte bearbeitet. Im ersten wurde ein 19F-Screening für die Erkennung von RNS bindenden Fragmenten etabliert. Im zweiten wurde ein RNS Doppelstrang untersucht, der mit Hilfe verschiedener, kovalent gebundener Spiropyrane reversibel gefaltet und entfaltet werden sollte. Im abschließenden Projekt wurden im Rahmen der COVID-19-NMR Initiative zwei Sekundärstrukturelemente der Covid-19 RNS untersucht.
Bei der Untersuchung des Cd1-Riboschalters konnten folgende Ergebnisse erzielt werden. Es wird gezeigt, dass die Bindung von c-di-GMP an das Cd1-Aptamer ein konzentrationsabhängiges Magnesiumverhältnis braucht. Dieses Verhältnis wurde ausgehend von initialen Messungen als 1/40 (RNS/Ligand) bestimmt. Spätere ITC Messungen geben aber Hinweise darauf, dass dieses Verhältnis bei niedrigen RNS Konzentrationen höher liegt und bei größeren RNS Konzentrationen niedriger. Die Bestimmung des Start- und Endpunktes der c-di-GMP Bindung wird in Unterkapitel 3.1.2 behandelt. Es wurde ermittelt, dass Cd1 bei 83 Nukleotiden eine alternative schwach Ligand bindende Konformation einnimmt, die wahrscheinlich durch eine P1 Helix bis zum Erreichen von Cd1-87 stabilisiert wird. Ab Cd1-87 bildet sich die reguläre von der Literatur vorhergesagte Bindetasche. Das Ende der c-di-GMP Bindung wird mit Cd1-148 erreicht, auch wenn hier noch Reste der Reportersignale für Bindung zu sehen sind. Diese Reste werden aber aller Wahrscheinlichkeit nach durch eine Cd1-83 entsprechende Konformation der Bindetasche erzeugt. In Kapitel 3.2 wird gezeigt, wie durch NMR Messungen die Zuordnung der Sekundärstruktur des Cd1-Riboschalters vollzogen wurde. Durch diese Messungen konnte bestätigt werden, dass in allen Längen eine P2 und P3 Helix vorhanden ist. Im Aptamer wird die Ligandbindung durch zwei Interaktionen zwischen P2 und P3 stark stabilisiert und der untere Abschnitt der P3 erst dann nicht mehr dynamisch, wenn c-di-GMP gebunden wird. Durch x-filter Experimente und Mutationen konnte nachgewiesen werden, dass C87 das basenpaarende Nukleotid an einem G des Liganden ist. Die Anwesenheit des HP1 Stamms konnte in den Längen 147, 148 und 160 nachgewiesen werden, wobei besonders der Vergleich der NOESY Spektren von Cd1-147 und Cd1-148 die Änderung der Sekundärstruktur hin zum Antiterminator zeigen. Der Verlauf der Bindungsaffinitäten wurde auch durch ITC Messungen an Cd1-83, 86, 87, 88, 135 und 146 bestätigt. Für die volle Länge (Cd1-160) des Riboschalters konnte gezeigt werden, dass der Terminatorstamm ausgeformt ist. Die erreichten Ergebnisse wurden in einem Modell zusammengefasst und der zeitliche Verlauf der Cd1 Regulation simuliert. Aus der Simulation ist zu erkennen, dass Cd1, wie erwartet, Ligand abhängig schaltet. Dabei ist der Aus-Zustand bei hoher Ligandkonzentration zu 90% populiert und der An-Zustand zu 100% bei niedriger Konzentration. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsgeschwindigkeit bei hohen Ligandkonzentrationen einen starken Einfluss auf die Regulationseffizienz des Riboschalters hat. So ist bei einer Transkriptionsgeschwindigkeit von 100 nt/s nach 1 s eine Gleichverteilung von An- und Aus-Zustand zu erkennen. Dieses Verhalten kann durch einen Stopp der Transkription an der potentiellen Pausierstelle U141-145 aufgehoben werden. Unter den Rahmenbedingungen des Modells erwiesen sich Transkriptionsgeschwindkeiten von um die 20 nt/s als optimal und bei niedrigen Ligandkonzentrationen hatte die Transkriptionsgeschwindigkeit faktisch keine Auswirkungen auf die Regulation. Ein interessantes Ergebniss der Modellierung ergab sich aus der Notwendigkeit der Verwendung einer Rate für konkurrenzlose Basenpaarschließungen. Hier konnte gezeigt werden, dass eine Rate von 400 nt/s ausreicht um einen voll funktionsfähigen Riboschalter zu beschreiben.
