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Im Rahmen dieser vorliegenden Thesis wurden verschiedene photosensitive Systeme anhand statischer und zeitaufgelöster optischer Spektroskopiemethoden charakterisiert. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag in der Entwicklung und Untersuchung neuer Quantenpunkt-basierter Hybridsysteme. Es war möglich die optischen Eigenschaften der Quantenpunkte über Optimierung der Syntheseschritte zu variieren und so auf geplante Projekte anzupassen.
Im Projekt „Quantenpunkte als Zwei-Photonen Antenne“ sollten die hohen Zwei-Photonen Einfangquerschnitte von Quantenpunkten ausgenutzt werden um in Kombination mit einer photolabilen Schutzgruppe, ein Uncaging im NIR-Bereich zu realisieren. Es wurden ZnSe/ZnS Partikel synthetisiert, die eine starke Emission im Bereich der Absorption der Schutzgruppe zeigen. Anhand von zeitaufgelösten transienten Absorptionsexperimenten mit einer Anregungswellenlänge bei 775 nm wurde eine Zwei-Photonen Absorption der Partikel nachgewiesen. Jedoch wurden starke Emissionsbeiträge aus Fallenzuständen und eine geringe Stabilität beobachtet. Die Synthese von CdS/ZnS Quantenpunkten lieferte stabile Partikel mit geringer trap state Emission. Diese Partikel wurden in einem Modellhybridsystem als Energiedonoren eingesetzt. Als Akzeptor wurde der Farbstoff Cumarin343 gewählt. In statischen Absorptions- und Emissionsmessungen, zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen sowie in fs-zeitaufgelösten transiente Absorptionsmessungen konnte ein ultraschneller Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung des Hybridsystems beobachtet werden. Über TPiF Messungen wurde die Zwei-Photonen Absorption der Quantenpunkte detektiert. Ein Energietransfer nach Zwei-Photonen Anregung der Quantenpunkte wurde beobachtet. Schließlich wurde ein Hybridsystem aus CdS/ZnS und der photolabilen Schutzgruppe Az-NDBF (Synthese im AK Heckel, Goethe Universität, Frankfurt a. M.) untersucht. Auch in diesem System wurde ein Energietransfer von Quantenpunkt auf die Schutzgruppe nach Ein- und Zwei-Photonen Anregung beobachtet. Anhand von TA Experimenten wurde eine Zeitkonstante von <100 ps für den Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung ermittelt. Es konnte anhand der vorgestellten Resultate gezeigt werden, dass sich Quantenpunkte, aufgrund der guten Anpassung ihrer optischen Eigenschaften generell sehr gut als Antennen für organische Verbindungen eigenen.
Des Weiteren wurde ein Hybridsystem aus CdSe/ZnS Quantenpunkten und einer Dyade (Verbindung eines DTE Photoschalters und BODIPY Derivats), entworfen und charakterisiert. Ein ultraschneller EET von BODIPY auf den geschlossenen DTE Schalter wurde in vorangegangenen Studien beobachtet. Dieser EET führte zur Löschung der BODIPY-Emission. Sobald der Photoschalter im offenen Zustand vorliegt, findet aufgrund des fehlenden spektralen Überlapps kein EET statt und es wird die BODIPY-Emission detektiert. Die Erweiterung der Dyade um einen Quantenpunkt zeigte nach Anregung des Quantenpunkts dessen Fluoreszenzlöschung. Da die Emissionsbande der Quantenpunkte im Absorptionsbereich des BODIPY Farbstoffes liegt, konnte über statische und zeitaufgelöste Experimente ein ultraschneller EET von CdS/ZnS auf den Farbstoff ermittelt werden. Dies führte zu der Erweiterung des Anregungsspektrums des BODIPY Farbstoffs. Die Kopplung der Dyade an die Quantenpunktoberfläche lieferte eine Verbindung mit dem breiten Anregungsspekrum des Quantenpunkts und der schaltbaren Fluoreszenz der Dyade.
Das Hybridsystem aus CdSe Quantenpunkten und PDI zeigte vom Verhältnis der Quantenpunkte zu gekoppelten PDI Molekülen abhängige Fluoreszenzsignale. In TA Experimenten wurde ein ultraschneller EET ermittelt. Für hohe PDI Konzentrationen wurde ein weiterer EET von höher angeregten Elektronen auf das PDI identifiziert. Neben der EET Charakterisierung konnte ein zusätzlicher Prozess innerhalb des Hybridsystems mit hoher PDI Konzentration beobachtet werden. Auf den EET von Quantenpunkt auf PDI folgt ein ET aus dem Valenzband des Quantenpunkts in das HOMO des PDI*. In vorangegangene Arbeiten zu Hybridsystemen aus CdSe/ZnS und PDI wurde kein ET beobachtet. In dem beschriebenen Projekt konnte der Einfluss einer passivierenden Schale auf die elektronischen Eigenschaften von CdSe Quantenpunkten gezeigt werden.
Im letzten Teil dieser Thesis wurde die spektroskopische Charakterisierung einer NVOC und zweier NDBF Schutzgruppen beschrieben. Es konnten anhand statischer Absorptionsmessungen eine Freisetzungsquantenausbeute für NVOC-Adenin von 1,1 % ermittelt werden. Die Charakterisierung der Schutzgruppen mit einer NDBF Grundstruktur (DMA-NDBF und Az-NDBF) ergab eine Abhängigkeit der Freisetzungs- und Fluoreszenzausbeute von der Polarität des Lösungsmittels. In polarer Umgebung reduzierten sich die Quantenausbeuten deutlich...
Verschiedene physikalische Effekte erlauben es Licht so zu führen und zu verändern, dass es Einblicke in für Menschen sonst unzugängliche Bereiche gewährt. Eines von insgesamt drei Elementen dieser Dissertationsschrift ist der Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskops. Dieses fortschrittliche Werkzeug erweitert das zur Verfügung stehende Instrumentarium um verschiedene Analysemethoden, allen voran die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie. Durch geringfügige Modifikationen können auch weitere Methoden, wie beispielsweise stimulierte Raman-Streuung realisiert werden.
Insbesondere die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie war für das zweite Element dieser Dissertationsschrift von großer Bedeutung. In dieser Studie wurde das Bleichverhalten von Spinach bei 2-Photonen-Absorption untersucht, sowohl an frei in Lösung befindlichen als auch auf einem Träger immobilisierten Spinach-Komplexen. Die Ergebnisse zu den frei in Lösung befindlichen Spinach-Komplexen zeigen, dass die Verstärkung der Fluoreszenz von DFHBI grundsätzlich auch im Fall der 2-Photonen-Absorption eintritt. Dabei wurde ein Ausbleichen der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz für frei in Lösung befindliche Spinach-Komplexe erst bei außerordentlich hohen Intensitäten der Anregungsstrahlung beobachtet. Dieser Befund kann zumindest teilweise auf das Eindiffundieren fluoreszenter Spinach-Komplexe in das sehr kleine Fokalvolumen innerhalb der 2-Photonen-Anregung stattfindet zurückgeführt werden. Für immobilisierte Spinach-Komplexe konnte gezeigt werden, dass eine kontinuierliche Bildaufnahme gegenüber einer Bildaufnahme in Intervallen mit jeweils zusätzlichen Dunkelphasen zur Erholung des reversiblen Bleichens der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz, sowie der generelle Verzicht auf spezielle Belichtungsschemata und Methoden der Datenakquise mit keinen besonderen Nachteilen verbunden ist. Abschließend betrachtet erweist sich Spinach bei 2-Photonen-Anregung als ausgesprochen resistent gegenüber einem irreversiblem Ausbleichen des Fluoreszenzsignals.
Als drittes Element dieser Dissertationsschrift wurde die Dynamik von Chrimson, einem Kanalrhodopsin mit rot-verschobener Absorption mittels zeitaufgelöster Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Sowohl die Anregungswellenlänge als auch der pH-Wert bzw. der Protonierungszustand des Gegenions haben einen messbaren Einfluss auf die Primärreaktion. Diese verlangsamt sich, sobald der pH-Wert abgesenkt oder die Anregungswellenlänge rot-verschoben wird. Darüber hinaus führt eine Rot-Verschiebung der Anregungswellenlänge zu einer geringeren Effizienz der Isomerisation des Retinal-Chromophors. Die Primärreaktion von Chrimson entspricht dabei einem Reaktionsmodell mit einer Verzweigung des Reaktionspfades auf der Energiehyperfläche des angeregten Zustandes. Ein Reaktionspfad führt dabei durch ein lokales Minimum, welches in seiner Ausprägung stark von der elektrostatischen Umgebung des Retinal-Chromophors abhängt. Je nach ursprünglichem Protonierungszustand des Gegenions der Retinal-Schiff-Base wurden große Unterschiede hinsichtlich der beobachteten transienten Absorptionsmuster für den im Anschluss von Chrimson durchlaufenen Photozyklus gefunden. Bei pH 6,0 weist der Photozyklus von Chrimson eine insgesamt deutlich schnellere Kinetik auf, als es für den Photozyklus bei pH 9,5 beobachtet wurde. Es ist bemerkenswert, dass in elektrophysiologischen Messungen für beide Photozyklen eine Öffnung des Ionenkanals gefunden wurde. Die Kanalfunktion von Chrimson ist somit grundsätzlich nicht vom Protonierungszustand des Gegenions abhängig, wenngleich die Kinetik des Ionenkanals durchaus davon beeinflusst wird. Dies deutet auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen dem Ionenkanal und dem Gegenion der Retinal-Schiff-Base hin.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Dynamik zweier grundlegend verschiedener, deaktivierender Mechanismen von Retinalproteinen untersucht. In einem dritten Projekt wurde die Photodynamik einer Dreifachmutante von visuellem Rhodopsin erforscht, von der eine Mutation zu kongenitaler (angeborener) Nachtblindheit führt und zwei andere Mutationen das Protein über eine Disulfidbrücke stabilisieren. Die Ergebnisse dieser drei Projekte sind im Folgenden zusammengefasst.
