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Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.
Different numerical approaches and algorithms arising in the context of modelling of cellular tissue evolution are discussed in this thesis. Being suited in particular to off-lattice agent-based models, the numerical tool of three-dimensional weighted kinetic and dynamic Delaunay triangulations is introduced and discussed for its applicability to adjacency detection. As there exists no implementation of a code that incorporates all necessary features for tissue modelling, algorithms for incremental insertion or deletion of points in Delaunay triangulations and the restoration of the Delaunay property for triangulations of moving point sets are introduced. In addition, the numerical solution of reaction-diffusion equations and their connection to agent-based cell tissue simulations is discussed. In order to demonstrate the applicability of the numerical algorithms, biological problems are studied for different model systems: For multicellular tumour spheroids, the weighted Delaunay triangulation provides a great advantage for adjacency detection, but due to the large cell numbers the model used for the cell-cell interaction has to be simplified to allow for a numerical solution. The agent-based model reproduces macroscopic experimental signatures, but some parameters cannot be fixed with the data available. A much simpler, but in key properties analogous, continuum model based on reaction-diffusion equations is likewise capable of reproducing the experimental data. Both modelling approaches make differing predictions on non-quantified experimental signatures. In the case of the epidermis, a smaller system is considered which enables a more complete treatment of the equations of motion. In particular, a control mechanism of cell proliferation is analysed. Simple assumptions suffice to explain the flow equilibrium observed in the epidermis. In addition, the effect of adhesion on the survival chances of cancerous cells is studied. For some regions in parameter space, stochastic effects may completely alter the outcome. The findings stress the need of establishing a defined experimental model to fix the unknown model parameters and to rule out further models.
Die mechanische Streckung hat einen großen Einfluss auf Keratinozyten und bei der Transduktion dieses Reizes nehmen ßl-integrine, E-Cadherine und EGF-Rezeptoren eine zentrale Rolle ein: Eine einfache mechanische Dehnung von HaCaT-Zellen um 10% fuhrt innerhalb von 5min zu einer schnellen Umorientierung der ßl-Integrine auf der Zellmembran, ohne dass sich dabei die Menge dieser Oberflächenrezeptoren ändert. Die Integrine sammeln sich in der basalen Membran zu größeren Adhäsionskomplexen. Dies hat Auswirkungen auf das Adhäsionsverhalten der Zellen. Eine Streckung bewirkt, dass die mechanisch stimulierten Zellen gegenüber den Kontrollzellen sowohl schneller an das Substrat anheften als auch eine stärkere Zell-Matrix-Adhäsion aufweisen. Das unterschiedliche Adhäsionsverhalten auf den verschiedenen Substraten (Arginin+Serum, Fibronektin, Kollagen) und Experimente mit funktionsblockierenden Antikörpern gegen ßl-Integrine sind Beweise für die Beteiligung dieser Oberflächenrezeptoren an diesem Vorgang. Da adhärente Zellen, wie Keratinozyten. neben Wachstumsfaktoren den Zell-Matrix-Kontakt benötigen, um in die S-Phase eintreten zu können, hat das unterschiedliche Adhäsionsverhalten von gestreckten und ungestreckten Zellen wiederum Einfluss auf die Proliferation. Diese ist bei den mechanisch gereizten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen gesteigert und zwar im direkten Verhältnis zu der mechanisch induzierten Steigerung der Adhäsion. Im Rahmen einer Rezeptor-Transaktivierung (siehe vorne) kooperieren ßl-Integrine und E- Cadherine sowohl räumlich als auch funktionell mit dem EGF-Rezeptor bei der Übermittlung des Dehnungsreizes: Räumliche Interaktionen: Eine Koclusterung von ßl-Integrinen mit dem EGF-Rezeptor tritt bereits nach 5minütiger mechanischer Reizung an den Zell-Zell-Grenzen und den Fokalkontakten auf. Eine Kolokalisation zwischen E-Cadherinen und EGF-Rezeptoren besteht ebenfalls, wobei sich allerdings Kontrolle und Streckung nicht unterscheiden. Funktionelle Interaktionen: Eine mechanische Stimulation führt zu einer transienten Aktivierung des EGF-Rezeptors (Aktivitätsmaximum: 5min) und der MAP-Kinase ERK1/2 (Aktivitätsmaximum: 15min). Diese streckungsinduzierte Aktivierung von ERK1/2 wird sowohl durch die Blockierung der ßl-Integrine und E-Cadherine als auch durch die Inhibition des EGF-Rezeptors unterbunden. Weiterhin hemmt die Blockierung der Adhäsionsmoleküle die Aktivierung des EGF-Rezeptors. Dies spricht für die Transaktivierungs-Theorie des EGF- Rezeptors durch die ß1-Integrine und E-Cadherine. Die Zellstrukturen und viele zelluläre Prozesse werden durch eine zellintern erzeugte Grundspannung im Zytoskelett aufrechterhalten. Ohne eine Verankerung der Zelle an der ECM oder den Nachbarzellen, was durch die Blockierung der ßl-Integrine und E-Cadherine erreicht wird, bricht dieses fein ausbalancierte System zusammen; die Zytoskelett-Elemente F-Aktin, Intermediär-Filamente und Mikrotubuli zerfallen. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit wird ersichtlich, welche enorme Bedeutung den Adhäsionsrezerptoren - ßl-Integrine und E-Cadherine - für die Formstabilität und die funktionellen Eigenschaften der Zelle zukommt. Ein Ausfall dieser Adhäsionsmoleküle beeinträchtigt sowohl die Form der Zelle (Adhäsionsvorgänge und Tensigrity-Modell) als auch die Transduktion von Umweltreizen durch die Plasmamembran, z.B. einer mechanischen Stimulation, die letztendlich das Überleben der Zelle und die Proliferation bestimmt. Daher wäre denkbar, das die Ergebnisse dieser Grundlagenforschung in Zukunft zur Behandlung von Hautkrankheiten herangezogen werden können.