Beim 19F Bindungsscreenings von 101 Fragmenten, die alle ein oder mehrere 19F Atome besaßen, an Cd1-98 wurden 9 Fragmente gefunden die an Cd1-98 binden. Diese sind größtenteils planar mit Ausnahme von 2 Fragmenten bei denen die eine Hälfte des Moleküls nicht aromatisch ist. Des Weiteren besitzen alle Fragmente, außer einem, mindestens eine Aminogruppe im Molekül. Die daraus resultierende Vermutung, dass die Fragmente in die RNS interkalieren, konnte durch RNS beobachtende NMR Messungen nicht überprüft werden, da keine Signaländerung im Imino-Bereich zu erkennen war. Durch Verdrängungsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Fragmente, nicht wie c-di-GMP, die RNS Faltung homogenisieren und auch nicht in der Bindetasche gebunden werden.
An application of EPR spectroscopy that is becoming increasingly important is the measurement of distances between electron spins. Several EPR methods have been developed for this purpose, all based on measuring the dipolar coupling between two spins. Due to the specific nature of the sample, we applied dipolar relaxation enhancement measurements to study the geometry of a protein-protein complex. The paramagnetic centers in question had EPR spectra that were too broad and had such short relaxation time that they could not be studied using the more straightforward PELDOR technique. EPR spectral resolution can be increased appreciably by measuring at a frequency higher than conventional X-band (9 GHz) frequency. The spectra of many paramagnetic species can only be resolved at frequencies higher than 90 GHz. For accurate measurement of the orientation of the vector between two dipolar coupled spins with respect to the g-tensors of the spins, high spectral resolution is required. We therefore performed our EPR measurements at G-band (180 GHz) frequency. Dipolar relaxation measurements were applied to study the complex that is formed by the two electron-transfer proteins cytochrome c and cytochrome c oxidase (CcO) from the soil bacterium Paracoccus denitrificans. We were able to detect dipolar relaxation enhancement due to complex formation of soluble subunit II of P.d. CcO (CcOII) with two substrate cytochromes, which was practically absent in a mixture of CcOII with the negative control protein cytochrome c1. This complex formation was characterized by a pronounced temperature dependence that could be simulated using a home-written computer program. The G-band EPR measurements could not be simulated with a single complex geometry. This provided evidence for the hypothesis that electron-transfer protein complexes are short-lived and highly dynamic; they do not seem to form one specific electron-transfer conformation, but rather move around on each other’s binding surfaces and transfer an electron as soon as the distance between donor and acceptor is short enough. As a test of our simulation program, we also applied dipolar relaxation measurements to specially synthesized organic molecules that contained a nitroxide radical and a metal center. The transverse relaxation of Cu2+-OEP-TPA was compared to the relaxation of Ni2+-OEP-TPA at temperatures between 20 and 120 K. In this temperature range, the nitroxide relaxation was enhanced due to the presence of Cu2+, but not by Ni2+. Similarly, relaxation enhancement was found in the nitroxide-Mn2+ pair in Mn2+-terpyridine-TPA with respect to the terpyridine-TPA ligand. Due to the fast T2 relaxation of the nitroxide radical at high temperatures, the measurements were all performed in the low-temperature regime where the T1 relaxation rate of the metal ion was smaller than the dipolar coupling frequency. In this region, no structural information about the molecule can be deduced, since the dipolar relaxation enhancement is only determined by the T1 of the metal ion. The dipolar relaxation measurements we performed at high field indicated a difference in relaxation times between X-band and G-band frequencies. Extensive T1 - measurements of different paramagnetic centers (CuA, Cu2+) confirmed a strong dependence of T1 on magnetic field in the temperature range where the direct process is the dominating T1 relaxation process. This dependence is very strong (factor of 103 with respect to X-band), but does not follow the B04 dependence predicted in literature. The T1 relaxation of low-spin iron in cytochrome c at high magnetic field, estimated from dipolar relaxation data, is also in agreement with a larger contribution by the direct process (factor of 104). Dipolar relaxation enhancement was found to be a technique that is useful for measuring distances between paramagnetic centers, but only for systems where several important conditions are met, such as: the system exists in one certain static geometry, and the relaxation rate of the fast-relaxing spin is faster than the dipolar coupling frequency within the accessible temperature range. Additionally, it is a great advantage for the analysis of dipolar relaxation data if the procedure of dividing the relaxation trace of the dipolar-coupled slow-relaxing spin by the relaxation trace of the slow-relaxing spin in absence of dipolar coupling can be applied. Another useful application of dipolar relaxation enhancement measurements is the measurement of T1 relaxation of extremely fast-relaxing spins, or spins that are otherwise difficult to detect.
