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Beim Übergang vom Wachstum zur Entwicklung entsteht in Dictyostelium discoideum aus einzelnen vegetativ wachsenden Zellen ein multizellulärer Organismus, der in der Lage ist ausdauernde Sporen zu bilden. Während der im multizellulären Verband stattfindenden morphologischen Veränderungen und Zelldifferenzierung nimmt die Proteinkinase A (PKA) eine Schlüsselfunktion ein. Der C-Modul bindende Faktor A (CbfA), ursprünglich aufgrund seiner spezifischen Bindung an eine regulatorische DNA-Sequenz des Non-LTR Retrotransposons TRE5-A.1 in D. discoideum entdeckt, ist für den Übergang vom Wachstum zur Differenzierungsphase essentiell. Zellen der CbfA-Mangelmutante JH.D2 weisen im Vergleich zu denen des Wildtyp-Stamms AX2 ein verlangsamtes Wachstum und eine verzögerte Einleitung der Aggregation und der Entwicklung auf. Charakteristisch für diese CbfA-Mutante ist die Unterexpression der mRNA für die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A (PkaC). Da die Expression der PkaC sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene reguliert ist, wurde in dieser Arbeit ein monoklonaler Antikörper gegen die katalytische Untereinheit hergestellt, um den Proteingehalt an PkaC in Zellen der CbfA-Mutante zu untersuchen. Dabei konnte eine starke Unterexpression der PkaC in den CbfA-depletierten Zellen nachgewiesen werden. Demnach scheint es einen mittelbaren Zusammenhang zwischen der Menge an CbfA und dem sich selbst verstärkenden cAMP-abhängigen Signaltransduktionssystem der Zellen zu geben, da ein Mangel an cAMP eine fehlende Aktivierung der sich selbst induzierenden PKA nach sich zieht. Für D. discoideum konnte erstmals eine reproduzierbare 2D-gelelektrophoretische Trennmethode etabliert werden, mit der es gelang, differentiell exprimierte Proteine im Stadium der frühen Entwicklung zwischen den untersuchten D. discoideum-Stämmen AX2 und JH.D2 aufzufinden. Die Anwendung der DIGE-Technologie ermöglichte dabei die Detektion von ca. 30-40 differentiell exprimierten Proteinen. Durch die massenspektrometrische Untersuchung dieser Proteine unter Verwendung der MALDI-TOF Methode in Kombination mit dem Peptid-Massen-Fingerabdruck konnten insgesamt ca. 30% der differentiell exprimierten Proteine identifiziert werden. Dabei stellte sich heraus, daß vor allem Proteine mit essentiellen Funktionen im zellulären Stoffwechsel in der CbfA-Mangelmutante JH.D2 auf geringerem Niveau exprimiert wurden als im Wildtyp-Stamm AX2. Dies könnte eine Erklärung für die letalen Auswirkungen eines vollständigen knockouts von CbfA in D. discoideum liefern. Zusätzlich wurde mit Hilfe der DIGE-Technologie die Funktion der C-terminalen Domäne des CbfA-Proteins untersucht. Für diese Experimente wurde eine CbfA-Mutante verwendet, die den C-Terminus konstitutiv überexprimiert. Die daraus resultierenden Proteinmuster haben gezeigt, daß die C-terminale Domäne unabhängig vom Rest des Proteins sowohl induzierenden als auch reprimierenden Einfluß auf die Proteinexpression nimmt. Diese Ergebnisse zeigen eine unerwartet komplexe Funktion des Proteins CbfA in der Regulation von Genen während der untersuchten Lebensphasen von D. discoideum.
Der Qualitätsstandard von Arzneimitteln in Deutschland und anderen Industrienationen ist zum heutigen Zeitpunkt hoch. Dies ist in erster Linie den strengen arzneimittelrechtlichen Anforderungen und Kontrollen zuzuschreiben, denen der Arzneimittelmarkt unterliegt. Es muss allerdings befürchtet werden, dass sich dies in Zukunft ändern könnte. Die Gefahr besteht zum einen in der Legalisierung des Versandhandels von Arzneimitteln und zum anderen in der EU-Osterweiterung. Es besteht die Gefahr, dass aus osteuropäischen Staaten vermehrt qualitativ minderwertige oder gefälschte Arzneimittel auftauchen. In Entwicklungsländern dagegen besteht heute schon ein großes Problem bezüglich der Arzneimittelqualität, die WHO vermutet, dass 25 % aller Arzneimittel in ärmeren Ländern qualitativ minderwertig oder gefälscht sind. Um so wichtiger erscheint die Möglichkeit, einfache, schnelle und zerstörungsfreie Prüfmethoden zur Qualitätskontrolle von Arzneimitteln zur Verfügung zu haben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einsatz der Nahinfrarot-Spektroskopie zur Qualitätskontrolle von Tabletten und Lösungen geprüft. Diese Technik bietet sich besonders an, da sie schnell und zerstörungsfrei ist und keinerlei Probenaufbereitung bedarf. Die NIRS hat sich in den letzten Jahren als geeignete Methode zur Quantifizierung von Wirkstoffen in Tabletten und anderen Arzneiformen erwiesen. Bisher allerdings nur zur Anwendung auf ganz spezielle Präparate, so dass mit den Methoden nur eine bestimmte Spezialität untersucht werden konnte. In dieser Arbeit wurde die NIRS erstmals auf Präparate verschiedener Hersteller mit unterschiedlicher Matrix eingesetzt. Damit konnte eine ganze Präparategruppe mit nur einer Methode untersucht werden. Im ersten Teil konnte gezeigt werden, dass Tablettenpräparate des Deutschen Marktes unterschiedlicher Hersteller, die sich Form, Farbe, Größe und Hilfsstoffmatrix unterschieden, zusammen bezüglich ihres Wirkstoffgehaltes kalibriert werden können. Damit erlauben die Methoden eine Aussage darüber zu treffen, ob der Wirkstoff