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Die Haarzell-Leukämie ist eine niedrigmaligne Iymphoproliferative Leukämie der BZell reihe mit sehr guten Therapiemöglichkeiten. Zur Erfassung der Lebensqualität und Verträglichkeit der bei den Therapieformen 2-Chlorodeoxyadenosin und lphaInterferon haben wir sowohl die Patienten (mittels des standardisierten EORTC QLQC30- Fragebogens) als auch behandelnde Ärzte (mittels eines selbst konzipierten Fragebogens) deutschlandweit befragt. Es haben 202 Patienten und 74 Praxen (mit Erfassung von insgesamt 189 Patienten) geantwortet. Zusammenfassend läßt sich festhalten, daß in unserer befragten Patientenkohorte unter 2-CdA hohe komplette Remissionsraten erzielt werden konnten (CR 85%), darunter bei über 90% mit nur einem Zyklus 2-CdA. Lediglich ein Patient zeigte kein Ansprechen auf die Cladribintherapie. Sowohl in der Literatur als auch in unserer Untersuchung ist die Rezidivrate gering. Die Progressionsfreiheit nach 7 Jahren wird in der Literatur mit 60% beschrieben, wohingegen 77% der Interferonpatienten nach einem Median von 31 Monaten ein Rezidiv erleiden.B9 In unserer Umfrage wurde bei 2-CdA eine Gesamtremissionsrate von 98.2% erreicht (CR 80%), wobei die Mehrzahl der Patienten nur einen Zyklus zum Erreichen der CR benötigte. Bemerkenswert hierbei ist die Tatsache, daß dies mit 2-CdA bei der Mehrzahl der Patienten schon nach einem Zyklus möglich war, ein Phänomen, welches in der Chemotherapie bei Krebspatienten nicht häufig vorkommt. Demgegenüber steht die komplette Remissionsrate von 20% bei den mit Interferon therapierten Patienten. In unserer Befragung hatten zum Zeitpunkt der Datenerhebung 50% der Interferonpatienten ein Rezidiv erlitten. Hierbei konnten mit der Anwendung von 2-CdA (bzw. DCF) bei Nicht-Ansprechen, Progression oder Rezidiv gute Erfolgsraten erzielt werden. Auch diejenigen Patienten, die unter Interferon nachweislich kein Ansprechen zeigten, konnten mit 2-CdA erfolgreich therapiert werden. Jedoch ist hier zu vermerken, daß lange stabile Verläufe (ohne Rezidiv oder Progression) unter Interferon möglich sind. So fanden sich Patienten, die über Jahre (bis 15 Jahre) unter IFN in einer stabilen kompletten Remission lebten. Die Überlegenheit von 2-CdA bezüglich des Erfolges der Therapie spiegelt sich nicht nur in den Remissionsraten wider, sondern auch in der subjektiven Einschätzung der Verträglichkeit, dem Profit und der Verbesserung der Lebensqualität durch die Patienten selbst. Demnach wurde von 67% der mit 2-CdA behandelten Patienten angegeben, das Medikament gut vertragen zu haben, gegenüber 45% in der Interferon-Gruppe. Es gaben mehr Patienten aus der Interferon-Gruppe eine schlechte Verträglichkeit dieser Therapie an. Dieser Unterschied bezüglich der Verträglichkeit war statistisch signifikant. Patienten, die sich bei den Therapien unterziehen mußten, gaben an, bezüglich Krankheitsbekämpfung (80%) und Verbesserung der Lebensqualität (87%) vom 2-CdA eher profitiert zu haben. Auch das Nebenwirkungsspektrum aus den Patientenfragebögen scheint unter Interferon deutlich größer zu sein (p=0.081), wobei unter 2-CdA vor allem das Fieber und Zytopenien dominieren. 28% gaben hier keinerlei Nebenwirkungen an, gegenüber 16% aus der Interferongruppe. Bei letzteren dominierte vor allem die Müdigkeit, Muskel-/Gelenkschmerzen sowie die Injektionen selbst, die als unangenehm empfunden wurden. Bezüglich der objektivierten Einschätzung der Lebensqualität mittels des EORTCC30 Fragebogens, ist bemerkenswert, daß insgesamt in beiden Gruppen über 60% der Fragen von je 70-100% der Patienten mit gut beantwortet wurde (Fisher's exact test). Lediglich die Frage nach der körperlichen Belastbarkeit zeigt eine signifikante Überlegenheit von 2-CdA gegenüber Interferon (p=0.039). Die spezifische Auswertung nach dem EORTC QLQ-C30 Scoring Manual ermöglicht den Vergleich der Lebensqualität der HZL-Patienten mit der Normalbevölkerung. Hier erreicht die 