Bis zur Entfaltung der Wirkung eines Pharmakons laufen zahlreiche komplexe Vorgänge ab, die sich in drei wesentliche Phasen unterteilen lassen. Die pharmazeutische Phase umfasst mit der Applikation und dem Zerfall der Arzneiform sowie dem Auflösen des Wirkstoffes Vorgänge, die im wesentlichen von den galenischen Eigenschaften des Arzneistoffes abhängen. In der pharmakokinetischen Phase erfolgt mit der Resorption die Aufnahme des Wirkstoffes in den Organismus, dem sich die Verteilung in die unterschiedlichen Gewebe über die Blutbahn anschließt. Durch verschiedene Eliminationsprozesse wird der Wirkstoff zuletzt wieder aus dem Körper ausgeschieden. Mit dem Erreichen des Wirkortes beginnt die pharmakodynamische Phase, in der die pharmakologischen Effekte des Arzneistoffes zur erwünschten klinischen Wirkung führen. Der Nachweis des Pharmakons am Wirkort in klinisch-relevanten Konzentrationen ermöglicht somit Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Arzneistoffes, aber unter bestimmten Voraussetzungen auch auf dessen Wirkmechanismus. Während mittlerweile ein Großteil neuer Arzneistoffe mit Hilfe unterschiedlicher Mechanismen durch exaktes Drug Targeting an den Wirkort gesteuert werden, weisen andere Substanzen teilweise ungewollt eine gewebespezifische, dirigierende Komponente auf, die neben der eigentlichen Hauptwirkung weitere unterstützende oder auch unerwünschte Effekte auslösen. Von besonderem Interesse ist diese Gewebespezifität für pflanzliche Arzneistoffe, deren Wirkkomponenten bislang noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Gemeinsam mit anderen pharmakologischen Befunden kann der analytische Nachweis eines wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffes am Wirkort in ausreichenden Konzentrationen ein weiterer deutlicher Hinweis auf dessen Wirkbeteiligung sein. Besonders vor dem Hintergrund einer rationalen, evidenz-basierten Pharmakotherapie, deren Anforderungen die pflanzlichen Arzneien mittlerweile ebenso wie die synthetischen Wirkstoffe erfüllen müssen, ist die Erforschung sowohl des Wirkprinzips als auch der Pharmakokinetik des Wirkstoffes von besonderer Bedeutung. Obwohl Johanniskrautextrakte bereits seit dem 17. Jahrhundert gegen die Melancholie und somit als Antidepressivum eingesetzt wurden, sind sowohl der exakte Pathomechanismus der Depression als auch die Wirkkomponente und der Wirkmechanismus der Extrakte aus Hyperici herba noch immer Gegenstand umfassender Forschung. Vor allem wegen der geringen Nebenwirkungsrate sind Johanniskrautpräparate gegenüber synthetischen Antidepressiva eine bevorzugte Alternative für die Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen. Ähnlich den Effekten der synthetischen Antidepressiva sind Johanniskrautextrakte in der Lage, durch eine Wiederaufnahmehemmung der Neurotransmitter Noradrenalin, Serotonin, Dopamin, sowie GABA und L-Glutamat deren Konzentration im synaptischen Spalt zu erhöhen, was zu einer nachfolgenden adaptiven Veränderung der jeweiligen Rezeptoren führt. In mehreren Studien konnten diese Effekte vornehmlich den Phloroglucinolderivaten Hyperforin und Adhyperforin zugeordnet werden. Unterstützt wurden diese in vitro und in vivo Befunde durch die Ergebnisse einer Vielzahl verhaltenspharmakologischer Untersuchungen, die einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit in antidepressiven Modellen und dem Gehalt an Hyperforin in den Extrakten ergeben haben. Zahlreiche klinische Studien belegen darüber hinaus die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Johanniskrautextrakten. ...
