Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (9)
Has Fulltext
- yes (9)
Is part of the Bibliography
- no (9)
Keywords
- Bartonella henselae (1)
- CHIP (1)
- Hochdurchsatz (1)
- HuR (1)
- IFT (1)
- Immunofluoreszenz (1)
- Kolonkarzinom (1)
- PKCδ (1)
- RNA-Bindeprotein (1)
- SENP (1)
- SUMO (1)
- age (1)
- atherosclerosis (1)
- autologous stem cell transplantation (1)
- chemotherapy (1)
- clonal dominance (1)
- clonal hematopoiesis (1)
- heart failure (1)
- hematopietic stress (1)
- hematopoietic stem cell (1)
- hematopoietic stem cells (1)
- high-throughput (1)
- inflammation (1)
- leukemia (1)
- somatic mutations (1)
- transglutaminase 2 (1)
Institute
- Medizin (5)
- Biowissenschaften (3)
- Pharmazie (1)
Bartonella henselae (B. henselae) ist ein zoonotischer humanpathogener Erreger, der die Katzenkratzkrankheit sowie andere Infektionskrankheiten verursacht. Trotz des globalen Auftretens sind epidemiologische Daten rar oder beruhen auf geringen Fallzahlen. Die aktuelle Forschung zu Bartonellen zielt mehr und mehr auf einen interdisziplinären Ansatz, der als one-health-Konzept zusammengefasst werden kann und als solcher zunehmend Daten zur Seroprävalenz mit hohen Fallzahlen benötigt.
Die Detektion von anti-B. henselae IgG-Antikörpern mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IFT) ist die Diagnostik der Wahl für Bartonella-Infektionen. Dabei handelt es sich um ein objektträgerbasiertes Verfahren, wodurch dessen Handhabung ungeeignet für die Verarbeitung im Hochdurchsatz wird.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der high-throughput IFT (hpIFT) zum Nachweis von anti-B. henselae IgG-Antikörpern im 96-Well-Platten-Format entwickelt, welcher es zum ersten Mal ermöglicht, seroepidemiologische Daten mit hohen Fallzahlen zu generieren.
Für die Antigenpräparation im 96-Well-Platten-Format wurden HeLa 229-Zellen mit B. henselae [Houston-1 RSE 247 (BadA-)-Stamm] infiziert, fixiert, blockiert und permeabilisiert. Humane Seren wurden 1:320 verdünnt. Nach Inkubation der Seren folgte die Zugabe von Sekundärantikörpern. Für die genannten Schritte wurde ein einfacher, ökonomischer Workflow unter Zuhilfenahme des Pipettierroboters VIAOFLO 96/384 von Integra erstellt.
Mit dem entwickelten hpIFT wurden insgesamt 5.215 Proben verarbeitet. Alle Seren wurden bei einem cut-off-Wert von 1:320 bewertet, dabei galten Werte von ≥ 1:320 als positiv. Um die diagnostische Validität zu überprüfen, wurden zunächst 20 bekannte Seren in unterschiedlichen Titerstufen und anschließend 238 zufällig ausgewählte Blutspendeseren mit der kommerziellen objektträger-basierten IFT-Methode von Euroimmun (Produktcode: FK-219b-1010-1G) verglichen. Zur Überprüfung der Intraspezies-Kreuzreaktivität wurden verschiedene B. henselae-Stämme [Houston-1 RSE 247 (BadA-), Marseille (BadA+), Houston-1 MFE341 (BadA+), Marseille (BadA-)] und B. quintana-Stämme [JK31 (Vomp+) und 2D70(Vomp-)] als Antigen mit unterschiedlichen, in der Antikörperkonstellation bekannten Seren untereinander verglichen. Um die Interspezies-Kreuzreaktivitäten abzuklären, wurden Seren mit hohen IgG-Antikörpern gegen andere Pathogene (Anaplasma phagocytophilum, Leptospira spp., Brucella spp., Coxiella burnetii, Rickettsia typhi, Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Epstein-Barr-Virus und B. quintana) überprüft.
Es zeigte sich, (I) dass der modifizierte hpIFT mit beinahe gleichwertiger Sensitivität (86,2 %) und Spezifität (80,6 %) verglichen mit dem kommerziell erhältlichen IFT von Euroimmun bei umfangreichen Probenmengen ein ökonomisches, vergleichsweise einfach zu bedienendes, zuverlässiges und präzises Verfahren zur Detektion von anti-B. henselae IgG-Antikörpern in humanen Seren darstellt und (II), dass die ermittelte anti-B. henselae IgG-Prävalenz von 22,3 % unter 5.215 Blutspenderinnen und Blutspendern verglichen mit weltweit publizierten Studien vergleichbarer Kohorten der letzten Jahre höher ausfällt als angenommen.