2-CdA-Gruppe einen annähernd mit der Normalbevölkerung vergleichbaren QoL-Score (88 versus 92), aber auch die Interferon-Patienten weisen mit 80 Punkten ein hohes Niveau der körperlichen Belastbarkeit auf. Deutliche Unterschiede zwischen HZL-Patienten und der Normalbevölkerung zeigen sich in den Symptomenkomplexen Müdigkeit, Schmerzen und Schlafstörungen, aber auch in allen anderen Bereichen der Lebensqualität zeigt das gesunde Personenkollektiv eine deutlich höhere Punktzahl. Auffällig ist die Einschätzung der allgemeinen Lebensqualität, die bei der Normalbevölkerung deutlich höher liegt. Die Einschätzung der Lebensqualität der HZL-Patienten unterscheidet sich mit 59 bzw. 61 Punkten deutlich von der Normalbevölkerung (73 Punkte). Auffällig ist die Ermittlung der besseren Lebensqualität der 2-CdA Gruppe gegenüber der Interferon-Gruppe bei den Patienten, die aktuell bzw. innerhalb der letzten 3 Jahre eine Therapie durchmachten. Auch der Vergleich des Patientenkollektivs, das 2-CdA als Ersttherapie erhalten hatte mit dem, welches 2-CdA als Second-line Therapie nach erfolglosem Interferonversuch erhielt, schneidet die 2. Gruppe (2-CdA nach durchgemachter Interferontherapie) in dem Scoring wesentlich schlechter ab. Die Frage nach der Heilung der HZL durch 2-CdA ist bisweilen noch nicht beantwortet worden, obwohl die Tatsache, daß langjährige komplette Remissionen mit Erlangung einer nahezu normalen Lebensqualität nach einem einzigen Zyklus mit minimaler Belastung der Patienten an die Möglichkeit der Heilung denken lassen könnte. Wie bereits in dem Kapitel "Minimal Residual Disease" beschrieben, weisen ca. 10-50% der Patienten mit CR Anzeichen für Restbestände der malignen Zellen im Knochenmark auf, die nachweislich zu einem Rezidiv prädispositionieren. 107• lOB. 112, 124 Ob Patienten mit einer nachgewiesenen minimalen Resterkrankung trotz CR von einem 2. Zyklus 2-CdA profitieren würden, müßte in weiterführenden Untersuchungen geklärt werden. Da diese Therapie mit einer erheblichen Immunsuppression einhergeht, wäre der Anschluß eines 2. Zyklus bei Entdeckung der minimalen Resterkrankung erst nach Erholung der CD4-Zellen nach 6 Monaten sinnvoll. Trotz der kontroversen Diskussionen über die HZL als potentiell heilbare Krankheit, gilt als gesichert, daß durch die Einführung von 2-CdA ein Durchbruch in der Behandlung der HZL gelungen ist. Eine fast 100%ige Erfolgswahrscheinlichkeit mit nur einem Zyklus des Purinanalogons mit langen Remissionszeiten und relativ niedriger Rezidivquote ermöglichen den betroffenen Patienten wahrscheinlich eine fast normale Lebenserwartung mit einer relativ hohen Lebensqualität.
Die Purinanaloga Cladribin und Fludarabin sowie die Pyrimidinanaloga Cytarabin und Gemcitabin sind wichtige Bestandteile in der Behandlung Iymphoproliferativer und hämatologischer Erkrankungen. Die zwei Hauptmechanismen der zytostatisch wirksamen Medikamente sind zum einen die Induktion der Apoptose und zum anderen die Hemmung der ZeIlproliferation. Beide Wege führen am Ende zum Untergang der Zelle und damit zur Tumorregression. In verschiedenen klinischen Studien wurde die klinische Wirksamkeit der Nukleosidanaloga demonstriert. Das Ziel der Kombinationen etablierter Substanzen mit neuen Medikamenten ist der Erhalt additiver und synergistischer Effekte, resultierend in einer Erhöhung der klinischen Effektivität. 