The formation and maintenance of a defined three-dimensional structure is a prerequisite for most proteins in order to fulfill their function in the native context. However, there are proteins, which are intrinsically unstructured and thus natively unfolded. In addition, the misfolding and aggregation of many proteins can lead to severe diseases. The investigation of non-native states of proteins significantly contributes to the understanding of protein folding and misfolding. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is the only known technique that can provide information on structure and dynamics of non-native states of proteins at atomic resolution. Unfolded and non-native states of proteins have to be treated as ensembles of rapidly interconverting conformers and their observed properties are ensemble and time averaged. In this thesis, hen egg white lysozyme (HEWL) and mutants thereof have been investigated by NMR spectroscopy. The reduction of its four disulfide bridges and the successive methylation of the cysteine residues renders HEWL permanently non-native (‘HEWL-SMe’). Alternatively, the exchange of the eight cysteines for alanines results in very similar states (‘all-Ala-HEWL’). Under these conditions, HEWL-SMe and all-Ala-HEWL do not resemble random coil conformations, but exhibit residual secondary and tertiary structure. The presence of hydrophobic clusters and long-range interactions around the proteins six tryptophan residues and the modulation of these properties by single-point mutants has been observed. For the NMR spectroscopic investigation, HEWL has been isotopically labelled in E. coli by expression into inclusion bodies. After purification, the 1HN, 15NH, 13Calpha, 13Cbeta, 13C’, 1Halpha and 1Hbeta resonances of HEWL-SMe and all-Ala-HEWL have been assigned almost completely using three-dimensional NMR experiments. The analysis of secondary chemical shifts revealed regions in the proteins sequence — particularly around the six tryptophan residues—with significantly populated alpha-helix like conformations. In order to further elucidate the influence of the tryptophan side chains, a set of two new pulse sequences has been developed that allowed for the successful assignment of the 13Cg, 15Ne and 1HNe resonances in these side chains. This knowledge was eventually exploited in the interpretation of two-dimensional 15N-1H photo-CIDNP spectra, which revealed a differential solvent accessibility of the tryptophan residues in all-Ala-HEWL but not in the single point mutant W62G-all-Ala-HEWL. In addition, heteronuclear R2 relaxation rates have been determined for the indole 15Ne nuclei of all-Ala-HEWL and W62G. While in the wild-type like all-Ala-HEWL, the rates are different among the six tryptophan residues, in W62G they are more uniform. Together with relaxation data from the amide backbone, these results indicate the significant destabilization of the hydrophobic clusters in the absence of W62. In contrast, in the W108G mutant the profile of the R2 relaxation rates was not found to be significantly altered. No evidence was found by R1rho relaxation rates and relaxation dispersion measurements for conformational exchange on slower (micro- to millisecond) timescales. Residual dipolar couplings have been determined for non-native HEWL in order to retrieve structural information of these states. The differences of the W62G and the wild-type like non-native HEWL is also picked up in NH-RDCs of these proteins aligned in polyacrylamide gels. Significant positive RDCs are observed in the regions of the hydrophobic clusters in all-Ala-HEWL, but to a much lesser degree in W62G. So far, all attempts to simulate RDCs from generated non-native ensembles failed even when including long-range contacts or specific phi/psi backbone angle propensities. However, the measured RDCs can be used to cross-validate structural ensembles of non-native HEWL generated by molecular dynamics simulations that are based on restraints from the other experimental data, such as the differential solvent accessibilities from the photo-CIDNP experiments and the data on the hydrophobic clustering gained from the combined mutational and relaxation studies. Finally, non-native HEWL has been investigated for the first time using two-dimensional NMR in organic solvents, which are able to induce secondary structures and ultimately lead to amyloid formation. Under these conditions severe line broadening was observed, which was attributed to exchange between different — mostly a-helical— conformations. In summary, in this thesis methods have been developed, optimized and successfully applied for the structural and dynamical characterization of non-native states of proteins and the effect of single-point mutants on the properties of such ensembles has been investigated. Data has been gained that can considerably contribute to the further elucidation of the nature of non-native states of HEWL by molecular dynamics simulations.