in der deklarierten Menge enthalten ist. Dies war sogar ohne die simultane Durchführung einer entsprechenden Referenzanalytik zur Erstellung der Kalibrationsmodelle möglich. Alle erstellten Methoden mit ASS-, Atenolol- und Enalapril-Tabletten erlaubten es zu überprüfen, ob der Wirkstoff in einer Konzentration von ± 10 % der Deklaration enthalten ist. Dabei zeigte sich, dass der Kalibrationsdatensatz idealerweise alle möglichen später auftretenden Variationen berücksichtigen sollte, um bei der späteren Analyse falsche Ergebnisse zu vermeiden. Im zweiten Teil sollte überprüft werden, ob mit diesen NIR-Methoden Arzneimittelfälschungen und damit verbundene Qualitätsmängel wie Unterdosierungen, Placebos, falsche Wirkstoffe oder zusätzliche Wirkstoffe erkannt werden. Da uns keine „realen“ Proben zur Verfügung standen, wurden die Tabletten im Rahmen einer Kooperation mit der Pharmazeutischen Technologie der Universität Frankfurt produziert. Die Messungen erfolgten in Transmission, Reflexion und durch verschiedene Blistermaterialien. Im Rahmen der Kalibration und Validierung wurde deutlich, dass die unterschiedlich gewählte Hilfsstoffmatrix einen großen Einfluss ausübt. Die Validierung zeigte, dass die Gehaltsbestimmung in einem Rahmen von ± 15 % der wahren Wirkstoffmenge möglich ist. Dieser Rahmen scheint zunächst sehr groß, allerdings muss bedacht werden, dass im Rahmen der Kalibration eine große Variation in den Datensatz gebracht wurde und die zur Validierung verwendeten Präparate dem Modell völlig unbekannt waren. Die Untersuchung der simulierten Fälschungen ergab für die Transmissions- Reflexions- und Blistermessungen vergleichbare Ergebnisse. Placebos wurden eindeutig identifiziert, ebenso die Tabletten mit falschem Wirkstoff. Dass Unterdosierungen ab 15 % erkannt werden, wurde im Rahmen der Validierung gezeigt. Zusätzliche Wirkstoffe wurden sowohl bei den Reflexions- als auch bei den Transmissionsmessungen erst ab einer Konzentration von 10 % sicher erkannt. Die Methoden mit Messungen durch den Blister lieferten dagegen ab 2 % zusätzlicher Substanz Hinweise auf einen qualitativen Mangel. Im dritten Teil wurde am praxisrelevanten Beispiel der Tilidin-Lösungen eine NIR-Methode erstellt, die zukünftig eine schnelle und sicher anwendbare Möglichkeit zur Überprüfung dieses Arzneimittels auf Manipulation darstellt. Im Vergleich zu einer bisher angewandten zeitintensiven DC, kann die nur wenige Minuten in Anspruch nehmende NIR-Analyse erheblich Zeit einsparen...
Niacin ist neben seiner Bedeutung als Vitamin im menschlichen Organismus ein seit langem bekannter Wirkstoff bei der Therapie von Fettstoffwechselstörungen. Sein großer Vorteil gegenüber anderen Lipidsenkern liegt in der positiven Beeinflussung aller bedeutenden Lipid – Bestandteile im Blut. Es wird im menschlichen Organismus sehr rasch metabolisiert. Die beiden Hauptmetaboliten sind das Nikotinamid und die Nikotinursäure. Angesichts der pharmakologischen und therapeutischen Bedeutung von Niacin, spielt die Analytik dieser Verbindung sowie seiner Metaboliten eine wichtige Rolle, zumal Niacin aktuell in immer weiteren Präparaten (unter anderem in Form von Kombipräparaten) weiterentwickelt und eingesetzt wird. Es überraschte daher, dass bislang in der Literatur keine LC-MS Methode zur Bestimmung von Niacin beschrieben war, wo sich doch die LC-MS in den letzten Jahren zur vorherrschenden Analysentechnik für die Analyse von Biomolekülen und Wirkstoffen in biologischen Matrices entwickelt hat, da sie in der Regel geringe Anforderungen an die Probenaufarbeitung stellt und einen hohen Probendurchsatz erlaubt. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch erstmals gezeigt werden, dass LC-MS eine leistungsfähige Methode zur simultanen, quantitativen Bestimmung von Nikotinsäure, Nikotinamid und Nikotinursäure in Humanplasma darstellt. Die vorgestellte Methode beweist hohe Selektivität, Empfindlichkeit, Genauigkeit, Richtigkeit und Reproduzierbarkeit im Konzentrationsbereich von 50.0 – 750 ng/mL Plasma für alle drei Analyten bei relativ kurzer Analysenzeit. Verglichen mit früher entwickelten Methoden ist keine zeitaufwendige Probenaufarbeitung notwendig. Alle drei Analyten konnten in einem Schritt mit einer einzigen Festphasenextraktion ohne zeitaufwendige Derivatisierungschritte aus Plasma extrahiert werden. Die Validierung dieser Methode wurde gemäß aktuell geltender Standards durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte LC-MS Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Innerhalb einer klinischen Bioäquivalenz-Studie zu 1000 mg Niacin Tabletten, die erfolgreich bei AAI Development Services durchgeführt wurde, konnten gute und plausible Ergebnisse erzielt werden. Der validierte Konzentrationsbereich war ausreichend um alle drei Analyten zufriedenstellend zu detektieren. Damit zeigt sich, dass diese entwickelte LC-MS Methode eine leistungstarke Alternative zur simultanen Bestimmung von Niacin und seinen Hauptmetaboliten darstellt, welche erfolgreich in pharmakokinetischen oder toxikokinetischen Studien eingesetzt werden kann. Die in dieser Dissertation vorgestellte Analysenmethode wurde inzwischen in der Fachliteratur publiziert [83]. Eine Kopie dieser Publikation ist dieser Arbeit beigefügt.