2-CdA, ein Purinanalogon, zeigte bisher Aktivitäten als Einzelsubstanz in der Behandlung niedrigmaligner Lymphome. Chow et al untersuchten die Induktion der Apoptose durch die Einzelgabe von 2-CdA und durch 2-CdA in Kombination mit anderen antineoplastischen Medikamenten. Die Messungen der Apoptoserate (Durchflußzytometrie) induziert durch die alleinige Gabe von Cladribin, ergab eine von der Dosis abhängigen Kurvenverlaur 3x Mit Steigerung der Dosis erhöhte sich die Apoptoserate in den normalen wie in den neoplastischen Zellen. Hier wurde nun untersucht, ob sich durch die Steigerung der extrazellulären 2-CdA Konzentration, dessen intrazellulären Metabolismus erhöhen lässt und damit die Menge des aktiven Metaboliten 2-CdA TP. Als Methode eignete sich hierfür die HPLC. Die Ergebnisse zeigten, daß mit zunehmender extrazellulärer Konzentration die intrazelluläre Phosphorylierung des Cladribins in seine aktiven Metabolite signifikant anstieg. Es ist daher anzunehmen, daß höhere Dosen in vivo in der Behandlung niedrigmaligner Lymphome in einer größeren klinischen Effektivität resultieren könnte. Die klinische Effektivität könnte auch durch die Kombination mit anderen neoplastischen Substanzen erhöht werden. Untersucht wurde daher die Kombination von 2-CdA mit dem neuen Pyrimidinanalogon Gemcitabin (dFdC), welches bisher vielversprechende Aktivitäten gegenüber myeloischen und lymphatischen leukämischen Zellen gezeigt hat. Es wirkt dabei als Modulator auf den Metabolismus anderer Nukleoside, wenn diese durch die Deoxycytidinkinase phosphoryliert werden. Analysiert wurden unterschiedliche Inkubationsbedingungen (simultane und sequentielle Inkubation) an zwei myeloischen (Hel, HL 60) und an zwei lymphatischen (JURKAT, HUT 78) Zellinien. Der Einfluss von dFdC auf den intrazellulären Metabolismus des 2-CdA wurde mit Hilfe der HPLC untersucht. Es wurde beobachtet, daß eine simultane Applikation beider Substanzen zu einer antagonistischen Wirkung führte, während eine konsekutive Gabe einen synergistischen Effekt bewirkte, unabhängig von der Inkubationsdauer und dem Ursprung der Zellen (myeloisch oder lymphatisch). Die gewonnenen Daten legen nahe, daß eine gleichzeitige Kombinationstherapie von Cladribin und Gemcitabin nicht zu einer Verbesserung der klinischen Effektivität führt. In vielen Standardregimes werden Purin- und Pyrimidinanaloga zur Verbesserung der klinischen Effektivität miteinander kombiniert. Untersucht wurde bisher nur der Metabolismus der Standardtherapieschemata. Das Ziel dieser Arbeit bestand nun darin die Effektivität auf die Induktion der Apoptose, auf die Zellproliferation, auf den Zusammenbruch der Mitochondrienmembranpotentials und auf die Expression apoptoserelevanter Proteine zu analysieren. Die Hemmung der Zellproliferation und die Induktion der Apoptose sind die Hauptmechanismen der Zytotoxizität der antineoplastisch wirksamen Agenzien.65 Daher wurde hier analysiert, ob Ara-C in Kombination mit Purinanaloga einen synergistischen oder antagonistischen Effekt auf die Zellproliferation und auf die Induktion der Apoptose in AML Zellinien (HL 60 und HEL) ausübt. Daneben wurden die Effekte der Kombination von Ara-C mit Bendamustin, einem neuen bifunktionellen Agenz mit alkylierender Aktivität und mit den Eigenschaften der Purinanaloga, geprüft. Die Ergebnisse zeigen, daß Ara-C kombiniert mit Fludarabin oder Bendamustin sowohl zu antagonistischen Effekten auf die Hemmung der Zellproliferation, auf die Induktion der Apoptose als auch auf die Ruptur der Mitochondrienmembran führen, unabhängig von einer simultanen oder konsekutiven Applikation (Purinanaloga vor Ara-C), im Gegensatz zur Kombination von Cytarabin mit Cladribin. Während der Induktion der IC 50 Levels der Apoptose, konnte weder bei den antagonistischen noch bei den synergistischen Zytostatikakombinationen ein spezifisches Expressionsmuster der Apoptose assoziierten Proteine, wie der pro- oder antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern, der Exekutionscaspasen, der IAPs, des proapoptotischen PAR-4, PARP oder p53, beobachtet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, daß die Effektivität der Medikamentenkombinationen Ara-C plus Purinanaloga abhängig ist von dem gewählten Purinanalogon, wohingegen die Inkubationsbedingungen (gleichzeitig oder sequentiell) oder die Dosiseskalation keine Rolle spielen.
