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Fettsäuren vermitteln ebenso wie Gallensäuren über ihre G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPR40 bzw. TGR5) und nukleären Rezeptoren Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPARs) bzw. Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) Signale zur Regulation wichtiger Stoffwechselwege, wie dem Fettstoffwechsel, Cholesterolstoffwechsel und der Glukosehomöostase. Gerade die nukleären Rezeptoren stellen durch ihre Regulation einer Vielzahl an Targetgenen vielversprechende Wirkstofftargets dar. Die Aktivierung von PPARα und PPARγ wird seit Jahren therapeutisch genutzt zur Therapie der Dyslipidämie (Fibrate) und des Typ-2 Diabetes (Glitazone). Dennoch zeigte sich durch diese Vollaktivierung ein bedenkliches Profil unerwünschter Nebenwirkungen eng mit der therapeutischen Wirkung verknüpft. Im Falle des FXR befindet sich derzeit ein semisynthetisches Derivat, welches sich von den endogenen Liganden CDCA ableitet, in Phase III der klinischen Entwicklung zur Therapie von Lebererkrankungen, wie der nicht-alkoholischen Fettleber und der primären billiären Zirrhose. In vitro und in vivo-pharmakologische Untersuchungen weisen auf positive Effekte von FXR-Agonisten aber auch mit FXR-Antagonisten auf den Zucker- und Cholesterolstoffwechsel hin. Doch hier bleibt abzuwarten, ob agonistisch oder antagonistisch aktive Substanzen das größte therapeutische Potential besitzen, wobei die Erfahrung mit Liganden anderer nukleärer Rezeptoren, wie den PPARs und Estrogenrezeptoren (ER) zeigt, dass die partielle Aktivierung der Vollaktivierung zu bevorzugen ist. Diese Arbeit unterteilt sich in zwei Projekte, die sich von der an PPAR dual aktiven Pirinixinsäure (1) ableiten. Ausgangspunkt des ersten Projekts bildet die Substanz MD78 (2), die sich aus Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) vorangegangener Arbeiten entwickelt hat. Mit ihrem potenten dual PPARα/γ-agonistischen Profil hebt sie sich in ihrer Aktivität von den anderen Derivaten ab. Ziel war es die Ursache dieser Aktivität mit Hilfe einer konkretisierten SAR zu identifizieren. Die nähere Untersuchung der Verbrückung des lipophilen Substituenten zeigte einen deutlichen Einfluss des sekundären Amins auf die Aktivität, vor allem am PPARα-Subtyp. Eine Dockingstudie unterstützte die These, dass ein Wasserstoffbrückendonor an dieser Stelle für die Aktivität von Vorteil sei, da dadurch ein Wasserstoffbrückennetzwerk zu einem konserviert vorliegendem Wasserkluster ausgebildet werden konnte. Dieses Wasserkluster wird durch die Aminosäure Thr279 in der Ligandbindetasche fixiert, sodass eine Mutationsstudie durchgeführt wurde, die diese These belegen konnte. Ebenfalls aus vorangegangenen Arbeiten entwickelte sich ausgehend von der Pirinixinsäure Phenylthiohexansäuren, die in einem Screening als FXR-Liganden identifiziert wurden. Die Substanz HZ55 (3) bildete somit die Leitstruktur des zweiten Projekts dieser Arbeit, bei dem die Zielsetzung die Entwicklung selektiver FXR-Liganden war. Da die Leitstruktur 3 eine auf die Aktivität an PPAR und den Enzymen der Arachidonsäurekaskade mPGES-1 und 5-LO optimierte Substanz darstellte, wurde im ersten Schritt der SAR der substituierte Thioether deletiert, da dieser als potentes PPAR-Pharmakophor bekannt war. Anschließend erfolgte die weitere Optimierung durch Struktur-Wirkungs-Beziehung der sauren Kopfgruppe, des Linkers und des heteroaromatischen Substituenten. Erste agonistisch aktive Derivate wurden durch Austausch des Chinolin-Rings durch einen Pyridin-Ring erreicht, wobei die Position 2 des Stickstoffs bevorzugt war (4). Durch Variation der Substitutionsposition am Pyridin-Ring stellte sich die Position 3 als vorteilhaft heraus, um hier durch Vergrößerung des lipophilen Substituenten die Aktivität zu steigern. Bei dem Einsatz des Eduktes Pyridin-2-ol musste die Synthese optimiert werden, um das Tautomeren-Gleichgewicht zwischen Pyridin/Pyridon steuern zu können. Denn auch die Pyridon-Derivate zeigten vergleichbare partialagonistische Potenz zu ihren Isomeren. Hier führte jedoch die Vergrößerung des lipophilen Substituenten in 3-Position zu der Etablierung einer neuen FXR-antagonistischen Substanzklasse. Der hieraus potenteste Vertreter (5) wurde weitergehend charakterisiert und konnte seine antagonistische Wirkung auch auf die FXR-Targetgene SHP, BSEP, Ostα und IBABP nachweisen. Durch qRT-PCR quantifiziert zeigte sich, dass 5 die Aktivität des endogenen Liganden CDCA antagonisieren konnte. Weiterhin zeigte die Substanz eine gute Selektivität über die PPARs. Optimierungsbedarf besteht jedoch in der metabolischen Stabilität und Löslichkeit und der Selektivität gegenüber mPGES-1. Doch die Substanz 5 stellt einen interessanten Ausgangspunkt für eine neue Substanzklasse dar, da sie eine agonistische Aktivität an dem G-Protein gekoppelten Rezeptor der Gallensäuren, TGR5, zeigt. Somit stellt 5 die erste synthetische Substanz dar, die dieses duale Profil der Gallensäurerezeptoren besitzt. Dies stellt ein vielversprechendes neues Therapieprinzip dar, nachdem sowohl der FXR-Antagonistmus positive Wirkung auf die Insulinsensitivität in Mausmodellen des Diabetes gezeigt hat, als auch der TGR5-Agonismus durch die Sekretion von GLP-1 Auswirkungen auf den Glukosehomöostase hat.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung von Inhibitoren der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) als neue potentielle antientzündliche Wirkstoffe. Beide Enzyme befinden sich innerhalb der Arachidonsäurekaskade und sind einerseits an der Prostaglandin E2 (PGE2) Biosynthese und andererseits an der Biosynthese der Leukotriene (LTs) beteiligt (siehe Abb. 1). Die mPGES-1 ist ein membranständiges