Der hier etablierte hpIFT stellt damit ein vielversprechendes Tool für die Hochdurchsatz-Serologie zum Nachweis von anti-B. henselae-Antikörpern in Prävalenzstudien dar. Eine weitere Modifizierung beispielsweise für den veterinären Bereich könnte im Sinne des one-health Ansatzes neue Möglichkeiten für epidemiologische Forschungsaspekte eröffnen.
Weltweit stellt das kolorektale Karzinom die dritthäufigste Krebsdiagnose bei Männern und die zweithäufigste bei Frauen dar. Von den bekannten beeinflussbaren Risikofaktoren sind Ernährung, Rauchen und körperliche Aktivität zu nennen, hingegen gelten Alter, familiäre Belastung und männliches Geschlecht als nicht beeinflussbare Risikofaktoren. Neben Genmutationen, welche beispielsweise bei der Familiären Adenomatösen Polyposis coli und beim “Lynch Syndrom” eine wichtige Rolle spielen, kann auch die pathologisch verstärkte Expression von tumorrelevanten Proteinen wie z.B. induzierbare COX-2, Cyclin A, B und D, c-Fos, EGF, MMP-9, VEGF sowie das ubiquitäre RNA-Bindeprotein HuR maßgeblich zur Entstehung des Kolonkarzinoms beitragen. Viele der bislang identifizierten Zielgene des HuRs sind an der Regulation tumorpromovierender Eigenschaften wie Proliferation, Invasion, Metastasierung und Apoptose beteiligt, was HuR zu einem hochattraktiven Target der molekularen Tumortherapie macht. Bislang ist bekannt, dass eine gesteigerte HuR-Bindung an AREs in der 3’UTR vieler Zielgene entweder zur Stabilisierung und/oder
Translationsveränderung von kurzlebigen mRNAs von tumorrelevanten Genprodukten führen kann. Eine pathologisch erhöhte zytosolische HuR Akkumulation, welche bekanntlich oft mit einer ungünstigen Prognose der Tumorpatienten korreliert, wird jedoch im Wesentlichen als Folge eines fehlerhaft regulierten erhöhten Exportes des überwiegend im Zellkern lokalisierten HuR Proteins ins Zytoplasma (sogenanntes “HuR-Shuttling”) betrachtet, während genomische oder epigenetische Mechanismen vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielen. Der Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der bisher nur wenig bekannten zugrunde liegenden Mechanismen des erhöhten HuR-Shuttlings in der Kolonkarzinom-Zelllinie DLD-1 unter besonderen Berücksichtigung PKCδ-abhängiger Signalwege. Durch Zugabe des pharmakologischen PKCδ-Inhibitors Rottlerin konnte die subzelluläre HuR-Lokalisation in den Kolonkarzinom Zelllinien DLD-1 und SW-620 deutlich reduziert werden, wobei die maximale Wirkung erst nach einer Inhibitionszeit von 16 Stunden erreicht wurde. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass Rottlerin die PKCδ Aktivität in DLD-1 Zellen hemmt. Hingegen konnten Inhibitoren von verschiedenen MAPK-Kinasen (SB203580, SP600125, PD98059, Raf-1-Inhibitor) die basale zytoplasmatische HuR Lokalisation nicht beeinflussten, ebensowenig der pharmakologische Inhibitor der Calcium-abhängigen PKCs (PKCα und PKCβ) Gö6976. Auf der anderen Seite bewirkte das Phorbolester PMA eine deutliche Steigerung der PKC-Aktivität. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit nach tumorrelevanten Genen gesucht, deren Expression in humanen Kolonkarzinomzellen posttranskriptionell von HuR und gleichzeitig von PKCδ kontrolliert wird. Mit Hilfe von RNA-Pulldown Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der PKCδ funktionell zu einer starken Reduktion der an HuR-gebundenen mRNAs wie c-myc, cyclin A und D sowie COX-2 führt. Schließlich haben Aktivitätsmessungen der Gesamt-PKC-Aktivität gezeigt, dass diese in Kolonkarzinom-Zelllinien nachweisbar und damit basal aktiv ist. Die Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit können zum besseren Verständnis der pathophysiologischen Bedeutung des ubiquitären RNA-Bindeproteins HuR für die Kolonkarzinogenese sowie der prokarzinogenen Rolle der PKCδ im Kolongewebe beitragen.