Das Prostate-apoptosis-response-gene-4 (Par-4) sensibilisiert neoplastische Lymphozy-ten, deren Malignität durch eine Hemmung der Apoptosefähigkeit gekennnzeichnet ist, für apoptotische Stimuli. Vorhergehende Studien konnten zeigen, daß eine Überexpres-sion von Par-4 bei der Apoptoseinduktion durch Chemotherapeutika zu einer Downregulation von Bcl-2, einer Aktivierung von Caspase-3, einem verstärkten Abfall des Mi-tochondrialen Membranpotentials (MMP), sowie einer verstärkten PARP-Spaltung und dadurch zum programmierten Zelltod führt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere molekulare Mechanismen aufgezeigt werden, über die die apoptosesensibilisierende Wirkung von Par-4 vermittelt wird. Es konnte gezeigt werden, daß bei Behandlung mit Doxorubicin die Par 4 Überexpression außer zur stärkeren Aktivierung von Caspase-3 auch zur stärkeren Aktivierung von Caspase-8 und -9 führt. Außerdem kann eine Caspase 3 Inhibition bei Par-4 Überexpression durch eine alternative Aktivierung der Caspasen-6,-7,-8 und -9 umgangen werden. Dieses veränderte Caspasenaktivitätsmuster läßt sich mit einer Downregulation von Mitgliedern der Inhibitors of Apoptosis Proteins (IAPs) erklären. So konnte gezeigt werden, daß es bei Apoptoseinduktion unter Überexpression von Par-4 zur Downregulation von XIAP, cIAP1 und Survivin kommt. Diese Downregulation bleibt auch unter Caspase-3 Inhibition, sowie von XIAP und Survivin sogar unter allgemeiner Caspaseninhibition bestehen, das heißt sie ist nicht Caspase-3-, bzw. überhaupt nicht Caspasen-vermittelt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß es bei Überexpression von Par-4 unter Apoptoseinduktion mit Doxorubicin außer zum Abfall des MMPs auch zur verstärkten Ausschüttung von Cytochrom c und des Apoptosis In-ducing Factors (AIF) ins Cytosol kommt. Cytochrom c führt im Cytosol unter Bildung des Apoptosoms zur Aktivierung von Caspase-9, einem weiteren Mechanismus, der zur verstärkten Caspasenaktivität unter Par-4 Überexpression beiträgt. Die vermehrte Ausschüttung von Cytochrom c ist bedingt durch eine Translokation von tBid an die Mito-chondrienmembran. So ergaben die Untersuchungen, daß eine Par 4 Überexpression in neoplastischen T-Lymphozyten bei Behandlung mit Doxorubicin zur stärkeren Spaltung von Bid, einem Mitglied der proapoptotischen Bcl-2 Familie, sowie zur stärkeren Translokation des Bid Spaltproduktes (tBid) an die Mitochondrienmembran führt. Mit Hilfe der Immunfluoreszens konnte dargestellt werden, daß Bid in Par-4 überexprimierenden Zellen ein verändertes Verteilungsmuster im Cytosol aufweist und auf einen apoptotischen Reiz hin, verglichen mit den Par-4-negativen Zellen, vermehrt an die Mitochondrienmembran transloziert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß Bak und Bad, zwei weitere proapoptotische Mitgliederr der Bcl-2 Familie, durch Par 4 Überexpression Caspasen unabhängig verstärkt aktiviert werden. Bak wird durch das Bid-Spaltprodukt tBid aktiviert und führt ebenfalls zu einer verstärkten Cytochrom c Freisetzung ins Cytosol, wohingegen Bad seine proapoptotische Wirkung durch Bindung an antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie entfaltet. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, daß die Par-4 Überexpression in neoplastischen Lymphozyten bei Behandlung mit Doxorubicin zu einer Downregulation von Ras, welches zu den GTPasen zählt, führt. Diese Downregulation ist Caspasen-, jedoch nicht Caspase-3-abhängig. Hierbei besteht kein Zusammenhang zwischen der Expression von Ras und dem Tumorsupressorgen P53. Das heißt Par-4 entfaltet seine proapoptotische Wirkung über einen P53-unabhängigen Weg. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, daß Par 4 Überexpression in neoplastischen Lymphozyten zu einer verstärkten Sensibilität des Fas-Rezeptors führt, das heißt, es konnte bewiesen werden, daß der pro-apoptotische Effekt von Par 4 sowohl durch Chemotherapeutika, als auch über direkte Rezeptorstimulation ausgelöst werden kann. Insgesamt legt diese Arbeit die wesentlichen molekularen Mechanismen der pro-apoptotischen Wirkung von Par-4 in neoplastischen Lymphozyten dar.