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In the past century, scientists have realized that venoms are a source of a number of natural substances presenting a wide range of pharmacological properties and often displaying a high specificity for their targets. Thus, the field of toxinology came into being, which is defined as the study of toxic substances of biological origin. Toxins are found in a wide variety of animals, including fish, cone snails, scorpions, snakes, and even some mammals. To be classified as venom, these must contain substances, i.e. toxins, which disturb physiological processes and must be deliberately delivered to the target animal. Snakes have evolved one of the most sophisticated mechanisms for venom delivery. Envenomation by snakebite can induce and inhibit aggregation/agglutination of platelets as well as inhibit/activate hemostasis, but also disrupt other physiological functions via neurotoxins and angioneurin growth factors. Snake venoms contain a substantial amount of C-type lectin-related proteins (CLRPs) which are known to function, notably, as integrin inhibitors. CLRPs are heterodimers composed of homologous α and β subunits which can assemble either covalently or noncovalently to oligomers, resulting in αβ, (αβ)2 and (αβ)4 structures. Some of the main targets of CLRPs are membrane receptors, coagulation factors, and proteins essential to hemostasis. The platelet collagen receptors GPVI and α2β1 integrin as well as the von Willebrand factor receptor GPIb play important roles in platelet activation and aggregation and are considered main targets of antithrombotic drugs. In this thesis, the integrin α2β1 is particularly considered as it is the sole collagen-binding integrin on platelets. Reduced expression of this platelet receptor results in dysfunction of platelet responses. Equivalently, overexpression of α2β1 integrin results in an increased risk of thrombosis. As a result, selective inhibitors of the collagen-α2β1 interaction could give rise to effective antithrombotic drugs. Integrins are large receptors which mediate cell-cell contacts and the binding of cells to the extracellular matrix (ECM). Therefore, they play a role in physiological processes, e.g. hemostasis and immunity, as well as in pathological processes, e.g. tumor angiogenesis and atherosclerosis. 18 α and 8 β integrin subunits, with nine α subunits containing an additional A domain, associate non-covalently to form 24 heterodimers with distinct binding specificities. Integrin collagen receptors are a subclass of four receptors which all utilize the β1 subunit. The α2β1 integrin is a collagen-binding receptor expressed not only on platelets, but also on endothelial and epithelial cells. Consequently, this integrin is also essential for cell adhesion and migration playing a role in angiogenesis as well as tumor metastasis. To date, there are five known antagonists of α2β1 integrin: EMS16, rhodocetin, vixapatin, and most recently rhinocetin and flavocetin-A. The first four have been shown to be specific for the integrin α2A domain, the major collagen-binding domain. All these antagonists are CLRPs and present new leads for drug design. In the past few years, many insights into the structure and function of rhodocetin were obtained. Monoclonal antibodies proved to be advantageous in disclosing this information, making them not only useful as therapeutic agents, but also as tools for protein characterization. The venom of the Vipera palaestinae snake was recently shown to contain an α2β1 integrin inhibitor, which prevented the integrin from binding collagen. This inhibitor, called vixapatin, was the initial focus of this dissertation. Vixapatin’s interaction with the α2β1 integrin needed further characterization on a molecular and cellular level to assess its medical potential and monoclonal antibodies were to be used as a tool. Originally, vixapatin had been isolated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. To avoid the stringency of this method, for this study, it was replaced with gentler chromatographic methods. First, the α2β1 integrin inhibitor was isolated from the crude snake venom with affinity chromatography using the α2A domain as bait, establishing a method to quickly screen venoms for α2β1-binding proteins which affect the collagenintegrin interaction. The applicability of this method to other snake venoms was shown by isolating an α2A domain-specific toxin from the venom of Trimeresurus flavoviridis. To allow further characterization of both these toxins, gel filtration and ion exchange chromatography were employed to purify the protein without the α2A domain. These classical protein purification methods resulted in similar separation patterns of both the V. palaestinae and T. flavoviridis venom proteins. Purified proteins exhibiting the potential of inhibiting integrinbinding to collagen were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Both VP-i and flavocetin-A, the integrin inhibitors from V. palaestinae and T. flavoviridis, respectively, were shown to have more complex structures than was evident from the purification. Each consisted of four low-molecular-weight proteins which assembled into two bands (for VP-i) or one single band (for flavocetin-A) under non-reducing conditions. Mass spectrometry analyses revealed VP-i to belong to the family of CLRPs, just like vixapatin does. However, these two proteins differed in their primary sequences and only showed homology to one another. The toxin purified from T. flavoviridis revealed this toxin to be flavocetin-A, a heterodimeric CLRP which had so far only been shown to have GPIb-binding activity. At the time of flavocetin-A’s purification, flavocetin-B was co-purified; flavocetin-B consists of the same two α and β subunits, plus an additional γ subunit. As no sequence information is known to date for the γ subunit, it may be one of the additional proteins purified here, along with an additional δ subunit. Therefore, the toxin isolated here may actually consist of four different subunits forming a tetramer of two different heterodimers, generating an (αβ)2(γδ)2 structure. This proposed (αβ)2(γδ)2 flavocetin-A structure has binding sites for both α2β1 integrin and GPIb, with no sterical overlap, as shown by affinity chromatography using the α2A domain and the extracellular domain of the GPIb receptor. The potential of VP-i and flavocetin-A to inhibit integrin-binding to type I collagen was shown during purification: Both toxins efficiently bind to the integrin α2A domain; also, VP-i and vixapatin bind to the A domain with the same affinity. Surface plasmon resonance showed the interaction of flavocetin-A with the α2β1 integrin to be extremely strong and association to be very fast. Furthermore, both toxins were shown to inhibit binding of the wildtype integrin to collagen: VP-i and flavocetin-A acted antagonistically on cell adhesion and cell migration. Initially, the interaction between VP-i and α2β1 integrin was to be further characterized with the help of monoclonal antibodies. However, this proved problematic, the procedure requiring various optimizations. Although, after expert consultation, some monoclonal antibodies could be obtained, the cells were extremely sensitive and gave unsatisfactory results when tested as detection tools in Western blot and immunoassays. Concluding, two novel α2β1 integrin inhibitors were discovered: VP-i and flavocetin-A, which were purified using the same procedure and which have similar functions. Both are Ctype lectin-related proteins which effectively inhibit cell adhesion and migration. This underlines that nature has instrumentalized CLRPs to specifically inhibit α2β1 integrin. Further characterization of VP-i and flavocetin-A will be able to provide leads for future drug development.