Hematopoietic stem cells (HSCs) have the unique abilities of life-long self-renewal and multi-lineage differentiation. They are routinely used in BM or stem cell transplantations to reconstitute the blood system of patients suffering from malignant or monogenic blood disorders. For an adequate production of each blood cell lineage in homeostasis and under stress conditions, the fate choice of HSCs to either self-renew or to differentiate must be strictly controlled. The incomplete understanding of the molecular mechanisms that control this balance makes it still impossible to maintain or expand undifferentiated HSCs in culture for advanced regenerative medical purposes.
The aim of this thesis was the identification and molecular characterisation of mechanisms that control the decision of HSCs to self-renew or to differentiate, and how they are connected to extrinsic cytokine signaling control. Prior to this thesis, a screening for genes upregulated under self-renewal promoting thrombopoietin (TPO) signaling via the transcription factors STAT5A/B in HSCs was conducted, and Growth arrest and DNA damage inducible 45 gamma (Gadd45g) was one of the regulated genes. GADD45G was described as stress sensor, DNA-damage response and tumor suppressor gene, that is epigenetically silenced in many solid tumors and leukemia. Furthermore, Gadd45g is upregulated in aged HSCs with impaired multi-lineage reconstitution abilities, and it is induced by differentiation promoting cytokines in GM-committed cells. However, the function of GADD45G in LT-HSCs was unknown. All these points warrant further investigation to unravel the function of GADD45G on early cell fate decisions of HSCs in hematopoiesis.
The expression of Gadd45g was stimulated by hematopoietic cytokines TPO, IL3 and IL6 both in HSCs and MPPs, making GADD45G an interesting target to focus on. To simulate the cytokine-induced expression GADD45G was lentivirally transduced in HSCs. Surprisingly, GADD45G did not induce cell cycle arrest or cell death in hematopoietic cells neither in vitro nor in vivo, as reported in many cell lines. Instead GADD45G revealed an enhanced and markedly accelerated differentiation of HSCs into mainly myelomonocytic cells, similar as observed for IL3 and IL6 containing cultures. Also in vivo, GADD45G rapidly initiates the differentiation program in HSCs at the expense of self-renewal and long-term engraftment, as shown by serial HSC transplantation experiments. Along the same line, HSCs from Gadd45g-knock out mice exhibited an increased self-renewal. In vitro, Gadd45g-/- progenitors showed higher and prolonged colony formation potential and slower expansion after cytokine stimulation. The loss of Gadd45g increased HSC self-renewal and improved repopulation in secondary recipients, determined by serial competitive transplantations. Taken together, GADD45G could be identified as molecular link between differentiation-promoting cytokine signaling and rapid differentiation induction in murine LT-HSCs.
As presented in this thesis the differentiation induction of GADD45G was mediated by the activation of the cascade of MAP3K4 – MKK6 –p38 MAPK. Small molecule inhibition of p38, but not JNK, blocked the GADD45G-induced differentiation. GADD45G binds to MAP3K4 and releases its auto-inhibitory loop by a change in confirmation, initiating this cascade. Phosphoflow cytometry demonstrated the activation of p38 and a downstream kinase MK2 by GADD45G expression in MPPs. Furthermore, the expression of constitutive active MAP3K4 and MKK6 were able to phenocopy GADD45G-induced differentiation, which could be blocked by p38 inhibition.
The other two family members GADD45A and B also induced accelerated differentiation in LT-HSCs. Interestingly, only GADD45G suppressed the differentiation into megakaryocyte and erythrocyte (Mek/E) lineage cells suggesting a role of GADD45G in lineage choice. Long-term time-lapse microscopy-based cell tracking of single LT-HSCs and their progeny revealed that, once GADD45G is expressed, the development of LT-HSCs into granulocyte-macrophage-committed progeny occurred within 36 hours, and uncovered a selective lineage choice with a severe reduction in Mek/E cells. Furthermore, no megakaryocytic-erythroid progenitors (MEPs) could develop from HSPCs in BM 2 weeks after transplantation suggesting a very early selection against Mek/E cell fates. In line with these findings, GADD45G-transduced MEPs could not expand or form colonies in vitro, demonstrating that the differentiation program induced by GADD45G is not compatible with Mek/E lineage fate. Gene expression profiling of HSCs indicated that GADD45G promotes myelomonocytic differentiation programs over programs for self-renewal or megakaryo-/ erythropoiesis. The here identified differentiation induction potential of GADD45G is so strong that the expression of GADD45G in primary acute myeloid leukemia (AML) cells inhibited their expansion accompanied by enhanced differentiation and increased apoptosis.