Die Aktivität des mikrobiellen Proteorhodopsins als lichtgetriebene Protonenpumpe kann photoinduziert unterbunden werden. Dies erfolgt durch die Absorption von blauem Licht durch das Retinal bei deprotonierter Schiff‘schen Base. Vor dieser Arbeit war allerdings nur wenig über den Mechanismus und die Kinetik dieses Effekts bekannt. Das einzige Retinalprotein, an dem diese Deaktivierungsdynamik auf molekularer Ebene zeitaufgelöst untersucht wurde, ist Bakteriorhodopsin. Doch auch an diesem System wurde die ultraschnelle Primärreaktion in der photoinduzierten Deaktivierungsdynamik - die Photoisomerisierung des 13-cis-Retinals - bisher nicht zeitaufgelöst gemessen.
In dieser Arbeit wurde ein Weg gefunden, diesen Prozess auf einer Sub-Pikosekundenzeitskala zu detektieren. Dazu wurde eine Proteorhodopsinmutante genutzt, in der der primäre Protonendonor E108 durch Glutamin ersetzt ist. Diese Mutante weist eine signifikante Erhöhung der Lebensdauer des M-Intermediats auf. Im photostationären Gleichgewicht führt diese veränderte Kinetik zu einer erheblich erhöhten Akkumulation des Proteins im M-Zustand, die ausreicht, um photoinduzierte Absorptionsänderungen der Deaktivierungsdynamik sowohl im sichtbaren als auch im mittleren Infrarotbereich auf ultrakurzer Zeitskala zu detektieren. Dieses Projekt erfolgte in Kooperation mit dem Arbeitskreis Glaubitz (Goethe-Universität Frankfurt am Main).
Es zeigte sich, dass die Anregung des Retinals von Proteorhodopsin im M-Zustand zur Isomerisierung von 13-cis zu all-trans führt, die nach wenigen Pikosekunden abgeschlossen ist. Der zweite und abschließende Schritt ist die Reprotonierung der Schiff'schen Base. Es stellte sich heraus, dass dieser Prozess auf einer Nanosekundenzeitskala abläuft und über einen Protonentransfer vom primären Protonenakzeptor D97 zur Schiff'schen Base ermöglicht ist.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Methodik zur Untersuchung der deaktivierenden Photodynamik von Proteorhodopsin auf ultraschneller Zeitskala, könnte in Zukunft auf weitere mikrobielle Rhodopsine angewandt werden. So ist die Studie der Deaktivierungsdynamik von Channelrhodopsinen von großem Interesse für optogenetische Anwendungen. Eine lichtgesteuerte Kontrolle der Ionenkanalöffnung und -schließung sollte die Präzision in der Regulierung ionischer Permeation erheblich verbessern.
Die Proteorhodopsinmutante E108Q wurde außerdem in ihrer primären Photodynamik sowohl bei grünem als auch blauem Anregungslicht untersucht. Es zeigte sich in beiden Fällen eine Dynamik, die der des Wildtyps sehr ähnlich ist. Eine Beobachtung unterscheidet sich jedoch wesentlich vom Wildtyp. Das K-Intermediat der E108Q-Mutante scheint nach einigen hundert Pikosekunden zumindest partiell zu zerfallen, woraufhin sich eine Signatur im blauen Spektralbereich bildet. Blitzlichtphotolysemessungen lassen vermuten, dass diese blau absorbierende Species im zwei- bis dreistelligen Nanosekundenbereich wieder zerfallen sein muss.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Photozerfall von visuellem Rhodopsin. Es ist bekannt, dass die Signaltransduktion durch Wechselwirkung zwischen aktiviertem Rhodopsin und Arrestin unterbunden wird. Im ersten Abschnitt wurde der Einfluss der Arrestin-1-Variante p44 auf die Photodynamik visuellen, bovinen Rhodopsins untersucht. In einer Kooperation mit dem Arbeitskreis Schwalbe (Goethe-Universität Frankfurt am Main) konnte gezeigt werden, dass Arrestin erheblichen Einfluss auf die Zerfallsdynamik von Meta II und Meta III hat. Es wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung von p44 mit photoaktiviertem Rhodopsin eine erhöhte Population des Intermediats Meta III bewirkt, mit der Folge einer zweifach langsameren Freisetzungskinetik des all-trans-Retinals. Diese Beobachtung weist auf eine physiologische Rolle des Zustands Meta III in der Retinalhomöostase hin.
Gegenstand einer zweiten Studie mit dem Arbeitskreis Schwalbe ist zum einen die Rhodopsinmutation G90D, die mit kongenitaler (angeborener) stationärer Nachtblindheit zusammenhängt, und zum anderen die Doppelmutation N2C und D282C, die zur Ausbildung einer stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen den im extrazellulären Bereich eingeführten Cysteinen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Photodynamik des Wildtyps, der Doppelmutante und der stabilisierten G90D-Mutante (Mutationen G90D, N2C und D282C) sowohl auf einer ultrakurzen Zeitskala als auch auf einer Minutenskala untersucht.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die Untersuchungen lichtgesteuerter Reaktionen der zwei Retinalproteine Channelrhodopsin-2 (ChR-2) und Proteorhodopsin (PR) mit Hilfe zeitaufgelöster Laserspektroskopie.
Da der Mechanismus der Kanalöffnung des ChR-2 bis heute nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, beschäftigt sich diese Arbeit insbesondere mit den Prozessen, die direkt nach der Photoanregung des Retinals stattfinden und die Kanalöffnung vorbereiten. Es wurde dabei gezielt auf für die Funktion des Proteins wichtige Faktoren wie strukturelle Besonderheiten des Chromophors und seiner Umgebung eingegangen und deren Auswirkung auf die Dynamik der Photoreaktionen sowie die Veränderungen im Protein nach der Anregung untersucht.
Zunächst wurden die Ergebnisse der vis-pump-IR-probe-Experimente an ChR-2 im Bereich der Carbonylschwingungsbanden protonierter Glutamat- und Aspartat-Reste dargestellt. Dabei wurde insbesondere die Bildungsdynamik der Differenzbanden in diesem Spektralbereich untersucht und in Anlehnung an die vorhandene Literatur eine Bandenzuordnung der für die Funktion des Proteins wichtigen Aminosäurereste vorgenommen. Aus den Messergebnissen konnte geschlossen werden, dass die mit der Kanalöffnung einhergehenden Konformationsänderungen in ChR-2 durch eine effektive Aufnahme der Überschussenergie durch das Protein auf einer sub-Pikosekunden-Zeitskala vorbereitet werden.
Des Weiteren wurden spektroskopische Untersuchungen an der R120H-Mutante des ChR-2 vorgestellt. Da diese Mutante bei elektrophysiologischen Messungen keine Kanalaktivität zeigte, sollte zunächst geklärt werden, ob die Mutation einen Einfluss auf die Retinalisomerisierung und den nachfolgenden Photozyklus hat. Dabei stellte sich heraus, dass die Retinalisomerisierung bei der R120H-Mutante zwar im Vergleich zum Wildtyp etwas verzögert stattfindet, der Einfluss der Punktmutation auf den weiteren Photozyklus jedoch insgesamt gering ist. Mit Hilfe der Kurzzeit-IR-Spektroskopie im Bereich der Amid I-Schwingung des Proteinrückgrats konnten für die Mutante allerdings signifikante Veränderungen der Bildungsdynamik sowie eine deutliche Abnahme der Amplitude des Amid I-Signals detektiert werden. Anhand weiterer Experimente an den Mutanten E123T und D253N in diesem Spektralbereich konnte anschließend ein Zusammenhang zwischen der Intensität der Amid I-Bande und der Kanalaktivität von ChR-2 festgestellt werden. Diese Ergebnisse ließen somit die Schlussfolgerung zu, dass die Aminosäurereste R120 und D253 eine entscheidende Rolle beim schnellen Transfer der Überschussenergie an das Protein nach der Retinalanregung und der so initiierten Kanalöffnung spielen.
Zusätzlich wurde der Frage nachgegangen, inwieweit Veränderungen am Chromophor die Isomerisierungsreaktion, den nachfolgenden Photozyklus sowie die Funktion des ChR-2 als Ionenkanal beeinflussen können. Zu diesem Zweck wurden spektroskopische Untersuchungen an einem mit 9-12-Phenylretinal (PheRet) rekonstituierten ChR-2 vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung des PheRet zu seiner 13-cis-Form in ChR-2 stark verlangsamt ist und verglichen mit dem nicht modifizierten Chromophor deutlich ineffizienter abläuft. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Veränderungen am Retinal zu deutlichen Beeinträchtigungen des Photozyklus führen. Zum einen wurde ein sehr schneller Zerfall des ersten Photoprodukts sowie die Bildung eines zusätzlichen, blauverschobenen Px-Zustands detektiert. Außerdem wurde festgestellt, dass nach der Deprotonierung des isomerisierten PheRet der Großteil der modifizierten Retinale in den Ausgangszustand zurückkehrt und der P3-Zustand nur in geringen Mengen gebildet wird. Die Messergebnisse führten somit zu der Schlussfolgerung, dass die all-trans-Konformation des PheRet in ChR-2 deutlich bevorzugt wird. Da elektrophysiologische Untersuchungen des Retinal-Analogons jodach keine signifikanten Verminderungen der Photoströme im Vergleich zum ATR in ChR-2 zeigten, ließ sich schließlich festhalten, dass die vorgenommenen Veränderungen am Chromophor, die zu einer deutlichen Hemmung der Isomerisierungsreaktion führen und einen starken Einfluss auf den nachfolgenden Photozyklus haben, nicht ausreichend sind, um die Kanalaktivität von ChR-2 komplett zu blockieren, solange noch ein kleiner Anteil der Retinale isomerisieren kann.
Der abschließende Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Absorption des UV-Lichts durch das Retinal mit deprotonierter Schiff-Base im grünabsorbierenden Proteorhodopsin, welches in einem alkalischen Medium im Dunkelzustand akkumuliert werden kann. Die Untersuchungen der Primärreaktion zeigten einen langsamen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands der UV-absorbierenden Spezies mit anschließender Bildung des 13-cis-Photoprodukts. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein Reaktionsmodell für die ersten Prozesse nach der UV-Anregung des Retinals im GPR aufgestellt werden, welches möglicherweise für weitere UV-Rezeptoren genutzt werden kann.
