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Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methodik zur umfassenden und automatischen Identifizierung von nativen Peptiden aus Extrakten komplexer biologischer Quellen entwickelt und am Beispiel des humanen Hämofiltrats angewendet. Die Firma BioVisioN führt seit der Gründung Forschung auf dem Gebiet der Peptide und kleinen Proteine mit dem Ziel, diagnostisch und therapeutisch relevante Substanzen zu finden, durch. Die Analyse sogenannter Peptidome, der qualitativen und quantitativen Beschreibung aller nativen Peptide und kleinen Proteinen bis ca. 15 kDa, ist als Analogon zur Proteom-Analytik zu verstehen, welche sich umfassend mit Proteinen beschäftigt. Quantitativ wird ein Peptidom über die Kombination chromatographischer Trennung und Fraktionierung mit der massenspektrometrischen „Inventarisierung“ der einzelnen Peptidspezies sowie den relativen Konzentrationen in der Probe erfasst, welches an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist. Das Ergebnis einer solchen Peptidomanalyse besteht aus einer Peptidkarte, die die Peptide der Probe repräsentativ abbildet. Die Qualität eines Peptidoms wird über die Massen der Peptide, deren Aminosäuresequenzen und Elutionsverhalten und weitere biologische Informationen beschrieben. Zu diesen Zweck wird der Begriff des Peptide-Inventory eingeführt. Ein Inventory besteht aus allen verfügbaren Informationen nativer Peptide einer Quelle. Zu Beginn der Arbeit standen mit der reproduzierbaren Erstellung von Peptidbanken und deren systematischer Kartierung über MALDI-MS bereits zwei Werkzeuge zur Verfügung, um Daten eines Inventories zu erheben. Lediglich für die Erzeugung der Sequenzdaten wurde mit dem Edman-Abbau zwar eine etablierte, aber viel zu langsame und wenig sensitive Methode eingesetzt. Hier wurde der Ersatz durch eine schnelle und leicht zu automatisierenden Methode angestrebt. Die massenspektrometrische Sequenzierung über MS/MS mit anschließender Datenbanksuche ist ein aus der Proteom-Analytik durchaus bekanntes Verfahren, musste aber für die Analyse der nativen Peptide in einigen Bereichen modifiziert werden. Obwohl die Massenspektrometrie Peptide direkt aus komplexen Mischungen heraus identifizieren kann, stellte sich schnell heraus, dass die vorliegende biologische Beispielprobe (humanes Blutfiltrat) zu komplex war, um sie direkt für die geplante Sequenzierung einzusetzen. Es wurde eine erneute Auftrennung und Feinkartierung der Peptidbank notwendig. Jede dritte Fraktion wurde rechromatographiert und anschließend wiederum kartiert. Die entstandenen 97 Peptidkarten enthalten im Linear Modus ca. 100.000 Signale und im Reflektron Modus ca. 30.000 Signale, so dass nach der Feinkartierung > 10.000 native, im menschlichen Körper zirkulierende Peptide durch diese Methode dargestellt werden können. Zur Automatisierung der Kartierungsmessungen mit MALDI-MS wurde im Laufe dieser Arbeit ein Autosampler für ein MALDI-TOF-MS-System entwickelt und implementiert (DiskJockey). Das System hat eine Kapazität von 20 MALDI-Targets und ist vollständig über die Gerätesoftware steuerbar, so dass MALDI-MS-Messungen vollständig automatisiert über mehrere Tage ablaufen können. Zur Erzeugung der Sequenzdaten wurde eine Kombination aus elektrischer Ionenfalle und Datenbanksuche angewendet. Um zu gewährleisten, dass nur die zuvor kartierten Peptide einer MS/MS-Messung unterzogen werden, wurde das Softwaretool Alcatrap entwickelt. Diese Software übernimmt aus MALDI-MS-Messungen die Werte der monoisotopischen Peaks, überführt sie in mehrfach geladene Spezies und erstellt sowohl eine Methode für das MS-Gerät, als auch eine in die Gerätesoftware importierbare Arbeitsliste. Hierbei wird jeweils die Kollisionsenergie in Abhängigkeit der m/z-Wertes dynamisch gesetzt. Um den Datentransfer vom Fragmentspektrum zur Datenbanksuchmaschine zu gewährleisten, wurde mit „D2M“ eine weitere Softwareschnittstelle entwickelt. Die Erstellung des Inventories aus humanem Hämofiltrat liefert 1.225 verschiedene native, im menschlichen Blut zirkulierende Peptide aus 146 Proteinvorläufern. Darunter befinden sich mehrere Peptide, die neben ihrer physiologischen Bedeutung auch eine potenzielle medizinische Relevanz besitzen. Weiterhin ist auch der dynamische Bereich von acht Größenordnungen, in dem Sequenzen erzeugt wurden, vergleichbar mit dem des menschlichen Blutes. Eine Charakterisierung von Peptidomen ist in diesem Umfang bisher noch nicht durchgeführt worden und stellt eine Neuerung in der Proteomforschung dar. Die Studie ist durchaus vergleichbar mit kürzlich veröffentlichten umfangreichen Proteomstudien aus menschlichem Plasma und Serum und stellt eine Ergänzung dieser für den Bereich der Peptide und kleinen Proteine dar. Limitierungen bei der Identifizierung von Peptiden mit der Ionenfalle wurden analysiert und mit der Adaptierung des Peptide-Inventory Konzepts auf hochauflösende Quadrupol-Time-of-Flight Massenspektrometer zufriedenstellend gelöst. In diesem Rahmen wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, native Peptide bis zu einem Molekulargewicht von bis zu 8.500 Da direkt aus der komplexen Mischung zu fragmentieren und über eine Datenbanksuche zu identifizieren. Außerdem konnte exemplarisch gezeigt werden, dass durch die größere Massengenauigkeit und das größere Auflösungsvermögen des QTOF die Datenbanksuche wesentlich effektiver ist und durch die Kombination von Rechromatographie und QTOF-MS/MS nahezu jedes Signal einer Peptidbank der Identifizierung zugänlich gemacht werden kann. Sowohl die integrierte Methodik der Herstellung eines Peptide-Inventories, als auch die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse von nativen Peptiden in humanem Blut stellen wissenschaftliche Neuerungen dar, auf denen eine weitergehende Peptidom-Analytik aufsetzen kann.
Im ersten Projekt der vorliegenden Arbeit wurden CD - 1 Mäuse mit drei unterschiedlichen Diäten für zwei Wochen ad libitum gefüttert. Die Diäten bestanden aus zwei kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten und einer Standard Haltungsdiät. Die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten enthielten entweder Triheptanoin (dreifach mit Heptanoat verestertes Glycerol) oder Soja - Öl als Fettkomponente (jeweils 35 % der Gesamtkalorien). Nach zwei Wochen wurde ein ischämischer Schlaganfall für 90 min. mithilfe eines Silikonfadens induziert. Die Leber, das Blut und das Gehirn wurden nach dem Schlaganfall entnommen und die Konzentrationen der Metabolite β - Hydroxybutyrat, Glukose, Laktat und Citrat wurden mit der zuvor etablierten GC - MS-Methode ermittelt. Unter gleichen Bedingungen wurde eine Mikrodialysestudie durchgeführt.