Enzym, das downstream lokalisiert ist, hauptsächlich unterhalb der induzierbaren COX-2, und katalysiert die Reaktion von PGH2 zu PGE2. PGE2 gilt innerhalb der Prostaglandine als prominentester Vertreter bezüglich Entzündungen, Schmerzen und Fieber. Die Leukotriene gehören ebenso wie die Prostaglandine zu den proinflammatorisch wirkenden Lipid-Mediatoren und sind unter anderem beteiligt an der Bronchokonstriktion oder erhöhen auch die vaskuläre Permeabilität. Während dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungsbeziehungen zweier verschiedener Substanzklassen untersucht. Leitstruktur I entstammt einem Pirinixinsäure-Derivat (siehe Abb. 2). Die Pirinixinsäure (Verbindung 1) selbst ist sowohl an der mPGES-1 als auch an der 5-LO inaktiv. Initiale Arbeiten haben gezeigt, dass eine Einführung eines n-Hexyl Restes in α-Position zu der Carbonsäure zu einer dualen Inhibition der 5-LO und mPGES-1 geführt hat (Verb. 2). Unter Beibehaltung dieses Restes sollte der lipophile Rückraum durch Austausch des 2,3-Xylidin-Gerüsts optimiert werden und hier hat sich insbesondere das 4-(4-Chlorphenyl)-1,3-thiazol-2-amin Gerüst als potent erwiesen (Verb. 3). Mit dieser Erkenntnis sollten verschiedene 2-Aminothiazolhaltige Pirinixinsäurederivate synthetisiert werden, und ihre Struktur-Wirkungsbeziehung als
duale 5-LO/ mPGES-1 Inhibitoren untersucht werden. Leitstruktur II entstammt einem virtuellen Screening Ansatz, in dem neue acidische mPGES-1 Inhibitoren identifiziert werden sollten. Das Benzensulfonamid Derivat FR4 (Verb. 4) stellt dabei eine neuartige Leitstruktur für mPGES-1 Inhibitoren dar, die nicht nur in der Lage sind die humane mPGES-1 zu hemmen, sondern ebenso die murine mPGES-1. Viele in der Literatur beschriebene mPGES-1 Inhibitoren sind zwar in der Lage, die humane mPGES-1 sehr potent zu inhibieren, haben allerdings keinen Effekt gezeigt in ersten präklinischen Versuchen, weil der Spezies Unterschied zwischen der murinen und humanen mPGES-1 zu groß ist. Dementsprechend liefern die Benzensulfonamide einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuartiger mPGES-1 Inhibitoren, um die Hürde der präklinischen Entwicklung zu überwinden.
Synthese und in vitro-pharmakologische Charakterisierung von dualen PPARalpha/gamma-Agonisten
(2005)
Die Behandlung von Hypertriglyceridämien und Insulinresistenz erfolgt heute vor allem durch den Einsatz der Fibrate und Thiazolidindione (TZDs). Eine neue Wirkstoffklasse stellen die vor der Zulassung stehenden Glitazare dar, die als duale PPARalpha/gamma-Agonisten die lipidsenkenden Eigenschaften der Fibrate und die insulinsensitivierenden Eigenschaften der TZDs in einer Molekülklasse vereinen. Peroxisomen Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPARs) gehören zur Klasse der nukleären Rezeptoren, von denen drei Subtypen (PPARalpha, beta und gamma) bekannt sind. PPARalpha fungiert als molekulares Target für die Klasse der Fibrate, welche als Lipidsenker eingesetzt werden, wohingegen die Thiazolidindione (TZDs) bei Typ 2 Diabetes indiziert sind und ihre Wirkung als selektive PPARgamma-Aktivatoren (Insulinsensitizer) entfalten. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten wie Muraglitazar und Tesaglitazar stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, deren Zulassung beantragt ist und die zukünftig zur Behandlung von Typ 2 Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung am selektiven PPARalpha-Agonist Pirinixinsäure (WY 14643) mit Hilfe subtypspezifischer Reportergenassays durchgeführt. Dabei wurde wurde zunächst eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha-Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand im Allgemeinen in einer vierstufigen Reaktionsfolge. Die PPAR-Modulatoren 18-25, 30, 53-59, 62, 65, 69, 71, 73 und 74-77 wurden in vitro-pharmakologisch unter Anwendung Subtyp-selektiver Reportergen-Assays (mPPARalpha, hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich (Substanzen 18-25) der Leitstruktur WY 14643 (EC50 (hPPARalpha) = 39.8 mikroM, EC50 (hPPARgamma) = 53.7 mikroM) konnte im Falle der 4-Halogenaryl-substituierten Liganden 18 (Br) und 20 (Cl) eine signifikante Steigerung der hPPARalpha-Aktivität um den Faktor 4 (18) bzw. den Faktor 3 (20) erzielt werden. Die Inaktivität der Precursorverbindungen 74-77 demonstriert den für PPAR-Aktivität essentiellen terminalen hydrophoben Molekülrest, welcher dem 2,3-Dimethylphenyl-Rest von WY 14643 entspricht. Die alpha-alkylsubstituierten Derivate 53-57 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Die EC50-Werte (hPPARalpha) der Carbonsäuren 53-57 und 62 liegen zwischen 1.2 und 8.8 mikroM, wobei sich das alpha-Hexyl-Derivat 57 und das alpha-Butyl-Derivat 56 mit EC50-Werten von 1.2 mikroM (57) bzw. 1.3 mikroM (56) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um Faktor 33 (57) bzw. Faktor 30 (56) als besonders potent erwies. Am hPPARgamma präsentieren ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 56 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 57 mit EC50-Werten von 3 mikroM (56) bzw. 3.6 mikroM (57) und einer Steigerung der Bindungsaktivität gegenüber WY 14643 von ~Faktor 18 (56) bzw. ~Faktor 15 (57) die Verbindungen mit der höchsten PPARgamma-Aktivität. Im Rahmen dieser Dissertation gelang somit die Auffindung neuartiger Leitstrukturen 56 und 57. Die alpha-butyl- und alpha-hexylsubstituierten Liganden 56 und 57 besitzen dualen hPPARalpha/gamma-Charakter. Die PPARalpha/gamma-agonistischen Eigenschaften der neuentwickelten alpha-alkylsubstituierten Pirinixinsäurederivate werden durch ein von Pirard et al etabliertes Pharmakophor- und Selektivitätsmodell, welches die Ligandenbindungsdomäne (LBD) der PPARs durch fünf Bindungstaschen beschreibt, unterstützt. Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt offensichtlich zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY 14643 stärkeren Bindung an die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors.