Probing the photointermediates of light-driven sodium ion pump KR2 by DNP-enhanced solid-state NMR
(2021)
KR2 is a light-driven sodium ion pump found in marine flavobacterium Krokinobacter Eikastus. The protein belongs to the microbial rhodopsin family, which is characterized by seven transmembrane helices and a retinal cofactor covalently bound to a conserved lysine residue through a Schiff base linkage. Specific features of KR2 and other sodium pumping rhodopsins are the NDQ motif, the N-terminal helix capping the protein at the extracellular side, and the sodium ion bound at the protomer interface in the pentameric structure. The ability to pump sodium ions was a surprising discovery since the positive charge at the Schiff base was long thought to hinder the transport of non-proton cations and the Grotthuss mechanism could not be applied to explain the Na+ transport. The photocycle of KR2 revealed by flashed photolysis and ultrafast femtosecond absorption spectroscopy consists of consecutive intermediates, named K, L, M, and O.
Here, DNP-enhanced ssNMR was used to analyze various aspects of these intermediate states. The K/L-state can be generated and trapped by in-situ illumination inside the magnet at 110 K. The trapping of L-state together with the K-state at this temperature is unexpected as this usually leads to the trapping of only K-state in bacteriorhodopsin (BR), proteorhodopsin (PR), and channelrhodopsin 2 (ChR2). This observation suggests a lower energy barrier between K- and L-state in KR2. For the O-state, the intermediate was generated by illuminating outside the magnet, followed by rapid freezing in liquid nitrogen and transfer to the magnet. Based on these procedures, the retinal conformation, and the electrostatic environment at the Schiff base in KR2 dark, K-, L- and O-intermediates were probed using 13C-labeled retinals bound to 15N-labeled KR2 by both 1D and 2D magic angle spinning (MAS) NMR experiments.
The obtained data show an all-trans retinal conformation with the distortion of 150° at H-C14-C15-H in the dark state whereas the retinal has a 13-cis, 15-anti conformation in the K- and L-state after light activation. Differences between K- and L-intermediates were observed. The retinal chemical shifts of the K-state show a large deviation from the model compound behavior between the middle and end part of the polyene chain. In the L-state, these differences are much less pronounced. These observations indicate that the light energy stored in the K-state dissipates into the protein in the subsequent photointermediate states. Furthermore, an additional shielding observed for C14 in L-state indicates the slight rotation toward a more compact 13-cis, 15-syn conformation. The distortion of the H-C14-C15-H angle in the L-state (136°) is larger than in the dark state. This twist of the retinal in the L-state would play an important role in lowering the pKa of the Schiff base, which is a prerequisite for the proton transfer from the Schiff base to the proton acceptor (D116). The electrostatic environments at the Schiff base in K- and L-states cause a de-shielding of the 15N nitrogen compared to the dark state. This indicates a stepwise stronger interaction with the counterion as the Schiff base proton moves away from the Schiff base and comes closer to the D116 in the transition from K- to L-state and approaches the proton transfer step during the M-state formation. In the O-state, the retinal was found to be in the all-trans conformation but differed to the dark state in the C13, C20, and Schiff base nitrogen chemical shifts. The largest effect (9 ppm) was observed for the Schiff base nitrogen, which could be explained by the effect of the positive charge of bound Na+ near the Schiff base in the O-state, coordinated by N112 and D116 as observed in the O-state crystal structure in the pentameric form.
The structural change at the opsin followed the retinal isomerization and the energy transfer from the chromophore to the surrounding were also investigated in this thesis using various amino acids labeling schemes. Moreover, 1H-13C hNOE in combination with CE-DNP was applied to probe the dynamics of retinylidene methyl groups and 23Na MAS NMR was employed to detect the bound sodium ion at the protomer interface in KR2 dark state.
The membrane protein Green Proteorhodopsin (GPR), found in an uncultured marine γ-proteobacterium, is a retinal binding protein and contains a conserved structure of seven transmembrane helices (A-G). The retinal is bound to a conserved lysine residue (K231) in helix G via Schiff base linkage. It belongs to the widespread family of microbial rhodopsins and functions as a light dependent outward proton pump that bacteria may utilize for establishing a proton gradient across the cellular membrane. Proton pumping takes place after photon absorption, where GPR goes through a series of conformational changes, termed photocycle, causing the proton to be transported across the cellular membrane from the intra-cellular to the extracellular space. It is further mediated by the highly conserved functional residues D97 and E108, which function as the primary proton acceptor and primary proton donor for the protonated Schiff base, respectively. Another functionally important residue is the highly conserved H75 in helix B. It forms an intra-molecular cluster with D97 and is responsible for the high pKa value of the primary proton acceptor, stabilized by a direct interaction between D97 and H75.
Different Proteorhodopsin variants are globally distributed and colour tuned to their environment, depending on the water depth in which they occur. A single residue in the retinal binding pocket at position 105 is responsible for determining the absorption wavelength of the protein. GPR (from eBAC31A08) contains a leucine at position 105, while BPR (blue proteorhodopsin, from Hot75m4) in deeper waters possesses a glutamine. Although GPR shows 79% sequence identity with BPR, a single amino acid substitution (L105Q) in GPR is able to switch the absorption maximum to the one of BPR.
Protein oligomerisation describes the association of subunits (protomers) through non-covalent interactions, forming macromolecular complexes. It is an important structural characteristic of microbial rhodopsins, contributing to structural stability and promoting tight packing of the protomers in the bacterial membrane. GPR was shown to assemble into radially arranged oligomers, mainly pentamers and hexamers. No high resolution crystal structure of the whole GPR complex is available, but the structurally related BPR (Hot75m4) was successfully crystallized, showing pentameric oligomers.
The BPR crystal structure model reveals detailed information about complex assembly of the whole proteorhodopsin family. It reveals the oligomeric structures and shows residues that are part of the protomer interfaces, forming cross-protomer contacts, which is valuable information for the elaborate analysis of cross-protomer interactions of GPR oligomers.
Based on the knowledge of GPR and BPR oligomeric complexes, the aim of this study is to analyse specific cross-protomer contacts and to characterize the functional role of GPR oligomerisation. This includes the identification of residues, which are part of charged cross-protomer contacts and play an important role for the formation of the GPR oligomeric complex. Furthermore, this study deals with a detailed characterization of a potentially functional cross-protomer triad between the residues D97-H75-W34, which was detected in the BPR structural model. Hereby, the focus lies especially on the functional role H75, which is highly conserved and is positioned in between the primary proton acceptor D97 and W34 across the protomer interface. In summary, this study addresses GPR oligomerisation via specific cross-protomer contacts and its potential role for the functional mechanism of the protein.
The fundamental technique used in this study is solid-state NMR. Furthermore, an elaborate characterization of GPR oligomerisation was executed using a variety of biochemical methods and mutational approaches. Solid-state NMR is a powerful biophysical method to analyse membrane proteins in their native lipid environment and can be used to obtain diverse information about structure, molecular dynamics and orientation of the protein in the lipid bilayer.
Solid-state NMR naturally has a low sensitivity. In order to detect the low number of spins, DNP signal enhancement is of particular importance in this study. It is exhibited under cryogenic conditions and allows to drastically enhance the solid-state NMR signal by transferring magnetization from highly polarized electrons to the nuclear spins.
By applying these methods and techniques on GPR oligomers, this study reveals new insights in specific cross-protomer interactions in the complex. First the oligomeric states of GPR were determined for the specific experimental conditions used in this study. LILBID-MS, BN-PAGE and SEC analysis identified the pentameric state to be dominant for GPR. Furthermore, specific interactions across the protomer interface, which drive GPR oligomerisation, were identified. This was conducted by creating mixed 13C-15N labelled complexes. These mixed complexes show a unique isotope labelling pattern across their protomer interfaces. Solid-state NMR 13C-15N-correlation spectroscopy (TEDOR) was used to identify through-space dipole-dipole couplings, which indicate specific cross-protomer contacts. The results indicated that the residues R51, D52, E50 and T60 are important for GPR oligomerisation, and further analysis via single mutations of these residues showed a severe impact of the GPR oligomerisation behaviour.
The functional importance of GPR oligomerisation was analysed by DNP-enhanced solid-state NMR on the cross-protomer D97-H75-W34 triad. The DNP cryogenic conditions allowed to trap GPR in distinct stages of the photocycle. It could be shown that trapping GPR in a specific intermediate leads to a drastic conformational effect for the highly conserved H75 residue. Furthermore, DNP-enhanced solid-state NMR was used to characterize the cross-protomer contact between H75 and W34. Mutations of W34 could show that the cross-protomer interaction is highly important for the functionality of the protein, as negative mutants such as W34E showed a reverse proton transport across the bacterial membrane.
In summary this study represents a detailed analysis of GPR cross-protomer interactions and sheds light into the cause and functional importance of oligomeric complex formation in the microbial rhodopsin.
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an zwei verschiedenen Retinalproteinen durchgeführt. Das erste analysierte Retinalprotein, Channelrhodopsin 2, wurde hauptsächlich auf die Beziehung zwischen Retinalisomerisierung und Photozyklus bzw. Funktionalität untersucht. Hierfür wurde das Chromophor all-trans Retinal durch verschiedene, sterisch anspruchsvolle, Retinalanaloga ersetzt. Das 9,12-Phenylretinal wurde bereits in BR erfolgreich eingesetzt, um die Isomerisierung des all-trans Retinals zum 13-cis Retinal in der Bindetasche zu verhindern und die Funktionalität des Proteins zu stoppen. In ChR2 hingegen kann das Phenylretinal nach Lichtanregung isomerisieren und ein Photoprodukt bilden, welches anschließend einen modifizierten Photozyklus durchläuft. In diesen Photozyklus zerfällt das erste Photoprodukt P1' sehr schnell und bildet ein zusätzliches Intermediat, Px, welches zeitlich zwischen dem P1' und P2' Intermediat liegt und eine grundzustandsähnliche Absorptionsbande besitzt. Im Vergleich zum Wildtyp läuft der modifizierte Photozyklus schneller ab als im Wildtyp und das Protein behält seine Funktion. Ein weiteres Retinalanalogon ist das trans-locked Retinal, welches sich als schwierig in das Protein einzubauen erwies. Dies resultierte in zwei verschiedenen Absorptionsbanden, wobei nicht klar war, welche die mit dem korrekt eingebauten Retinal war. Beide Banden wurden in Ultrakurzzeitexperimenten angeregt, hierbei stellte sich heraus, dass die bathochrom verschobene Spezies das korrekt eingebaute Retinal besitzt, da diese auch eine Schwingungsfeinstruktur, wie auch der Wildtyp, zeigt. Das trans-locked Retinal kann ChR2 erfolgreich an der Isomerisierung hindern und zeigt nach dem Zerfall des angeregten Zustandes keine Photoprodukt-Bildung.