Bei den Tieren, die die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten erhielten, konnte in den Leber - und Hirnhomogenaten, im Plasma sowie im Mikrodialysat eine Ketose festgestellt werden. Die BHB Konzentrationen durch eine Soja Diät erreichten im Leberhomogenat bis zu 4 mM, im Plasma bis zu 1,5 mM, im Hirnhomogenat bis zu 1,5 mM und im Mikrodialysat bis zu 30 µM. Um eine Aussage treffen zu können, ob das Gehirn die von der Leber produzierten Ketonkörper als Energiesubstrate nutzen kann, wurde eine Folgestudie (unter gleichen Bedingungen) durchgeführt. Bei dieser Studie wurde der Zeitpunkt der Gewebeentnahme 60 min. nach Entfernen des Fadens (Reperfusion) gewählt. In den Leber – und Hirnhomogenaten konnten erniedrigte Konzentrationen des Ketonkörpers BHB nachgewiesen werden. Die nicht operierten Tiere, die eine fettreiche Diät erhielten, hatten erhöhte Konzentrationen an Citrat in den genannten Geweben. Durch den Abbau des Ketonkörpers BHB können bei Verstoffwechslung in Geweben außerhalb der Leber, zwei Moleküle Acetyl - CoA gebildet werden. Diese gebildeten Acetyl - CoA Moleküle können in den Citratzyklus eingespeist werden.
Um diesen Befund mechanistisch besser verstehen zu können, wurde den Mäusen Propranolol (ein unselektiver β - Blocker) verabreicht, und zwar kurz nachdem der Faden die mittlere Zerebralarterie verschlossen hatte. Als Folge blieb bei den fettreich gefütterten Tieren die zuvor beobachtete Ketose, aus. Daraus wurde geschlossen, dass die auftretende Ketose bei den fettreich gefütterten Tieren durch adrenerge β - Rezeptoren vermittelt wurde. Zusammengefasst kann eine fettreiche bzw. ketogene Ernährung im Falle einer Ischämie die Versorgung des Gehirns durch die Bildung von Ketonkörper gewährleisten.
Die zu beobachtende hepatische Ketogenese aus dem ersten Projekt hat die Frage entstehen lassen, ob eine akute Gabe von β - Hydroxybutyrat (BHB) bei Entfernen des Fadens schützende Effekte auf das Verhalten bzw. die Mitochondrien als Kraftwerke der Zelle hat. Hierzu wurde BHB bei Reperfusion gegeben und die Wirkungen dieser Einmalgabe nach 24 h untersucht. Als erster Schritt wurde der Nachweis erbracht, dass eine exogene Gabe von BHB das Gehirn erreicht. Im zweiten Schritt wurde das Verhalten der Mäuse nach 24 h untersucht. Hierbei erbrachte die Gabe von BHB eine signifikante Verbesserung der sensorischen und motorischen Fähigkeiten der Mäuse. Die metabolischen Veränderungen nach 24 h wurden erneut in Leberhomogenaten und Plasma vermessen. Eine Einzelgabe von BHB bewirkte eine milde Ketose auch 24 h nach Reperfusion der mittleren Zerebralarterie. Um eine detailliertere Erkenntnis über die Wirkung von BHB zu erlangen, wurden die Mitochondrien als potentielles Ziel für BHB in den Fokus genommen. Die Einmalgabe von BHB verhinderte ein Absinken der Komplex – II Aktivität. Außerdem kann die Aktivität der Citratsynthase unter der Gabe von BHB erhalten werden, sodass die Mitochondrien vor allem im wichtigen Zeitraum nach der Reperfusion geschützt werden. Im Rahmen der Untersuchungen der Mitochondrien wurden unterschiedliche Substrateinflüsse auf die Respiration der isolierten Mitochondrien getestet. Bei Zugabe von BHB, Oxalacetat + Acetat oder Citrat zu dem Respirationsmedium stieg die Respiration der Mitochondrien an. Im Falle von Glukose, Propranolol oder Acetat wird die Respiration verringert. Bei Zugabe von Laktat, verbleibt die Respiration auf Ausgangsniveau. Abschließend ist festzustellen, dass die Einzelgabe von BHB nach 24 h das Verhalten der Mäuse verbessert, eine milde Ketose induziert, sowie Mitochondrien und die Citratsynthase gegen ischämische Ereignisse schützt.
Um die in dieser Arbeit gezeigten Daten über metabolische Veränderungen zeigen zu können, musste eine vorherige Etablierung der GC – MS Analytik vollzogen werden. Auf der einen Seite musste die Probenvorbereitung, aber auch die gesamte Vermessung der Proben aufgebaut werden. Es wurden insgesamt 11 Analyte in vier unterschiedlichen Kompartimenten quantifiziert. Die Nachweisgrenze lag bei diesen 11 Analyten bei 0,01 - 1 ng/µl, was einer umgerechneten Stoffmengenkonzentration von 0,5 - 10 µM entspricht. Mithilfe dieser Methode können optional weitere Substanzen aus verschiedenen Geweben zugänglich gemacht werden. Diese Arbeit bietet hierzu eine Anleitung, wie die Etablierung erfolgen kann. Im Rahmen der Probenvorbereitung wurden alle Schritte systematisch verbessert. Dazu wurden Wiederholungsmessungen für unterschiedliche Modalitäten vollzogen. Die Abundance und die Zeitbeständigkeit waren die wesentlichen Beurteilungskriterien. So wurden die Daten für die Extraktionseffektivität, die Lösungsmittelabhängigkeit der Silylierung, der Zusatz von Hünig - Base sowie die Temperatur und Zeitabhängigkeit der Silylierung in dieser Arbeit erarbeitet. Die Quantifizierung wurde anhand von internen Standardverbindungen durchgeführt. Die jeweiligen Response – Faktoren blieben über die gesamte Zeit nach der Etablierung konstant und erlaubten die Quantifizierung mit geringen Fehlern. Die Beurteilung der ermittelten Daten über die Validierung wurden anhand von geltenden Regelwerken der pharmazeutischen Industrie entschieden. Es wurde ein Protokoll entwickelt, das im Rahmen der universitären Forschung eine vertrauenswürdige Aussage über Veränderungen von Metabolitenspiegeln in vielen Geweben der Maus und der Ratte geben kann.