Locomotion, the way animals independently move through space by active muscle contractions, is one of the most apparent animal behaviors. However, in many situations it is more beneficial for animals to actively prevent locomotion, for instance to briefly stop before reorienting with the aim of avoiding predators, or to save energy and recuperate from stress during sleep. The molecular and cellular mechanisms underlying such locomotion inhibition still remain elusive. So, the aim of this study was to utilize the practical genetic model organism Caenorhabditis elegans to efficiently tackle relevant questions on how animals are capable of suppressing locomotion.
Nerve cells, mostly called neurons, are known to control locomotion patterns by activating some and inhibiting other muscle groups in a spatiotemporal manner via local secretion of molecules known as neurotransmitters. This study particularly focuses on whether neuropeptides modulate such neurotransmission to prevent locomotion. Neuropeptides are small protein-like molecules that are secreted by specific neurons and that act in the brain by activating G protein-coupled receptors (GPCRs) expressed in other target neurons. They can act as hormones, neuromodulators or neurotransmitters. DNA sequences coding for neuropeptides and their cognate receptors are similar across diverse species and thus indicate evolutionary conservation of their molecular signaling pathways. This could potentially also imply that regulatory functions of specific neuropeptides are also similar across species and are thus meaningful to unravel more general mechanisms for instance underlying locomotion inhibition.
Specifically, we find that the modulatory interneuron RIS constitutes a dedicated stop neuron of which the activity is sufficient to initiate rapid locomotion arrest in C. elegans while maintaining its body posture. Similar to its known function in larval sleep, RIS requires RFamide neuropeptides encoded by the flp 11 gene for this activity, in addition to GABA. Furthermore, we find that spontaneous calcium activity transients in RIS are compartmentalized and correlated with locomotion stop. These findings illustrate that a single neuron can regulate both stopping and sleeping phenotypes.
Secondly, we show that C. elegans RPamide neuropeptides encoded by nlp-22 and nlp-2 regulate sleep and wakefulness, respectively. We unexpectedly find that these peptides activate gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-like receptors dose dependently and we highlight their sequence resemblance to other bilaterian GnRH-like neuropeptides. In addition, we show that these receptors are expressed in distinct subsets of neurons that are associated with motor behavior. Finally, we show that nlp 22 encoded peptides signal through GNNR 6 receptors to regulate larval sleep and that nlp 2 encoded peptides require both GNRR 3 and GNRR 6 receptors to promote wakefulness.