PPARs gehören wie die Steroidhormon-Rezeptoren (z. B.Glucocorticoid-, Estrogen- oder Testosteron-Rezeptoren) zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren. Es existieren drei PPAR-Subtypen, die als PPARalpha, PPARbeta/delta und PPARgamma bezeichnet werden und von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Fibrate sind PPARalpha-Agonisten, welche die Plasma-Triglyceridspiegel reduzieren und gleichzeitig eine moderate Steigerung des HDL-Cholesterols bewirken. Thiazolidindione (Glitazone) sind PPARgamma-Agonisten, die bei Typ-2-Diabetes-mellitus indiziert sind und als Insulinsensitizer wirken. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, die zukünftig zur Behandlung von Typ-2-Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden könnten. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung des selektiven PPARalpha-Agonisten Pirinixinsäure (WY 14643) durchgeführt. Die pharmakologische In-vitro-Charakterisierung der Substanzen erfolgte mit Hilfe subtypspezifischer Reportergen-Assays. Zusätzlich wurde gezeigt130, dass Chinolinderivate der Pirinixinsäure 5-LOX-inhibierende Eigenschaften in polymorphnukleären Leukozyten zeigen. Zunächst wurde eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten und 5-LOX-Inhibitoren führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha- Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand in einer vierstufigen Reaktionsfolge (I–IV; siehe Abb.). ... Die PPAR-Modulatoren (Carbonsäuren) 4, 8, 14, 32–38, 41 und 42 wurden in-vitropharmakologisch unter Anwendung subtypselektiver Reportergen-Assays (hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Die 5-LOX-Modulatoren (Carbonsäureester) 3, 7, 8, 13, 14, 24–29, 31–42 und 50 wurden in-vitro-pharmakologisch unter Anwendung des 5-LOX-Standardassays in intakten PMNL (polymorphnukleäre neutrophile Leukozyten) evaluiert. Die vorliegende Untersuchung deckte auf, dass der Ersatz des 2,3-Dimethylanilin-Strukturelements der Pirinixinsäure durch 6-Aminochinolin zu einem Gesamtverlust des PPARalpha/gamma-Agonismus führt. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich der Leitstruktur WY 14643 mit für 5-LOX-Non-Redoxinhibitoren typischen Pharmakophorresten, Tetrahydropyran-4-yl (Substanzen 13–14) und Methoxychinolin-2-yl (Substanz 43), konnte eine signifikante Steigerung des 5-LOX-inhibitorischen Potenzials erzielt werden [IC50 7 mikro M (13) bzw. 4 mikro M (43)]. Die alpha-alkylsubstituierten Carbonsäurederivate 33–38 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Am hPPARalpha erwiesen sich das alpha-Hexyl-Derivat 35 und das alpha-Butyl-Derivat 34 mit EC50-Werten von 1,9 mikro M (35) bzw. 11,5 mikro M (34) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um den Faktor 20 (35) bzw. den Faktor 4 (34) als besonders potent. Im Falle des hPPARgamma zeigten ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 34 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 35 die höchste Aktivität mit EC50-Werten von 8,7 mikro M (34) bzw. 5,8 mikro M (35) und einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 von Faktor 6 (35) bzw. Faktor 9 (34). Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt möglicherweise zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY14643 stärkeren Bindung in die Ligandenbindungstasche des Rezeptors. Die Besetzung dieser proximalen Bindungstasche entscheidet jedoch nicht über die PPAR-Selektivität, da diese sowohl von hPPARalpha- als auch von hPPARgamma-Agonisten belegt wird. PPARalpha/gamma-Selektivität kann zum einen durch das Besetzen der linken bzw. rechten distalen Bindungstasche erzielt werden, zum anderen durch die Auswahl verschiedener acider Kopfgruppen. Aufgrund unterschiedlicher Aminosäuresequenzen der Bindungstaschen der einzelnen PPAR-Subtypen ergibt sich für die Kopfgruppen der PPAR-Modulatoren im hPPARalpha und hPPARgamma eine durch den sterischen Einfluss von Carboxyl- bzw. TZD-Kopfgruppen verursachtes unterschiedliches Wasserstoffbrückennetzwerk. Im Vergleich mit Pirinixinsäure konnte nur durch die Einführung der größeren Alkylketten (n-Butyloder n-Hexyl) ein stark erhöhter dualer PPARalpha/gamma-Agonismus erreicht werden. Die Substitution des sekundären Amins der Chinolin-6-ylverbindungen durch einen Ether-Sauerstoff in den Substanzen 41 und 42 sowie die Einführung eines Linkers, genauer einer Methylengruppe, zwischen dem Chinolin-6-ylrest und dem Scaffold (Derivate 29 und 36), führt zu einer verminderten Aktivität sowohl an hPPARalpha als auch an hPPARgamma. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass an entsprechender Position der Liganden-Bindungstasche eine Wasserstoffbrücken-Akzeptor-Position vorhanden ist, welche zur Erhöhung der Affinität beiträgt. Offensichtlich wird, durch die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der NH-Funktion und einem Wasserstoffbrücken-Akzeptor innerhalb der LBP im Falle von WY 14643 ein hoher Bindungsbeitrag erreicht. Daten bezüglich der Inhibierung der 5-Lipoxygenase demonstrieren, dass 6-Aminochinolinderivate potente 5-LOX-Inhibitoren sind. Die Einführung eines 3,5-Bis-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-phenylrestes in 6-Position des alpha-hexylsubstituierten Scaffolds führt zu Ligand 38. Dieser ist ein potenter dualer PPARalpha/gamma-Agonist mit einem EC50-Wert von 11 mikro M an hPPARalpha bzw. 7,7 mikro M an hPPARgamma und ein stark wirksamer 5-LOX-Inhibitor mit einem IC50-Wert von 1 mikro M im 5-LOX-PMNL-Standardassay. Die Substanz 38 wurde in präklinischen Studien eingesetzt. Vier Stunden nach oraler Administration bei Mäusen (n = 6) wurde einen Plasmaspiegel von 40 mikro M erreicht. Im Hinblick auf eine Steigerung der PPAR-agonistischen Aktivität und der Reduktion der hepatotoxischen Eigenschaften der Leitstruktur Pirinixinsäure wurde eine Leitstrukturoptimierung durch Einführung der größeren Alkylketten in alpha-Position zur pharmakophoren Carboxyl-Funktion durchgeführt. Für die inhibierende Wirkung auf die 5-LOX scheint das Chinolin-Strukturelement verantwortlich zu sein, während die Potenz der Inhibition durch das Substitutionsmuster moduliert wird.