The here presented work shows that IL3 and IL6 induce a differentiation program in HSCs via GADD45G and p38 closing the link of extrinsic cytokine signaling and differentiation induction. Since the loss of Gadd45g increased the self-renewal and slowed HSC differentiation, this may be utilized, i.e. by p38 inhibition, to ex vivo maintain and expand HSCs by preventing cytokine-induced differentiation. Furthermore, Re-expression of GADD45G may overcome the differentiation block in leukemia to eliminate these cells by driving them into terminal differentiation and apoptosis.
Clonal hematopoiesis of indeterminate potential (CHIP) is caused by recurrent somatic mutations leading to clonal blood cell expansion. However, direct evidence of the fitness of CHIP-mutated human hematopoietic stem cells (HSCs) in blood reconstitution is lacking. Because myeloablative treatment and transplantation enforce stress on HSCs, we followed 81 patients with solid tumors or lymphoid diseases undergoing autologous stem cell transplantation (ASCT) for the development of CHIP. We found a high incidence of CHIP (22%) after ASCT with a high mean variant allele frequency (VAF) of 10.7%. Most mutations were already present in the graft, albeit at lower VAFs, demonstrating a selective reconstitution advantage of mutated HSCs after ASCT. Thus, CHIP-mutated stem and progenitor cells largely gain on clone size upon ASCT-related blood reconstitution, leading to an increased future risk of CHIP-associated complications. CHIP increase with age and is also associated with atherosclerosis and inflammation. Age and inflammation are the major risk factors for heart failure, yet the association of CHIP with chronic ischemic heart failure (CHF) in humans is unknown. Therefore, we analyzed bone marrow-derived mononuclear cells from 200 patients with CHF by NGS to detect the presence of CHIP and associated such with long-term prognosis in patients with CHF. Forty-seven mutations with a VAF of at least 2% were found in 18.5% of 200 patients with CHF. The mutations most commonly occurred in the genes DNMT3A and TET2. During a median follow-up of 4.4 years, a significantly worse clinical outcome for patients with either DNMT3A or TET2 mutations compared with non-CHIP carriers was notable. Importantly, there was a significant dose-response association between VAF and clinical outcome. Our data suggest that somatic mutations in hematopoietic cells, may be significantly associated with the progression and poor prognosis of CHF.
In der Akuten Lymphatischen Leukämie (ALL) im Erwachsenenalter beträgt die 5–Jahres-Überlebensrate trotz verbesserter Therapien unter 40%. Die Prognose wird durch das Auftreten von Rezidiven signifikant verschlechtert. ALL entsteht durch genetische Veränderungen lymphatischer Vorläuferzellen im Knochenmark, welche zu einem Differenzierungsblock und zu starker Zunahme der Vorläufer-zellen führen. Eine mögliche Erklärung für das bestehende hohe Rezidiv-Risiko wird in der unvollständigen Elimination von Leukämie-induzierenden Zellen (LIZ) durch die Primärtherapie gesehen. Die Identifizierung und Charakterisierung von LIZ in der ALL anhand spezifischer Oberflächenmarker war bisher nicht möglich, daher ist die molekulare und funktionelle Charakterisierung von LIZ für die Entwicklung moderner Therapieansätze unabdingbar. Metabolische Analysen primärer ALL-Langzeitkulturen (LZK) in Vorarbeiten zeigten eine deutliche Abweichung des Kohlenhydratstoffwechsels vom physiologischen metabolischen Profil einer Knochenmarkszelle hin zur Nutzung der Glykolyse mit zunehmendem leukämogenen Potential der etablierten LZK. Folglich ist in dieser Dissertation der Zusammenhang zwischen höherer Glukoseaffinität, schnellerer Glukoseaufnahme und dem Vorliegen eines höheren leukämogenen Potentials der Zellen und damit einer Definition der LIZ anhand ihres Energiestoffwechsels untersucht worden.
Hierfür wurden Tests im Mausmodell in vivo und in vitro mit drei ALL-LZK CR, PH und BV durchgeführt. Wir etablierten unter Verwendung des fluoreszenzmarkierten Glukoseanalogons 2–NBDG sowie eines gegen den GLUT–1 gerichteten Antikör-pers jeweils ein durchflusszytometrisches Verfahren zur quantitativen Messung der Glukoseaufnahme. Anhand dieser Parameter erfolgte die FACS-Anreicherung unterschiedlicher Zellpopulationen der LZK und die Xenotransplantation zur Evaluation potentieller Unterschiede des leukämogenen Potentials.