In sum, we find that locomotion inhibition in C. elegans is regulated by multiple, but evolutionary conserved RFamide and GnRH-like RPamide neuropeptidergic signaling pathways.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
Starkes Übergewicht und eine damit einhergehende Hypertrophie von Geweben aber auch des Herz-Kreislauf-Systems führen zu einer Reihe von Folgeerkrankungen wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 oder auch Arteriosklerose. Während im Fettgewebe freie Fettsäuren, die von Makrophagen aufgenommen werden, eine entscheidende Rolle spielen, scheint in der Pathogenese von Arteriosklerose die Aufnahme von Fettsäuren aus Lipoproteinpartikeln durch Makrophagen von großer Wichtigkeit zu sein. Ein weiterer Faktor, der durch freie Fettsäuren ausgelöst wird ist ER-Stress. Makrophagen, die zu Triglycerid (TG) reichen Schaumzellen geworden sind, akkumulieren in arteriosklerotischen Läsionen. Der Lipidmetabolismus von Makrophagen wird transkriptionell u.a. durch den Transkriptionsfaktor PPARγ (Peroxisomproliferator aktivierter Rezeptor γ) reguliert. Sein Zielgen FABP4 (Fettsäuren bindendes Protein 4) beschleunigt die Entwicklung von Arteriosklerose in Mausmodellen. Da die Expression von PPARγ und FABP4 in IL 4- (Interleukin-4) polarisierten Makrophagen induziert wird, sollte die Rolle von FABP4 in humanen, mit IL 4 polarisierten Makrophagen untersucht werden. Hierfür wurden primäre humane Monozyten in Anwesenheit von LPS/IFNγ (Lipopolysaccharid/Interferon γ) bzw. IL 4 zu Makrophagen differenziert. Es zeigte sich, dass in LPS/IFNγ stimulierten Makrophagen PPARγ und dessen Zielgene nicht exprimiert wurden. Dagegen waren sie bei unstimulierten Makrophagen bei IL 4 stimulierten Makrophagen deutlich erhöht. Dies spiegelte sich auch in einer erhöhten Aufnahme von Triglyceriden aus VLDL-Partikeln (Lipoproteinpartikel sehr niedriger Dichte) wider. IL 4 induzierte also einen Fettsäuren akkumulierenden Phänotyp. Durch einen PPAR-Luciferase-Reporter-Test wurde untersucht, ob FABP4 für die Aktivierung von PPARγ nötig war. Dies konnte bestätigt werden, da PPARγ durch seinen Liganden Linolsäure nur in Anwesenheit von FABP4 aktiviert werden konnte. Diese Aktivierung konnte zusätzlich durch den FABP4-Inhibitor HTS01037 verhindert werden. Nun sollte der Einfluss von FABP4 auf die PPARγ-abhängige Genexpression untersucht werden. Hierfür wurde FABP4 während der Differenzierung mit den beiden Inhibitoren HTS01037 oder BMS309403 in IL 4 stimulierten Makrophagen inhibiert. Durch die Inhibition von FABP4 sank die Expression von FABP4 und LPL (Lipoproteinlipase), während die von PPARγ unverändert blieb. Die LPL spielt eine entscheidende Rolle in der Aufnahme von Lipiden aus VLDL-Partikeln und trägt somit zur TG-reichen Schaumzellbildung bei. Die verminderte Expression von LPL spiegelte sich in einer verminderten Lipidaufnahme aus VLDL-Partikeln wider. Gleichzeitig wurde durch die FABP4-Inhibition die Entzündungsantwort der Makrophagen auf VLDL-Partikel abgeschwächt. IL 4 induziert also LPL, indem es PPARγ aktiviert. FABP4 unterstützt hierbei die Aktivierung von PPARγ. Durch die Inhibition kann die LPL-Expression vermindert werden, was die TG-reiche Schaumzellbildung und die Entzündungsreaktion in einem VLDL-reichen Umfeld vermindert und eine neue Therapiemöglichkeit von Arteriosklerose eröffnet. Im Fettgewebe kommt bei starkem Übergewicht, bedingt durch die erhöhte Konzentration an freien Fettsäuren und Hypoxie, zu einer leichten Entzündungsreaktion. Diese Entzündungsreaktion wurde durch eine Stimulation mit Palmitat unter Hypoxie (1 % O2) nachgebildet. Überstände von Makrophagen nach dieser Stimulation (MCM) wurden auf primäre humane Adipozyten übertragen. Diese Überstände konnten zwar keine Insulinresistenz in Adipozyten auslösen, induzierten jedoch eine Entzündungsreaktion. Diese zeigte sich in einer erhöhten Expression der proentzündlichen Zytokine CCL2 (CC-Chemokin-Ligand-2) und IL 6. Gleichzeitig wurde die Expression des antientzündlichen Zytokins Adiponectin vermindert. Der Transfer von MCM ist also ein Modell für die Entstehung der Insulinresistenz in einem frühen Stadium. Beim Versuch, die entzündungsfördernde Fähigkeit des MCMs zu verhindern, wurde AMPK mit verschiedenen Aktivatoren stimuliert. Es zeigte sich, dass der AMPK-Aktivator AICAR (5-Aminoimidazol-4-carboxamidribonukleotid) die Entzündungsantwort und den ER-Stress von mit Hypoxie und Palmitat stimulierten Makrophagen deutlich reduzierte. Der starke Effekt auf den ER-Stress konnte auch mit anderen ER-Stress-Auslösern wie Thapsigargin oder Tunicamycin nachvollzogen werden. Da AICAR ein AMPK-Aktivator ist, wurden typische Effekte der AMPK-Aktvierung wie reduzierte Proteinexpression, verstärkte Sirtuin-1-Aktivierung und Steigerung der Fettsäurenoxidation mittels Inhibitoren verhindert. Dies hatte keinen Einfluss auf die Wirkung von AICAR. Ebenso wurde untersucht, ob AICAR in die Zelle aufgenommen werden musste und ob es zu seiner phosphorylierten Form ZMP umgewandelt werden musste. Durch den Inhibitor ABT 702 kann die Adenosinkinase inhibiert werden, welche die Phosphorylierung katalysiert. Es zeigte sich, dass die Phosphorylierung von AICAR zu ZMP nicht erforderlich war, damit AICAR die ER-Stress-Antwort hemmen konnte. AICAR und nicht ZMP wirkte gegen den ER-Stress. Da durch das fehlende ZMP die AMPK nicht aktiviert wurde, war das ein weiteres Zeichen, dass AICAR AMPK-unabhängig wirkte. Dies