Synthese und Struktur-Wirkungsbeziehungen neuer rezeptorselektiver Dopamin-D 2- und -D 3-Liganden
(2003)
Dopaminrezeptoren gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, der bisher größten Rezeptorklasse. Seit der Identifizierung der zuvor unbekannten Rezeptorsubtypen D3-D5 in den Jahren 1990 und 1991 hat die Erforschung des dopaminergen Systems neuen Anschub erhalten, der maßgeblich auf das spezifische Vorkommen jeweiliger Subrezeptoren in diskreten Hirnarealen zurückzuführen ist. Während dopaminerge Neuronen an neurologischen und psychiatrischen Störungen wie Morbus Parkinson, Schizophrenie und Drogenmißbrauch bzw. -abhängigkeit seit geraumer Zeit in einen ursächlichen Zusammenhang gebracht werden, begründen die unterschiedlichen Charakteristika der Rezeptorsubtypen hinsichtlich Lokalisation, Aminosäuresequenz und pharmakologischem Verhalten die Hoffnung, mit subrezeptorselektiven Wirkstoffen neue therapeutische Ansätze verwirklichen zu können, die eine Reduktion der gravierenden, mit bisherigen Therapiekonzepten korrelierten Nebenwirkungen erlauben. In der vorliegenden Arbeit wurden, ausgehend von den D2- und D3-rezeptorbevorzugenden Wirkstoffen ST 177, L-741,626, ST 314, NAN190, ST 198 und BP 897, gezielte Modifikationen an unterschiedlichen Molekülteilen unternommen, um ihre jeweils charakteristischen pharmakologischen Eigenschaften stärker zu profilieren.
In der vorliegenden Arbeit wurden Liganden, die Strukturmerkmale von Glycin-Bindungsstellen-Antagonisten des NMDA-Rezeptors und von Dopamin-Rezeptor-Agonisten enthalten, synthetisiert und charakterisiert. Es handelte sich dabei um Hybrid-Moleküle vom überlappenden Typ. Als Leitstrukturen dienten Thienopyridinone, die bereits als Glycin-Antagonisten etabliert waren. In diese Strukturen wurden Funktionalitäten von Dopamin-Rezeptor-Agonisten integriert. Einige Verbindung enthalten die Aminoethyl-Funktion des endogenen Agonisten Dopamin und eine Verbindung die Aminomethyl-Funktion des D2-Agonisten Piribedil. Zunächst wurde durch einfache Methoden des Molecular Modeling und dem anschließenden Vergleich der pharmakophoren Deskriptoren der Liganden überprüft, ob eine duale Affinität der angestrebten Strukturen möglich ist. Die Kombination der Affinitäten wurde im Hinblick auf die Therapie des Morbus Parkinson ausgewählt. Dual affine Wirkstoffe sollten neben der Verbesserung der Symptomatik auch eine Verlangsamung des Fortschreitens der Krankheit, aufgrund der Verringerung des Zelluntergangs, bewirken. Es wurde ebenfalls versucht durch die Einführung verschiedener Aminoalkyl-Substituenten mit unterschiedlichem sterischen Anspruch (Aminoethyl-, N,N-Dimethylaminmethyl-, N,N-Dimethylaminethyl-, N,N-Di-propylaminmethyl- und N,N-Dipropylaminethyl-Substituenten) in 3-Position der Thieno[2,3 b]pyridinone weitere Aussagen über die Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors zu ermöglichen. Im Rahmen der Synthese wurden die Amino-Funktionalitäten zu Beginn der Synthese oder an Vorstufen der Cyclisierungen eingeführt. Zunächst wurden 2 Aminothiophene mit entsprechenden Amino-Substituenten in 4 Position und freier 5-Position, die Schlüsselverbindungen sind beim Aufbau der Zielstruktur, über verschiedene Modifikationen der Gewald-Reaktion hergestellt. Es wurden ebenfalls versucht entsprechend substituierte Cyclisierungsvorstufen mit Amino-Substituenten in 4–Position durch verschiedene Substitutionreaktionen herzustellen. Dies sollte durch die Synthese von 2-Aminothiophenen mit guten Abgangsgruppen, wie Tosylat oder Halogenide in der 4-Position erfolgen. Die Cyclisierungsreaktion wurde unter Verwendung unterschiedlicher Basen untersucht. Die duale Affinität der Liganden wurde durch pharmakologische in vitro Bindungsstudien untersucht. Zur Bestimmung der Affinitäten an der Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors wurden Glycin-Bindungsassays durchgeführt. Die Affinitäten an Dopamin-Rezeptoren wurde über Racloprid-Bindungsassays bestimmt. Die Verbindungen weisen Affinitäten im mikromolaren Bereich zur Glycin-Bindungsstelle auf. Allerdings zeigen Verbindungen der gleichen Verbindungsklasse mit sterisch vergleichbaren Substituenten in der 3- oder 2-Position des Thienopyridinon-Gerüstes deutlich bessere Affinitäten (niedriger nanomolarer Bereich auf). Dies lässt den Schluss zu, dass der Affinitätsverlust auf ungünstige elektrostatische Wechselwirkungen des geladenen Substituenten (Aminofunktion liegt bei pH 7.0 protoniert vor) des Liganden mit dem Rezeptorprotein zurückzuführen sind. Die Affinitäten der Verbindungen an Dopamin-Rezeptoren sind unbefriedigend. Hybrid-Moleküle vom überlappenden Typ, die neben der Thienopyridinon-Struktur auch Strukturmerkmale des Dopamin-Rezeptor-Agonisten Ropinirol enthalten, konnten trotz verschiedenster Syntheseansätze im Rahmen dieser Arbeit synthetisch nicht zugänglich gemacht werden. Weitere Anstrengungen wurden aufgrund des bereits deutlichen Affinitätsverlusts der Verbindungen mit einer freien Amino-Funktion nicht unternommen. Im Rahmen der synthetischen Arbeiten konnte eine Methode der Gewald-Reaktion bezüglich Ausbeuten und Anzahl der Nebenprodukte optimiert werden. Hybrid-Moleküle vom überlappenden Typ führten zu Verbindungen mit dualen Affinitäten an NMDA- und an Dopamin-Rezeptoren. Allerdings wurden für beide Rezeptortypen nur Affinitäten im mikromolaren Bereich erzielt, wobei deutlich bessere Affinitäten für den NMDA-Rezeptor resultierten. Dies ist sicherlich auf die gewählten Ausgangsstrukturen der Thienopyridinone zurückzuführen, die bereits als Antagonisten der Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors etabliert waren.