Bei dem zweiten Retinalprotein, welches in dieser Arbeit untersucht wurde, handelt es sich um Krokinobacter eikaustus rhodopsin 2. Zuerst wird in dieser Arbeit die Primärreaktion des Proteins untersucht. Diese wurde unter verschiedenen Salzbedingungen, welche wichtig für die spätere Funktion des Proteins sind, jedoch auch Einfluss auf die Ultrakurzzeitdynamik des Proteins nehmen, analysiert. Der angeregte Zustand des Proteins zerfällt biexponentiell, wobei die erste Komponente den reaktiven Pfad und die langsamere Komponente den nicht-reaktiven Pfad beschreibt. Der reaktive Pfad bildet innerhalb einiger hundert Femtosekunden das bathochrom verschobene, isomerisierte J Intermediat, welches durch Kühlprozesse auf der unteren Pikosekundenzeitskala in das K Intermediat übergeht. Beim nicht-reaktiven Pfad zerfällt der angeregte Zustand innerhalb einiger Pikosekunden und geht in den Grundzustand über, ohne dass eine Isomerisierung des Retinals stattfindet. Sind Na+ oder K+ Ionen in der Lösung anwesend, sind diese Prozesse gleich schnell. In Abwesenheit dieser Ionen wird der nicht-reaktive Pfad stärker populiert und zerfällt langsamer. Das gleiche salzabhängige Verhalten konnte mit der Mutante H30A gezeigt werden. Die Aminosäure H30 sitzt im Interface zweier Oligomere in der Nähe der extrazellulären Na+ Bindestelle. Durch die Mutation von Histidin zu Alanin, wird das Protein fast ausschließlich zu einer Na+-Pumpe und pumpt kaum noch Protonen. Die Ultrakurzzeitdynamik bleibt jedoch unbeeinflusst davon und unterscheidet sich nicht vom Wildtyp. Neben dem normalen all-trans Retinal wurden auch hier, wie schon für Channelrhodopsin 2, Retinalanaloga im Wildtyp untersucht, hier hauptsächlich unter dem Aspekt der Farbanpassung. Die hier verwendeten Analoga waren das A2 Retinal und das MMA Retinal (MMAR), die beide durch die Erweiterung des -Systems zum Grundzustand rotverschobene Absorptionsspektren aufweisen. Das A2 Retinal besitzt eine weitere Doppelbindung und das MMAR zwei weitere Doppelbindungen im -Jonen Ring im Vergleich zum Retinal. Das MMAR hat zusätzlich noch eine weitere Methylamino-Gruppe. Durch das größere -System hat das MMAR auch die größere Rotverschiebung im Spektrum. Beide Retinalanaloga zeigen sehr breite ESA Banden und isomerisieren nur zu einem geringen Prozentsatz, die Hauptpopulation der angeregten Moleküle geht über den nicht-reaktiven Pfad zurück in den Grundzustand.
Der Photozyklus von KR2 wurde ebenfalls untersucht. Hierbei wird unter anderem das Verhalten des Proteins unter verschiedenen pH- und Salzbedingungen analysiert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Dynamik des Natrium-Pump-Zyklus unabhängig vom pH Wert ist. In einem pH Bereich zwischen 6 und 9.5 ändern sich die Lebenszeiten des Zyklus nicht signifikant, jedoch wird die Amplitude des O Intermediats, welches als Indikator für den (nicht Protonen) Ionentransport genutzt wird, bei niedrigem pH Wert geringer. Die geringere Amplitude weist auf einen geringeren Na+-Transport hin. Dies liegt an der Kompetition der zu transportierenden Ionen, in diesem Fall Na+ und H+. Ist die H+ Konzentration viel höher als die Na+ Konzentration, so fängt das Protein an H+ zu pumpen. Unter physiologischen Bedingungen handelt es sich bei KR2 jedoch um eine reine Na+-Pumpe. Sind Kalium-Ionen bei pH 9.5 anwesend, so zeigt das Protein wie auch beim Natrium-Pump-Zyklus ein starkes O Intermediat, was darauf hindeutet, dass auch K+ transportiert werden kann. Dies konnte von Dr. Janina Sörmann (Arbeitsgruppe Bamberg, MPI für Biophysik Frankfurt) auch in elektrophysiologischen Messungen gezeigt werden. Bisher wurde in der Literatur davon ausgegangen, dass K+ vom Wildtyp nicht transportiert werden kann. Um die Photozyklusdynamik des Natrium-Pumpzyklus besser verstehen zu können, wurde die Temperaturabhängigkeit des Photozkylus mit Hilfe der Target Analysis untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass das simple sequentielle Modell K -> L -> M -> O -> GS die besten Fitresultate liefert, obwohl viele verschiedene Modelle mit Verzweigungen oder Rückraten ebenfalls getestet wurden. Resultat der Target Analysis sind unter anderem die Evolution Associated Difference Spectra (EADS). Diese beinhalten die Differenzspektren der einzelnen Zustände, welche um das Grundzustandsbleichen korrigiert werden können, um die Evolution Associated Spectra (EAS) zu bilden. Durch Entfaltung dieser EAS (auf der Energieskala) konnten die Reinspektren der einzelnen Photointermediate K, L, M und O berechnet werden. Auffällig hierbei war, dass das M Intermediat eine geringere Blauverschiebung als erwartet aufwies, was höchstwahrscheinlich an der Elektrostatik in der Retinal-Bindetasche liegt. Durch die Entfaltung der Spektren konnten ebenfalls die Gleichgewichte, welche zu schnell sind, um in der Target Analysis aufgelöst zu werden, bestimmt werden. Die K, L und M Intermediate stehen, je nach Temperatur, in verschiedenen Gleichgewichten zueinander, während das O Intermediat, keine Gleichgewichte eingeht und nur separiert von den anderen Intermediaten auftaucht. Dies bedeutet, dass sich zwischen M und O Intermediat ein unidirektionaler Schritt im Photozyklus befinden muss. Dieser hängt wahrscheinlich mit dem Na+-Transport zusammen, da das Ion beim Übergang vom M zum O aufgenommen und an der Schiffbase vorbei transportiert werden muss.
Um den Photozyklus besser untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Anlage zur transienten Blitzlichtphotolyse aufgebaut und die bestehende Breitband-Blitzlichtphotolyse automatisiert und verbessert. Hierfür wurden mithilfe von MATLAB und LABVIEW verschiedene Programme zur Datenakquisition, -verarbeitung und -analyse geschrieben. Für die transiente Blitzlichtphotolyse musste ein Datenreduzierungsprogramm entwickelt werden, um die mehrere Gigabyte großen Datensätze auf eine verarbeitbare Größe, mit gleichzeitiger Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses, zu bringen. In der Breitband-Blitzlichtphotolyse konnte ein Pulsverzögerungsgenerator als zentrale Steuereinheit aller Komponenten der Breitband-Blitzlichtphotolyse eingesetzt und programmiert werden, um das Messverfahren zu automatisieren. Anschließend musste noch ein neues Datenverarbeitungsprogramm geschrieben werden, welches die Daten für die anschließende Analyse zusammenstellt und vorbereitet. Die neuen Programme gewähren einen reibungslosen Anschluss an die Analysesoftware OPTIMUS, welche in der Arbeitsgruppe genutzt wird.
Molekulare Werkzeuge können in der Wissenschaft unter anderem dazu verwendet werden, biochemische Prozesse gezielt zu untersuchen, um sie somit besser zu verstehen. Dabei handelt es sich zum Beispiel, um kleine chemische Moleküle, die gezielt für ihr Anwendungsgebiet konzipiert worden sind. Mit Ihnen lassen sich z.B. Interaktionen zwischen (Makro-)Molekülen regulieren, chemische Gleichgewichte lokal verändern oder auch Botenstoffe zielgerichtet freisetzen. Die Effekte dieser temporären Einwirkung auf verschiedenste biologische Systeme können hilfreiche Erkenntnisse struktureller, funktioneller oder systematischer Art für die entsprechenden Forschungsgebiete liefern.
Um die interdisziplinären Problemstellungen zielgerichtet mit den entsprechend zugeschnittenen Werkzeugen zu adressieren, ist es dabei jedoch absolut notwendig, dass ein umfassendes und über die Grenzen der jeweiligen Fachgebiete hinaus gehendes Verständnis der jeweiligen Fragestellungen entwickelt wird.
Viele der bisher bekannten Werkzeuge benötigen für ihren Einsatz bis heute noch relativ harsche Reaktionsbedingungen, haben ein eingeschränktes Anwendungsfeld oder lassen sich nicht ausreichend Zeit- & Ortsaufgelöst „aktivieren“. Die Möglichkeit Licht als externes Trigger-Signal zu verwenden, um die entsprechenden molekularen Werkzeuge zu aktivieren (oder auch zu deaktivieren), überwindet genau diese Defizite und bringt neben der hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung noch viele weitere Vorteile mit sich. Im Rahmen meiner Doktorarbeit ist es mir gelungen gemeinsam mit meinen Kooperationspartnern neue lichtaktivierbare molekulare Werkzeuge von Grund auf zu designen, zu synthetisieren, sie auf ihre photochemischen Eigenschaften zu untersuchen und sie anzuwenden. Durch die interdisziplinäre Zusammenarbeit mit Doktoranden aus der Organischen, Theoretischen und Physikalischen Chemie, konnte ein umfassendes Bild dieser neuen Substanzklassen aufgezeigt werden. Die verschiedenen Arten lichtaktivierbarer Werkzeuge sollen im Verlauf dieser Arbeit genauer herausgearbeitet werden. Generell kann man in drei grundlegenden Klassen von lichtaktivierbaren Werkzeugen unterscheiden: 1. irreversibel photolabile Schutzgruppen, 2. photoaktivierbare Label und 3. reversibel lichtschaltbare Photoschalter.
Auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen, auch photoaktivierbare Schutzgruppen oder Photocages genannt, ist es uns gelungen eine neue Spezies von Molekülen zu identifizieren, die dazu in der Lage sind, nach photochemischer Anregung eine spezifische Bindung innerhalb ihres molekularen Gerüsts zu spalten. Möglich gemacht wurde dies, indem wir den sog. „uncaging Prozess ganz neu gedacht“ haben und mit der Unterstützung von Theorie und Spektroskopie unsere Ergebnisse in einer Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie (SAR) festhalten konnten. Aus einer Substanzbibliothek von diversen theoretisch berechneten Kandidaten, wurden die vielversprechendsten Verbindungen anschließend synthetisiert und photochemisch charakterisiert. Nach initialen Untersuchungen und den daraus hervorgehenden Erkenntnissen, wurden weitere molekulare Struktur auf die Optimierungen der photochemischen Eigenschaften hin theoretisch berechnet und anschließend im Labor realisiert. Daraus resultierend entwickelten wir einen Photocage, der mit einer hohen Quantenausbeute mit Licht von über 450 nm photolysierbar ist und ebenfalls dazu in der Lage ist Neurotransmitter wie z.B. Glutamat zielgerichtet und lichtaktiviert freizusetzen. Eine weitere Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie wurde im Rahmen dieser Arbeit mit dem Isatin-Gerüst als potentiell neue photolabile Schutzgruppe durchgeführt.
Ebenfalls konnten in einer dritten Studie auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen Untersuchungen am Coumarin-Grundgerüst zeigen, dass eine systematische Einschränkung der Relaxationspfade im Molekül eine Verbesserung der photochemischen Eigenschaften mit sich bringen kann.
Photoaktivierbare Label werden in den verschiedensten Bereichen der Wissenschaft angewendet. Meist erlauben jedoch die chemischen Moleküle nur eine begrenzte „Beobachtungszeit“ der biochemischen Prozesse aufgrund der effizienten und damit schnellen Relaxationspfade zurück in den Grundzustand. Zu Beginn der durchgeführten Untersuchungen, bestand unsere Idee darin, die selektive Prä-IR-Anregung mit Hilfe eines UV/vis-Pulses (entsprechend der VIPER-Spektrokopie) in ein langlebiges Triplett-Signal eines geeigneten Chromophors zu überführen, welches anschließend für die Beobachtung vergleichsweise lang-lebiger biochemischer Prozesse verwendet werden könnte. Aus dieser Idee heraus entwickelten wir einen Chromophor, der neben einer Absorption im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, zusätzlich eine IR-adressierbare funktionelle Gruppe, sowie die Eigenschaft, ein effizientes Inter-System-Crossing (ISC) nach photochemischer Anregung durchzuführen, besaß. Zu unserem Erstaunen zeigte dieses Derivat jedoch nach erfolgreicher Synthese nicht das erwartete Verhalten. Ein weiteres Beispiel für die hochgradige Komplexität der Photochemie.
Mit Hilfe von theoretischen und spektroskopischen Methoden konnten dennoch viele hilfreiche Erkenntnisse aus dieser Studie für zukünftige Untersuchungen aufgedeckt werden.
Ebenso war es während meiner Promotion eines der Ziele, den Schaltprozess des sog. Fulgid-Photoschalters genauer zu untersuchen und somit besser zu verstehen. Hierbei handelt es sich um ein ausgesprochen beständiges, photochemisch reversibel schaltbares Molekül, auch wenn dies vielleicht auf den ersten Blick ein Widerspruch in sich zu sein scheint. Es gelang uns diesen Photoschalter, genauer gesagt seine Photo-Isomere, auf dem Gebiet der chemischen Aktinometrie zu etablieren.
Dafür waren zahlreiche Messungen diverser Reaktivitäten (photochemische Reaktions-Quantenausbeuten) in verschiedenste Wellenlängenbereiche vom Nah-UV-Bereich bis hin zur 700 nm Grenze erforderlich. Außerdem wurden alle Werte mit der Referenzmessung einer Photodiode bzw. je nach Wellenlängenbereich auch mit der klassischen Ferri-Oxalat-Aktinometrie verglichen. Im Anschluss daran fokussierte ich mich weiter auf die einzelnen Photo-Isomere und ihre einzigartige chemische Struktur. Mit Hilfe der chiralen HPLC gelang es uns die einzelnen Photo-Isomere voneinander zu isolieren und diese mit verschiedensten photochemischen und theoretischen Methoden „genauer unter die Lupe“ zu nehmen. Die aus dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse bereiten den Weg für diverse, zukünftige spektroskopische Anwendungen dieses Photoschalters.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die schnelle Energietransfer- (EET) und Elektronentransfer (ET)-Dynamik unterschiedlichster Quantenpunkte (QD) spektroskopisch untersucht. Die untersuchten Systeme bestanden in den meisten Fällen aus Donor-Akzeptor-Paaren, bei denen die Halbleiternanokristalle als Donor fungierten. Der Fokus lag dabei auf der gezielten Anpassung des Donors, um die optimale Funktionalität zu erreichen. Die Untersuchung der Nanokristalle erstreckte sich daher von einfachen Kernen über verschiedene Kern-Schale-Partikel bis hin zu völlig anderen Strukturen wie Nanoplatelets (NPL). Als Akzeptor wurden eine Vielzahl von Molekülen verwendet, die sich als Elektronen- und/oder Energieakzeptoren für die verschiedenen QDs eignen.
The enzyme quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes is a membrane protein complex that couples the catalysis of the oxidation of menaquinol to menaquinone to that of the reduction of fumarate to succinate. This is the terminal step in fumarate respiration, a form of anaerobic respiration in which oxygen is replaced by fumarate as the terminal electron acceptor in many anaerobic microorganisms. In QFR, both the heme groups (low-potential distal and high-potential proximal heme b group in transmembrane subunit C) are part of the electron transport chain between the two catalytic sites of the redox enzyme. Although the reduction of fumarate by menaquinol is exergonic, it is not exergonic enough to support the generation of a transmembrane electrochemical proton potential delta p. Evidence has previously shown that this reaction is catalysed by a novel mechanism, involving the facilitation of transmembrane electron transfer by transmembrane proton transfer via an essential compensatory transmembrane proton transfer pathway ("E-pathway") which is inactive in the oxidized state of the enzyme. The two key constitutents of the the pathway are the amino acid residue Glu C180 of the transmembrane helix V (located in subunit C) and the ring C propionate of the distal heme bD. The aim of the project was to obtain, by employing a combination of time-resolved as well as static spectroscopic approaches, a detailed insight of the transmembrane electron coupled proton transfer mechanism. Minute changes in both the oxidized and reduced states of a redox protein system can be selectively and sensitively monitored by static Fourier Transformed Infrared (FTIR) difference spectroscopy. The technique employed in this context, electrochemically induced FTIR difference spectroscopy, is complemented by computer-based electrostatic calculations. In order to elucidate the catalytic mechanism of the important reactions in QFR, it is necessary to investigate these in a time-resolved manner. Rapid scan FTIR difference spectroscopy is a suitable technique that allows the course of the reaction to be monitored in a time dependent fashion. The techniques employed in this context are time-resolved (tr-FTIR) and transient absorption spectroscopy. In the following, the details of individual sub-projects are discussed in brief. ...
Experiments on Vibrational Energy Transfer (VET) in proteins contribute to our understanding of fundamental biological processes such as allostery, dissipation of excess energy, and possibly enzymatic catalysis. While these processes have been studied for a long time, many questions remain unanswered. The aim of this work was to expand the application of existing spectroscopic techniques to investigate VET, seeking tailored solutions for the diversity of proteins and amino acid environments. Additionally, new target proteins were to be established to broaden the spectrum of VET experiments towards the role of VET and low-frequency protein modes (LFMs).
To test their suitability as VET sensors, the non-canonical amino acids (ncAAs) Azidoalanine (N3Ala), azido-L-Homoalanine (Aha), p-azido-Phenylalanine (N3Phe), p-cyano-Phenylalanine (CNPhe), and 4-cyano-Tryptophan (CNTrp) were coupled to the VET donor β-(1-azulenyl)-L-Alanine (AzAla) in dipeptides. Their spectral properties were compared using FTIR and VET spectra in H2O, dimethyl sulfoxide, and tetrahydrofuran.
The solvent strongly influences the measured VET signals, which can be explained by the direct interaction of the solvent with the dipeptides. Additionally, the peak time within the subgroups of azide and nitrile sensors increased with the size of the side chain, indicating the dependence between peak time and the distance between VET donor and sensor. When incorporated into a protein, solvent interactions are less dominant. Therefore, Aha, N3Phe, and CNPhe were additionally incorporated at two different positions in the PDZ protein domain and investigated. Due to Fermi resonances, signals from azide sensors are challenging to predict, unlike those of the nitrile sensors.
Overall, the experiments showed that nitrile groups can serve well as VET sensors, as their lower extinction coefficient is compensated for by a narrower bandwidth. This expands the number of potential target proteins, and sensor incorporation can be less disruptive at various protein locations.
Since the VET donor AzAla can inject the energy of a photon into a protein as vibrational energy at a specific location, it can also be used for the targeted excitation of LFMs. If these modes are involved in an enzymatic reaction, a direct influence on activity is expected. This hypothesis has long existed but has not been definitively verified. Some studies have found evidence for the involvement of LFMs in formate dehydrogenase (FDH) catalysis. Therefore, FDH was chosen for the investigation of LFMs in enzymes. This specific system additionally allows the use of a natural VET sensor: it forms a stable complex with NAD+ and N3-, an excellent IR marker. Thus, it provided the opportunity to test low-molecular-weight non-covalent ligands as VET sensors.
After ensuring sufficient AzAla supply through the internal establishment of an enzymatic synthesis, AzAla could be incorporated at various positions in FDH. Despite spectral overlap between free and bound N3-, the latter could be identified by its narrower FWHM. For some variants, no binding could be observed. Circular dichroism spectra showed that these variants structurally deviate slightly from other variants and the wild type (WT). VET could be observed over 22 Å from two regions of the protein to the N3- bound in the active center, at protein concentrations of below 2 mM. Unbound N3- did not generate signals, allowing it to be added in excess ensuring the saturation of the protein in VET experiments.
The activity of FDH WT and four AzAla mutants was investigated under substrate saturation without and with AzAla excitation. In these experiments, a slight reduction in activity under illumination was observed, even for the WT, who is not expected to interact with the excitation light. So far, a difference in sample temperature cannot be excluded as the cause for this decline.