konnte durch einen AMPK-Knockdown bestätigt werden. Durch einen Knockdown verschiedener Adenosintransporter konnte gezeigt werden, dass SLC28A3 (Soluttransporterfamlie 28 Typ A3) verantwortlich für die Aufnahme von AICAR in primäre humane Makrophagen war. Es konnte demnach gezeigt werden, dass AICAR den ER-Stress in primären humanen Makrophagen in einem von AMPK unabhängigen Mechanismus vermindert. Dafür wird es mittels SLC28A3 in die Zelle aufgenommen und wirkt als AICAR und nicht als ZMP. Diese Erkenntnisse stellen eine interessante, neue therapeutische Möglichkeit im Feld von Arteriosklerose und Diabetes dar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene metabolische Anpassungsmechanismen des humanpathogenen Bakteriums Acinetobacter baumannii an seinen Wirt untersucht. Im ersten Teil wurde die Rolle von verschiedenen Trimethylammoniumverbindungen (Cholin, Glycinbetain und Carnitin) und den zugehörigen Aufnahmesystemen, sowie ihren Stoffwechselwegen während dieses Prozesses analysiert. Für die Analyse der Transportsysteme wurde eine markerlose Vierfachmutante (Δbcct) von A. baumannii generiert, sodass alle bekannten Transportsysteme für die genannten Verbindungen deletiert vorlagen. Wachstumsversuche mit dieser Mutante zeigten, dass es in A. baumannii keine weiteren Transporter für die Aufnahme von Cholin gibt, jedoch weitere primär aktive oder sekundär aktive Transporter für die Aufnahme von Glycinbetain. Weiterhin konnten innerhalb dieser Arbeit die KM-Werte der Transporter bestimmt werden. Verschiedene Virulenz- und Infektionsanalysen führten zu dem Schluss, dass die Transporter keine Rolle bei der Virulenz von A. baumannii spielen. In Genomanalysen konnten die Gene, die für die Enzyme des Oxidationsweges von Cholin zu Glycinbetain kodieren identifiziert werden (Cholin-Dehydrogenase (betA), GlycinbetainAldehyd-Dehydrogenase (betB) und ein potenzieller Regulator (betI)). Es wurden Deletionsmutanten innerhalb dieses Genclusters generiert, mit dessen Hilfe gezeigt werden konnte, dass Cholin unter Salzstress ausschließlich als Vorläufer für das kompatible Solut Glycinbetain fungiert und nicht als kompatibles Solut von A. baumannii genutzt werden kann. Virulenz- und Infektionsstudien mit den Deletionsmutanten zeigten, dass der Cholin-Oxidationsweg keine Rolle bei der Virulenz von A. baumannii spielt.
Die Cholin-Dehydrogenase BetA wurde zusätzlich in E. coli produziert und anschließend mittels NiNTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die biochemische Charakterisierung des Enzyms zeigte, dass BetA membranständig ist und die höchste Aktivität bei einem pH-Wert von 9,0 hat. Salze wie NaCl oder KCl hatten keinen Effekt auf die Aktivität des Enzyms, während Glutamat die Aktivität stimulierte.
Weiterhin konnte FAD als Cofaktor identifiziert werden und der KM-Wert ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Oxidation von Cholin zu Glycinbetain unter isoosmotischen Bedingungen zu einem Anstieg der ATP-Konzentration in A. baumannii-Zellsuspensionen führt und damit, dass Cholin als alternative Energiequelle genutzt wird. Das Phospholipid Phosphatidylcholin konnte als natürliche Cholinquelle identifiziert werden. Eine Rolle der Phospholipasen D bei der Abspaltung der Cholin-Kopfgruppe des Phosphatidylcholins konnte ausgeschlossen werden. Die Gene für die Oxidation von Cholin zu Glycinbetain werden ausschließlich in Anwesenheit von Cholin exprimiert, jedoch unabhängig von der extrazellulären Salzkonzentration. Diese Studien zeigten, dass der Cholin-Oxidationsweg eine Rolle in der metabolischen Adaptation von A. baumannii an den Wirt spielt. Phosphatidylcholin kann hier als natürliche Cholinquelle im Wirt genutzt werden, da die Wirtsmembranen aus bis zu 70 % Phosphatidylcholin bestehen. Transportstudien mit Carnitin führten zu dem Schluss, dass der Transporter Aci01347 aus A. baumannii neben Cholin ebenfalls Carnitin transportiert. Wachstumsversuche mit einer aci01347-Mutante bestätigen, dass Aci01347 essenziell für die Aufnahme und anschließende Verwertung von Carnitin als Kohlenstoffquelle ist. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass das Transportergen mit essenziellen Genen für den Carnitin-Abbau in einem Operon liegt. Für die Analyse des Abbauweges von Carnitin wurden markerlose Deletionsmutanten innerhalb des Operons generiert. In Wachstumsstudien mit diesen Mutanten konnte der Abbauweg aufgeklärt werden und der Regulator des Operons identifiziert werden. Carnitin wird hier über Trimethylamin und Malat-Semialdehyd zu D-Malat umgewandelt und anschließend über Pyruvat in den TCA-Zyklus eingespeist. Der Regulator wurde zusätzlich in E. coli produziert und mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Mithilfe von EMSA-Studien konnte die Bindestelle des Regulators auf eine 634 Bp lange DNA-Sequenz stromaufwärts des CarnitinOperons eingegrenzt werden. Durch Transkriptomanalysen konnte gezeigt werden, dass bei Wachstum mit Acetylcarnitin, Carnitin und D-Malat die Expression des Carnitin-Operons induziert wurde. Darüber hinaus wurden die Gene konservierter Aromatenabbauwege wie z. B. des Homogentisatweges, des Phenylacetatweges und des Protocatechuat-Abbaus, verstärkt exprimiert. In G. mellonellaVirulenzstudien konnte eine Rolle des Abbaus von Carnitin bei der Virulenz von A. baumannii nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte dieser Effekt dem entstehenden Trimethylamin zugesprochen werden...