Die vorliegende, in kumulativer Schreibweise verfasste Arbeit erläutert die Entwicklung, Charakterisierung und Optimierung zweier unterschiedlicher Leitstrukturen, die als Agonisten von Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) und gleichsam als duale Inhibitoren der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO) wirken. Chemisch betrachtet sind dies zum ersten die Gruppe der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate und zum zweiten die Gruppe der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate. Die Publikation zur Synthese und in vitro-pharmakologischen Charakterisierung der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate an PPAR (Zettl et al., QSAR & Combinatorial Science, 28:576–586, 2009) enthält einerseits die strukturelle Optimierung durch Variation der Aryl-Substitution des zentralen Pyrimidinringes der Leitstruktur und andererseits die durch Docking-Verfahren gestützte Untersuchung des Einflusses der Stereochemie auf die PPAR-Aktivierung. Letztlich konnte durch die Einführung von Biphenyl-Substituenten eine Verbesserung insbesondere der PPARalpha-Aktivität gegenüber der als strukturellen Referenz dienenden alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäure (Rau et al., Archiv der Pharmazie, 341:191–195, 2008) erreicht werden. Mit Hilfe von präparativer enantioselektiver HPLC wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre beiden Enantiomere getrennt. Deren in vitro-pharmakologische Charakterisierung ergab, dass das (R)-Enantiomer insbesondere bei PPARalpha als Eutomer fungiert. Dieses Ergebnis konnte mit Hilfe von Docking-Studien weiter untermauert werden. Hierbei wurde deutlich, dass die Besetzung der linken proximalen Bindetasche der PPARalpha-Liganden-Bindungs-Domäne durch den alpha-n-Hexyl-Rest lediglich im Fall einer (R)-Konfiguration optimal erfolgen kann. Die Synthese und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung der Substanzklasse der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate an PPAR sind in Zettl et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19: 4421-4426, 2009 zusammengefasst. Bei der Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen erwies sich die Leitstruktur als hochaktiv und sehr robust. Je nach Substitutionsmuster des lipophilen Molekülteils wurden potente selektive PPARalpha-Agonisten wie auch PPARalpha-präferenzielle duale PPARalpha/gamma-Agonisten dargestellt. Durch die Synthese von Kohlenstoff-Analoga und alpha-unsubstituierten Verbindungen wurde des Weiteren der Einfluss des Schwefelatoms und des n-Butylrestes in alpha-Position zur Carbonsäure auf die PPAR-Aktivität untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass beide Strukturelemente einen großen Beitrag zur hohen PPARalpha-Aktivität der Leitstruktur leisten. Wie auch bei den alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivaten wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre Enantiomere getrennt und der Einfluss des Stereozentrums in alpha-Position zur Carbonsäure untersucht. Das Ergebnis bestätigte die Resultate der vorangegangenen Studie: Das (R)-Enantiomer wirkte als Eutomer, wobei der stereochemische Einfluss bei PPARalpha besonders deutlich war. Ausgewählte Synthesen und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung von Pirinixinsäurederivaten an mPGES-1, 5-LO sowie der Cyclooxygenase (COX) sind in Koeberle und Zettl et al., Journal of Medicinal Chemistry, 51:8068–8076, 2009 publiziert. Die Arbeit beinhaltet eine umfassende Reihe an Pirinixinsäurederivaten mit Strukturvariationen in alpha-Position zur Carbonsäure und im Aryl-Substitutionsmuster des Pyrimidinringes. Hinsichtlich der alpha-Substitution zeigte sich, dass für Alkylreste eine Kettenlänge von mindestens 6 Kohlenstoffatomen für einen dualen Wirkmechanismus erforderlich ist. Als Leitstruktur für duale mPGES-1/5-LO-Inhibitoren ergab sich somit alpha-n-Hexyl-substituierte Pirinixinsäure, deren Aryl-Substitutionsmuster am zentralen Pyrimidin weiter optimiert wurde. Als vorteilhaft erwies sich die Substitution mit Biphenylresten, wodurch die Darstellung von niedrig mikromolar aktiven dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren gelang. Bei der Analyse der Strukur-Wirkungs-Beziehungen von unterschiedlichen Biphenylresten zeigte sich eine hohe strukturelle Toleranz hinsichtlich der dualen inhibitorischen Aktivität an der mPGES-1 und der 5-LO. Somit stellen die alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate die ersten publizierten dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren dar.