Durch durchflusszytometrische Messungen konnten in den drei LZK jeweils drei Subpopulationen von Zellen anhand ihrer Glukoseaffinität unterschieden werden (2–NBDG negativ, 2–NBDG positiv und 2–NBDG hochaffin). Auch zeigten sich Unterschiede in der Kinetik der Glukoseaufnahme der drei getesteten LZK, wobei CR Zellen mit Abstand am schnellsten 2–NBDG aufnahmen, gefolgt von PH. Die schnellere Glukoseaufnahme der LZK CR und PH wurde durch eine vermehrte Expression des GLUT-1 Rezeptors und einen höheren Anteil an GLUT–1 positiver Zellen hervorgerufen. Interessanterweise bestand auch eine Korrelation zwischen höherem leukämogenem Potential mit schnellerer Glukoseaufnahme und stärkerer GLUT–1 Expression. Hierbei zeigte sich, dass die HIF-1α Stabilisierung unter Normoxie in einer vermehrten GLUT–1 Expression und daraufhin vermehrter Glukoseaufnahme resultierte. Die prospektive Anreicherung von distinkten Zellsubpopulationen der LZK CR und PH aufgrund ihrer Glukoseaufnahme (gemessen durch 2–NBDG) und Transplantation der sortierten Zellpopulationen in NSG Empfängermäuse zeigte keine kohärente Beziehung zwischen der Glukoseaffinität der Zellen und der Entwicklung der Leukämie. Während es bei CR Zellen initial zu einer beschleunigten Expansion der 2–NBDG-positiv sortierten Leukämiezellen kommt, was sich aber nicht signifikant auf das Gesamtüberleben der Empfängermäuse auswirkt, zeigte die serielle Transplantation von 2–NBDG negativen Zellen ein schnelleres Ableben der Tiere. Bei der LZK PH expandierten 2–NBDG-negative Zellen schneller in primären Empfängermäusen als positive Zellen. Dabei konnten zelltoxische Effekte durch die Verwendung von 2–NBDG ausgeschlossen werden. Auch die Transplantation von GLUT-1 positiven bzw. negativen CR Zellen zeigte, dass GLUT-1 negative Zellen schneller in den Mäusen expandierten, eine aggressivere Leukämie verursachten und zu einem früheren Ableben der Mäuse führte.
Diese Ergebnisse zeigen keine unmittelbare Korrelation von Glukoseaufnahme oder GLUT-1 Expression und der Leukämogenität der untersuchten ALL Zellen. Daher können diese Eigenschaften nicht dazu verwendet werden LIZ in ALL prospektiv anzureichern. Im Rahmen dieser Dissertation zeigte sich aber auch, dass sich die LZK in ihrer jeweiligen Gesamtpopulation bezüglich ihres Glukoseaufnahmeverhaltens und ihrem Anteil GLUT-1-positiver Zellen unterschieden. Weiterführende Untersuchungen sind nötig, um den Grund der differentiellen Expression von GLUT-1 und der damit zusammenhängenden gesteigerten Glukoseaufnahme einzelner Zellen in der ALL zu ermitteln.
The functional and molecular role of transglutaminase 2 in hematopoietic stem and progenitor cells
(2023)
Long-term repopulating hematopoietic stem cells (LT-HSCs) that reside in the bone marrow (BM) give rise to all blood cell types including erythrocytes, leukocytes and platelets. LT-HSCs are mainly quiescent during steady state hematopoiesis. LT-HSCs can process self-renewal to expand and maintain stemness, or commit to differentiation into short-term (ST) repopulating HSC and multipotent progenitors (MPPs). MPPs differentiate into oligopotent lineagerestricted progenitors which eventually produce all mature blood cell lineages, and thereby regenerate hematopoietic system.
Previous studies have shown in transcription profiles and quantitative PCR (qPCR) analysis that transglutaminase 2 (Tgm2) is one of the most upregulated genes in quiescent LT-HSCs in comparison to active HSCs, mobilized HSCs, ST-HSCs, MPPs, as well as leukemic stem cells (LSC). However, the reason why Tgm2 is strongly upregulated in dormant mouse LTHSCs and what the role of Tgm2 is in LT-HSCs has not been investigated yet.