Die toxikologische Charakterisierung von Chemikalien und Arzneimitteln basiert auch heute noch hauptsächlich auf Toxizitätstests an Labortieren. Insbesondere die Prüfung auf Kanzerogenität fordert eine große Tieranzahl mit einer hohen Belastung der eingesetzten Tiere und ist sehr zeit- und kostenintensiv. Folglich stellt die Entwicklung von Methoden als Ergänzung und potenziellen Ersatz für Tierversuche ein Ziel der molekularen und zellulären Toxikologie dar. Diese Methoden umfassen verkürzte oder minimal invasive in vivo- sowie in vitro-Versuche, welche der toxikologischen Prüfung von Substanzen gemäß dem 3R-Prinzip dienen könnten.
Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einsatz von Toxikoproteomics und -genomics im 28-Tage-Test (Toxizitätsstudie nach wiederholter oraler Gabe in Ratten), die in der Toxikologie routinemäßig durchgeführt werden müssen, zu untersuchen. Daneben wurden entsprechende Lebergewebeproben aus der in vivo-Prüfung mit den Daten aus einem hepatozytären Zellkultursystem als Ersatz- und Ergänzungsmethode verglichen. Identifizierte mechanistische Daten und putative Biomarker könnten für die Ableitung von chronisch-toxischen Potentialen von Substanzen genutzt werden und eine frühere Vorhersage zu kanzerogenen Potentialen von Stoffen erlauben.
Die in der Arbeit gewählten Modellsubstanzen stammten aus drei verschiedenen mechanistischen Kategorien: genotoxische Kanzerogene [Diethylnitrosamin (DEN), Aflatoxin B1 (AFB), Cupferron (CUP)], nicht-genotoxische Kanzerogene [Tetrachlorkohlenstoff (CCl4), Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP), Clofibrat (CF)] und hepatotoxische Nicht-Kanzerogene [Diallyl Phthalat (DAP), Benzaldehyd (BA), Ketokonazol (KC)].
Im ersten Teil der Arbeit wurden Rattenlebern aus den behandelten Tieren (ausgewählte Substanzen: AFB, CUP, CF, BA, KC) und den entsprechenden Kontrollen auf Veränderungen der globalen Genexpression nach 3, 7 und 28 Behandlungstagen untersucht. Das Ziel war es, nach kurzer Expositionsdauer charakteristische Wirkmechanismen auf Ebene der Genexpression zu erfassen, welche als frühes Indiz für zelluläre Transformation in Richtung Lebertoxizität bzw. Tumorentwicklung verwendet werden könnte. Dabei wurde gezeigt, dass eine Aktivierung verschiedener Prozesse, wie oxidativer Stress, Zellzyklus, Apoptose, Zellwachstum sowie spezifische Mechanismen infolge der verursachten Schädigung durch die eingesetzten Verbindungen bereits ab Tag 3 detektiert werden konnten. Mit der Genexpressionsanalyse wurden zudem auch einige putative Biomarker, welche kanzerogene Veränderungen beschreiben können, an Tag 28 identifiziert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Daten der toxikogenomischen Analyse mit den histopathologischen Beobachtungen für diese Substanzen gestützt werden.
Im darauf folgenden Teil der Arbeit sollte eine Proteommethode zur Identifizierung und Charakterisierung putativer Protein-Biomarker im Plasma eingesetzt werden, die eine verbesserte Vorhersage von Prozessen der chemisch induzierten Leberkanzerogenese innerhalb des geforderten 28-Tage-Tests erlauben. Der Vorteil der Nutzung von Plasma ist, dass die Tiere dafür nicht getötet werden müssen und man den Verlauf der Veränderungen in weniger Tieren über viele Zeitpunkte hinweg verfolgen kann. Hierfür wurde das Rattenplasma von Tag 3, 7 und 28 der mit genotoxischen und Nichtgenotoxischen Kanzerogenen behandelten Tiere mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und anschließender Identifizierung mit MALDI Massenspektrometrie untersucht. Die Ergebnisse zeigten bei den genotoxischen als auch Nichtgenotoxischen Kanzerogenen eine Vielzahl von Proteinen, die in akut toxischen Prozessen, wie z.B. dem Fettstoffwechsel, der Immunantwort und dem Proteinmetabolismus involviert sind. Als putativer Biomarker konnte zum Beispiel Alpha-1-Antitrypsin identifiziert werden, das auch im Serum bei Patienten mit Leberzellkarzinomen erhöht ist. Eine klare Unterscheidung zwischen den Mechanismen der genotoxischen und Nicht-genotoxischen Kanzerogene war allerdings auf Basis dieser begrenzten Daten nicht möglich.