Das genetische Material der Zellen besteht aus Molekülketten der Desoxyribonukleinsäure (DNA), die ein Träger der Erbinformation ist. In normalen Körperzellen wird die Erbinformation der DNA in eine andere Molekülkette, die sogenannte Ribonukleinsäure (RNA), übersetzt. Die RNA reguliert die Bildung von neuem Protein in der Zelle. Dass die RNA nicht bloß ein „Stempel“ ist, der die Informationen der DNA weitervermittelt, darin sind sich die Experten heute einig. RNA-Moleküle können Informationen speichern, katalytische Aktivitäten entfalten, sich perfekt tarnen, und sie regulieren auch als Produkt ihre eigene Synthese. Manche Viren enthalten ebenfalls RNA (oder DNA) und können so den Produktionsapparat der Zelle täuschen. Erkenntnisse über die Wechselwirkung dieser RNA mit natürlichen und synthetischen Liganden können zur Suche nach potentiellen Wirkstoffen beitragen. Nukleinsäuren sind lineare Biopolymere von grundlegenden Untereinheiten, die Nukleotide genannt werden und aus Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Urazil (U), und Thymin (T) zusammengesetzt sind. Sie sind jedoch in der Lage sich zu falten und so eine Doppel-Helixstruktur auszubilden. Diese besteht größtenteils aus den bekannten "Watson-Crick-Basenpaaren" (G-C und A-U oder A-T), die zur Stabilität der Struktur beitragen, sowie aus den weniger stabilen G-U-Paaren. Durch die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Sekundärstrukturelementen entstehen Tertiärstrukturelemente, deren Struktur und Dynamik oft nur schwer experimentell zu bestimmen sind. Fortschritte in der RNA-Strukturanalyse wurden durch Röntgenkristallographie und Kernresonanzspektroskopie (NMR) möglich. Durch die Röntgenkristallographie wurden viele RNA-Eigenschaften festgestellt. Allerdings besteht keine Kristallstruktur für alle mögliche Einzelnfaser-RNA-Haarnadeln, weil diese immer dazu neigen, in eine linearen doppelte Faserform zu kristallisieren, die geringe biologische Bedeutung hat. Außerdem wurde mit Hilfe der NMR-Spektroskopie das dynamische Verhalten von RNA, z.B. Entfaltungsprozesse bei ansteigender Temperatur, beobachtet. Jedoch erlauben diese experimentellen Daten oft keine direkte mikroskopische Beschreibung der molekularen Prozesse. Molekulardynamik (MD)-Simulationen von biologischen Systemen ermöglichen es hingegen, diese Prozesse in atomischem Detail zu untersuchen. Die MD-Simulation beschreibt ein molekulares System auf atomarer Ebene mit Hilfe der klassischen Mechanik. Kräfte werden von empirischen Potentialen abgeleitet. Sie liefern zeitabhängige Trajektorien, die sich aus den Newton'schen Bewegungsgleichungen ergeben. Durch verbesserte Computerleistung, bessere Kraftfelder, und neu entwickelte genauere Methoden stimmen heutzutage MD-Simulationen von RNA mit experimentellen Daten immer besser überein. In meiner Doktorarbeit wurden MD-Simulationen durchgeführt um die Dynamik, die Struktur und insbesondere die Stabilität von RNA-Hairpins theoretisch zu beschreiben, um so ein erweitertes Verständnis für die dynamischen Vorgänge zu erhalten. Auch der SFB 579 der Universität Frankfurt beschäftigt sich mit RNA-Systemen. Erforscht wird unter anderem der D-Loop des Coxsackievirus B3 (CVB3), der Virenmyocarditis verursacht. Die Interpretation dieser experimentellen Daten wird durch MD-Simulation möglich. In dieser Arbeit wurden das GROMACS Software-Paket und das AMBER Kraftfeld verwendet, um das