Durch die beiden Ionisationstechniken Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) und Electrospray-Ionization (ESI) sind Biopolymere für die Massenspektrometrie zugänglich geworden und die Zahl der biochemischen Applikationen ist sprunghaft angestiegen. Dagegen sind die zugrundeliegenden Prozesse der Ionenbildung nur zum Teil bekannt. Bei MALDI wird die Laserstrahlung durch die Matrix absorbiert, wodurch es zur explosiven Auflösung der festen Phase unter Bildung von geladenen Molekülen kommt. Der genaue Mechanismus vom Festkörper zum gasförmigen Ion ist nur teilweise aufgeklärt und Gegenstand vieler Diskussionen. Eine wichtige Funktion der Matrix ist die räumliche Separierung und Isolierung der Analyte beim Einbau in die Matrixkristalle. Während der Einschluß von Molekülen in Wirtskristalle schon früh als wesentliches Merkmal von MALDI erkannt wurde, ist bisher noch nicht systematisch untersucht worden, in welcher Form die Analyte im Kristall vorliegen. Genau diese Information ermöglicht jedoch Aussagen über die Relevanz verschiedener Mechanismen der Ionenbildung bei MALDI. Die Bestimmung des Ausgangszustandes des Analyten im Matrixkristall und die Abschätzung möglicher Reaktionen bei der nachfolgenden Freisetzung der Analytionen ist das zentrale Thema der vorliegenden Arbeit. In dieser wurde insbesondere der Ladungszustand der Analyte sowie der Einschluß von Lösungsmittel untersucht. Des weiteren wurden Experimente zur Zahl und Koordination möglicher Gegenionen, zur Neutralisation dieser Ionenpaare und zur Adduktbildung bei MALDI durchgeführt. Die Ergebnisse erlauben Aussagen über primäre und sekundäre Ionisationsreaktionen, die zu einem stimmigen Bild der Ionenbildung bei MALDI zusammengefaßt wurden. Grundlage des vorgestellten Modells sind bereits veröffentlichte Modelle, deren wesentliche Aspekte teilweise schon in den ersten Jahren nach der Einführung von MALDI, zu einem erheblichen Teil aber erst in jüngster Zeit erkannt wurden. Einen erneuten Anstoß für die Diskussion um den Mechanismus von MALDI gab die Hypothese, daß die Ionisation eng mit der Bildung von Clustern verbunden ist und dabei sowohl eine Freisetzung präformierter Ionen als auch nachfolgende Reaktionen unter Transfer von Protonen und Elektronen erfolgen. Der Ausgangspunkt für all diese Prozesse ist der Analyt im Matrixkristall. Die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente zeigen, daß einige wesentliche Postulate des "Cluster-Modells" richtig sind. Insbesondere konnte der Beweis geführt werden, daß Analyte geladen im Matrixkristall existieren und daß die gelöste Form des Analyten weitgehend im Matrixkristall konserviert wird. Als einfache Testsysteme wurden Matrixlösungen mit verschiedenen pH-Indikatoren versetzt und die Farbe der Kristalle dokumentiert. Dabei zeigte sich, daß in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung sowohl Moleküle mit einer positiven oder negativen Nettoladung als auch neutrale Zwitterionen gleichermaßen effizient in Matrixkristalle eingebaut werden. Die Ladung aller sauren und basischen funktionellen Gruppen des Analyten im Kristall ist damit durch den pH-Wert der Matrixlösung bestimmt. Wenn eine Nettoladung vorhanden ist, muß zudem diese Ladung durch Gegenionen kompensiert sein, so daß Ionenpaare entstehen. Aber auch bei Zwitterionen können Gegenionen vorhanden sein. Darüber hinaus gelang durch 1H-NMR-Spektroskopie der Nachweis, daß Lösungsmittel im Kristall eingeschlossen ist und selbst nach Trocknen der Kristalle bei erhöhter Temperatur oder im Vakuum dort verbleibt. Dies führt zu dem anschaulichen Bild, daß Analyte in Abhängigkeit vom pH-Wert als "Multi-Ionenpaare" und partiell solvatisiert im Matrixkristall konserviert werden. Ausgehend von diesen präformierten, solvatisierten Ionenpaaren wird durch den plötzlichen Energieeintrag des Laserpulses die explosive Bildung von Clustern ausgelöst. Für die Bildung von geladenem Clustern gibt es zwei plausible Erklärungsansätze. Durch die Existenz der geladenen Analyte im Kristall ist eine besonders einfache Ionisation unter Freisetzung "präformierter" Ionen durch die Trennung eines Ionenpaares denkbar. Eine zweite Möglichkeit wäre die Photoionisation eines Matrixmoleküls mit nachfolgendem Protonentransfer. Da aber stets negative Ladungen vorhanden sind (entweder im Analyten selbst oder als Gegenion), wird bevorzugt ein Anion neutralisiert. In beiden Fällen entsteht ein Cluster, der durch ein fehlendes oder neutralisiertes Gegenion geladen ist. Die Freisetzung des Analytions erfolgt durch Verdampfen von Neutralmolekülen (Matrix, Lösungsmittel). Ionenpaare werden durch Protonentransfer neutralisiert, so daß kleine Neutralmoleküle abdampfen und mit Ausnahme von Metallkationen keine ionischen Addukte detektiert werden. Der Protonierungsgrad des Analyten beim Einbau hat einen erheblichen Einfluß auf die detektierten Ionen. Sind bereits in Lösung und damit im Kristall positiv geladene Gruppen vorhanden, werden besonders leicht protonierte Molekülionen gebildet. Dagegen entstehen aus deprotonierten Vorläuferionen (in der Regel negativ geladen) verstärkt kationisierte Molekülionen. Dabei ist nicht die Nettoladung entscheidend, sondern die Existenz und Anzahl positiver und negativer Gruppen im Analyten. Die Kationisierung erfolgt bereits im Kristall, da die Ionen eine hohe, MALDI-typische Anfangsgeschwindigkeit zeigen. Die Koordination der Kationen an der negativen Ladung verhindert die Neutralisation durch Protonierung, die wesentlich für die Freisetzung von protonierter Molekülionen ist. Diese Neutralisation von Ionenpaaren ist auch die Ursache dafür, daß Anionenaddukte normalerweise nicht nachgewiesen werden. Durch Zugabe einer sehr starken Säure wird jedoch diese Zwischenstufe stabilisiert und erscheint in Form von Anionenaddukten im Spektrum. Dabei zeigte sich, daß die Anzahl der detektierten Addukte mit der Zahl der basischen Stellen im Analytmolekül korreliert, welches den Einbau von (mehrfach) geladenen Analytionen zusammen mit ihren Gegenionen bestätigt. Neben der Koordination der Anionen an positiv geladenen Stellen des Analyten ist die Energiebilanz des Protonentransfers dafür entscheidend, ob die Anionenaddukte den MALDI-Prozeß überstehen, so daß Anionen mit einer vergleichsweise geringen Gasphasenbasizität zur Adduktbildung neigen. Des weiteren kann die Konkurrenz verschiedener Anionen bei der Bildung der Ionenpaare eine Verschiebung der Adduktverteilung bewirken. Aber auch eine höhere Energiezufuhr (z.B. durch höhere Laserenergie) bewirkt eine verstärkte Neutralisation der Ionenpaare, wobei ein erheblicher Anteil metastabiler Fragmentierungen auftritt. Die Koordination von Gegenionen und die "metastabile Neutralisation" führt bei Verbindungen, die zur Ionenpaarbildung neigen, zur Peakverbreiterung und zu einer begrenzten Auflösung. Darüber hinaus sind bei MALDI weitere Sekundärreaktionen beteiligt. Dazu zählt die Übertragung von Wasserstoffatomen, die wahrscheinlich auch die Ursache für prompte Fragmentierungen ist (in-source decay, ISD). Ob eine Ladungsreduktion mehrfach geladener Vorläuferionen durch Elektronen auch bei Biopolymeren eine wesentliche Rolle spielt, bleibt dagegen weiterhin offen. Durch die in Abhängigkeit von der Nettoladung zunehmende Coulomb- Anziehung der koordinierten Gegenionen werden vermutlich erst gar keine hochgeladenen Ionen in die Gasphase freigesetzt. Die vorgestellten Ergebnisse ergeben ein plausibles, qualitatives Bild der Ionenbildung bei MALDI. Es wurde gezeigt, daß die gelöste Form des Analyten inklusive Ladungen, Gegenionen und Solvathülle bei der Kristallisation weitgehend erhalten bleibt, und daß diese Ausgangssituation entscheidend für die Art der letztendlich gebildeten Gasphasenionen ist. Zudem ist nicht die Protonierung neutraler Analyte, sondern eine Neutralisation von Ionen(paaren) durch Protonentransfer ein zentraler Bestandteil von MALDI.