Im dritten Teil der Arbeit wurden Rattenhepatozyten mit den gleichen fünf ausgewählten Ausgangssubstanzen wie im in vivo-Experiment behandelt. Das Ziel bestand darin, die Eignung von primären Rattenhepatozyten in Collagen-Sandwich-Kulturen als in vitro-Modell zur Prädiktion von hepatotoxischen Effekten zu überprüfen. Der Vergleich des in vitro-Systems zu den in vivo-Daten an den Behandlungstagen 3 und 7 zeigte, dass zwischen in vivo und in vitro eine gute Korrelation der mechanistischen Genexpressionsveränderungen nach Behandlung mit AFB und CF zu detektieren war. Des Weiteren lieferte die Behandlung der primären Rattenhepatozyten mit CUP detaillierte Hinweise auf den toxischen Mechanismus, wogegen in den Leberproben keine vergleichbaren Erkenntnisse gewonnen werden konnten. So konnte für CUP in vitro z.B. ein starker Einfluss auf das Netzwerk der nukleären Rezeptoren gezeigt werden. Der Vergleich des in vivo- und in vitro-Testsystems nach Behandlung mit den hepatotoxischen Substanzen KC und BA zeigte im Gegensatz zu AFB und CF nur eine sehr geringe Übereinstimmung der differentiell deregulierten Gene bzw. Signalwege. Ein möglicher Grund für die Unterschiede könnten die eingesetzten Dosierungen sein, welche möglicherweise nicht direkt miteinander verglichen werden können.
Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass die eingesetzten molekulartoxikologischen Methoden frühe Hinweise liefern können, die sowohl eine Zuordnung zu toxischen Wirkmechanismen als auch eine Identifizierung von kanzerogenesespezifischer Biomarker-Kandidaten ermöglichen. Zudem zeigte der Vergleich der in vivo / in vitro-Testsysteme eine gute Übereinstimmung in den identifizierten Signalwegen nach Behandlung mit den Testkanzerogenen. In Zukunft könnten diese Methoden in den kürzeren in vivo-Prüfungen wie z.B. 28-Tage-Test eingesetzt werden, um die konventionellen toxikologischen Prüfsysteme zu unterstützen.
Massenspektrometrie-basierte Proteomuntersuchungen erfolgen auch heute überwiegend nach dem sogenannten Bottom-Up-Ansatz, d.h. die Identifizierung von Proteinen erfolgt auf der Basis von Peptiden, die chromatographisch gut voneinander getrennt werden können und massenspektrometrisch leichter zu analysieren sind als Proteine. Nach Identifikation der Peptide kann rekonstruiert werden, welche Proteine ursprünglich in der Probe vorgelegen haben. Zentraler Arbeitsschritt der Probenvorbereitung ist daher die Zerlegung des Proteins, die entweder chemisch oder - wie in den meisten Fällen – enzymatisch erfolgt. Trypsin ist das mit Abstand am häufigsten genutzte Enzym, da es eine hohe Schnittspezifität aufweist und sehr effizient ist. Der Trypsin-Verdau ist darüber hinaus sehr robust, d.h. er zeigt eine hohe Toleranz gegenüber Verunreinigungen, und zudem werden Peptide erzeugt, die sowohl gute Ionisations- als auch gute Fragmentierungseigenschafen aufweisen. Die durch Trypsin gebildeten Peptide enthalten neben dem basischen N-Terminus eine weitere basische Aminosäure am C-Terminus, so dass sie leicht zumindest doppelt-geladene Ionen bilden können und sehr häufig aussagekräftige C-terminale Fragmentioneserien liefern.
Neben den zahlreichen Vorteilen gibt es allerdings auch Nachteile. So können nach einem tryptischen Verdau in Abhängigkeit von der Verteilung der Schnittstellen Peptide entstehen, die entweder zu klein sind, um eine verlässliche Zuordnung zu einem Protein zu erlauben oder die zu groß sind für den Massenbereich des gewählten Massenanalysators. Eine vielversprechende Alternative zu Trypsin wäre ArgC, welches C-Terminal zu Argininen schneidet und somit im Durchschnitt größere Peptide mit Ionisations- und Fragmentierungseigenschaften ähnlich zu tryptischen Peptiden erzeugt. Das Enzym ArgC weist jedoch nur eine geringe Schnittspezifität auf und sein Trypsin-ähnliches Verhalten – also das Schneiden auch hinter Lysin - wurde öfters beobachtet und wird auch vom Hersteller angegeben. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Verdaumethode, die Peptide erzeugt, die ausschließlich auf Argininen enden.
Das Resultat der zu entwickelnden Verdaumethode sollte somit dem eines idealen enzymatichen ArgC-Verdaues entsprechen. Realisiert wurde der ArgC-ähnliche-Verdau durch den Einsatz von Trypsin, dessen enzymatischer Schnitt durch die chemische Derivatizierung der Substrat-Lysine auf Arginine reduziert wurde. Neben dem weiteren Einsatz von Trypsin sollte dieser "Quasi-Arg-C-Verdau" weitere systematische Vorteile für Proteomanalysen realisieren: Zum Ersten sollte die Anzahl von Fehlschnitt-Peptiden, die sich bei Trypsin insbesondere an Lysinen mit saurer chemischer Umgebung ergeben, reduziert werden, zum Zweiten sollten die Arg-C-Peptide sowohl durch ihre gewachsende Größe, als auch durch das mit dem C-terminalen Arginin verbesserte Fragmentierungsverhalten höhere Score-Werte bei der bioninformatischen Auswertung der MS-Daten ergeben.