The presented experiments with FDH illustrate the potential of low-molecular-weight ligands as VET sensors, with N3- being particularly attractive due to its simple structure (preventing Fermi resonances) and its high extinction coefficient. Its use can add many metalloproteins as potential targets for VET experiments and allows investigation without a VET sensor ncAA. Additionally, initial experiments were conducted to measure light-dependent FDH activity. By specifically exciting protein LFMs, this project could contribute in the future to answering longstanding questions about the extraordinary catalytic efficiency of enzymes.
Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung und Überprüfung von Modellen zur Berechnung von Schwingungspektren von Peptiden und Proteinen. Solche Modelle verbinden die Konformationsstruktur eines Moleküls mit seinen Schwingungseigenschaften und sind demzufolge wichtig für die Interpretation der Schwingungspektren. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte theoretische Erforschung dieses Gebietes beschränkt sich auf die Betrachtung der Amide-I-Moden, welche aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften sich zur Untersuchung der Peptidkonformationen eignen. Die Arbeit kann prinzipiell in zwei Teile separiert werden. In dem ersten Teil werden Fragen betrachtet, die mit der Entwicklung des Schwingungshamiltonian verbunden sind. Im zweiten Teil wurden die erhaltenen Hamiltonian für die Berechnung der Schwingungspektren verwendet. Bei der Berechnung der Schwingungspektren wurden verschiedene spektroskopische Näherungen verwendet und erforscht. Die Entwicklung des Schwingungshamiltonian beinhaltet zwei Aufgaben. Die ab initio Parametrisierung des Schwingungshamiltonian von Dipeptiden, sowie die Analyse der Entwicklungsmethoden für Schwingungshamiltonian von Polypeptiden. Die Entwicklungsmethoden stützen sich auf ab initio berecheten Schwingungseigenschaften von Dipeptiden und/oder elektrostatische Modelle. Die ab initio Parametrisierung basiert auf einer Geometrieoptimierung und anschließender Berechnung von Normalmoden. Hierbei wurde die Abhängigkeit der Ergebnisse vom theoretischen Niveau und dem verwendeten Basissatz untersucht. Die Transformation der errechneten Normalmoden lieferte die Schwingungseigenschaften der lokale Amide-I-Mode. Die Lokalisierung der Normalmode folgt diversen Kriterien. Sie ist von der Wahl der Lokalmoden und somit implizit auch von der Art der Geometrieoptimierung abhängig. Mit dieser Arbeit konnte die Abhängigkeit der Ergebnisse von der Parameterwahl weitgehend aufgeklärt und eine für das Amide-I-System geeignet Parametrisierung gefunden werden. Im nächsten Arbeitsschritt wurde die Abhängigkeit der Amide-I-Schwingungseigenschaften von den Peptidseitenketten und terminalen Gruppen untersucht. Desweiteren wurden Methoden zur Formulierung der Hamiltonian für Polypeptide konzeptionell entwickelt. Diese Untersuchung ist außerordentlich wichtig, da direkte quantenmechanische Berechnungen von Polypeptiden zu zeitaufwendig sind. Solche Methoden beruhen auf dem sogenannten “Building-Block”-Ansatz und verschiedenen elektrostatischen Modellen. In dieser Arbeit wurden sowohl die einzelnen Methoden als auch ihre Kombination für die Entwicklung des Hamiltonians verwendet. Zur Abschätzung der Genauigkeit der verwendeten Methoden wurden Vergleichsrechnungen durchgeführt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die erhaltenen Schwingungshamiltonian zur Berechnung von Schwingungsspektren diverser gelöster Peptide angewandt. In diesem Zusammenhang konnte die Genauigkeit unterschiedlicher spektroskopischer Approximationen überprüft werden. Auf Grundlage der erhaltenen Ergebnisse können wir sagen, dass eine angemessene Beschreibung der konformationellen Verteilung und eine korrekte Berechnung des dynamischen Absorptionsspektrum gewährleistet ist. Was noch fehlt, ist ein hinreichend genaues quantenchemisches Modell für die Schwingungsfrequenzen eines gelösten Peptids. Diese Aufgabe stellt zur Zeit ein aktives Forschungsgebiet dar. Zuletzt wurde das Schwingungsspektrum eines sogenanten “Photoschaltbaren”-Peptids simuliert. Mit Hilfe des dafür aufgestellten Hamiltonians ist man in der Lage spektroskopische Beobachtungen auf Konformationsänderungen direkt zu übertragen.
Zur Vorhersage der Konformationen organischer Moleküle in wässriger Lösung wurde ein explizites Solvatationsmodell (TPA3) für das Kraftfeldprogramm MOMO entwickelt, getestet und erfolgreich angewendet. Für jede zu optimierende Konformation wird eine der räumlichen Ausdehnung entsprechende Solvathülle generiert. Dadurch werden zu große Solvathüllen mit vielen Wassermolekülen vermieden. Diesem ersten Schritt liegt das Aneinanderreihen von Eiselementarzellen und ungeordneten Wasserzellen zugrunde. Überschneidungen oder unrealistisch nahe Orientierungen von Wassermolekülen zu dem solvatisierten Molekül werden ausgeschlossen. Gleichzeitig wird sichergestellt, dass in der Umgebung von Wasserstoffbrücken-Donoren und -Akzeptoren im solvatisierten Molekül Wassermoleküle zu finden sind.
Die Optimierung vereinfachter Wassermoleküle ohne molekularen Zusammenhalt basiert auf vektoriellen Ausgleichsbewegungen, in die die Bewegungsvektoren der minimierten Wassermolekül-Atome eingehen. Dadurch ist es möglich, ein einziges Potential für Coulomb- und vdw-Wechselwirkungen ohne Vernachlässigung der Rotation zu nutzen, was eine deutliche Rechenzeitoptimierung bedeutet. Die besondere Beachtung der Programmstruktur von MOMO und die sich daraus ergebende Interaktion des Solvatationsmodells mit nahezu allen relevanten Programmteilen des Kraftfeldprogramms ermöglicht trotz ihres kontinuierlichen Austauschs eine Unterscheidung von präzise behandelten nahen und vereinfachten fernen Wassermolekülen während der gesamten Minimierung. Gleichzeitig werden von jedem nahen Wassermolekül die Einzelenergiebeiträge der Wechselwirkungen mit dem solvatisierten Molekül direkt in den Potentialen gesammelt und durch Summation die Stabilisierungsenergie Estab bestimmt.
Somit wird ein Nahbereich mit ungeordneten Wassermolekülen um ein solvatisiertes Molekül herum mit der gesamten in MOMO möglichen Präzision behandelt. Hierbei ist die Berechnung von Wasserstoffbrücken zwischen dem solvatisierten Molekül und umgebenden Wassermolekülen für Estab von entscheidender Bedeutung. Hingegen wird der Fernbereich ausgehend und basierend auf der Eisstruktur rechenzeitoptimiert behandelt. Dynamik und Durchmischung mit dem Nahbereich werden durch den auf der Minimierung der isolierten Atome basierenden TPA3-Algorithmus erreicht.
Mit den erreichten Rechenzeitoptimierungen können systematische Konformationsanalysen an Di- und Tripeptiden in Wasser mit bis zu 2500 Konformationen problemlos durchgeführt werden. Mit den statistischen Auswertungsmethoden des Clusterings, der Medianbildung und der Datenrasterung ergaben sich aussagekräftige Energieflächen über Ramachandran-Diagrammen der berechneten Peptide. Die Visualisierung der Trajektorien und der Minimum-Konformationen der Peptide mit deren Wasserstoffbrücken und der daran beteiligten Wassermoleküle sowie die detaillierte Analyse der Energiebeiträge lieferten eine solide Interpretationsbasis der vorhergesagten Strukturen.
Insgesamt wurden Konformationsanalysen im Vakuum und mit dem neu entwickelten TPA3-Solvatationsmodell an zehn Peptiden durchgeführt. Ungeschützte Peptide wurden in unterschiedlich protonierten Formen berechnet. Vergleichende Konformationsanalysen mit AMBER11 und TIP3P-Solvatationsmodell waren nur für die zwitterionische Form möglich.
Bei dem geschützten Alaninpeptid N-Acetyl-L-L-dialanin-N-methylamid zeigte sich eine Begünstigung der PPII-Struktur. Daneben trat ein Minimum im β-Faltblattbereich auf; eine Stabilisierung des αR-helikalen Bereichs wurde ebenfalls beobachtet. Dies entspricht den in der aktuellen Literatur zu findenden spektroskopisch erhaltenen Ergebnissen.
Aufgrund nicht vorhandener Informationen bezüglich der Energiebeiträge durch das explizite TIP3P-Solvatationsmodell war die Auswertung der AMBER11-Konformationsanalysen auf die Verteilung der Konformationen im Ramachandran-Diagramm begrenzt und somit stark eingeschränkt. Bezüglich N-Acetyl-L-L-dialanin-Nmethylamid ergaben sich auch mit AMBER11 Häufungen im PPII- und β-Faltblatt-Bereich und darüber hinaus im αD-helikalen Bereich.
Für Peptide mit negativ geladenen Seitenketten in der zentralen Position wurden Konformationen, die in Turns zu finden sind, als begünstigt berechnet. Bei Tripeptiden mit Aminosäuren, die Donoren D bzw. Akzeptoren A zur Wasserstoffbrückenbildung in ihren Seitenketten besitzen (Ala−Lys−Ala, Ala−Asp−Ala, Cys−Asn−Ser), wurden in allen Fällen zweifache Wasserstoffbrücken über verbrückende Wassermoleküle hinweg (D/A···H2O···D/A) beobachtet. Diese scheinen insbesondere bei Ala−Asp−Ala durch Beteiligung des Aspartatrestes und einem zweimalig negativen Energiebetrag von mehr als 10 kJ/mol Einfluss auf die Konformation zu nehmen und δ-Turn-Konformationen zu stabilisieren. Die AMBER11-Konformationsanalyse mit TIP3P-Modell ergab hingegen eine deutliche Häufung minimierter Konformationen für φ < 120°. Diese Häufung zeigt sich als deutlicher Streifen im Ramachandran-Diagramm bei φ ≈ 60°. Die α-helikalen Konformationen αD und αL sowie die C7 ax-Struktur sind von AMBER11 hier stark begünstigt. Die Konformationsanalyse mit TPA3-Solvatationsmodell an Ala−Lys−Ala zeigte mehrere Minima; die Konformationen im Bereich δR / PPII / C7 eq werden jedoch besonders stabilisiert. Ein verbrückendes Wassermolekül ist auch hier beteiligt.