In dieser Arbeit wurde YM155 anhand eines Neuroblastom-Zellmodells bezüglich seiner antitumoralen Wirkung, sowie möglicher Resistenzmechanismen untersucht. Mit Hilfe eines Viabilitäts-‚Screenings‘ wurde eine Auswahl von 113 chemosensitiven und chemoresistenten Neuroblastomzellen auf mögliche Kreuzresistenzen gegen YM155 untersucht. Hinsichtlich der IC50 Werte gegen YM155, lagen insgesamt 74 % der untersuchten Zelllinien im therapeutisch erreichbaren Bereich von unter 50 nM. Zusätzlich wurden Neuroblastom-, Mammakarzinom- und Prostatakarzinomzellen an eine klinisch relevante YM155 Konzentration adaptiert. Diese zeigten wiederum, dass durch die Adaptierung hervorgerufene Expressionsänderung des ABC-Transporters ABCB1 und des ‚solute carrier‘ Protein SLC35F2 eine bedeutsame Rolle hinsichtlich des Resistenzmechanismus gegen YM155 spielen. Durch den Einsatz von spezifischen ABCB1-Inhibitoren, als auch durch siRNA-vermittelte Reduzierung von ABCB1 konnte eine Abhängigkeit für die Wirksamkeit YM155 von ABCB1 in Neuroblastomzellen bestätigt werden. Des Weiteren wurde in den untersuchten Zelllinien ein Zusammenhang zwischen der Wirkung von YM155 und der Expression des ‚solute carrier‘ Proteins SLC35F2 hergestellt. Dazu wurden Zellen mit verminderter SLC35F2 Expression verwendet, welche durch Transduktion mit einem für eine SLC35F2 spezifische shRNA kodierenden Vektor etabliert wurden. Dabei führte eine verminderte SLC35F2 Expression zu einer starken Minderung der Sensitivität gegen YM155. Das Zusammenspiel dieser beiden Transporter und der damit verbundene Resistenzmechanismus gegen YM155, konnte in fast allen etablierten YM155-resistenten Zelllinien (UKF-NB-3rYM15520, 22RV1rYM155300, PC-3rYM15520, HCC-1806rYM15520 und MDA-MB-231rYM15520) gezeigt werden. Wobei diese Zellen unabhängig von der Tumorentität als Resistenzmechanismus gegen YM155 entweder eine signifikant induzierte ABCB1 Expression (verstärkter YM155 Efflux) und/oder eine verminderte SLC35F2 Expression (verringerter YM155 Influx) entwickelten. Außerdem konnte mit Hilfe der p53-depletierten Zelllinie UKF-NB-3pc-p53 eine Abhängigkeit der YM155 Wirkung vom Tumorsuppressor p53 nachgewiesen werden, wobei es durch die Depletierung von p53 zu einer verminderten Sensitivität der Zellen gegen YM155 kam. Zudem kam es durch die Nutlin-3 hervorgerufene p53 Aktivierung und Akkumulierung zu einer Verstärkung der YM155 Wirkung in den untersuchten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der p53 Status von Zellen einen Einfluss auf deren YM155 Resistenz haben kann. Da in der Behandlung von Neuroblastomen neben der Chemotherapie auch Bestrahlung eingesetzt wird, wurde zusätzlich untersucht ob eine Adaptierung von Neuroblastomzellen an YM155 zu einer verminderten Sensitivität gegen Bestrahlung führen kann. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten UKF-NB-3 Zelllinien (UKF-NB-3 und UKF-NB-3rYM15520) eine ähnliche Sensitivität gegenüber der Bestrahlung aufwiesen, konnte kein Zusammenhang zwischen einer Adaptierung an YM155 und der Ausbildung einer Bestrahlungsresistenz gezeigt werden.
Ein weiterer wichtiger Teil dieser Arbeit war es, den primären Wirkmechanismus von YM155 in Neuroblastomzellen zu untersuchen. In vorangegangenen Studien wurde die vom Hersteller beschriebene Wirkung von YM155 als Survivin-Inhibitor in Frage gestellt. Stattdessen soll der primäre Apoptose-induzierende Effekt in erster Linie durch DNA-Schäden hervorgerufen werden, während die Survivin Inhibierung lediglich darauf folgen soll. In einer zeitlichen und konzentrationsabhängigen Kinetik der YM155 Behandlung konnte in UKF-NB-3 Zellen der genaue Zeitpunkt der Survivin-Inhibierung und der Induktion der DNA-Schadensantwort ermittelt werden. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass in Neuroblastomzellen als Antwort auf die YM155 Behandlung zuerst eine Survivin-Inhibierung erfolgt, und die DNA-Schadensantwort als Folge dieser induziert wird. Darüber hinaus belegte die siRNA-vermittelte Survivin-Inhibierung in UKF-NB-3 und UKF-NB-6, dass eine fehlende Survivin Expression die DNA-Schadensantwort induziert.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals in YM155 adaptierten Neuroblastomzellen der Resistenzmechanismus gegen YM155 näher untersucht werden und darüber hinaus wurde demonstriert, dass die Wirkung von YM155 in Neuroblastomzellen nicht auf die Induktion der DNA-Schadensantwort beruht, sondern primär auf die Survivin-Inhibierung zurückzuführen ist.