Sojabohnen sind aufgrund ihres hohen Proteingehaltes ein wichtiges Nahrungsmittel und insbesondere bei Kindern ein häufig austretendes allergenes Lebensmittel. Der einizige zur Zeit mögliche Schutz vor einer allergischen Reaktion auf Soja ist die strikte Vermeidung der Aufnahme. Die allergenen Substanzen sind Proteine und Glykoproteine. Es gibt eine Reihe von Produkten aus Soja, die kein oder nur geringe Mengen Protein enthalten, aber in zahlreichen Lebensmitteln enthalten sind. Die Prüfung der potenziellen Allergenität von solchen Produkten, wie z.B. Vitamin E aus Soja, ist von grundlegendem Interesse für allergische Personen. Vitamin E aus Soja wird vielen Produkten z.B. als Antioxidanz zugesetzt und müsste nach den rechtlichen Kennzeichnungsvorschriften als Allergen auf der Verpackung angegeben werden. Ein Ziel dieser Promotionsarbeit war daher die Entwicklung von sensitiven und spezifischen Detektionmethoden für den Nachweis von Sojaprotein in Tocopherol (VitaminE) aus der Sojabohne. Aber auch die Charakterisierung von Sojaallergenen für die Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Methoden ist wichtig. Das zweite Ziel der Arbeit war somit die genauere Charakterisierung von β-Conglycinin (Gly m 5) als Sojaallergen sowie die Identifizierung der IgE-bindenden Bereiche des untersuchten Proteins. Zum Nachweis, dass in dem hoch prozessierten Sojaprodukt Tocopherol kein Sojaprotein mehr vorhanden war, wurden mehrere proteinbiochemische und immunologische Methoden entwickelt und validiert. Der sojaspezifische ELISA zur Detektion von hydrophilen Sojaproteinen aus der Tocopherolmatrix mit einer realen Nachweisgrenze von 10 ppm zeigte eine gute Reproduzierbarkeit. Die Detektion von lipophilen, denaturierten und hydrophilen Sojaproteinen aus Tocopherol im Immunoblot mit einer Nachweisgrenze von 20 ppm war ebenfalls gut reproduzierbar. Der etablierte IgE Immunoblot mit Sojaallergikerseren wies eine vergleichbare Sensitivität auf. In keiner der 10 untersuchten Tocopherolproben wurde mit den etablierten sensitiven sojaspezifischen Methoden Sojaprotein detektiert. Bei in vivo Studien von klinischen Partnern wurde bei Sojaallergikern weder eine Reaktion auf Tocopherol im Hauttest noch in der oralen Provokation von 500 mg Tocopherol beobachtet. Dass Gly m 5 ein wichtiges Sojaallergen ist und als diagnostischer Marker für schwere allergische Reaktionen genutzt werden kann, wurde in einer früheren Publikation unserer Arbeitsgruppe beschrieben. Die genauere Charakterisierung von Gly m 5 in dieser Arbeit zeigte, dass es ein Hauptallergen bei sojaallergischen Kindern und bei Sojaallergikern mit anaphylaktischen Reaktionen darstellt. Dabei zeigten alle Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker spezifisches IgE gegen eine der drei Gly m 5 Untereinheiten, das Gly m 5.03. Diese Untereinheit kann somit als diagnostischer Marker für eine Gly m 5 Sensibilisierung eingesetzt werden. Es konnte ebenfalls in dieser Arbeit bestätigt werden, dass die meisten Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker moderate bis schwere allergische Reaktionen zeigten und Gly m 5 somit einen potenziellen Marker für die Schwere einer Sojaallergie darstellt. Zur Identifizierung von IgE-bindenden Bereichen des Gly m 5 und des homologen Erdnussallergens Ara h 1 wurde die hoch sensitive und spezifische CelluSpot Technik etabliert, welche im Vergleich zur häufig angewendeten SPOT Membran-Technik nicht nur Zeit und Serumvolumen spart, sondern auch die individuelle Testung der Seren unter ständiger Mitführung von Positiv-und Negativkontrollen ermöglichte. Diese Methode stellt damit eine geeignete Technik zur Untersuchung von IgE reaktiven linearen Bereichen der Gly m 5 Untereinheiten und des Ara h 1 dar. Die Mehrheit der Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker besaß spezifisches IgE gegen sequenzielle synthetische Peptide der Gly m 5 Untereinheiten, wobei jedes Allergikerserum ein individuelles IgE Bindungsmuster zeigte. Zusammengefasst wurden fünf sequenzielle Regionen auf allen drei Gly m 5 Untereinheiten identifiziert, welche die größte IgE Bindungshäufigkeit aufwiesen. Alle fünf Bereiche waren zwischen 12-17 Aminosäuren groß und auf der Moleküloberfläche lokalisiert. Sie bildeten gemeinsam zwei zusammenhängende Bereiche in der Kernregion der Gly m 5 Moleküle und lassen vermuten, dass sie Teile von Konformationsepitopen darstellen. Zur Untersuchung einer möglicherweise vorhandenen serologischen Kreuzreaktivität zwischen den zwei Leguminosen Soja und Erdnuss, wurden sowohl Sojaallergiker mit Erdnussallergie als auch Erdnussallergiker ohne Sojaallergie auf Reaktivitäten gegen Peptide des Erdnussallergens Ara h 1 untersucht. Dabei wurden drei sequenzielle Bereiche identifiziert, die von der Mehrheit der Sojaallergiker, jedoch nur selten von den Erdnussallergikern erkannt wurden. Diese drei Bereiche wiesen eine Sequenzähnlichkeit zu den reaktivsten Bereichen der Gly m 5 Untereinheiten auf. Die Untersuchung von Allergikerseren auf Aminosäuresequenzebene könnte als diagnostische Methode zur Unterscheidung der klinischen Ausprägung einer Sojaallergie im Vergleich zur Erdnussallergie dienen und somit die Anzahl der risikobehafteten Nahrungsmittelprovokationen zur Bestätigung einer Sojaallergie senken. Die Identifizierung von B-Zell Epitopen ist eine wichtige Grundlage für die Herstellung von Hypoallergenen mit verringerter B-Zell Aktivität, bei gleichbleibender T-Zell-Aktivierung. Solche hypoallergenen Mutanten sind eine hoffnungsvolle Perspektive für eine Immuntherapie von Sojaallergikern, da sie womöglich das Risiko einer allergischen Reaktion während der Behandlung verringern können.