strukturelle, dynamische und thermische Verhalten der RNA-Hairpins mit Hilfe von MD-Simulationen auf atomarer Ebene zu untersuchen. Betrachtet wurden die 14-mer RNA-Hairpins, uCACGg und cUUCGg. Die verfügbaren NMR-Strukturen zeigen, dass das uCACGg-Tetraloop auffallend ähnlich in der gesamten Geometrie und den Wasserstoffbindungen zu der experimentellen Struktur des cUUCGg-Tetraloop ist, obwohl die schließende Basenpaarsequenz der beiden Tetraloops unterschiedlich sind. Trotz beachtlicher struktureller Ähnlichkeit unterscheiden sich allerdings die uCACGg und cUUCGg Tetraloops in Funktionalität und Thermostabilität. Zunächst orientiert sich unser erstes Bemühen an der Frage nach einem guten Modell für RNA-Hairpins und Simulationsbedingungen, um die zu untersuchenden RNA-Hairpins in Wasser möglichst realitätsnah zu simulieren. Erstens werden drei Versionen des biomolekularen AMBER-Kraftfelds geprüft, indem man die 60 ns Simulationen des 14-mer uCACGg-Hairpins durchführt. Die simulierten strukturellen Eigenschaften und Atomfluktuationen zeigen hohe Ähnlichkeiten in den drei Kraftfeldern. Darüber hinaus stimmen die von MD-Simulationen berechneten Atomkernabstände mit den experimentellen NMR-Daten gut überein. Die gute Übereinstimmung zwischen den Simulationen und den strukturellen NMR Daten belegt die Fähigkeit des AMBER-Kraftfelds zur Beschreibung der strukturellen Eigenschaft von kleinen RNA-Hairpins. Anschließend werden die Einflüsse der Methoden, welche die langreichweitigen, elektrostatischen Wechselwirkungen beschreiben, auf die strukturellen Eigenschaften untersucht. Insbesondere werden die Ergebnisse der Reaktionfeld-Methode mit denen der Particle Mesh Ewald (PME)-Methode verglichen. Es zeigt sich, dass die PME-Methode die elektrostatischen Wechselwirkungen am besten beschreibt, auch wenn die Simulationen der beiden Methoden Ähnlichkeit in der Struktur-Stabilität und der Atomfluktuation bei niedriger Natriumkonzentration aufweisen. Drittens wird der Kationseffekt auf die RNA-Stabilität untersucht. Betrachtet wurden zwei unterschiedliche Kationen (ein- und zweiwertig) und verschiedene Konzentrationen. Die Simulationen weisen darauf hin, dass sich die Metallionen in der Affinität zum RNA-Hairpin unterscheiden, wenn Na+ und/oder Mg2+ als Gegenionen verwendet werden. Weiterhin wird gezeigt, dass sich die bevorzugten Positionen der Na+-Ionen in der großen Furche (major groove) des RNA-Hairpins befinden. Insbesondere die Anlagerungsort der Na+-Ionen liegen in der Nähe des schließenden Basenpaar U5-G10. Im Vergleich zu Na+-Ionen lagern sich Mg2+-Ionen sowohl an die RNA-Basen U3, A4-U11, und die Phosphat-Gruppe, als auch an das schließenden Basenpaar U5-G10 an. Bestätigt werden die Modelle und Simulationsbedingungen durch den Vergleich von Parametern, die sowohl experimentell als auch durch Simulationen ermittelt werden können. Ferner erlauben MD-Simulationen Einblick in das System, indem sie detallierte Konformations- und andere Verteilungen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse der Loopsequenz und des schließenden Basenpaares auf die Verteilung der Konformationen, der internen Bewegungen, und auf die Thermostabilität von zwei RNA-Hairpins mit Hilfe dieser Modelle untersucht. Zunächst wurden die strukturellen Eigenschaften bei Raumtemperatur ausgewertet. Die starken strukturellen Ähnlichkeiten und die gute Übereinstimmung mit NMR-Daten bestätigen die