Tgm2, encoded by the Tgm2 gene, is a multi-functional protein within the transglutaminase family. It has been found to be widely expressed inside and outside the cells. It consists of four domains and two functionally exclusive forms that are regulated by the Ca2+ and GTP concentration. Besides the most well-known transglutaminase enzymatic activity for transamidation, deamidation and crosslinking, Tgm2 acts also as a GTPase/ATPase, kinase, adhesion/scaffold protein, as well as disulfide isomerase. The role of Tgm2 in hematopoiesis remains elusive. Accordingly, the aim of this dissertation is to investigate the role of Tgm2 in murine hematopoiesis, especially in murine LT-HSCs.
Firstly, the expression of Tgm2 was analyzed in highly purified murine hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) populations. Low input label-free mass spectrometric proteomics and WES protein analysis confirmed the highly specific expression of Tgm2 in LT-HSCs at protein level. Already at the state of MPPs, Tgm2 protein was almost absent with further decline towards oligopotent progenitors. These results indicated Tgm2 as a specific protein marker for LT-HSCs, justifying the future generation of a fluorescent reporter mouse line based on endogenous Tgm2 tagging.
To delineate the functional and molecular role of Tgm2 in LT-HSCs, a conditional Tgm2 knockout mouse model was generated using the Mx1-Cre/loxP system, with the loxP sites flanking the coding exons of the catalytic domain of Tgm2. After PolyIC-mediated induction, a more than 95% knockout efficiency was observed in purified LT-HSCs and the protein expression of Tgm2 was confirmed to be vanished in the purified LT-HSCs from conditional Tgm2-KO mice. Conditional knockout mice are viable and show no aberrant organ functions.
In steady state condition, the distribution of mature blood cell lineages and immunophenotypically-defined HSPC populations within the BM, the mitochondrial potential of HSPCs reflected by the non-invasive cationic dye JC-1, as well as the cell cycle status of HSPCs mirrored by the intracellular Ki67 staining did not show any significant variations upon loss of Tgm2. However, the in vitro continuous observation of prospectivly isolated LT-HSCs by time-lapse microscopy-based cell tracking revealed a delayed entry into cell cycle with a two fold increased apoptosis rate after knocking out Tgm2, indicating Tgm2 expression might be essential for survival of LT-HSCs. Moreover, while the absence of Tgm2 in LT-HSCs did not influence differentiation and lineage choice in vitro, overexpression of Tgm2 in LT-HSCs resulted in an increase of the most immature subpopulation upon cultivation. All these features were not observed in Tgm2-deleted MPPs, suggesting Tgm2 playing a specific function at the level of LT-HSCs. Upon stress hematopoiesis, induced by the administration of 5-fluorouracil (5-FU), there was a trend towards delayed recovery of LT-HSCs lacking Tgm2. Although Tgm2 express specificly in LT-HSCs, two rounds of competitive BM serial transplantation displayed an equal overall engraftment and multi-lineage reconstitution of LT-HSCs from Tgm2-WT and Tgm2-KO mice in peripheral blood (PB), BM and spleens. Interestingly, LT-HSCs from Tgm2-KO mice reconstituted to more myeloid cells and fewer B cells in the first four weeks after primary transplantation, which disappeared at later time points.
Gene expression profiling and simultaneous single cell proteo-genomic profiling indicated that HSPCs and LT-HSCs from Tgm2-KO mice were transcriptionally more active. A heterogeneity of Tgm2 expression within Tgm2-WT LT-HSCs was revealed by single cell data. Commonly up-regulated genes in Tgm2-KO LT-HSCs and MPPs were significantly involved in regulation of transcription from RNA polymerase II promoter in response to stress, positive regulation of cell death as well as negative regulation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways. In Tgm2-KO LT-HSCs, 136 up-regulated genes demonstrated an enrichment of genes involved in apoptosis, as well as negative regulation of MAPK signaling pathway.
Taken together, this dissertation shows that Tgm2 protein is highly specifically expressed in LT-HSCs, but not in subsequent progenitor populations. However, Tgm2 is not essential for differentiation and maturation of myeloid lineages, the proliferation and the long-term multilineage reconstitution potential of LT-HSCs after transplantation. Tgm2 might be involved in accurate stress response of LT-HSCs and the transition from LT-HSCs into MPPs, meaning that the absence of Tgm2 results in poor survival, myeloid bias upon transplantation, as well as slower recovery upon chemotherapeutic treatment.