Im ersten Teil wurden zunächst bioinformatische Werkzeuge entwickelt, die MALDI-MS-Dateien automatisiert prozessierten. Die entwickelten Programme umfassen die Identifizierung und relative Quantifizierung von Proteinen aus diesen Dateien. Des Weiteren wurde ein Programm zur Analyse von MALDI-ISD-Dateien entwickelt. Automatisierte Auswertungen gelangen durch die Erstellung von Workflows in der Datenanalyseplattform KNIME. Diese Workflows kombinieren in Python geschriebene Skripte und Funktionalitäten frei verfügbarer Programme wie "MSConvert" und "mMass".
Nach Erstellung der bioinformatischen Werkzeuge wurde die Methodenentwicklung zur Modifizierung der Lysine für verschiedene Reagenzien durchgeführt. Die Auswahl fiel auf vier Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie unter milden Reaktionsbedingung im quantitativen Ausmaß mit Aminogruppen reagieren. Diese waren Sulfo-NHS-Acetat, Propionsäureanhydrid, Diethylpyrocarbonat und die reduktive Methylierung mit Formaldehyd und Picolin-Boran. Die Reaktionsbedingungen mussten zunächst für Proteine optimiert werden, da die publizierten Protokolle hauptsächlich zur Derivatizierung von Peptiden verwendet worden waren. Anschließend wurden die optimierten Protokolle für eine Protein- und Proteomprobe eingesetzt und die Resultate miteinander verglichen. Die Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, dass sowohl auf Protein- als auch auf Proteomebene die Propionylierung des Lysins die besten Resultaten zeigte. Insbesondere ist hervorzuheben, dass alle ArgC-ähnlichen Ansätze unabhängig vom eingesetzten Reagenz zu besseren Ergebnissen in jeder der Untersuchungen führte als der klassische enzymatische ArgC-Verdau.
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Als Teil der Atmungskette des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus besteht die NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus 13 Untereinheiten, die durch 24 unterschiedliche Gene codiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für den massenspektrometrischen Nachweis dieser Untereinheiten nach der Aufreinigung des Komplexes eine SDS-PAGE durchgeführt, an die sich eine tryptische Proteolyse und eine Messung per MALDI MS und MS/MS anschlossen. Mit dieser analytischen Strategie war es möglich, jede nicht-homologe Untereinheit nachzuweisen und 20 von 24 genombasierten Isoformen eindeutig zu identifizieren. Selbst kleine bzw. sehr hydrophobe Untereinheiten mit vielen Transmembranhelices konnten mit Hilfe dieser Methode analysiert werden. Die hohe Anzahl an präsenten, unterschiedlichen Isoformen und die vorherrschenden Verunreinigungen durch Fremdproteine (z.B. ATP-Synthase) könnten Indizien dafür sein, dass bis jetzt keine hinreichend stabile und reproduzierbare Enzympräparation gelungen ist, um eine Kristallstrukturanalyse durchzuführen. Im Allgemeinen kann der Ablauf eines solchen Proteomics-Experiments in drei Teile gegliedert werden: die Auftrennung eines Protein- oder Peptidgemischs zur Verringerung der Probenkomplexität, die Identifikation des Proteins per Massenspektrometrie und die damit verbundene bioinformatische Datenanalyse. Neben chromatographischen Methoden ist die Elektrophorese in Polyacrylamidgelen immer noch das am häufigsten angewandte Trennverfahren im Proteomics-Bereich. Vor der MS-Messung werden die aufgetrennten Proteine in der Regel direkt in der Gelmatrix verdaut. Die Qualität der Ergebnisse wird stark durch Proteinmenge und die auftretenden Probenverluste beeinflusst. Diese werden beispielsweise durch eine unzureichende Peptidextraktion aus dem Gel hervorgerufen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Gelsystem entwickelt, dass vor allem für die Proteolyseeffizienz, die Peptidextraktion und somit auch für die anschließende massenspektrometrische Messung von Vorteil ist. Das Monomer Acrylamid wird hierzu mit den beiden Quervernetzern N,N-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglykoldiacrylat (EDA) polymerisiert. Es entsteht ein Gel, dessen Poren durch die basische Hydrolyse der Esterbindungen des EDAs vergrößert werden können, ohne die dreidimensionale Grundstruktur des Gels zu zerstören.   Die gemischten Gele mit MBA und EDA als Crosslinkern sind sowohl für Tris-Glycin- als auch Tris-Tricin-Puffersysteme einsetzbar. Die Evaluierung der Daten erfolgte meist gegen ein Standardgel mit T= 14% und C= 2,6%. Durch eine experimentell ermittelte Anpassung der Mischgele auf T+10% und C+45% mit einem MBA/EDA-Verhältnis von 0,5 verhalten sich die beiden Gelsysteme empirisch gleich und zeigen eine übereinstimmende elektrophoretische Trennung und Auflösung. Es gibt keine wesentlichen Nachteile in Bezug auf die Handhabung, die elektrophoretische Trennung und die anschließenden Analysen und Techniken, solange diese in sauren bis leicht basischen pH-Bereichen durchgeführt werden. So wurde das gemischte Gelsystem sowohl bei einer 2D IEF/SDS-PAGE als auch bei einem Western Blot-Experiment angewendet und für vollständig kompatibel befunden. Die gemessenen MS-Daten profitieren im Fall von Trypsin und Elastase erheblich von der besseren Zugänglichkeit des Enzyms zum Substratprotein und der verbesserten Peptidextraktion. Die Gelaufweitung führt zu signifikant besseren Ergebnissen, die größtenteils auf höhere S/N-Werte zurückzuführen sind. Die Signalintensitäten der Peptide sind um den Faktor 5 besser als die des Referenzgels. Der Nachweis von je 1 pmol der Proteine BSA, Serotransferrin und Alkoholdehydrogenase profitiert stark von den zusätzlich erhaltenen Daten, da die Zunahme an identifizierten Peptiden bei der PMF-Suche im Bereich von 40 bis 80% liegt. Auch bei geringen Proteinmengen wie 250 bzw. 50 fmol BSA ist die Anzahl der zugeordneten Signale um den Faktor 2-3 besser. Der in-Gel Verdau von 1 pmol Bacteriorhodopsin mit Elastase zeigt ebenfalls einen Anstieg der Peptidsignale um 60% im Vergleich zum Referenzgel. Da die Proteine im Gel alle mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue angefärbt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass sich die guten MS-Ergebnisse auf jede mit diesem Farbstoff visualisierte Probe übertragen lassen. Für den Fluoreszenzfarbstoff RuPBS trifft dies ebenso zu, insgesamt wurden aber weniger Peptide als bei kolloidaler Coomassie Brilliant Blue-Färbung detektiert. Dementsprechend handelt es sich bei Acrylamidgelen mit MBA/EDA-Vernetzung um ein vielversprechendes alternatives Gelsystem, dass auf eine Vielzahl anderer Methoden angewendet werden kann.