Hypothese, dass die zwei Tetraloops zur gleichen “erweiterten” RNA-Familie gehören. Diese zwei Hairpins haben ähnliche Lösemittelzugängliche Oberflächen (solvent accessible surface), wobei deren Lösemittel zugänglichen funktionellen Gruppen unterschiedlich sind. Weiterhin weist das uCACGg-Hairpin eine stärkere Tendenz auf Wasserstoffe abzugeben als das cUUCGg-Hairpin, was in den unterschiedlichen Bindungsaffinitäten zwischen diesen Hairpins und der viralen Protease begründet liegt. Darüber hinaus wurde der Faltungs- und Entfaltungsprozess mit Hilfe der Replica-Exchange-Molekulardynamik-Simulationen untersucht. Diese Untersuchung zielt auf das bessere Verständnis der unterschiedlichen Thermostabilität der Hairpins, indem sie die möglichen Zwischenprodukte im atomaren Detail liefern. Sowohl experimentell als auch von den MD-Simulationen ergibt sich eine Differenz in den Schmelztemperaturen der beiden Hairpins von ungefähr 20 K. Allerdings sind die von MD beobachteten Schmelztemperaturen 20 % höher als die von Experiment zu ansehende Wert. Die Ergebnisse machen deutlich, dass die Schmelztemperaturdifferenz nicht auf die Unterschiede in der Sequenz, in der Struktur, oder in der Dynamik der Loops zurückführen sind, sondern auf die Unterschiede der Basenpaaren in den Stämmen. Weiterhin wird gezeigt, dass sich das uCACGg-Hairpin einerseits kooperativ entfaltet, und die Entfaltung des cCACGg-Hairpins anderseits weniger kooperativ stattfindet. Um die schnelle interne Dynamik der uCACGg- und cUUCGg-Hairpins zu untersuchen, erlauben die Simulationen von 50 ns eine akurate Beschreibung der schnellen internen Bewegung der RNA-Hairpin, obwohl der den Hairpins zugängliche Konformationsraum nicht vollständig abgedeckt wird. Die NMR-Relaxationsparameter, die mit Hilfe der MD-Simulationen zurückgerechnet wurden, bestätigen das Modell und die Simulationsbedingungen der MD-Simulationen. Im Hinblick auf die Übereinstimmung kann man den besten Ansatz zur Berechnung der NMR-Ordnungsparameter bestimmen. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Ansätze angewandt, nämlich das Fitting von 100 ps auf modellfreiem Ansatz nach Lipari-Szabo, equilibrium average, und das Gaussian Axial Fluctuation (GAF)-Modell. Die zwei letzteren können nur qualitativ mit den experimentellen Daten übereinstimmen. Die NMR-Ordnungsparameter können mit Hilfe des Modells von Lipari-Szabo richtig ermittelt werden, wenn sich die interne Bewegung in kleineren Zeitskalen als zur Gesamtbewegung vollzieht. Vorausetzung für die Berechnung dieses Modells ist aber, dass das Fitting der internen Korrelationsfunktionen nur auf den ersten Teil von 100 ps der Korrelationsfunktionen eingesetzt wird. Die berechneten Ordnungsparameter deuten auf ein unterschiedliches Verhalten der beiden Hairpins besonders im Loop-Bereich hin. Die konformationelle Umordnung, die beim UUCG-Loop beobachtet wurde, tritt beim CACG-Loop nicht ein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es durch den Einsatz von MD Simulationen ermöglicht wird, die strukturellen und dynamischen Eigenschaften der RNA-Systeme auf atomarer Ebene zu untersuchen. Als Schlussfolgerung zeigt diese Doktorarbeit, dass sich die Studie der konformationell Dynamik der RNA-Systeme durch die Kombination aus MD-Simulation und NMR-Spektroskopie sowie der Leistungsfähigkeit der MD-Simulationen, die die interne Bewegungen deutlich beschreiben können, untersuchen lässt.