Die mitochondriale Atmungskette und insbesondere die Cytochrom c Oxidase als deren terminales Enzym sind essentiell für den Energiestoffwechsel eukaryotischer Zellen. Die Assemblierung der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase mit ihren bis zu 13 Untereinheiten ist noch nicht bis ins Detail aufgeklärt, aber es handelt sich um einen geordneten, stark regulierten Prozess, und Defekte der Assemblierung sind häufig Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen. In Eukaryoten sind bisher mehr als 30 Proteine identifiziert worden, die an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt sind, darunter Surf1. Beim Menschen führt der Verlust von Surf1 zu einer letalen neurodegenerativen, als Leigh-Syndrom bezeichneten Krankheit, wobei die genaue Rolle von Surf1 bei der Assemblierung der Cytochrom c Oxidase unklar ist. Das Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans kann als Modellorganismus für die mitochondriale Atmungskette dienen, da seine aeroben Atmungskettenkomplexe eine deutliche Homologie zu denen der Mitochondrien auf weisen. P. dentrificans besitzt zwei homologe Gene für Surf1, die in Operons mit terminalen Oxidasen assoziiert sind: surf1c ist im cta-Operon lokalisiert, das für Untereinheiten der aa3-Cytochrom c Oxidase kodiert, und surf1q im qox-Operon, das die Gene für die ba3-Ubichinoloxidase enthält. Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Gene und ihre Translationsprodukte zu charakterisieren und auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Chromosomale Einzel- und Doppeldeletionen beider surf1-Gene führten zu einem spezifischen Aktivitätsverlust der jeweiligen Oxidase in Membranen, wobei surf1c und surf1q unabhängig von einander für ihre korrespondierenden Oxidasen zuständig sind und keine überlappenden Funktionen besitzen. Dies war der erste experimentelle Hinweis, dass ein Surf1-Protein auch bei der Assemblierung einer Chinoloxidase eine Rolle spielt. Untersuchungen an aufgereinigter aa3-Cytochrom c Oxidase ergaben, dass der Hämgehalt im Fall der surf1c-Deletion stark vermindert ist. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Vermutungen, dass Surf1 eine Rolle beim Häm-Einbau in UEI spielt. Diese Arbeit untersuchte zum ersten Mal aufgereinigtes Surf1-Protein und lieferte mit der Charakterisierung weitere Hinweise auf seine Rolle beim Häm a-Einbau in terminale Oxidasen. So konnte gezeigt werden, dass sowohl Surf1c und als auch Surf1q Häm a in vivo binden. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden und der isothermen Titrationskalorimetrie konnte die Bindung von Häm a an apo-Surf1c und Apo-Surf1q quantifiziert werden. Beide Proteine binden Häm a mit submikromolaren Affinitäten in einer 1:1 Stöchiometrie. Ligandenbindungspektren wiesen weiterhin darauf hin, dass das Eisenatom des Häm a in Surf1 nur über fünf Liganden koordiniert ist. Über gerichtete Mutagenese konnte der konservierte Histidinrest His193 für Surf1c und His202 für Surf1q als möglicher fünfter Ligand des Eisenatoms identifiziert werden. Untersuchungen zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen zeigten eine direkte Interaktion zwischen der Häm a Synthase und den beiden Surf1-Proteinen in vivo und in vitro, die zuvor noch für kein anderes Surf1-Homolog beschrieben war. Zusätzlich konnte ein Transfer von Häm von der Häm a Synthase auf Surf1c bzw. Surf1q in vitro erreicht werden. Für Surf1c ließ sich außerdem eine Interaktion mit Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase nachweisen. Obwohl die Funktion von Surf1 im Rahmen der Biogenese der Cytochrom c Oxidase noch nicht abschließend geklärt werden konnte, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit nichtsdestotrotz klare Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Surf1 beim Einbau der Häm a-Kofaktoren, und ein neues Modell für die Funktion von Surf1 konnte erstellt werden.