Im Forschungsgebiet der Proteomik hat sich die Massenspektrometrie als essenzielles Werkzeug etabliert. Zur Probengewinnung und deren Präparation für die chromatogra-phische Trennung und massenspektrometrische Analyse existieren eine Vielzahl von Protokollen, deren Verwendung jedoch unterschiedlichste Vor- und Nachteile mitbringt. Im Idealfall wäre ein solches Protokoll schnell und kostengünstig durchführbar, würde mit hoher Robustheit die Proteine aus den Ausgangszellmaterial quantitativ extrahieren und Probenverluste auf ein Minimum beschränken. Ziel dieser Arbeit war es, in einem strukturierten Ansatz sich diesem Ideal zu nähern und mögliche Kompatibilitaten mit anderen Methoden wie dem Arg-C analogen Proteinverdau zu untersuchen. Als Maß-stäbe dienen hierbei die aktuellen Standardprotokolle: die Acetonfällung der Proteine mit anschließender Solublisieung und das FASP-Protokoll, bei dem die zur Proteinpro-zessierung notwendigen Arbeitsschritte auf einer Größenausschlussmembran stattfinden. Dazu wurde zunächst das Adsorptionsverhalten von Proteinen auf den Silica-Oberflächen paramagnetischer Beads untersucht und dabei insbesondere der Einfluss von Chemikalien zur Zell-Lyse und den im Anschluss verwendeten Reduktions- und Alkylierungsreagenzien analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Proteine aus dem Totalzelllysat sehr effektiv an die Silicaoberfläche binden und dass der Prozess der Re-duktion von Disulfidbrücken mit nachfolgender Carbamidomethylierung positiv zur Adsorption beiträgt und negative Einflüsse auf die Immobilisierung negieren kann. Dar-aus wurde ein Protokoll zur kombinierten Lyse, Aufreinigung, Modifikation und Proteo-lyse (abgekürzt: ABP) entwickelt. Parallel dazu konnte die Kompatibilität des Protokolls mit dem ArgC-analogen Verdau gezeigt werden und in der Folge konnte die Komple-mentarität der Methoden erfolgreich getestet werden. Mit frischen Zell-Lysaten wurde der Einfluss der Lysisreagentien unter Einschluss einer kommerziellen Variante ("Bug-buster" Lysis-Puffer) bestimmt und Harnstoff konnte als Mittel der Wahl definiert wer-den, da mit diesem höhere Identifikationszahlen erreicht wurden, lipophile Proteine vermehrt in der Probe erhalten blieben und größere Ionscores ermittelt werden konnten. Das Potential von ABP wurde im Direktvergleich mit FASP und dem Verdau in Lösung anhand eines humanen Proteoms genauestens untersucht, wobei eine konsequente Ver-besserung gegenüber beiden Methoden festgestellt werden konnte, insbesondere im Hinblick auf Praktikabilität und die Zahl der erforderlichen Arbeitsschritte, Reprodu-zierbarkeit und Zahl der identifizierten Peptide. Ein Bias des ABP zugunsten spezieller Proteineigenschaften konnte nach ausführlicher Analyse der identifizierten Proteine und Peptide nicht festgestellt werden. Eine vermehrt auftretende Oxidation von Methionin wurde identifiziert, allerdings zeigten sich keine negativen Auswirkungen auf die Pro-teinidentifizierungen. Zur Unterdrückung potentieller und unerwünschter Nebenpro-dukte in Form von Methylierungen, die als Folge des ursprünglichen ArgC-analogen Verdaus36 auftreten, wurde mit Verwendung von Acetonitril eine Alternative erfolg-reich getestet. Ein humanes Proteom wurde mittels des formulierten Protokolls sowohl tryptisch als auch mit ArgC-analogen Verdau (mit Acetonitril bzw. Methanol) analysiert. In diesem Zusammenhang wurde die Vollständigkeit der Modifikation der Lysine unter Verwendung von ACN mit zufriedenstellenden 99% bestätigt und die unerwünschte Carbamylierung der Aminosäure durch Harnstoff als Lysisreagenz konnte ausgeschlos-sen werden. Beide Ansätze zum ArgC-analogen Verdau erwiesen sich zudem gegenüber der tryptischen Variante als überlegen, was sich in einer Erhöhung der Identifikations-zahlen des humanen Proteoms widerspiegelt. Insbesondere wenig abundante Proteine, Histone und membranassoziierte Proteine bildeten den Großteil der zusätzlich identifi-zierten Proteine. Zusätzlich konnte eine günstigeres Fragmentierungsverhalten beobach-tet werden. Die effektiven Grenzen des ABP im Hinblick auf die erforderliche Protein-menge wurden untersucht und beschrieben. Der zu erwartende Zusammenhang zwi-schen abnehmender Proteinmenge und Identifikationszahlen niedrig abundanter Protei-ne wurde bestätigt und ein effektiver Grenzwert von 5µg Ausgangsmenge humanen Proteoms ermittelt. Abschließend wurden Dauer und Aufwand der Probenvorbereitung durch Etablierung paralleler Reduktion, Carbamidomethylierung und Propionylierung minimiert und damit zusätzlich Probenverluste reduziert. Die dadurch erreichte Erhö-hung der Identifikationszahlen ergab sich wiederum aus der höheren Repräsentanz nied-rig abundanter Proteine.
Im Rückblick ist es überraschend, dass die Verwendung der Adsorptionstendenzen von Proteinen bisher keine größere Rolle in der Probenvorbereitung proteomischer Analysen eingenommen hat. Die symbiotisch wirkende, aktive Denaturierung als Resultat der durchgeführten Derivatisierung zur Analysenpräparation macht die Adsorption auf Sili-ca-Oberflächen zum prädestinierten Mittel der Probengewinnung und schafft die Vo-raussetzung für die erreichte Verkürzung der Arbeitsabläufe und Verbesserung der Ergebnisse.
5-lipoxygenase (5-LO) is an enzyme with a substantial role in inflammatory processes. In vitro kinase assays using [32P]-ATP in combination with mutagenesis have revealed that serine residues 271, 523 and 663 can be phosphorylated by MK2, PKA and ERK2 kinases, respectively. A few available reports regarding 5-LO protein sequence have covered up to 30% of the sequence after amino acid sequencing including Ser663. In LCMS/MS analyses of 5-LO tryptic digests from different cellular sources different peptides have been detected; however, none of the three phosphorylations has been detected and only Ser663 was included in the covered sequence.
As there was no comprehensive mass spectrometric analysis of 5-LO, the purpose of this study was to optimize the experimental conditions under which detection of the aforementioned phosphorylation events, as well as other possible post-translational modifications (PTMs), would be feasible. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) was used for peptide analysis of 5-LO cleaved either by chemical reagents or by proteases. Sequence coverage of 5-LO could be enhanced to be close to completion by combination of results from digestions by trypsin, AspN and chymotrypsin. In-gel trypsin digestion followed by in-solution AspN digestion proved to be a useful sample treatment for reproducible detection of the Ser271-containing peptide.
Nevertheless, in none of the examined cleavage protocols the sequence around Ser523 was detected reproducibly or with acceptable signal intensity for subsequent peptide fragmentation. Propionic anhydride and sulfo-NHS-SS-biotin cross-linker (EZ-linkTM), were used for derivatization of lysine side chains and hindrance of lysine residue recognition by trypsin. Phosphopeptide enrichment became possible after tryptic digestion of these samples, not only due to formation of an individual Ser523-containing peptide, but also because TiO2-mediated enrichment, which is performed in acidic pH, was not impaired by positively charged free lysine side chains. Additionally, biotinylation of lysine residues was exploited for an intermediate enrichment step of the lysine containing peptides, prior to TiO2 phosphopeptide enrichment.
MALDI-MS analysis after in-vitro phosphorylation of 5-LO by the three kinases showed that Ser271 was phosphorylated in the MK2 and PKA kinase assays, while Ser523 was phosphorylated only in the PKA kinase assay. Surpisingly, no phosphopeptides were detected in the in-vitro kinase assays with ERK2, even though the unmodified counterpart of the Ser663-containing peptide was easily detected. The detection limit for each of the three phosphorylation sites was determined by the use of custom made phosphopeptides and an amount of 0.06 pmol of phosphopeptide in 1 μg 5-LO (representing 0.5% phosphorylation rate) was sufficient in all cases for successful enrichment and detection by MS.