The ubiquitin-related SUMO system represents a versatile post-translational modification pathway controlling a variety of cellular signalling networks. In mammalian cells, lysine residues of target proteins can be covalently modified with three SUMO isoforms (SUMO1, SUMO2 and SUMO3) resulting in conjugation of either single SUMO moieties or formation of poly-SUMO chains. Importantly, SUMO modification is a reversible process, where the deconjugation of SUMO from its substrates is mediated by SUMO proteases. In humans, the best-characterized subfamily is the SENP family of SUMO-specific isopeptidases comprised of SENP1-3 and SENP5-7. For undisturbed cellular signalling events, a proper balance of SUMO conjugation and deconjugation is crucial. SENPs fulfil the important function of counteracting SUMOylation. A key question is how the relatively low number of SENPs specifically controls the SUMOylation status of hundreds of cellular proteins.
The aim of this thesis was to uncover the regulation and substrate specificity of distinct SUMO isopeptidases in order to better understand their role in cellular signalling pathways.
In the first part of this work, we investigated the influence of hypoxia on SUMO signalling, in particular on the activity of SENPs. Importantly, we found that the catalytic activity of distinct SENPs (especially SENP1 and SENP3) is strongly but reversibly diminished under low oxygen. As a consequence, the SUMO modification of a specific subset of proteins is changed under hypoxia. We specifically identified proteins being hyperSUMOylated after 24 hours of hypoxia by SUMO1 immunoprecipitation followed by mass spectrometry. We further validated the transcriptional co-repressor BHLHE40 as hypoxic SUMO target and confirmed SENP1 as responsible isopeptidase for deconjugation of SUMOylated BHLHE40. We provide evidence that SUMO conjugation to BHLHE40 enhances its repressive functions on the expression of the metabolic master regulator PGC-1α. Therefore we propose a model where inactivation of SENP1 under hypoxia results in SUMOylated BHLHE40, possibly contributing to metabolic reprogramming under hypoxia.
To get insight into substrate selectivity of SENP family members, in particular SENP3 and SENP6, we choose a proteomic profiling strategy. For the identification of specific SUMO substrates controlled by SENP3, we applied a large-scale IP-MS approach in SENP3 KO and WT cells. The most strongly induced SUMO targets in the absence of SENP3 were key regulators of ribosome maturation. We identified factors involved in the remodelling of both 90S and 60S pre-ribosomes. SENP3 has already been described as being critically involved in maturation of the pre-60S subunit and 28S rRNA processing. Previously described SENP3-regulated master targets in this process are the ribosome maturation factors PELP1 and Las1L. Importantly, both were also identified as the most significantly regulated SENP3 targets in our unbiased proteomic approach. Importantly, however, enhanced SUMOylation was also detected on 90S-associated regulators, such as BMS1. Altogether, these data strengthen the functional link between SENP3 and ribosome biogenesis and point to a role of SENP3 beyond 60S maturation.
In addition to SENP3, we explored the substrate specificity of SENP6, which mainly acts on polymeric SUMO2/3 chains. Applying a proteomic profiling strategy, we were able to identify SENP6-controlled SUMO networks functioning in DNA damage response as well as chromatin organization. We demonstrated that SENP6 reverses polySUMOylation of several subunits of the cohesin complex, thereby regulating the SUMOylation status and chromatin association of this complex. Furthermore, we found a tight interaction of SENP6 with the hPSO4/PRP19 complex, involved in DNA damage response by activation of the ATR-CHK1 signalling cascade. In cells depleted of SENP6, we observe deficient recruitment of the co-activator ATRIP to chromatin which results in diminished CHK1 activation. We therefore illustrate a general role of SENP6 in the control of chromatin-associated protein networks involved in genome integrity and chromatin organization.
Die MicroRNA-193b (miR-193b) fungiert in Akuter Myeloischer Leukämie (AML) als Tumorsuppressor und als Biomarker zur Prädiktion der Überlebenswahrscheinlichkeit bei erwachsenen sowie kindlichen AML-Patienten. Die Expression der miR-193b ist in allen AML-Entitäten reduziert, mit Ausnahme der Akuten Promyelozyten Leukämie (APL), bei der das Level an miR-193b erhöht ist. APL ist auch die einzige Form der AML, bei der All-Trans-Retinoinsäure (ATRA) leit-liniengerecht und effektiv zur Therapie angewendet wird.
In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass der antileukämische irreversible Inhibitor der Lysin-spezifischen Histon Demethylase 1 (LSD1) GSK-LSD1 die Expression von miR-193b induziert. Dadurch wird in murinen Homebox protein A9 (Hoxa9)/Meis Homebox Protein 1 (Meis1) AML-Zellen zumindest ein Teil der tumorsuppressiven Wirkung von GSK-LSD1 über die Hochregulation von miR-193b vermittelt.