In dieser Arbeit sollten auf Grundlage eines in vitro Transkriptions-/Translations-Assays (TTA) neue Substanzen als Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese gefunden werden. Um dieses Ziel verfolgen zu können, wurde zuerst ein zellfreies Testsystem aus kommerziellen Komponenten entwickelt und als Screening-Tool für Inhibitoren der bakteriellen Proteinbiosynthese evaluiert. Anhand des allgemein akzeptierten Bewertungskriteriums Z‘-Faktor konnte die Performance des etablierten Assays als exzellent eingeordnet werden. Mit diesem System war es nun möglich, Substanzen aus unterschiedlichen Quellen bei der Wirkstoffsuche als potentielle Antibiotika einzuordnen, welche die Proteinbiosynthese hemmen.
In zwei nachfolgenden Projekten wurde die Praktikabilität dieses neuen Assays bei der Auffindung möglicher Antibiotika-Kandidaten bewiesen. In dem ersten Ansatz wurde ein virtuelles Screening der Substanzdatenbanken Specs und Asinex anhand eines Pseudorezeptormodells für Aminoglykoside durchgeführt. In Kombination mit dem TTA sowie einem Ganzzell-Assay gegen den gram-positiven Keim Bacillus subtilis 168 konnte eine Struktur mit Ähnlichkeit zu Vanilloiden als interessanter Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchungen identifiziert werden. Die Entdeckung korreliert mit den antimikrobiellen Eigenschaften eines anderen Vanilloid, dem Capsaicin, für welches bisher aber keine Hemmung der Proteinbiosynthese in der Literatur beschrieben ist. Somit konnte gezeigt werden, dass anhand eines virtuellen Screenings sowie weiterer Assays neue Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese effizient und effektiv gefunden werden können. In einem zweiten Screening-Projekt dienten pflanzliche Naturstoffe als Substanzquelle. Hierfür wurden auf der Grundlage der diterpenoiden Fusidinsäure, einem Proteinbiosynthesehemmer (PBS-Hemmer), tetra-und pentazyklische Isoprenoide ausgewählt.
Aus einem Ensemble von terpenoiden Strukturen gingen nach TTA und einem zellbasierten Assay gegen Bacillus subtilis 168 in absteigender Aktivität die 18β-Glycyrrhetinsäure, 11-Keto-β-boswelliaäsure und Carnosolsäure als nennenswerte antimikrobiell wirksame Vertreter und PBS-Hemmer hervor. Auch zeigten sich diese Substanzen den Stoffen aus dem virtuellen Screening sowohl im TTA als auch in der Wirksamkeit gegen Bacillus subtilis 168 deutlich überlegen. Im nächsten Schritt erfolgte deshalb nur für diese drei Terpenoide eine Charakterisierung ihrer Auswirkungen auf das Proteom des gram-positiven Bakteriums Bacillus subtilis 168.
Dafür wurde eine komplette zweidimensionale gelelektrophoretische Methodik basierend auf der Differentiellen Gelelektrophorese (DIGE) etabliert. Sie umfasst eine Strategie zur schnellen Evaluierung der optimalen Anzucht des Testkeims Bacillus subtilis 168 unter Einfluss einer antimikrobiell wirksamen Substanz und ein einfaches Aufschlussverfahren, um einen kompatiblen Proteinextrakt für DIGE zu erhalten. Außerdem wurde ein preisgünstiges Markierungsverfahren mit dem 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimid-Ester als Alternative zu den teuren DIGE-Cyan-Farbstoffen entwickelt, um die Fluoreszenzbildqualität eines neuen unbekannten Extraktes vor dem eigentlichen kostspieligen DIGE-Versuch zu überprüfen. Eine Quantifizierung regulierter Spots im Gel ist mit diesem billigen Verfahren ebenfalls möglich, stellt aber keinen Ersatz für den DIGE-Versuch dar.
