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Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine aggressive Erkrankung des Knochenmarks, welche die Hämatopoese beeinträchtigt und zu Knochenmarksversagen führt. Trotz des Fortschritts in der AML-Therapie bleibt die Prognose für die meisten Patienten schlecht, sodass neue Therapieansätze für die Behandlung dringend benötigt werden. Autophagie, ein kataboler Abbauprozess von zellulären Komponenten, ist nachweislich an der Entstehung von AML beteiligt. Als zentraler Regulator von Zellüberleben, Homöostase und Stoffwechsel, dient die Autophagie als Nährstoffquelle durch die Wiederverwertung von Makromolekülen während begrenzter Energieversorgung. AML-Zellen benötigen ein konstantes Nährstoff- und Energieniveau, um ihre Vermehrung aufrechtzuerhalten. Dies wird durch eine Umstellung von Stoffwechselwegen, insbesondere des mitochondrialen Stoffwechsels einschließlich der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) und des Tricarbonsäurezyklus (TCA), erreicht.
Mehrere Studien haben die Hemmung der Autophagie für die Behandlung von Krebs als vielversprechenden Ansatz vorgestellt. Doch eine Monotherapie mit Autophagie-Inhibitoren erzielte nur eine geringfügige Wirksamkeit. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Entstehung von Kompensationsmechanismen, die zum Ausgleich der Autophagie-Hemmung in Krebszellen entstehen. Bis heute sind diese Kompensationsmechanismen kaum untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, ein geeignetes Autophagie-Gen zu identifizieren, mit dem sich die Rolle der Autophagie-Hemmung für das Überleben von AML-Zellen untersuchen lässt. Zusätzlich sollen die kompensatorischen Mechanismen, die durch die Autophagie-Hemmung in AML-Zellen entstehen können, untersucht werden, um neue metabolische Angriffspunkte zu identifizieren, die für Kombinationstherapien genutzt werden können.
Zu Beginn der Arbeit wurde ein gezielter CRISPR/Cas9 Screen in zwei humanen AML-Zelllinien durchgeführt, um Autophagie-Gene zu identifizieren, deren Verlust eine Proliferationsstörung in AML-Zellen verursacht, welche überwunden werden kann. Validierungsexperimente zeigten, dass der Verlust von ATG3 das Zellwachstum signifikant verminderte. Außerdem zeigte die Messung des Autophagie-Fluxes, dass der Verlust von ATG3 die Autophagie stark beeinträchtigte. Dies wurde durch eine Western-Blot-Analyse, die eine beeinträchtigte LC3-Lipidierung zeigte, und durch eine Immunfluoreszenzanalyse der Autophagosomen-Bildung mittels konfokaler Mikroskopie, die eine geringere Anzahl von Autophagosomen in ATG3-defizienten Zellen ergab, bestätigt. Deshalb wurde der Knockdown von ATG3 in AML Zellen verwendet, um die Mechanismen, die zum Ausgleichen der Autophagie-Hemmung entstehen, zu untersuchen. Zuerst wurde die Zellproliferation in fünf verschiedenen AML Zelllinien über sieben Tage betrachtet. In allen Zellenlinien führte der Verlust von ATG3 mittels small hairpin RNA zu verminderter Zellproliferation. Diese Ergebnisse zeigen die wichtige Rolle von ATG3 in der Autophagie und dass Autophagie-Hemmung durch ATG3-Verlust das Wachstum von AML-Zellen beeinträchtigt.
Da der Verlust von ATG3 die Proliferation von AML-Zellen beeinträchtigte, wurde eine Zellzyklusanalyse durchgeführt. Eine reduzierte S-Phase bestätigte die verminderte Proliferation in ATG3-depletierten AML-Zellen, doch der Zellzyklus war grundsätzlich nicht gestoppt. Darüber hinaus ergab die Analyse der Apoptose, dass diese unter dem Verlust von ATG3 erhöht war, aber etwa 50% der Zellen blieben vital. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass AML-Zellen trotz des Verlusts der ATG3-abhängigen Autophagie weiter proliferieren können.
Um die Mechanismen zur Kompensation der Autophagie-Hemmung zu untersuchen, wurden die Auswirkungen des ATG3-Verlusts auf die mitochondriale Homöostase untersucht. Die Mitophagie sowie das mitochondriale Membranpotenzial und die Masse unterschieden sich zwischen Kontroll- und ATG3-depletierten AML-Zellen nicht, was darauf hindeutet, dass die mitochondriale Homöostase durch den Verlust von ATG3 nicht beeinträchtigt ist. Als nächstes wurde die mitochondriale Funktion durch Messung des ATP-Spiegels und der OXPHOS untersucht. Die ATP-Level und die OXPHOS waren nach dem Verlust von ATG3 in AML-Zellen erhöht, was auf eine gesteigerte mitochondriale Aktivität bei Autophagie-Defizienz hinweist.