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Gültigkeit des potenziellen GSK-LSD1-Wirkmechanismus über die Induktion von miR-193b in humanen Zellen zu untersuchen. Weitere Ziele waren die Erforschung der Rolle der miR-193b bei dem Behandlungseffekt von ATRA in humaner AML und APL sowie die Untersuchung einer potenziell protoonkogenen Eigenschaft der miR-193b in APL. Der methodische Ansatz dieser Arbeit basierte auf einer Senkung bzw. Erhöhung des intrazellulären miR-193b-Levels mittels Locked nucleic acids (LNA) bzw. lentiviraler miR-193b-Überexpression und anschließender Behandlung der Zellen mit den Wirkstoffen. Es wurden Proliferationskurven erstellt und der Differenzierungsgrad durchflusszytometrisch bestimmt. Eine hohe Aufnahmeeffizienz und Effektivität der LNA und des lentiviralen Überexpressionsvektors wurde durchflusszytometrisch und per quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) bestätigt.
Zur Untersuchung der Rolle der miR-193b bei dem Behandlungseffekt von GSK-LSD1 wurden die AML-Linien ML-2 und MOLM-13 sowie die APL-Zelllinie NB-4 mit LNA transfiziert bzw. mit dem Überexpressionsvektor transduziert und mit GSK-LSD1 behandelt. Die Populationen mit reduziertem miR-193b-Level wiesen nach 96 Stunden eine unverändert reduzierte Proliferation und Differenzierung auf. Hingegen zeigten miR-193b-überexprimierende Zellen nach GSK-LSD1-Behandlung einen signifikant stärkeren antiproliferativen Effekt. ML-2 Zellen wiesen zudem eine signifikant gesteigerte Differenzierung auf, gemessen an der Expression des Differenzierungsmarkers CD11b.
Die erhöhten miR-193b-Level in APL-Patienten konnten in der APL-Zelllinie NB-4 mittels qPCR bestätigt werden. NB-4 weist eine über 60-fach höhere miR-193b Expression als ML-2 (AML) auf. Zur Überprüfung einer onkogenen Eigenschaft der miR-193b in APL wurde das zelluläre miR-193b-Level in NB-4-Zellen durch LNA reduziert und anschließend die Proliferationskurve über 12 Tage bestimmt und die Differenzierungsmarker CD11b und CD13 gemessen. Proliferation und Differenzierungsgrad blieben nach Reduktion der miR-193b in NB-4-Zellen unverändert.
Die gleichzeitige Behandlung von NB-4 mit ATRA und miR-193b-LNA zeigte nach 96 Stunden den gleichen antiproliferativen und differenzierungsinduzierenden Effekt wie bei ATRA allein. Auch bei den AML-Zelllinien ML-2 und MOLM-13 wirkte die ATRA-Behandlung bei reduziertem miR-193b-Level unverändert differenzierungsinduzierend und antiproliferativ. Hingegen führte eine ATRA-Behandlung der AML-Zelllinien bei erhöhtem miR-193b-Level zu einer Verstärkung des antiproliferativen Effekts. Bei beiden AML-Zelllinien wurde die Proliferation mehr als doppelt so stark reduziert als bei alleiniger ATRA-Behandlung.
Diese Arbeit konnte zeigen, dass miR-193b kein Protoonkogen in der APL-Zelllinie NB-4 ist. Außerdem weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die Wirkungseffekte von sowohl GSK-LSD1 als auch von ATRA, weder in APL noch in AML, über die Induktion der miR-193b vermittelt werden. Hingegen zeigt sich bei beiden Wirkstoffen in AML-Zellen ein additiver antileukämischer Effekt bei Behandlung mit gleichzeitiger Erhöhung des miR-193b-Levels. Die molekulare Begründung hierfür ist möglicherweise eine gemeinsame Modulation der Mitogen-aktivierten Protein Kinase (MAPK)-Signaltransduktionskaskade und bedarf weiterer Experimente zur Überprüfung dieser Hypothese. Ausblickend stellen die Ergebnisse dieser Arbeit die miR-193b als einen interessanten Kombinationspartner für die Therapie mit GSK-LSD1 oder ATRA, bzw. generell für den MAPK Signalweg beeinflussende Medikamente, dar, sobald eine sichere und effiziente Einschleusung von MicroRNAs in Patienten möglich ist.