Die Ergebnisse der quantitativ vergleichenden Proteomanalyse vom behandelten und unbehandelten Bacillus subtilis 168 mittels DIGE bieten erstmals einen Einblick in die Einflussnahme der drei Terpenoide 18β-Glycyrrhetinsäure, 11-Keto-ß-boswelliaäsure und Carnosolsäure auf die Stressregulation und die Stoffwechseländerungen dieses Bakteriums.
Außerdem beinhaltet die Arbeit einen Abgleich, inwieweit andere antimikrobiell wirksame Substanzen die regulierten Proteine der drei untersuchten Naturstoffe bei Bacillus subtilis 168 beeinflussen können. Aus den erhobenen Daten konnte dann ein Wirkmechanismus für 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure postuliert werden. 18β-Glycyrrhetinsäure greift wahrscheinlich am membranständigen Lipid-II-System der bakteriellen Zellwand an, da wie bei den Antibiotika Vancomycin, Nisin, Daptomycin, Ramoplanin und Bacitracin das Zellwandstress-Regulationsnetzwerk (LiaRS-System) als Warnsystem aktiviert wird. Außerdem konnte für 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure eine Theorie für Ihre PBS-Hemmung entwickelt werden. Beide beeinflussen gegebenenfalls die GTPase-Aktivität des Translationsfaktors EF-G durch Interaktion mit dem ribosomalen Bindezentrum für Translationsfaktoren. Dieses Bindungszentrum ist neben der dekodierenden Region auf der ribosomalen 30S-Untereinheit und dem Peptidyltransferase-Zentrum auf der ribosomalen 50S-Untereinheit eine extrem wichtige Region für die Funktionalität eines Ribosoms. Fusidinsäure greift auch an dieser Stelle an, indem es den EF-G-GDP-Ribosomkomplex stabilisiert. Natürlich wären weitere Studien nötig, z. B. eine Röntgenstrukturanalyse der Ribosomen von 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure behandelten Bakterien, um die Bindestelle für die PBS-Hemmung zweifelsfrei zu bestätigen.
Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse ermöglichten die Identifizierung neuer Inhibitoren der bakteriellen Transkriptions-/Translationsreaktion durch den Einsatz eines eigenständig etablierten nicht-kommerziellen zellfreien prokaryotischen GFP-Expressionsassays (ZFTT-Assay) als Screening Werkzeug. Der Nachweis der selektiven Inhibition der ZFTT-Reaktion durch antimikrobielle Translationsinhibitoren im Vergleich zu Antibiotika anderer Wirkmechanismen gelang im Rahmen einer proteomanalytischen Studie. Die parallele Anwendung des etablierten ZFTT-Assays und standardisierter Ganzzellassays ermöglichte die Charakterisierung der Aktivitätsprofile neun antimikrobieller Substanzen aus vier repräsentativen Translationsinhibitorklassen unter zellfreien und Ganzzellbedingungen in Abhängigkeit ihrer physikochemischen Substanzeigenschaften (Weidlich et al., 2008). Der Aufbau mehrerer interdisziplinärer Forschungkooperationen mit unterschiedlichen wissenschaftlichen Arbeitsgruppen wurde genutzt, um eine Substanzbibliothek chemisch heterogener Verbindungen als Quelle potentieller antimikrobieller Inhibitoren der bakteriellen Transkriptions-/Translationsreaktion zu generieren. Sowohl die Anwendung virtueller Screeningansätze und der Einsatz synthetischer Tripeptide ermöglichte die Identifizierung aktiver Substanzen. Im Rahmen einer globalen Identifizierungs- und Charakterisierungsphase wurde neben der zellfreien Aktivität auch die Wirksamkeit gegenüber bakteriellen Zellen, sowie die Toxizität gegenüber humanen Zellen untersucht. Der Einsatz der proteomanalytischen DIGE-Technologie ermöglichte schließlich die Charakterisierung der antimikrobiellen Wirkmechanismen ausgewählter Substanzen.
Im ersten Projekt der vorliegenden Arbeit wurden CD - 1 Mäuse mit drei unterschiedlichen Diäten für zwei Wochen ad libitum gefüttert. Die Diäten bestanden aus zwei kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten und einer Standard Haltungsdiät. Die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten enthielten entweder Triheptanoin (dreifach mit Heptanoat verestertes Glycerol) oder Soja - Öl als Fettkomponente (jeweils 35 % der Gesamtkalorien). Nach zwei Wochen wurde ein ischämischer Schlaganfall für 90 min. mithilfe eines Silikonfadens induziert. Die Leber, das Blut und das Gehirn wurden nach dem Schlaganfall entnommen und die Konzentrationen der Metabolite β - Hydroxybutyrat, Glukose, Laktat und Citrat wurden mit der zuvor etablierten GC - MS-Methode ermittelt. Unter gleichen Bedingungen wurde eine Mikrodialysestudie durchgeführt.
Bei den Tieren, die die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten erhielten, konnte in den Leber - und Hirnhomogenaten, im Plasma sowie im Mikrodialysat eine Ketose festgestellt werden. Die BHB Konzentrationen durch eine Soja Diät erreichten im Leberhomogenat bis zu 4 mM, im Plasma bis zu 1,5 mM, im Hirnhomogenat bis zu 1,5 mM und im Mikrodialysat bis zu 30 µM. Um eine Aussage treffen zu können, ob das Gehirn die von der Leber produzierten Ketonkörper als Energiesubstrate nutzen kann, wurde eine Folgestudie (unter gleichen Bedingungen) durchgeführt. Bei dieser Studie wurde der Zeitpunkt der Gewebeentnahme 60 min. nach Entfernen des Fadens (Reperfusion) gewählt. In den Leber – und Hirnhomogenaten konnten erniedrigte Konzentrationen des Ketonkörpers BHB nachgewiesen werden. Die nicht operierten Tiere, die eine fettreiche Diät erhielten, hatten erhöhte Konzentrationen an Citrat in den genannten Geweben. Durch den Abbau des Ketonkörpers BHB können bei Verstoffwechslung in Geweben außerhalb der Leber, zwei Moleküle Acetyl - CoA gebildet werden. Diese gebildeten Acetyl - CoA Moleküle können in den Citratzyklus eingespeist werden.