Prokaryotische Organismen werden in ihrer natürlichen Umgebung mit schwankenden Umwelteinflüssen konfrontiert oder müssen gegebenenfalls extremen Bedingungen standhalten. Um sich an derartige Veränderungen anpassen zu können und damit ein weiteres Überleben zu sichern, ist es wichtig neue genetische Informationen zu akquirieren. Die molekulare Basis dieser Anpassung sind Genmutationen, Genverlust, intramolekulare Rekombination und/oder horizontaler Gentransfer. Der vorliegende Selektionsdruck der Umwelt begünstigt schlussendlich die Spezialisierung und damit die Erschließung neuer Standorte aufgrund des Erwerbs neuer metabolischer Eigenschaften, Resistenzgene oder Pathogenitätsfaktoren. Vergleichende Analysen bakterieller Genome, welche auf Analysen der GC-Gehalte, der Codon- und Aminosäurenutzung und der Genlokalisation beruhen, zeigten, dass bei diesem evolutiven Prozess bzw. der Weiterentwicklung der bakteriellen Genome der horizontale Gentransfer als treibende Kraft eine entscheidende Rolle spielt. So indizieren Genomstudien, dass 0-22% der gesamten bakteriellen und 5-15% der archaeellen Gene horizontal erworben wurden, wobei der DNA-Transfer nicht ausschließlich zwischen Vertretern einer Domäne, sondern ebenfalls zwischen Organismen unterschiedlicher Domänen stattgefunden hat. So sind z.B. 24 bzw. 16% der Gene von Genomen hyperthermophiler Organismen wie Thermotoga maritima oder Aquifex aeolicus archaeellen Ursprungs. Ebenso finden sich Gene für Chaperone und DNA-Reparaturenzyme im Genom des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus wieder, welche wahrscheinlich ebenfalls durch horizontalen Gentransfer aus hyperthermophilen und archaeellen Genomen erworben wurden um eine Anpassung an extreme Standorte zu ermöglichen. Durch vergleichende Genomstudien wurde ebenfalls festgestellt, dass die durch horizontalen Gentransfer erworbenen Gene oftmals zu einer Neuorganisation von Transkriptionseinheiten und zu einer veränderten Genomorganisation führten. Dennoch finden sich immer wieder Beispiele von horizontal erworbenen Operonen in den verschiedenen Organismen. Gut charakterisierte Vertreter horizontal übertragener Operone sind dabei z.B. das archaeelle H+-ATPase-Operon, das Operon der Na+-translozierenden NADH:Ubichitonoxidoreduktase oder das Nitratreduktase-Operon.
Man unterscheidet bei dem horizontalen Gentransfer zwischen drei Mechanismen der DNAAufnahme: Konjugation, Transduktion und Transformation. Die DNA-Übertragung durch Konjugation ist durch einen spezifischen Zell-Zell-Kontakt definiert, der durch einen von der Donorzelle ausgehenden, sogenannten F-Pilus hergestellt wird. Die Donorzelle überträgt schließlich Plasmid-kodierte genetische Informationen und oftmals Eigenschaften für die eigenständige Konjugation auf eine Rezipientenzelle. Die Transduktion hingegen beschreibt die DNA-Übertragung von Bakteriophagen auf eine Wirtszelle, wobei hier eine hohe Wirtsspezifität Voraussetzung ist. Die Übertragung der DNA von einer Bakterienzelle in eine andere erfolgt dabei ohne Kontakt der Zellen. Die natürliche Transformation ist definiert als Transfer von freier DNA und ermöglicht damit im Gegensatz zu den beiden ersten spezifischen Mechanismen der DNA-Übertragung ein größeres Spektrum der Verbreitung genetischer Informationen. Freie DNA, welche entweder durch Zelllyse oder Typ-IVSekretion ausgeschieden wird und aufgrund von Adsorption an mineralische Oberflächen über längere Zeiträume stabil in der Umgebung vorliegen kann, kann unter der Voraussetzung der Existenz eines speziellen Aufnahmesystems von Bakterien aufgenommen werden. Mittlerweile sind über 44 Bakterien aus unterschiedlichen taxonomischen Gruppen beschrieben, die eine natürliche Kompetenz ausbilden können. Die bekanntesten Beispiele für natürlich transformierbare Gram-negative Bakterien sind Heliobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas stutzeri, Haemophilus influenzae, T. thermophilus und Acinetobacter baylyi. Auch unter den Gram-positiven Bakterien finden sich einige Vertreter, die natürlich kompetent sind, wie Deinococcus radiodurans, Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae. Ungeachtet der relevanten Rolle der Transformation im horizontalen Gentransfer, ist über die Struktur und Funktion der komplexen DNA-Aufnahmesysteme wenig bekannt.
The ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase is a key component of several aerobic respiratory chains in different organisms. It is an integral membrane protein complex, made up of three catalytic subunits (cytochrome b, cytochrome c1 and Rieske iron sulphur protein) and up to eight additional subunits in mitochondria. The complex oxidizes one quinol molecules and reduces two cytochrome c during the Q cycle, originally described by Peter Mitchell. Electrons are split between the low and the high potential chain and protons are released on the positive side of the membrane, increasing the protonmotive force needed by the ATP-synthase for energy transduction. The cytochrome bc1 complex from P. denitrificans is a perfect model for structural and functional studies. Bacteria are easy to grow and the genetic material is readily accessible for genetic manipulation. Moreover, the P. denitrificans aerobic respiratory chain is very close to the mitochondrial one: the complexes involved in electron transfer resemble the ones found in mitochondria, but lack most of the additional subunits. As a unique feature, P. denitrificans has a strongly acidic domain at the N-terminal region of the cytochrome c1, a sequence of 150 aminoacids which does not correlate with any known protein. An analogous composition can be found in the eukaryotic cytochrome bc1 complex as a part of an accessory subunit, proposed to be involved in facilitating electron transfer between the complex and the electron acceptor cytochrome c. In order to study the function of this domain in the P. denitrificans cytochrome bc1 complex, a deletion mutant has been previously cloned and modified with an affinity tag as a C-terminal extension of cytochrome b. The complex is purified by affinity chromatography and characterized by steady-state kinetics using not only horse heart cytochrome c but also the endogenous electron acceptor, the membrane bound cytochrome c552, employed here as a soluble fragment. Steady–state kinetics indicate that the deletion of the long acidic domain had effects neither on the turnover rate nor on the apparent affinity for the substrate. To understand wether the deletion affects the reaction between the cytochrome bc1 complex and the substrate, laser flash photolysis experiments are performed, showing that the interaction observed was not changed in the complex missing the acidic domain. The results presented in this work confirm the ones previously obtained by Julia Janzon using soluble fragments of the same interaction partners. The deletion, however, affected the oligomerization state of the complex, as shown by LILBID (Laser Induced Liquid Bead Ion Desorption) analysis. The wild type complex has a tetrameric structure, better described as a “dimer of dimers”. The deletion of the acidic domain on the cytochrome c1 results in the separation of the two dimers, yielding the canonical dimer. Therefore, the complex deleted in the acidic domain is used for cloning and expression of a heterodimeric complex, containing an inactivating mutation in the quinol oxidation site in only one monomer, thus allowing a selective switch-off for half the complex. Such a complex is needed for the verification of an internal regulation mechanism, the half-of-the-sites reactivity. According to it, the dimeric structure of the cytochrome bc1 complex has functional implications, since the two monomers can communicate and work in a coordinated manner. This approach confirms that substrate oxidation does effectively take place only in one of the two monomers constituting the dimer, and that the binding of substrate at the Qo and Qi site regulates the switch between active and inactive monomer. Moreover, this mechanism works also as an effective protection against the reaction of quinone intermediates with oxygen and the formation of reactive oxygen species (ROS), responsable for cellular aging. The motion of the ISP head domain is also addressed in this work; in particular the mechanism which regulates the movements towards the cytochrome c1 and the electron bifurcation at the quinol oxidation site. Laser flash kinetics in presence of several inhibitors and the substrate allow studying the response of the ISP to the binding of different species at the quinol oxidation site. The binding of ligand at the Qo site in the complex triggers the conformational switch in the ISP head domain, supporting the mechanism proposed in the literature according to which the Qo site is able to “sense” the presence of substrate and transfer the information to the ISP, regulating its mobility. The internal electron pathway between the ISP and the cytochrome c1 has been analyzed also by stopped-flow kinetics, in presence and absence of inhibitors. The results indicate that two kinetic phases describe the reduction of cytochrome c1 by the ISP, and a model for the simulation of the data is proposed.