In-vitro kinase assays with [32P]-ATP were performed for some kinases that were expected to phosphorylate 5-LO according to in-silico data. Three members of the Src tyrosine kinase family (Fgr, Hck and Yes) and the Ser/Thr specific kinase DNA-PK used 5-LO as their substrate and mainly residues at the N-terminal part of 5-LO were detected phosphorylated by MS (e.g. Y42, Y53). Additional in-vitro assays for recombinant 5-LO modification included incubation with glutathione or compound U73122, previously described as inhibitor of 5-LO.
Since in-vitro assays might have generated artifacts, a method for 5-LO purification from human cells was sought, in order to examine the modification state of the protein in the cellular context. ATP-agarose affinity purification and anti-5-LO immunoprecipitation proved inappropriate for sample purification for MALDI-MS analysis. Consequently, two human cell lines that are able to express 5-LO (Rec-1 Blymphocytes and MM6 monocytes) were transduced with a DNA cassette that contained recombinant human 5-LO sequence with an attached N-terminal FLAG-tag. Anti-FLAG immunoprecipitation was then performed effectively in cell lysates and the precipitated FLAG-5-LO was separated by SDS-PAGE before MALDI-MS analysis.
The examined cell stimuli were expected to result to phosphorylation of 5-LO at Ser523 by PKA in Rec-1 cells and to phosphorylation of Ser271 and/or Ser663 in MM6 cells by activated MK2 and ERK2, respectively. Additionally, under the conditions of MM6 cell stimulation, Fgr, Hck and Yes kinases, which phosphorylated 5-LO in vitro, were expected to be activated and the possibility of 5-LO phosphorylation on tyrosine was investigated. Although immunoblotting results indicated that all the aforementioned phosphorylation events existed in the examined samples, MALDI-MS analysis verified only phosphorylation on Ser271 in differentiated MM6 cells, interestingly regardless of cell stimulation.
Finally, the primary amine derivatization procedure by EZ-linkTM was utilized for MS analysis of lysine rich proteins. In the past, chemical propionylation of histones had been employed prior to trypsin digestion; however it was easily confused in MS with combinations of other PTMs (e.g. acetylation, methylation). Moreover, propionylation is a PTM for histone H3 and this information was lost. Consequently, the EZ-link reagent was more useful for analysis of histones, as unambiguous assignment of PTMs and detection of native propionylation on bovine H3 became possible.
Die Arbeit überprüft die Zusammensetzung der F1FO-ATP-Synthase in Säugetiermitochondrien, dem Enzymkomplex, der das meiste ATP für den Energiebedarf einer Zelle liefert. Es sind zwei neue Proteine identifiziert und als ATP-Synthase assoziiert verifiziert worden, das sog. dapit protein (diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissue; Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|19424210) bzw. 6.8 kDa mitochondrial proteolipid (Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|109478763). Bis jetzt sind beide Proteine nicht zusammen mit dem Komplex V detektiert worden, da es sich bei beiden Proteinen um sehr kleine Membranproteine (kleiner 7 kDa) handelt und sie sehr leicht in Gegenwart von Detergenzien verloren gehen. Die etablierte Strategie zur milden Aufreinigung von Komplex V, die eingesetzte gelelektrophoretische Trennung und die gewonnenen Erkenntnisse zur Identifizierung solch kleiner Proteine können sicherlich auch Lösungsansätze für andere ungelöste Problemfälle in der Proteinkomplexanalytik liefern. Da beide neuen Proteine in die Modulation des metabolischen Zellzustandes involviert sein könnten, sind die erarbeiteten Daten für weitere funktionelle und biochemische Untersuchungen der ATP-Synthase äußerst nützlich. Außerdem könnten die Ergebnisse für neurologische und klinische Studien hinsichtlich der Ursachenforschung von Funktionsstörungen in den Mitochondrien von Interesse sein, da eines der zwei neuen Proteine früher schon mit Diabetes in Zusammenhang gebracht worden ist (dapit, diabetesassociated protein in insulin-sensitive tissue). Für ein bakterielles Multihäm c-Typ Cytochrom konnte massenspektrometrisch gezeigt werden, dass es auf eine unkonventionelle Weise Häm bindet. Durch massenspektrometrische Charakterisierung des Proteins konnte erstmals nachgewiesen werden, dass es nicht nur die Häm c-Bindemotive CX2-4CH und CXXCK, sondern auch Häm c-Bindemotive der Form CXnCH in Bakterien gibt. Diese Erkenntnis führt in der Molekularbiologie zu neuen Fragen, z. B. welche speziellen Lyasen (cytochrome c haem lyases) letztendlich für das Einfügen der Häm-Gruppe an solche neuen Motive verantwortlich sind. Auch die computerbasierte Vorhersage von c-Typ Cytochromen wird dieses Wissen wohl zukünftig in Suchstrategien umsetzen, um die neuen Häm c-Bindemotive bei der Genomanalyse von Organismen nicht zu übersehen. In dem Feld der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen im Allgemeinen konnten grundlegende Erkenntnisse zum Umgang mit alternativen Enzymen und deren Potential für einen zukünftigen Einsatz erarbeitet werden. Schwerpunktmäßig wurden die Enzyme Chymotrypsin, Elastase und Pepsin untersucht. Es konnte für alle drei Kandidaten gezeigt werden, dass sie bevorzugt an einer begrenzten Anzahl von Aminosäuren spalten. Besonders für Elastase ist diese Erkenntnis neu, da sie in der Literatur bisher als unspezifisches Enzym wie Proteinase K geführt wurde. Auch wenn die Spezifität der drei Enzyme nicht zu 100% wie bei Trypsin festgelegt werden kann, sondern es sich nur um eine Bevorzugung gewisser Aminosäuren handelt, sind die enzymatischen Spaltungen reproduzierbar. Selbst eine Auswertung der MS-Spektren mittels Peptide Mass Fingerprint (PMF) ist deshalb auch bei diesen weniger spezifischen Enzymen möglich. Die Intensität der MS-Signale muss aber berücksichtigt werden, was bei bisherigen PMF-Suchen jedoch nicht in der Art und Weise geschieht, wie es für diese Enzyme nötig wäre. An einigen Membranproteinen konnte letztendlich bereits beispielhaft gezeigt werden, dass der Einsatz von weniger spezifischen Enzymen für die Identifizierung des Proteins und der nachfolgenden Charakterisierung (z. B. Identifizierung von posttranslationale Modifikationen) vorteilhaft ist. Für Elastase konnte in diesem Zusammenhang auch demonstriert werden, dass sie problemlos in Lösungsmittelsystemen mit einem hohen organischen Anteil (Acetonitril, Isopropanol, Methanol) einsetzbar ist. 100% Sequenzabdeckung lassen sich aber auch bei weniger spezifischen Enzymen trotz der größeren Anzahl an Schnittmöglichkeiten nur erahnen. Zwei Hauptursachen hierfür sind wahrscheinlich die schlechte Zugänglichkeit des Enzyms zum Membranprotein bzw. die Bevorzugung bestimmter enzymatischer Fragmente in MALDI und ESI. Polyacrylamidgele mit alternativen Quervernetzern, bei denen sich die Geldichte vor dem Verdau verringern lässt, könnten die Zugänglichkeit zum Membranprotein zukünftig vielleicht positiv beeinflussen. Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln und bestimmter Detergenzien beim Verdau verbessert ebenfalls die Zugänglichkeit zum Membranprotein. Die Zahl der Tenside, die mit der Massenspektrometrie sehr gut kompatibel sind, ist aber sehr gering, wie Untersuchungen in dieser Arbeit ebenfalls ergeben haben. Außerdem beschränkt sich die Anwendung von diesen Detergenzien ausschließlich auf MALDI. Die zu erwartenden Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen umschreibt daher besonders gut ein Aphorismus von Christian Morgenstern (deutscher Schriftsteller; 1871 – 1914): „Es gibt nur ein Neues: Die Nuance.“ Einige Nuancen sind in dieser Arbeit enthalten. In der Zukunft werden aber viele weitere solcher Nuancen das Überwinden der Hürde „Membran Proteomics“ immer realistischer werden lassen.