Um diesen Befund mechanistisch besser verstehen zu können, wurde den Mäusen Propranolol (ein unselektiver β - Blocker) verabreicht, und zwar kurz nachdem der Faden die mittlere Zerebralarterie verschlossen hatte. Als Folge blieb bei den fettreich gefütterten Tieren die zuvor beobachtete Ketose, aus. Daraus wurde geschlossen, dass die auftretende Ketose bei den fettreich gefütterten Tieren durch adrenerge β - Rezeptoren vermittelt wurde. Zusammengefasst kann eine fettreiche bzw. ketogene Ernährung im Falle einer Ischämie die Versorgung des Gehirns durch die Bildung von Ketonkörper gewährleisten.
Die zu beobachtende hepatische Ketogenese aus dem ersten Projekt hat die Frage entstehen lassen, ob eine akute Gabe von β - Hydroxybutyrat (BHB) bei Entfernen des Fadens schützende Effekte auf das Verhalten bzw. die Mitochondrien als Kraftwerke der Zelle hat. Hierzu wurde BHB bei Reperfusion gegeben und die Wirkungen dieser Einmalgabe nach 24 h untersucht. Als erster Schritt wurde der Nachweis erbracht, dass eine exogene Gabe von BHB das Gehirn erreicht. Im zweiten Schritt wurde das Verhalten der Mäuse nach 24 h untersucht. Hierbei erbrachte die Gabe von BHB eine signifikante Verbesserung der sensorischen und motorischen Fähigkeiten der Mäuse. Die metabolischen Veränderungen nach 24 h wurden erneut in Leberhomogenaten und Plasma vermessen. Eine Einzelgabe von BHB bewirkte eine milde Ketose auch 24 h nach Reperfusion der mittleren Zerebralarterie. Um eine detailliertere Erkenntnis über die Wirkung von BHB zu erlangen, wurden die Mitochondrien als potentielles Ziel für BHB in den Fokus genommen. Die Einmalgabe von BHB verhinderte ein Absinken der Komplex – II Aktivität. Außerdem kann die Aktivität der Citratsynthase unter der Gabe von BHB erhalten werden, sodass die Mitochondrien vor allem im wichtigen Zeitraum nach der Reperfusion geschützt werden. Im Rahmen der Untersuchungen der Mitochondrien wurden unterschiedliche Substrateinflüsse auf die Respiration der isolierten Mitochondrien getestet. Bei Zugabe von BHB, Oxalacetat + Acetat oder Citrat zu dem Respirationsmedium stieg die Respiration der Mitochondrien an. Im Falle von Glukose, Propranolol oder Acetat wird die Respiration verringert. Bei Zugabe von Laktat, verbleibt die Respiration auf Ausgangsniveau. Abschließend ist festzustellen, dass die Einzelgabe von BHB nach 24 h das Verhalten der Mäuse verbessert, eine milde Ketose induziert, sowie Mitochondrien und die Citratsynthase gegen ischämische Ereignisse schützt.
Um die in dieser Arbeit gezeigten Daten über metabolische Veränderungen zeigen zu können, musste eine vorherige Etablierung der GC – MS Analytik vollzogen werden. Auf der einen Seite musste die Probenvorbereitung, aber auch die gesamte Vermessung der Proben aufgebaut werden. Es wurden insgesamt 11 Analyte in vier unterschiedlichen Kompartimenten quantifiziert. Die Nachweisgrenze lag bei diesen 11 Analyten bei 0,01 - 1 ng/µl, was einer umgerechneten Stoffmengenkonzentration von 0,5 - 10 µM entspricht. Mithilfe dieser Methode können optional weitere Substanzen aus verschiedenen Geweben zugänglich gemacht werden. Diese Arbeit bietet hierzu eine Anleitung, wie die Etablierung erfolgen kann. Im Rahmen der Probenvorbereitung wurden alle Schritte systematisch verbessert. Dazu wurden Wiederholungsmessungen für unterschiedliche Modalitäten vollzogen. Die Abundance und die Zeitbeständigkeit waren die wesentlichen Beurteilungskriterien. So wurden die Daten für die Extraktionseffektivität, die Lösungsmittelabhängigkeit der Silylierung, der Zusatz von Hünig - Base sowie die Temperatur und Zeitabhängigkeit der Silylierung in dieser Arbeit erarbeitet. Die Quantifizierung wurde anhand von internen Standardverbindungen durchgeführt. Die jeweiligen Response – Faktoren blieben über die gesamte Zeit nach der Etablierung konstant und erlaubten die Quantifizierung mit geringen Fehlern. Die Beurteilung der ermittelten Daten über die Validierung wurden anhand von geltenden Regelwerken der pharmazeutischen Industrie entschieden. Es wurde ein Protokoll entwickelt, das im Rahmen der universitären Forschung eine vertrauenswürdige Aussage über Veränderungen von Metabolitenspiegeln in vielen Geweben der Maus und der Ratte geben kann.