Der Extrakt des indischen Weihrauchs (Boswellia serrata) ist eines der wenigen pflanzlichen Heilmittel, dem von der EMEA der Orphan Drug Status zur Behandlung des peritumoralen Hirnödems verliehen wurde. Boswellia serrata Extrakt und die Boswelliasäuren, die wirksamen Inhaltsstoffe des Weihrauchs, zeigten in zahlreichen in vitro-Untersuchungen antiinflammatorische und antitumorale Wirksamkeit. Diese Wirkungen konnten auch in mehreren klinischen Studien nachgewiesen werden. Untersuchungen zum pharmakokinetischen Verhalten der Boswelliasäuren zeigten, dass Weihrauch nur eine geringe orale Bioverfügbarkeit aufweist. Ziel der Arbeit war es daher, den Einfluss von Löslichkeit, Metabolismus und Permeabilität auf die Bioverfügbarkeit der Boswelliasäuren zu untersuchen. Weihrauchextrakte sind in wässrigen Medien schlecht löslich. In einer Rattenstudie wurde deshalb untersucht, inwieweit die verbesserte Löslichkeit des Extrakts in einer nanoskaligen Boswellia serrata Formulierung zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit führt. Eine bestehende LC-MS-Methode zur Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirngewebe wurde optimiert und revalidiert. Zur Vervollständigung des pharmakokinetischen Profils wurden die KBA- und AKBA-Konzentrationen auch in der Leber der Ratten bestimmt. Die analytische Methode wurde hierfür nach den anerkannten FDA-Richtlinien erfolgreich validiert. Die Plasma- und Leberkonzentrationen waren jedoch bei den Ratten, die die nanoskalige Boswellia serrata Formulierung bekamen, in den ersten Stunden nach der oralen Verabreichung nicht signifikant höher als bei den Ratten, die den unbehandelten Extrakt erhielten. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur metabolischen Stabilität von KBA und AKBA in Rattenlebermikrosomen (RLM), Humanlebermikrosomen (HLM) und Rattenhepatozyten (RH) zeigten, dass KBA einer stark ausgeprägten hepatischen Metabolisierung unterliegt. AKBA hingegen erscheint metabolisch relativ stabil. Die Identifizierung der Metabolite ergab, dass Boswelliasäuren in RLM hauptsächlich Phase-I-Metabolite wie mono-, di-, und seltener auch trihydroxylierte Metabolite bilden. Von AaBA und AbBA konnten keine Metabolite detektiert werden. Das metabolische Profil von KBA und AKBA in RH war mit dem in RLM vergleichbar. In einer Rattenstudie konnten dann im Plasma und in der Leber jedoch nicht im Hirn der Ratten KBA-Metabolite nachgewiesen werden, während für AKBA in vivo keine Metabolite detektiert wurden. Phase-II-Metabolite konnten weder von KBA noch von AKBA nachgewiesen werden. Bisher war man davon ausgegangen, dass die niedrigen Plasmakonzentrationen von AKBA in vivo durch eine Deacetylierung zu KBA zustande kommen. Diese These konnte im Rahmen dieser Arbeit widerlegt werden. Im Caco-2-Zellmodell zeigte KBA eine mittlere Permeabilität. Es konnte gezeigt werden, dass KBA und AKBA offensichtlich keinem Efflux-Transport unterliegen. AKBA erwies sich sowohl in absorptiver und sekretorischer Richtung als auch bei 4° C als schlecht permeabel. Da KBA und AKBA die Aktivität des ABC-Transportproteins Pgp modulieren, wurde in dieser Arbeit überprüft, ob diese beiden Boswelliasäuren auch Substrate des Pgp sind. Die Permeation von KBA und AKBA war in Anwesenheit des Pgp-Inhibitors Verapamil jedoch nicht signifikant verändert, was darauf hindeutet, dass KBA und AKBA keine Pgp-Substrate sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden einen wichtigen Baustein zur weiteren Aufklärung des pharmakokinetischen Verhaltens von KBA und AKBA. So ist die begrenzte systemische Verfügbarkeit von KBA auf eine mittlere Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt in Kombination mit der umfangreichen hepatischen Metabolisierung zurückzuführen. Die niedrigen systemischen Konzentrationen von AKBA hingegen liegen eher in der schlechten Absorption begründet. Auf der Basis der extensiven Metabolisierung von KBA und der schlechten Permeabilität von AKBA stellt sich im Allgemeinen die Frage nach dem tatsächlichen Wirkmechanismus von KBA und AKBA. In keiner pharmakokinetischen Studie konnten die in vitro pharmakologisch aktiven Konzentrationen dieser beiden Boswelliasäuren erzielt werden. Es ist daher nicht auszuschließen, dass auch andere Wirkmechanismen als die bisher beschriebenen existieren. Unter dem Gesichtspunkt möglicher Arzneimittelinteraktionen wurde die Wirkung von KBA und AKBA auf MRP2 und OATP1B3 in zwei zellbasierten Assays untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass KBA und AKBA die Aktivität von MRP2 und OATP1B3 in Konzentrationen modulieren, welche im Rahmen dieser Arbeit in der Leber von Ratten nachgewiesen wurden. Da Weihrauchextrakt häufig in Comedikation verwendet wird, sollte im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit in Zukunft geprüft werden, ob es zu praxisrelevanten Arzneimittelinteraktionen mit klinisch relevanten MRP2- und OATP1B3-Substraten kommt.
Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.