In this thesis the three dimensional solution strucutre of the RbfA protein from Thermotoga maritima was solved using multidimensional heteronuclear NMR spectroscopy. The RbfA protein binds to the helix I region of the 16S rRNA. To gain insights into the binding mode of RbfA to its target, a second RbfA construct from Helicobacter pylori was used. Comparison of the RbfA proteins with the published structure of RbfA from Escherichia coli, led to studies concerning the differences between proteins from thermophile and mesophile systems. In the second part of this thesis the native binding motive of the RbfA protein was identified. The RbfA protein binds to an alternate helix fold within the pre-sequence of the immature 16S rRNA.
Das Tau-Protein bildet im Verlauf von zahlreichen Demenzen, mit Morbus Alzheimer als die bekannteste unter ihnen, Aggregate, die sogenannten „neurofibrillären Geflechte“, die aus Fibrillen, den „paired helical filaments“ (PHFs) bestehen. Außerdem ist das Tau-Protein ein essentielles „microtubule-associated protein“, welches für die Aufrechterhaltung des neuronalen Zellmetabolismus notwendig ist. Dies veranlasste uns dazu, das Tau-Protein als Monomer, in der Mikrotubuli-gebundenen Form und als Fibrille zu charakterisieren. Die Technik, die wir hierzu verwendeten war die NMR-Spektroskopie, die als einzige strukturaufklärende Technik mit atomarer Auflösung dazu in der Lage ist, intrinsisch ungeordnete Proteine, wie das Tau-Protein, zu charakterisieren. Zwar war die Signalzuordnung der NMR-Spektren eine große Herausforderung, dennoch war es möglich praktisch alle Rückgratresonanzen sogar für die längste Tau-Isoform htau40 mit 441 Resten erfolgreich eindeutig zu identifizieren. Mit Hilfe der Zuordnung war es möglich das Tau-Protein bezüglich residualer Strukturelemente, Rückgratdynamik und Bindungsverhalten zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass in der C-terminalen Hälfte des Tau-Proteins, in welcher eine charakteristische Domäne vorliegt, die durch vier imperfekte „repeat“-Regionen (Länge ist jeweils ca. 31 Reste) gekennzeichnet ist, partieller beta-Strukturcharakter vorliegt. Ebenfalls weist diese Region eine verhältnismäßig hohe Rigidität auf. Aus diesem Grund betrachten wird diesen sequentiellen Bereich als den Aggregationskeim, was auch durch die Beobachtung verstärkt wird, das genau diese Zone den rigiden Teil der Fibrillen bildet. Diese aggregationsanfällige Region bindet gleichzeit stark an Mikrotubuli, wodurch ihre Pathogenität im gesunden biologischen System blockiert sein sollte. Mutationen oder Instabilität in den Mikrotubuli können jedoch dazu führen, dass immer höhere Mengen an Tau in freier gelöster Form vorliegen, sich Dimere ausbilden, welche dann weiter aggregieren und schließlich PHFs bilden, die eine starke cross-beta-Struktur aufweisen. Die übrigen Bereiche, wie die N-terminale Hälfe oder die äußersten 50 C-terminalen Reste weisen hingegen einen partiellen alpha-helikalen Charakter auf und eine höhere Peptidrückgratflexibilität. Deshalb kann man diese Elemente als aggregationsinhibierend betrachten. Das genauere Zusammenspiel dieser Elemente muss noch aufbauend auf der vorliegenden Dissertation verstärkt im Detail untersucht werden.