Bei den Tripeptiden mit sperrigen Seitenketten, wie Ala−Phe−Ala und Gly−Phe−Gly, wird eine sterische Abschirmung durch den Phenylrest deutlich, die zu einer Abschwächung der Begünstigung von PPII-Konformationen führt. Stattdessen sind α-helikale Konformationen favorisiert. Bei Gly−Phe−Gly scheint diese Abschirmung einen weniger starken Einfluss zu haben: im PPII- und β-Faltblattbereich sind wieder Minima vorhanden. Generell sind die Ergebnisse der MOMO/TPA3-Konformationsanalysen im Einklang mit der aktuellen Literatur und sehr plausibel für Peptide, bei denen (noch) keine eindeutigen Literaturergebnisse vorliegen. Die aktuelle Annahme, dass intramolekulare Wasserstoffbrücken in Peptiden Turn-Konformationen in Wasser stabilisieren könnten, wird mit den in dieser Arbeit mehrfach aufgetretenen zweifachen Wasserstoffbrücken über verbrückende Wassermoleküle erweitert.
Mit AMBER11 konnte dagegen kaum Bezug zu experimentellen Literaturergebnissen hergestellt werden. Dies liegt vor allem daran, dass die für eine aussagekräftige Auswertung unverzichtbaren Energiebeiträge der Peptid-Wechselwirkungen mit einzelnen Wassermolekülen mit AMBER11 nicht zur Verfügung standen. AMBER11 eignet sich daher kaum als Referenz für die mit MOMO und dem neu entwickelten TPA3-Solvatationsmodell erhaltenen Ergebnisse.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Charakterisierung zweier Systeme, bei denen schnelle photoinduzierte Ladungstransferreaktionen auftreten. Mittels Anregungs-Abtast-Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich wurde zum einen die bisher noch nicht charakterisierte Primärreaktion des erst vor wenigen Jahren entdeckten bakteriellen Retinalproteins Proteorhodopsin untersucht. Dieses Protein, das einen signifikanten Beitrag zur Energiebilanz der euphotischen Zone leisten kann, zeigt einen vektoriellen, pH-abhängigen und lichtgetriebenen Protonentransfer über die Zellmembran. Mittels zeitaufgelöster Femtosekundenspektroskopie wurde die Primärdynamik in saurer sowie in alkalischer Umgebung untersucht. Nach Photoanregung von Proteorhodopsin zeigt sich eine konzertierte Schwingung des all-trans-Retinals, die in einer biphasischen Reaktion zu einer Isomerisierung zum 13-cis-Zustand führt. Neben den genauen Zerfallszeiten wird auch das Besetzungsverhältnis des schnellen zum langsamen Zerfallskanal durch den Protonierungszustand des primären Protonenakzeptors gesteuert. In alkalischer Umgebung reagieren mehr Moleküle über den schnellen Reaktionskanal als in saurer Umgebung. Zusätzlich vergrößert sich die Quantenausbeute der Isomerisierungsreaktion vom all-trans- zum 13-cis-Retinal um den Faktor zwei beim Erhöhen des pH-Wertes von 6 auf 9. Durch die Reaktion des Chromophors auf die unterschiedlichen Ladungszustände des primären Protonenakzeptors zeigt sich, dass die Proteinumgebung elementar für die Funktion, speziell auch für die primäre Photodynamik, ist. Eine mögliche Erklärung berücksichtigt die räumliche Nähe der entsprechenden Aminosäure zur C13=C14 Bindung. Durch Deprotonierung an dieser Stelle kommt es zu einer Schwächung der genannten Bindung. Die energetische Barriere für die Isomerisierung wird herabgesetzt und diese Reaktion kann schneller und effizienter ablaufen als bei Gegenwart einer protonierten Aminosäure. Da die Ladung des Akzeptors die Reaktion „steuert“, kann von einer elektrostatischen Kontrolle der Reaktionsdynamik gesprochen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die photoinduzierte Dynamik von Merocyaninen sowohl frei in Lösung als auch an kolloidale Halbleiter gekoppelt untersucht. Für die freien Farbstoffe lassen sich zwei Deaktivierungskanäle unterscheiden. Nach der Photoanregung kann das Merocyanin an der zentralen konjugierten Polymethinkette isomerisieren. Die Entstehung des daraus resultierenden verdrehten Moleküls konnte innerhalb weniger zehn Pikosekunden beobachtet werden. Die andere Möglichkeit die aufgenommene Energie wieder abzugeben besteht in der Bildung eines angeregten Triplettzustandes. Die Besetzung dieses Zustandes lässt sich innerhalb weniger Pikosekunden beobachten und geht somit signifikant schneller vonstatten als die Isomerisierung. Durch Kopplung der Merocyanine an TiO2-Halbleiterkolloide werden andere Deaktivierungskanäle wichtig. Mit einer Zeitkonstante von wenigen zehn Femtosekunden kommt es zu einem schnellen Ladungstransfer aus dem Farbstoff in den Halbleiter. Parallel zu dieser ultraschnellen Elektroneninjektion bildet sich, wie für das ungekoppelte System auch, der verdrehte Zustand. Die Bindung an den Halbleiter führt jedoch zu einer Beschleunigung der Torsionsbewegung, sodass sich die Geometrieänderung innerhalb weniger Pikosekunden beobachten lässt. Auch aus diesem Zustand kommt es zur Elektroneninjektion aus dem Farbstoff in das Leitungsband des Halbleiters. Die Triplettbildung ist dagegen für das gekoppelte System nicht beobachtbar, was zu einer erhöhten Stabilität führt. Neben der Bildung der ladungsgetrennten Zustände konnte mittels der Femtosekundenspektroskopie auch die partielle Rückreaktion zu neutralen Systemen beobachtet werden. Die Reduktion des Merocyaninkations erfolgt innerhalb weniger 100 ps, ist aber nach einer Nanosekunde noch immer nicht vollständig abgeschlossen, sodass ein signifikanter Teil der Moleküle bzw. Kolloide geladen bleibt. Sämtliche Beobachtungen des Farbstoff-Halbleiter-Systems lassen sich in einem Reaktionsmodell zusammenfassen. Mit diesem lässt sich die Dynamik nach Photoanregung erklären, sowie die energetische Lage der beteiligten Zustände im Verhältnis zueinander betrachten. Ein bereits existierendes Reaktionsmodell des freien Farbstoffes konnte mittels der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse auf den Bereich unterhalb von einer Nanosekunde erweitert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit zum einen dazu dienen, natürliche Ladungstransferreaktionen zu verstehen. Durch die Aufklärung der Primärdynamik von Proteorhodopsin konnte ein weiterer Baustein zum Verständnis dieses erst kürzlich entdeckten und für die Energiebilanz der Meere wichtigen Proteins hinzugefügt werden. Zum anderen tragen die Resultate dieser Arbeit auch zum Verständnis eines künstlichen Photosynthesesystems (Grätzelzelle) bei und können zur Effizienzsteigerung sowie zur Optimierung genutzt werden.
Mechanistic characterization of photoisomerization reactions in organic molecules and photoreceptors
(2023)
In dieser Arbeit wurden verschiedene Einflüsse auf die Dynamik von Photoisomerisierungen in Phytochromen und indigoiden Photoschaltern untersucht. Beide Forschungsgebiete teilen wesentliche Aspekte wie die Kontrolle durch sterische Wechselwirkungen und den starken Einfluss der Polarität oder der ionischen Umgebung.
Auf dem Gebiet der Phytochrome wurde die relative Positionierung der knotenlosen Phytochrome innerhalb der Superfamilie der Phytochrome in Bezug auf ihre Photodynamik und den Effekt von Grundzustandsheterogenität herausgearbeitet. Es wurde anhand von ultraschnellen, zeitaufgelösten Anrege-Abtast-Experimenten der einzelnen GAF-Domäne All2699g1 im Vergleich mit dem vollständigen knotenlosen Phytochrom All2699g1g2 und dem strukturell ähnlichen knotenlosen Phytochrom SynCph2 gezeigt, dass knotenlose Phytochrome in ihrer Vorwärtsdynamik eine komplexe mehrphasige Kinetik mit einem langlebigen angeregten Zustand (~100 ps) aufweisen. Die beobachtete mehrphasige Kinetik konnte einer initialen Chromophordynamik sowie einer nicht exponentiellen Reorganisation der chromophor-umgebenden Proteinmatrix zugeordnet werden. Dies steht im starken Kontrast zur im Gebiet der Phytochrome etablierten Beschreibung derartiger mehrphasiger Kinetiken mittels heterogener Grundzustände. Stattdessen wurde ein konserviertes kinetisches Muster identifiziert, welches die mehrphasige Dynamik beschreibt und in allen in dieser Arbeit untersuchten Phytochrome beobachtet wurde. Zudem konnte dieses Muster in einem Phytochrom der Gruppe I und einem Phytochrom der Gruppe III, die einen ähnlichen Pr Dunkelzustand aufweisen, gezeigt werden, was eine breite Anwendbarkeit des damit verbundenen Mechanismus vermuten lässt. Weiterhin konnte die zentrale Rolle eines konservierten Tyrosins in der Photoisomerisierung anhand von Mutationsstudien in All2699g1 herausgearbeitet werden. Diese konservierte Aminosäure muss im Rahmen der Reorganisation der Proteinmatrix vom Chromophor weggezogen werden, damit die sterische Blockade abgebaut werden kann, die die Isomerisierung des Chromophors zunächst verhindert. Da diese Bewegung von diversen Faktoren in der den Chromophor umgebenden Proteinmatrix abhängt, weist sie eine nicht exponentielle Kinetik auf, die je nach Phytochrom, der spezifischen Flexibilität und dem vorhandenen Raum in der Bindetasche unterschiedliche Lebenszeiten aufweist.