Structural determinants for substrate specificity of the promiscuous multidrug efflux pump AcrB
(2013)
Opportunistic Gram-negative pathogens such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter Baumanii and Pseudomonas aeruginosa are becoming more and more multiresistant against many commonly available antibiotics [39, 40]. An important resistance mechanism of Gram-negative bacteria is the efflux of noxious compounds by tripartite systems [39, 41-44]. The best studied and most clinically relevant tripartite system is the AcrA-AcrB-TolC system of Escherichia coli, where substrate recognition and energy transduction takes place in the inner membrane protein AcrB. AcrB has a remarkably huge substrate spectrum and can recognize structurally diverse molecules, such as hexan in contrast to erythromycin, as its substrates [45]. Therefore, overproduction of the tripartite system can render a Gram-negative pathogen resistant against multiple antibiotics at once. The mechanisms of how AcrB is able to recognize such an enormous spectrum of molecules as substrates, without compromising its specificity (e.g. by neglecting essential compounds like lipids or gluclose as its susbtates), remained puzzling. Structural insight into substrate specificity was so far limited to two co-crystal structures of AcrB, where minocycline and doxorubicin, respectively, were identified bound to an internal binding pocket of AcrB. This binding pocket is particularly deeply buried into internal parts of the T monomer of AcrB and was, therefore, denoted deep binding pocket (DBP). Analysis of several AcrB co-crystal structures with substrate molecules bound to the DBP [4, 23, 25] indicated that the substrate promiscuity involved multisite binding modes within the DBP. Multisite binding modes, where different substrate molecules can bind to slightly different positions and orientations to the same binding pocket, is a common feature of multidrug recognizing proteins such as QacR or BmrR [27-29]. Nevertheless, AcrB's substrate spectrum is much broader than substrate spectra of most other multidrug recognizing proteins. Therefore, it is likely that additional mechanisms are involved in mediating the observed high substrate promiscuity of AcrB. In our recently published high-resolution AcrB/doxorubicin co-crystal structure (pdb entry: 4DX7 [23]) we were able to identify two additional substrate binding pockets in the L monomer of AcrB: i) the access pocket (AP), with an opening towards the periplasm, and ii) a putative binding site in a groove between transmembrane helices 8 and 9 (TM8/TM9 groove), accessible from the lipid layer of the inner membrane. Both binding pockets are likely to be access sites for substrates towards AcrB. Furthermore, each of the binding pockets are possibly specialized to recognize a specific subset of the entire substrate spectrum of AcrB, i.e. highly hydrophobic substrates (e.g. n-dodecyl-ß-d-maltoside or sodium dodecylsulfate) might access AcrB towards the TM8/TM9 groove and water soluble substrates (e.g. berberine) might access AcrB towards the AP. Since substrates will accumulate in the membrane or the periplasm according to their hydrophilic or hydrophobic nature, substrates will be "pre-selected" by the medium, rather than by the protein itself, and guided to their appropriate access site. This process is proposed to be called "medium- mediated pre-selection". The AcrB/doxorubicin co-crystal structure (pdb entry: 4DX7 [23]) furthermore revealed that the AP and DBP are in next neighborhood to each other and are separated by a switch loop. This switch loop adopts distinct conformations in the L, T and O monomers. Specific switch loop conformations are strongly involved in coordinating the selective occupation of both binding pockets, the AP and the DBP. The conformation of the switch loop in the L monomer (L-switch loop) opens the AP and closes the DBP, whereas the conformation of the switch loop in the T monomer (T-switch Loop) opens the DBP and closes the AP. An analysis of all asymmetric AcrB structures indicated that the L-switch loop is able to adopt multiple distinct conformations, whereas the conformation of T-switch loop remained largely congruent in all crystal structures. Moreover, each distinct switch loop conformation, observed in co-crystal structures of AcrB with occupied AP [4, 23], was perfectly adapted to the bound substrate molecule. Therefore, the putatively flexible switch loop is likely to act as an adaptive module and mediates a high binding pocket plasticity without altering the global protein structure. This binding mode is called adaptor-mediated binding mechanism, where an flexible adaptive module (like the switch loop) is able to adapt the surface shape of an binding pocket to different substrate molecules. Furthermore, structural and biochemical analyses of an AcrB G616N variant, revealed the involvement of specific switch loop conformations in the substrate specificity of AcrB. A substitution of G616, located on the switch loop, to N616 was able to alter the conformation of the switch loop exclusively in the L monomers of AcrB, whereas the switch loop conformations in T and O monomers remained congruent to the conformations observed in crystal structures of wildtype AcrB. Moreover, cells producing the AcrB G616N and MexB, both bearing the G616N amino acid substitution, exhibited a reduced resistance against certain substrates, whereas the resistance against most other substrates remained on the level of wildtype AcrB. Correlations of the phenotypes with minimal projection areas, a novel 2-spatiodimensional parameter which approximates the size of a substrate molecule, revealed that AcrB variants with a G616N substitution have a reduced efflux activity for exclusively large substrate molecules. The rejection of large substrates is most likely connected with altered L-switch loop conformations....
Während meiner Promotion habe ich zwei Projekte unter der Aufsicht von Dr. Misha Kudryashev durchgeführt. Im ersten Projekt habe ich die Strukturen des Ryanodinrezeptors 1 (RyR1) in Apo- und Ryanodin-Bindungszuständen in der nativen Membran durch Tomographie und Subtomogramm-Mittelung bei 12,6 bzw. 17,5 Å bestimmt. Im Vergleich zur Struktur von gereinigtem RyR1 unter Verwendung der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) können zusätzliche Dichten in der cytoplasmatischen Domäne und der sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran bzw. im SR-Lumen beobachtet werden. Die Auflösung der Struktur von RyR1 im Apo-Zustand wurde von den Kollegen in meinem Labor mithilfe der Hybridmethode auf 9,5 Å verbessert. Diese Arbeit hat unser Verständnis für die Mechanismen von RyR1 in nativen Membranen erweitert. Im zweiten Projekt habe ich die Struktur des Proteins SdeC der SidE-Familie durch Einzelpartikel-Kryo-EM bei 4,6 Å bestimmt. Die Kristallstruktur des C-Terminus von SdeA wurde von meinem Forschungspartner Dr. Mohit Misra gelöst. Durch Überlagerung einer gemeinsamen Helix dieser beiden Strukturen konnten wir ein kombiniertes Modell erstellen und ein allgemeines Verständnis der Proteine der SidE-Familie erhalten.