Die vorliegende Arbeit beschreibt Untersuchungen zur Beurteilung der pharmazeutischen Qualität von Phytopharmaka am Beispiel der häufig eingesetzten Johanniskrautextrakt-Präparate. Elf Johanniskrautextrakt-Präparate des deutschen Arzneimittelmarktes wurden hinsichtlich Chargenhomogenität, Chargenkonformität und Gehalt der wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffe Gesamthypericin und Hyperforin untersucht. Außerdem wurde die Freisetzung von Hyperforin, Hypericinen und Flavonoiden aus verschiedenen Präparaten in kompendialen und biorelevanten Medien geprüft. Zur Analytik des Hyperforins und der Flavonoide wurden zwei HPLC-Verfahren etabliert und nach ICH-Guidelines validiert. Die Analysenzeit der isokratischen Methode zur Bestimmung von Hyperforin war mit 10 Minuten sehr kurz. Somit war die Methode sowohl für die Gehaltsbestimmungen als auch für die Freisetzungsuntersuchungen sehr gut geeignet. Zur Bestimmung der Flavonoide Rutin, Hyperosid/ Isoquercitrin und Quercitrin wurde eine Gradientenelution verwendet, wodurch eine Analysenzeit von 18 Minuten resultierte. Gesamthypericin wurde mittels Differentieller Puls-Polarographie nach Belichtung der Proben bestimmt. Die Ergebnisse der Untersuchung zur Chargenhomogenität von Gesamthypericin und Hyperforin belegten für nahezu alle Präparate eine gute Gleichförmigkeit des Gehaltes der analysierten wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffe. Im Bezug auf die Chargenkonformität hinsichtlich Gesamthypericin wiesen die Präparate unterschiedliche Resultate auf. Zwar ist es seit Erscheinen des „Bühler-Papiers“ nicht mehr zulässig auf einen definierten Gehalt an Gesamthypericin, zu normieren, einige Extrakthersteller ziehen diese Substanzgruppe jedoch als analytischen Qualitätsparameter bei der Herstellung standardisierter Extrakte heran. So zeigten vier Präparate bei der Untersuchung von je fünf Chargen mit relativen Standardabweichungen von unter 10% eine gute Reproduzierbarkeit des Gesamthypericingehaltes. Die übrigen Präparate wiesen mehr oder weniger starke Schwankungen im Gesamthypericingehalt auf. Die Untersuchung der Chargenkonformität bezüglich Hyperforin führte zu dem Ergebnis, daß lediglich für zwei Präparate (eines Herstellers) eine sehr gute Reproduzierbarkeit des Hyperforingehaltes erreicht wurde. Hier betrugen die relativen Standardabweichungen weniger als 4%. Die übrigen Präparate zeigten mehr oder weniger starke Schwankungen, wobei für ein Präparat der Variationskoeffizient 70% betrug. Auffällig ist, daß die Präparate mit einheitlichen Hyperforingehalten höhere relative Standardabweichungen von ca. 20% bzgl. des Gesamthypericingehaltes zeigten. Umgekehrt zeigten Präparate mit einheitlichem Gesamthypericingehalt oftmals höhere Variationskoeffizienten bei den Hyperforingehalten. Eine gute Chargenkonformität für beide Analyten wiesen lediglich drei Präparate auf. Der relative Gesamthypericingehalt im Extrakt betrug zwischen 0,11 und 0,43%, während der Absolutgehalt an Gesamthypericin Werte zwischen 0,33 und 1,92 mg je Darreichungsform aufwies. Orientiert an den Einnahmeanweisungen der Hersteller lagen die maximalen Tagesdosen Gesamthypericin zwischen 1,00 und 3,69 mg Gesamthypericin. Die gefundenen relativen Hyperforinmengen lagen in der Regel zwischen 1,09 und 4,48% im Extrakt, wobei ein einzelnes Präparat weniger als 0,2% Hyperforin im Extrakt aufwies. Für den Absolutgehalt an Hyperforin wiesen die Präparate Werte zwischen weniger als 0,5 und 28,88 mg auf. Unter Berücksichtigung der Einnahmeempfehlungen des Herstellers ergaben sich daraus Tagesmaximaldosen zwischen < 1 und 53,76 mg Hyperforin. Die Ergebnisse der Freisetzungsuntersuchungen in kompendialen und biorelevanten Medien zeigten, daß Hyperforin im sauren Milieu des Magensaftes nicht freigesetzt wird und es auch unter Bedingungen, die den nüchternen Zustand im proximalen Dünndarm simulieren lediglich zu einer geringfügigen Freisetzung aus der Arzneiform kam. Eine gute Freisetzung konnte hingegen im Medium FeSSIF erreicht werden, daß die Bedingungen des proximalen Dünndarms im gesättigten Zustand simuliert. Gesamthypericin ging zwar im sauren pH-Milieu des Magensaftes ebenfalls nicht in Lösung, unter simulierten Nüchternbedingungen im Dünndarm konnte im Gegensatz zu Hyperforin aber bereits eine gute Freisetzung verzeichnet werden. Die untersuchten Flavonoide zeigten in allen verwendeten Medien eine gute Freisetzung. Der Vergleich verschiedener Präparate ergab starke Unterschiede hinsichtlich ihrer Freisetzungscharakteristik. Dabei ergaben sich Abweichungen sowohl hinsichtlich Geschwindigkeit als auch bezüglich Vollständigkeit der Freisetzung der untersuchten Inhaltsstoffe. Eine Tatsache ist, daß Präparate, die laut Deklaration als pharmazeutisch äquivalent einzustufen wären, sich einerseits im Bezug auf den Gehalt an pharmazeutisch-relevanten Inhaltsstoffen und andererseits auch in ihrem in-vitro-Freisetzungverhalten unterschiedlich verhalten und somit nicht als biopharmazeutisch äquivalent gelten können. Dies läßt den Schluß zu, daß Johnniskrautextrakt-Präparate zur Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen nicht ohne weiteres untereinander ausgetauscht werden sollten. Es ist unumstritten, daß Bedarf an neuen aussagekräftigen Beurteilungsansätzen zur Qualität von Phytopharmaka vorhanden ist. In dieser Arbeit wurde eine neue und verfolgenswerte Idee zur vergleichenden Bewertung der pharmazeutischgalenischen Qualität von Phytopharmaka am Beispiel von Johanniskrautextrakt-Präparaten aufgezeigt.
Die Komplementarität der molekularen Oberflächen und der Pharmakophorpunkte ist ein verbreiteter Konzept im rechnergestützen Moleküldesign. Diesem Konzept folgend wurde die Software SQUIRREL neu entwickelt und in der Programmiersprache Java implemetiert. Die Software generiert die Vorschläge für den bioisosteren Ersatz von Molekülen und Molekülfragmenten. SQUIRREL kombiniert Oberflächen- und Pharmakophoreigenschaften bioaktiver Substanzen und kann im virtuellen Screening und fragment-basierten de novo Design eingesetzt werden. In einer prospektiven Studie wurde SQUIRREL verwendet, um neue selektive PPARalpha-Agonisten aus einer kommerziellen Moleküldatenbank zu identifizieren. Die Software lieferte eine potente Substanz (EC50 = 44 nM) mit über 100facher Selektivität gegenüber PPARgamma. In einer zweiten Studie wurde eine Leitstruktur de novo generiert und synthetisiert. Als Ausgangstruktur diente der bekannte PPARalpha-Agonist GW590735. Während des Designvorgangs wurden zwei Teilstrukturen, die für die Aktivität von GW590735 verantwortlich sind, durch bioisostere Gruppen ersetzt, die von SQUIRRELnovo vorgeschlagen wurden. Die neue Leitstruktur aktiviert PPARalpha in einem zellbasierten Reportergen-Testsystem bei einem EC50 von 0.51 µM.