Die Rückreaktion knotenloser Phytochrome konnte ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert werden, welche im Pikosekundenbereich abläuft, und damit signifikant schneller ist als die Vorwärtsreaktion. Im Gegensatz zur Vorwärtsreaktion nimmt Grundzustandsheterogenität in der Rückreaktion eine weitaus bedeutendere Rolle ein. Hier weisen die in All2699g1 vorhandenen heterogenen Grundzustandspopulationen jeweils eine eigene Kinetik ihres angeregten Zustands auf, während die homogenen Grundzustände von All2699g1g2 und SynCph2 jeweils nur einen Zerfall des angeregten Zustands zeigen. Der Ursprung dieser Heterogenität konnte im Wasserstoffbrückennetzwerk des Chromophors lokalisiert und mit dem konservierten Tyrosin und einem konservierten Serin in der PHY-Domäne verknüpft werden. Die Anwesenheit der PHY-Domäne sorgt demnach für eine Verringerung der Grundzustandsheterogenität und des vorhandenen Raums in der Bindetasche, wodurch die Effizienz der Photoreaktion optimiert wird.
Zuletzt konnte die Millisekundendynamik knotenloser Phytochrome und der Einfluss der PHY-Domäne auf diese aufgeklärt werden. Die PHY-Domäne sorgt hierbei durch den verringerten Raum in der Bindetasche dafür, dass die zunächst stattfindende thermische Relaxation des Chromophors signifikant verlangsamt wird, während spätere Änderungen im Photozyklus nur wenig beeinflusst werden.
Auf dem Gebiet der indigoiden Photoschalter konnte, anhand eines sterisch überladenen Hemithioindigo Photoschalters, der Photoisomerisierungsmechanismus des Hula-Twists beobachtet und eine starke Lösungsmittelabhängigkeit der entsprechenden Kinetik aufgezeigt werden. Aus den durchgeführten zeitaufgelösten Anrege-Abtast-Experimenten in verschiedenen Lösungsmitteln konnte ein Modell für die Photodynamik des verwendeten Hemithioindigo Photoschalters entwickelt werden. In unpolaren Lösungsmitteln muss eine hohe Barriere zur produktiven konischen Durchschneidung überwunden werden, was zu Lebenszeiten des angeregten Zustands im Nanosekundenbereich führt. Der Weg zur produktiven konischen Durchschneidung folgt dabei dem Hula-Twist Mechanismus. Dieser Pfad ist in polaren Lösungsmitteln unerreichbar, weshalb eine schnelle Relaxation über eine unproduktive konische Durchschneidung stattfindet.
Im zweiten Projekt auf dem Gebiet der indigoiden Photoschalter wurde anhand der neuartigen Klasse der Iminothioindoxyl Photoschalter ein Schwingungsenergiedonor für Schwingungsenergietransferstudien entwickelt. Das daraus entwickelte Modellsystem, bestehend aus einer künstlichen Aminosäure auf Basis des Iminothioindoxyl Photoschalters und einem daran gekoppelten Schwingungsenergiesensor, wurde charakterisiert und die primäre Photoreaktion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der angeregte Zustand des Modellsystems kurzlebig ist und unter Abgabe von großen Mengen an Schwingungsenergie zerfällt, unabhängig von der Anregungswellenlänge und dem verwendeten Lösungsmittel. Somit zeigt das entwickelte System vorteilhafte Eigenschaften für Schwingungsenergietransferstudien.
Insgesamt konnten somit die Mechanismen der Photoisomerisierungsreaktionen in knotenlosen Phytochromen und indigoiden Photoschaltern aufgeklärt und daraus die Relevanz der Umgebung für derartige Reaktionen herausgearbeitet werden.
Die Verwendung von Photoschaltern zur gezielten Kontrolle von Systemen birgt ein hohes Potential hinsichtlich biologischer Fragestellungen, bis hin zu optoelektronischen Anwendungen. Infolge einer Photoanregung kommt es zu Geometrieänderungen, die einen erheblichen Einfluss auf ihr photophysikalisches Verhalten haben. Die Änderungen der photochemischen, wie photophysikalischen Eigenschaften, beruht entweder auf der Isomerisierung von Doppelbindungen oder auf perizyklischen Reaktionen. Durch sorgfältige Modifikationen, wie beispielsweise die Änderung der Konjugation durch unterschiedlich große π-Elektronensysteme, der Molekülgeometrie oder der Veränderung des Dipolmoments, lassen sich intrinsische Funktionen variieren.
Die Kombination dieser Eigenschaften stellt eine komplexe Herausforderung dar, da diese Änderungen einen direkten Einfluss auf wichtige Charakteristika wie die Adressierbarkeit, die Effizienz und die Stabilität der Moleküle haben. Darüber hinaus spielt die thermische Stabilität eine erhebliche Rolle im Hinblick auf die Speicherung von Energie oder Informationen für Anwendungsbereiche in der Energiegewinnung und Datenverarbeitung.
Für die Anwendung solcher photochromen Moleküle ist hinsichtlich der oben genannten Eigenschaften auch das Wissen über den photoinduzierten Reaktionsmechanismus unabdingbar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik organischer Photoschalter durch unterschiedliche Modifikationen mittels stationärer und zeitaufgelöster Spektroskopie untersucht. Im Bereich der Merocyanine konnte ein Derivat vorgestellt werden, das ausschließlich zwischen zwei MC-Formen (trans/cis) isomerisiert. Die interne Methylierung am Phenolatsauerstoff der Chromeneinheit verhindert die Ringschlussreaktion zum SP und somit seinen zwitterionischen Charakter. Die stabilen Grundzustandsisomere TTT und CCT weisen durch den Methylsubstituenten eine hypsochrome Verschiebung ihrer Absorptionsmaxima auf, während TTT das thermodynamisch stabilste Isomer darstellt. Das MeMC wies eine erstaunlich hohe Effizienz seiner Schaltamplituden, insbesondere der TTT → CCT Photoisomerisierung auf, sowie eine überaus hohe Quantenausbeute.
Das MeMC wies zudem eine signifikante Lösungsmittelabhängigkeit auf, die sich insbesondere in der Photostabilität bemerkbar macht. Während das MeMC in MeCN und EtOH photodegradiert, konnte in EtOH/H2O eine konstante Reliabilität festgestellt werden. Diese Zuverlässigkeit impliziert nicht nur eine Stabilisierung durch das Wasser, sondern auch eine Resistenz gegenüber Hydrolysereaktionen. Darüber hinaus konnten kinetische Studien eine hohe thermische Rückkonversion von CCT zu TTT bei Raumtemperatur nachweisen, womit auf schädliche UV-Bestrahlung verzichtet werden könnte.
Die Untersuchung der Kurzzeitdynamiken beider Grundzustandsisomere gab Aufschluss über die Beteiligung anderer möglicher MC-Intermediate und den Einfluss der Methylgruppe auf das System. Mittels quantenchemischer Berechnungen konnte eine erste Initiierung um die zentrale Doppelbindung beider Isomere bestimmt werden, die jeweils zu einem heißen Grundzustandsintermediat führt, bis nach einer zweiten Isomerisierung der endgültige Grundzustand der Photoprodukte populiert wird. Dies bedeutet, dass die trans/cis-Isomerisierung über TTT-TCT-CCT und die Rückkonversion über CCT-CTT-TTT erfolgt.
Im Bereich der Hydrazon-Photoschalter konnten unterschiedlich substituierte Derivate mittels statischer und zeitaufgelösten UV/Vis-Studien untersucht werden. Da ESIPT Prozesse eine wichtige Funktion bei der Kontrolle von biologischen Systemen spielen, wurden verschiedene Hydrazonderivate hinsichtlich ihrer Reaktionsmechanismen untersucht. Als Rotoreinheit diente zum einen eine Benzothiazolkomponente, die die interne H-Bindung des angeregten Z-Hydrazons schwächen sollte und zum anderen wurde ein Chinolinsubstituent eingesetzt, der als Elektronenakzeptor diente und den H-Transfer begünstigt. Der Einsatz der Benzothiazolkomponente bewirkte die gewünschte Vergrößerung der bathochromen Verschiebung des E-Isomers, sowie eine deutliche Erhöhung der thermischen Stabilität des metastabilen
Zustands. Dies bestätigten die zeitaufgelösten Studien der Z zu E Isomerisierung, bei denen die Isomere im Vergleich zum Chinolinhydrazonderivat, in beiden ausgewählten Lösungsmitteln metastabile Z-Intermediate zeigten und eine Lebenszeit bis in den µs-Zeitbereich aufwiesen. Die Rückreaktion beider Derivate (HCN) und (HBN) hingegen zeigte eine barrierelose Umwandlung in die beteiligten Photoprodukte. Trotz der Verwendung des Chinolinsubstituenten zusammen mit Naphthalin als Rotoreinheit (HCN), konnte kein ESIPT Prozess beobachtet werden. HCB mit einer Kombination aus einem Chinolinrotor und eines Benzothiazolsubstituenten, wies eine Hydrazon-Azobenzol-Tautomerie auf, die ein prototropes Gleichgewicht zwischen dem E-Hydrazon und der E-Azobenzolform (E-AB) ausbildete. Die Reaktionsdynamiken des Z-Hydrazons zum E-AB wiesen eine ultraschnelle Bildung des Photoproduktes auf, während die Rückreaktion über einen ESIPT im sub-ps-Bereich erfolgte. Dieser H-Transfer hat die Bildung des angeregten E-Hydrazons zur Folge. Interessanterweise wurde kein Rückprotonentransfer nachgewiesen, sondern die mögliche Formation eines Z-AB gefunden. Damit unterscheidet sich dieser Reaktionsmechanismus erheblich von den typischen ESIPT Prozessen, die normalerweise zu ihrem Ausgangsmolekül zurückrelaxieren. Des Weiteren konnte ein Pyridinoxid und Benzoylpyridin-substituiertes Hydrazon charakterisiert werden, bei denen die stationären Studien kein Schaltverhalten, sondern Photodegradation aufwiesen. Die zeitaufgelösten Daten ergaben ebenfalls keine Photoproduktbildung, was die These der Photozersetzung unterstützt. Die Verwendung von zusätzlich substituierten Rotoreinheiten, wie beispielsweise Pyridinoxid und Benzoylpyridin, die aufgrund fehlender Protonenakzeptormöglichkeit keine interne H-Bindung ausbilden, erlaubt keine Bildung des Z-Hydrazon Isomers.