Proteomic analysis is the large-scale identification and characterization of proteins including post translational modifications. Proteomics encompasses a number of approaches including bottom-up and top-down workflows which are widely used independently and complementary as tools for the successful study of protein species. However, up to the present day these techniques have not been able to overcome every analytical limitation. Mass spectrometry has played a vital role alongside proteomics in providing the required analytical means of detecting protein amounts down to the atomole range. Soft ionization methods such as matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI) and electrospray ionization (ESI) have permitted the transfer of peptides and intact proteins into the gas phase without extensive degradation. The introduction of recent developments in MALDI technology such as the highly sensitive 4-chloro-alpha-cyanocinnamic acid matrix (Cl-CCA) as well as the commercial availability of a MALDI-LTQ-Orbitrap which boosts peptide mass accuracy below 3 parts per million (ppm), have offered new prospective in protein analysis. The aim of the current study is to incorporate these new aspects and provide further advancements in gel-based as well as gel-free proteomic workflows.
Peptides of proteolytically digested proteins are routinely analyzed by means of peptide mass fingerprinting (PMF) often combined with MS/MS analyses to complement and substantiate PMF results by peptide sequence information. The most widely used protease for enzymatic digestion is trypsin, since it exhibits a very specific cleavage behavior limited to C-terminal hydrolyses after basic amino acids. However, less specific enzymes such as chymotrypsin, elastase and pepsin have emerged as useful tools in the analysis of particular protein classes e.g. membrane, cereal, and phosphorylated proteins. In this work a comprehensive bottom-up proteomic investigation including in-solution and in-gel protein digestions of analytes covering small to large, acidic to basic, and hydrophobic to hydrophilic proteins in combination with a series of less specific enzymes are presented in order to show the superiority of the novel MALDI matrix Cl-CCA. The Cl-CCA matrix proved to be highly superior compared to standard α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) since an average detection of more than 2- to 3-fold peptide amount was possible depending on the used protease and, therefore, resulting in strongly increased sequence coverage. Additionally, protein identification of chymotrypsin and elastase in-gel digested protein standards was evaluated. The MALDI-LTQ-Orbitrap providing peptide mass accuracy below and up to 3 ppm in combination with Cl-CCA as matrix and newly optimized digestion conditions led to unambiguous protein identifications of all chymotryptic digests outperforming its tryptic counterparts in the case of hydrophobic bacteriorhodopsin and α-globin from hemoglobin A (α-HgbA). In addition, significantly higher sequence coverage and increased number of detected peptides was acquired. Moreover, a proposed workaround for elastase digestions was capable of providing a solution for successful identification results.
Apart from digestions of singly separated proteins, solution isoelectic focusing (sIEF) was evaluated. OFFGEL fractionation is an efficient means of fractionating peptides and proteins according to their isoelectric point (pI) values through immobilized pH gel (IPG) strips after which samples are recovered in solution. Consequently, an issue of peptide recovery arises as a category of peptides relatively insoluble to the recovery solution should be present. A method was developed including the scraping of gel matrix from the IPG strips and peptide extraction using acetonitrile as organic solvent in combination with analytical techniques such as nLC-MALDI-MS/MS for peptide identification. The nature of the peptide species remaining in-gel was analysed and attributed to peptide solubility. A general trend in which a high percentage of neutral and hydrophobic peptides remaining entrapped in the IPG gel strip was observed.
The present work also examines a new top-down proteomic workflow involving protein elution from cleavable gels containing the labile crosslinker ethylene-glycol-diacrylate (EDA). Protein amounts of as low as 100 ng loaded onto EDA gels were detected using MALDI-TOF MS in the linear acquisition mode. Proteins from 8.5 up to 78 kDa were successfully measured including a hydrophobic 15 kDa core protein attaining a GRAVY score of +0.079. Additionally, the method was compatible with one dimensional protein separation as well as for 2-D IEF/SDS-PAGE. Lastly, two methods for protein identification were tested and found to be compatible to the proposed technique.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine allgemein anwendbare Methode zur Identifizierung und Quantifizierung kleiner Moleküle mittels MALDI-TOF-MS entwickelt. Dabei wurden zahlreiche Analyten, wie unterschiedliche Arzneistoffe, Neurotransmitter und Lebensmittelinhaltsstoffe in verschiedenen Probenmatrizes analysiert. Bei den verwendeten Matrizes wurden mit a-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (CHCA) die besten Ergebnisse erzielt. Es zeigte sich jedoch, dass die Probenpräparation wichtiger war als die Wahl der Matrix, da auch mit anderen Matrizes bei optimierter Probenpräparation sensitive Messungen im niedrigen Massenbereich möglich waren. Insbesondere eine schnelle Trocknung des Probenspots, und damit verbunden die Bildung kleiner Kristalle, ist für die Analytik kleiner Moleküle hilfreich. Bei gleichzeitiger Verwendung geringer Matrixkonzentrationen und geringer Laserintensität konnte so der störende Matrixhintergrund minimiert werden. Eine noch stärkere Suppression der Matrixsignale bei gleichzeitiger Anreicherung der Analyten auf dem Probenspot konnte durch eine Dünnschichtpräparation (TLP) mit CHCA und Nitrozellulose erreicht werden. Allerdings war die TLP für eine automatische Quantifizierung kleiner Moleküle nur bedingt geeignet. Die für kleine Moleküle so wichtige Quantifizierung war durch Verwendung einer optimierten schnell trocknenden Dried Droplet Präparation (DDP) möglich. Die Kombination dieser optimierten DDP mit ausreichend aufsummierten Einzelschussspektren bei gleichzeitiger Verwendung eines internen Standards (IS) ermöglichte eine valide Quantifizierung mit guter Präzision, Linearität und Richtigkeit. Dabei erfüllten die quantifizierten Analyten die Vorgaben der FDA für Präzision und Richtigkeit. Diese Quantifizierungsmethode wurde an Mischungen unterschiedlicher Arzneistoffe, sowohl in Standardlösungen als auch in humanem Plasma, erfolgreich durchgeführt. Dabei genügte ein einziger interner Standard, um alle Arzneistoffe der Mischung schnell und sensitiv zu bestimmen (Bestimmungsgrenze 1-5 ng/ml). Weiterhin war es möglich, den Wirkstoff einer pharmazeutischen Tablette ohne aufwändige Probenvorbereitung schnell und genau zu bestimmen. Dass MALDI über eine hohe Salztoleranz verfügt, wurde bei der Bestimmung von Acetylcholin (ACh) und Cholin (Ch) in Mikrodialysaten bestätigt. Trotz des hohen Salzgehalts der Proben (~150 mM) war eine direkte Messung ohne vorherige Aufarbeitung möglich. Dabei lag die Nachweis- und Bestimmungsgrenze für ACh bei 0,3 bzw. 1 fmol/µl und für Ch bei 20 bzw. 100 fmol/µl. Nach den Standardlösungen wurden in-vivo Mikrodialysate aus dem rechten Striatum verschiedener CD1-Mäuse quantifiziert. Durch Verbindung der Dialysesonde mit einem MALDI-Spotter konnte außerdem die zeitliche Auflösung der Dialyse deutlich verbessert werden. Ein weiterer Anwendungsbereich stellte die Bestimmung von Melamin in Milch und Milchpulver dar. Nach einfacher Probenvorbereitung war es möglich, Melamin mit einer Bestimmungsgrenze von 0,25 ppm in Milchpulver bzw. 0,625 ppm in Milch direkt und schnell zu quantifizieren. Damit wurden die geforderten Grenzwerte von 1 ppm für Babynahrung bzw. 2,5 ppm für übrige Lebensmittel leicht erreicht. Als letzte Methode wurden verschiedene Inhaltstoffe in Energy Drinks bestimmt. Bei Verwendung von Theophyllin als IS konnte so neben Koffein auch Niacin und Pyridoxin erfolgreich und ohne Probenvorbereitung schnell quantifiziert werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass MALDI auch für die Analytik kleiner Moleküle gut geeignet ist. Neben der Identifizierung der Analyten war auch die Quantifizierung mit guter Linearität, Reproduzierbarkeit und Richtigkeit möglich. Dabei konnten mit der Standardmatrix CHCA verschiedenste niedermolekulare Analyten in unterschiedlichsten Probenmatrizes bestimmt werden. Im direkten Vergleich war die Sensitivität der vorgestellten MALDI-Methoden mindestens vergleichbar, wenn nicht gar besser als bestehende LC-MS-Methoden. Da auf den Einsatz einer LC verzichtet werden kann, ermöglich MALDI einen sehr viel höheren Probendurchsatz. Zudem war keine spezielle Matrix, besondere Geräte oder zeitaufwändige Probenvorbereitung und Präparation notwendig.