RNA modifications are present in all three kingdoms of life and detected in all classes of cellular RNAs. RNA modifications are diverse, with more than 100 types of chemical modifications identified to date. These chemical modifications expand the topological repertoire of RNAs and are expected to fine-tune their functions. Ribosomal RNA (rRNA) contains two types of covalent modifications, either methylation on the sugar (Nm) or bases (mN), or base isomerization (conversion of uridine into pseudouridines, "). Pseudouridylations and ribose methylations are catalyzed by site-specific H/ACA and C/D box snoRNPs, respectively. The RNA component (snoRNA) of both types of snoRNPs is responsible for the site selection by base pairing with the rRNA substrate, whereas the protein component catalyzes the modification reaction: Nop1 in C/D box and Cbf5 in H/ACA box snoRNPs. Contrastingly, base methylations are performed by snoRNA independent, ‘protein-only’, methyltransferases (MTases). rRNA modifications occur at highly conserved positions, all clustering around functional ribosomal sites. Mutations in factors involved in rRNA modification have been linked to severe human diseases (e.g. X-linked Dyskeratosis congenita). Emerging evidences indicate that heterogeneity in RNA modification prevails, i.e. not all positions are modified at all time, and the concept of ‘specialized ribosomes’ has been coined. rRNA modification heterogeneity has been correlated with disease etiology (cancer), and shown to play a role in cell differentiation(hematopoiesis). Remarkably, alteration in rRNA modification patterns profoundly affects the preference of ribosomes for cap- versus IRESdependent translation initiation, with major consequences on cell physiology.
Untersuchungen zur Bedeutung selektiver Autophagie für Alterungsprozesse von Podospora anserina
(2022)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Funktion und die Rolle von Autophagie-assoziierten Proteinen im Alternsmodell Podospora anserina zu untersuchen und einen Einblick in die nicht-selektive Autophagie, die Mitophagie und die Bildung und den Abbau von Autophagosomen im Zusammenhang zur Alterung von P. anserina zu analysieren. Dabei wurden folgende Erkenntnisse erhalten:
1. Die Untersuchungen zu ΔPaAtg8 bestätigen, dass die PaATG8-abhängige Autophagosomenbildung zur Aufrechterhaltung der Lebensspanne benötigt wird. In ΔPaAtg8 kommt es zu einem Verlust der nicht-selektiven Autophagie. Die Mitophagie hingegen ist auch ohne PaATG8 partiell möglich und es liegt ein PaATG8-unabhängiger Abbau von mitochondrialen Proteinen in P. anserina vor.
2. In P. anserina ist PaATG11 an der nicht-selektiven Autophagie beteiligt und auch die Mitophagie erfolgt in Abhängigkeit dieses Gerüstproteins. Während der PaAtg11-Deletionsstamm unter Normalbedingungen keinen zum Wildtyp veränderten Phänotyp zeigt, führt eine Kultivierung auf M2-Medium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle zu einer starken Verkürzung der Lebensspanne. Eine mikroskopische Untersuchung der Mitochondrien zeigte, dass im juvenilen Altersstadium von ΔPaAtg11 stark fragmentierte Mitochondrien vorliegen. Während der Alterung normalisiert sich die Mitochondrienmorphologie wieder. Der mitochondriale Funktionsverlust wird möglicherweise von den fragmentierten Mitochondrien ausgelöst, denn eine Kultivierung von älteren ΔPaAtg11-Stämmen auf M2-Medium mit Glycerin führt zu einer Normalisierung der Lebensspanne.
3. Die initialen Untersuchungen zur ΔPaAtg11/ΔPaAtg24-Doppelmutante zeigen, dass es bei der Kultivierung unter Normalbedingungen zu einem additiven Effekt der beiden Genverluste kommt. Bei der Anzucht auf M2-Medium mit Glycerin hingegen kann eine im Vergleich zum ΔPaAtg11-Stamm längere Lebensspanne festgestellt werden. Die Mikroskopie der Mitochondrien in ΔPaAtg11/ΔPaAtg24 zeigt, dass im juvenilen Alter zum Wildtyp vergleichbare filamentöse Mitochondrien vorhanden sind.
4. In P. anserina ist PaATG24 kein Mitophagierezeptorprotein, da im PaAtg24-Deletionsstamm eine Beeinträchtigung der nicht-selektiven Autophagie vorliegt. Auch die Mitophagie ist in diesem Stamm geschädigt. Die mikroskopische Betrachtung der Mitochondrien zeigt keinen Unterschied zum Wildtyp. Bei der Untersuchung zur Mitochondrienfunktion durch M2-Medium mit Glycerin ist wie unter Normalbedingungen eine verkürzte Lebensspanne feststellbar.
5. Der Abbau von GFP::PaATG8 ist in der PaAtg24-Deletionsmutante signifikant verringert und es kommt zu einer Akkumulation von Autophagosomen, somit liegt in diesem Stamm eine Beeinträchtigung des autophagosomalen Flusses vor. Bei der mikroskopischen Untersuchung von PaATG24 zeigt sich, dass dieses Protein in P. anserina im Bereich der Vakuolen lokalisiert ist. Die Analyse der Vakuole-Autophagosomen-Fusion zeigt jedoch, dass dieser Mechanismus unabhängig von PaATG24 ist. Die Vakuolenmorphologie und Vakuolengröße ist in ΔPaAtg24 beeinträchtigt und dadurch kommt es zu dem beobachteten Defekt der nicht-selektiven und selektiven Autophagie.