Der Qualitätsstandard von Arzneimitteln in Deutschland und anderen Industrienationen ist zum heutigen Zeitpunkt hoch. Dies ist in erster Linie den strengen arzneimittelrechtlichen Anforderungen und Kontrollen zuzuschreiben, denen der Arzneimittelmarkt unterliegt. Es muss allerdings befürchtet werden, dass sich dies in Zukunft ändern könnte. Die Gefahr besteht zum einen in der Legalisierung des Versandhandels von Arzneimitteln und zum anderen in der EU-Osterweiterung. Es besteht die Gefahr, dass aus osteuropäischen Staaten vermehrt qualitativ minderwertige oder gefälschte Arzneimittel auftauchen. In Entwicklungsländern dagegen besteht heute schon ein großes Problem bezüglich der Arzneimittelqualität, die WHO vermutet, dass 25 % aller Arzneimittel in ärmeren Ländern qualitativ minderwertig oder gefälscht sind. Um so wichtiger erscheint die Möglichkeit, einfache, schnelle und zerstörungsfreie Prüfmethoden zur Qualitätskontrolle von Arzneimitteln zur Verfügung zu haben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einsatz der Nahinfrarot-Spektroskopie zur Qualitätskontrolle von Tabletten und Lösungen geprüft. Diese Technik bietet sich besonders an, da sie schnell und zerstörungsfrei ist und keinerlei Probenaufbereitung bedarf. Die NIRS hat sich in den letzten Jahren als geeignete Methode zur Quantifizierung von Wirkstoffen in Tabletten und anderen Arzneiformen erwiesen. Bisher allerdings nur zur Anwendung auf ganz spezielle Präparate, so dass mit den Methoden nur eine bestimmte Spezialität untersucht werden konnte. In dieser Arbeit wurde die NIRS erstmals auf Präparate verschiedener Hersteller mit unterschiedlicher Matrix eingesetzt. Damit konnte eine ganze Präparategruppe mit nur einer Methode untersucht werden. Im ersten Teil konnte gezeigt werden, dass Tablettenpräparate des Deutschen Marktes unterschiedlicher Hersteller, die sich Form, Farbe, Größe und Hilfsstoffmatrix unterschieden, zusammen bezüglich ihres Wirkstoffgehaltes kalibriert werden können. Damit erlauben die Methoden eine Aussage darüber zu treffen, ob der Wirkstoff in der deklarierten Menge enthalten ist. Dies war sogar ohne die simultane Durchführung einer entsprechenden Referenzanalytik zur Erstellung der Kalibrationsmodelle möglich. Alle erstellten Methoden mit ASS-, Atenolol- und Enalapril-Tabletten erlaubten es zu überprüfen, ob der Wirkstoff in einer Konzentration von ± 10 % der Deklaration enthalten ist. Dabei zeigte sich, dass der Kalibrationsdatensatz idealerweise alle möglichen später auftretenden Variationen berücksichtigen sollte, um bei der späteren Analyse falsche Ergebnisse zu vermeiden. Im zweiten Teil sollte überprüft werden, ob mit diesen NIR-Methoden Arzneimittelfälschungen und damit verbundene Qualitätsmängel wie Unterdosierungen, Placebos, falsche Wirkstoffe oder zusätzliche Wirkstoffe erkannt werden. Da uns keine „realen“ Proben zur Verfügung standen, wurden die Tabletten im Rahmen einer Kooperation mit der Pharmazeutischen Technologie der Universität Frankfurt produziert. Die Messungen erfolgten in Transmission, Reflexion und durch verschiedene Blistermaterialien. Im Rahmen der Kalibration und Validierung wurde deutlich, dass die unterschiedlich gewählte Hilfsstoffmatrix einen großen Einfluss ausübt. Die Validierung zeigte, dass die Gehaltsbestimmung in einem Rahmen von ± 15 % der wahren Wirkstoffmenge möglich ist. Dieser Rahmen scheint zunächst sehr groß, allerdings muss bedacht werden, dass im Rahmen der Kalibration eine große Variation in den Datensatz gebracht wurde und die zur Validierung verwendeten Präparate dem Modell völlig unbekannt waren. Die Untersuchung der simulierten Fälschungen ergab für die Transmissions- Reflexions- und Blistermessungen vergleichbare Ergebnisse. Placebos wurden eindeutig identifiziert, ebenso die Tabletten mit falschem Wirkstoff. Dass Unterdosierungen ab 15 % erkannt werden, wurde im Rahmen der Validierung gezeigt. Zusätzliche Wirkstoffe wurden sowohl bei den Reflexions- als auch bei den Transmissionsmessungen erst ab einer Konzentration von 10 % sicher erkannt. Die Methoden mit Messungen durch den Blister lieferten dagegen ab 2 % zusätzlicher Substanz Hinweise auf einen qualitativen Mangel. Im dritten Teil wurde am praxisrelevanten Beispiel der Tilidin-Lösungen eine NIR-Methode erstellt, die zukünftig eine schnelle und sicher anwendbare Möglichkeit zur Überprüfung dieses Arzneimittels auf Manipulation darstellt. Im Vergleich zu einer bisher angewandten zeitintensiven DC, kann die nur wenige Minuten in Anspruch nehmende NIR-Analyse erheblich Zeit einsparen...