Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (11)
Language
- German (11)
Has Fulltext
- yes (11)
Is part of the Bibliography
- no (11)
Keywords
- Komplementsystem (2)
- Antibiotika (1)
- Antibiotikaresistenz (1)
- Borrelia (1)
- Borrelien (1)
- Carbapenemase (1)
- HIV (1)
- Hodgkin-Lymphom (1)
- NDM (1)
Institute
- Medizin (8)
- Biowissenschaften (3)
Die Lyme-Borreliose stellt in Deutschland mit ca. 60.000 Neuinfektionen pro Jahr die am häufigsten durch Zecken übertragene Zoonose beim Menschen dar. Obwohl adäquat antibiotisch therapiert, konnte in wenigen Fällen bei Patienten mit Erythema migrans eine persistierende Borrelieninfektion nachgewiesen werden. Die zugrunde liegenden Mechanismen einer möglichen Antibiotikaresistenz sind jedoch nur unzureichend untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde daher der Frage nachgegangen, ob und wie B. burgdorferi der inhibitorischen Wirkung von Antibiotika entgehen. Basierend auf einer vergleichenden Proteomanalyse von antibiotisch behandelten und unbehandelten Borrelienzellen, sollten Unterschiede in den Proteinsignaturen einzelner Moleküle, als Ausdruck einer koordinierten Abwehrreaktion aufgezeigt werden. Die unter subinhibitorischen Antibiotikakonzentrationen inkubierten Borrelienzellen wiesen mikroskopisch keine morphologischen Veränderungen auf. Gleichermaßen konnten keine signifikanten Unterschiede in der Proteinexpression nachgewiesen werden. Sichtbare, strukturelle Veränderungen liessen sich erst in Gegenwart von 0,5mg/l bis 1mg/l Penicillin bzw. Doxycyclin nachweisen, was der MHK beider Antibiotika entsprach. Die unter identischen Bedingungen durchgeführte Proteomanalyse ergab eine deutliche Veränderung bei 14 Proteinen der mit Penicillin-behandelten Borrelienzellen und 5 Proteinen der mit Doxycyclin-behandelten Borrelienzellen. Mit Ausnahme eines einzelnen Proteins waren alle anderen Moleküle durch eine signifikante Repression gekennzeichnet. Interessanterweise wurde die Expression bei drei Proteinen sowohl von Penicillin als auch von Doxycyclin beeinflusst. Mittels massenspektrometrischer Analyse (MALDI-TOF-MS) konnten insgesamt 9 zytoplasmatische Proteine und ein membranständiges, porenbildendes Protein (p66) eindeutig identifiziert werden. Von den im Zytoplasma lokalisierten Proteinen besitzen vier Proteine als Isomerasen, Transferasen, bzw. Kinasen enzymatische Aktivität und ein Protein (FtsZ) ist bei der Zellteilung beteiligt. Die Ergebnisse dieser Studie lassen vermuten, dass Borrelien auf Penicillin und Doxycyclin mit einem koordinierten Regulations- bzw. Abwehrmechanismus reagieren, der in unterschiedliche Stoffwechselprozesse eingreift. Inwieweit dieser Antibiotika-induzierte Prozess als Stressantwort zu deuten ist oder Teil eines Resistenzmechanismus darstellt, sollte Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
Die Bedeutung verschiedener CRASP-Proteine für die Komplementresistenz von Borrelia burgdorferi s.s.
(2010)
Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des molekularen Mechanismus der Immunevasion von B. burgdorferi s.s., insbesondere der Bedeutung einzelner CRASP-Proteine für die Komplementresistenz. Sie trägt dazu bei, die Relevanz dieser Proteine für die Pathogenese dieses Erregers zu untermauern. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, verschiedene Vektoren mit den ursprünglichen oder mutierten CRASP-kodierenden Genen cspA, cspZ, erpP und erpA aus B. burgdorferi s.s. zu generieren und diese in das CRASP-negative Isolat B. garinii G1 zu transformieren. Die Expression der speziesfremden Gene als auch der Transport der CRASP-Moleküle auf die Zelloberfläche von B. garinii G1 konnten nachgewiesen werden. Für die konstitutiv CRASP-1- oder CRASP-2-produzierenden Borrelienzellen konnte gezeigt werden, dass diese, auf der Zelloberfläche lokalisierten CRASP-Moleküle mit Faktor H und FHL-1 interagieren, die gebundenen Komplementregulatoren ihre funktionelle Aktivität zur C3b-Inaktivierung aufrechterhalten und die Zellen in Gegenwart von Komplement überleben. Damit wurde erstmals der Nachweis erbracht, dass beide CRASP-Moleküle unabhängig voneinander Schutz vor komplementvermittelter Lyse verleihen. Untersuchungen mit den veränderten CRASP-1-Molekülen ergaben, dass die Transformante G1/pCRASP-1 E147K eine verringerte Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, welche sich jedoch nicht auf die Komplementresistenz der Zellen auswirkte. Im Gegensatz dazu führte eine Aminosäuresubstitution im C-Terminus des CRASP-1-Moleküls an Position 240 zum Verlust der Bindung von Faktor H und einer stark verminderten Bindung von FHL-1, so dass auch keine Kofaktoraktivität nachgewiesen werden konnte. Trotz des Bindungsverlustes beider Komplementregulatoren zeigte die Transformante G1/pCRASP-1 Y240A nur geringe Ablagerungen des lytischen, terminalen Komplementkomplexes (TCC) auf der Zelloberfläche und Wachstum in Gegenwart von aktiven Komplement. Mittels eines Hämolyse-Assays wurde schließlich festgestellt, dass CRASP-1 direkt mit Komponenten des Komplementsystems interagiert und dadurch die Assemblierung des TCC verhindert. Die Bedeutung der Aminosäuren an den Positionen 81, 139, 207 und 211 im CRASP-2-Molekül für die Faktor H / FHL-1-Bindung und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Komplementresistenz der Borrelien wurde gleichfalls nachgewiesen. Dabei wies insbesondere die Transformante G1/pCRASP-2 Y211A ein inhibiertes Wachstum in Humanserum und verstärkt Komplementablagerungen auf der Zelloberfläche auf, was auf den Verlust bzw. der sehr schwachen Bindung von FHL-1 und Faktor H zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu den Transformanten, welche ein CRASP-2-Molekül mit nur einem Aminosäureaustausch produzierten, zeigten die Transformanten, deren CRASP-2-Molekül zwei Aminosäuresubstitutionen aufwies (G1/pCRASP-2 R139A-Y207A, G1/pCRASP-2 R139A-Y211A, G1/pCRASP-2 Y207A-Y211A) keine Bindung der beiden Regulatorproteine und keinen Schutz der Zellen vor der lytischen Wirkung von Komplement. Neue, unerwartete Erkenntnisse ergaben sich aus den Untersuchungen mit Borrelienzellen, welche das CRASP-3- oder CRASP-5-kodierende erpP- bzw. erpA-Gen enthielten. Obwohl gereinigtes als auch denaturiertes CRASP-3 und RASP-5 in der Lage war, Faktor H zu binden, wiesen die vitalen Zellen der Transformanten G1/pCRASP-3 und G1/pCRASP-5 keine Bindung von Faktor H und keinen Schutz der Zellen vor komplementvermittelter Lyse auf. Aus den durchgeführten Untersuchungen konnten für gereinigtes CRASP-3 und CRASP-5 als auch für die CRASP-3- und CRASP-5-produzierenden Transformanten neue Liganden, nämlich CFHR-2 und CFHR-5, aus Humanserum identifiziert werden. Zusammenfassend lassen sich folgende Aussagen hinsichtlich des molekularen Mechanismus der Komplementresistenz bei B. burgdorferi s.s. aus den erhobenen Daten dieser Arbeit mit transformierten Borrelienzellen formulieren: *Die Komplementresistenz der Borrelien wird durch die Faktor H- und FHL-1-bindenden Proteine CRASP-1 und CRASP-2, jedoch nicht durch CRASP-3 und CRASP-5 determiniert, *CRASP-1 als multifunktionelles Protein ist zusätzlich in der Lage, direkt mit Komplement zu interagieren, *Die C-terminalen Domänen von CRASP-1 und CRASP-2 sind für die Bindung der beiden Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 relevant, *CRASP-3 und CRASP-5 auf der Borrelienoberfläche lokalisiert, interagieren mit CFHR-1, CFHR-2 und CFHR-5, aber nicht mit Faktor H.
Borrelia lusitaniae, eine vorwiegend im Mittelmeerraum/ Südwesteuropa vorkommende Borrelienspezies des B. burgdorferi s.l.-Komplexes, wird derzeit als eine potentiell humanpathogene Genospezies diskutiert. Für vergleichende Studien stehen derzeit vorwiegend Zeckenisolate und nur zwei Patientenisolate zur Verfügung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 16 Isolate, darunter ein Patientenisolat aus verschiedenen Regionen Portugals und Süddeutschlands im Bezug auf ihre Serumempfindlichkeit/-resistenz gegenüber humanem Serum und der Fähigkeit Komplementregulatoren aus Serum zu binden, untersucht. Anhand der erhaltenen Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass B. lusitaniae, mit Ausnahme des Stammes IP-N1, als serumsensible Genospezies klassifiziert werden kann. Alle Isolate aktivierten die Komplementkaskade hauptsächlich über den alternativen Weg wobei massiv Komplementkomponenten auf der Zelloberfläche deponiert wurden. Die effiziente Aktivierung und Ablagerung des terminalen Komplementkomplexes führte zur vermehrten Ausbildung sogenannter Blebs, Ausstülpungen der äußeren Membran, was auf eine effiziente Lyse der Borrelienzellen hinwies. Obwohl serumsensibel, waren alle Isolate in der Lage, den löslichen Komplementregulator des alternativen Weges, Faktor H aus dem Serum zu binden. Allerdings konnte nur bei 4 der 16 untersuchten Isolate eine schwache komplementregulatorische Aktivität von zellgebundenem Faktor H durch den Nachweis spezifischer C3b-Spaltprodukte bestätigt werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Faktor H in seiner Eigenschaft als Komplementregulator inhibiert ist. Durch weiterführende Analysen konnte ein Faktor H-bindendes Protein von 16 kD bei B. lusitaniae MT-M8 identifiziert und charakterisiert werden. Dieses als BlCRASP-3 bezeichnete Protein war in der Lage, Faktor H über dessen C-terminale SCR-Domänen 19-20 zu binden. Im Vergleich zu anderen mit Faktor H interagierenden Proteinen war die Bindung sehr schwach und erreichte nur ca. 16% der Bindungsstärke von BbCRASP-3, was eine nicht nachweisbare Kofaktoraktivität von an BlCRASP-3 gebundenem Faktor H erklären könnte. Sequenzanalysen und Untersuchungen mit verschiedenen Proteasen identifizierten BlCRASP-3 als ein auf der Oberfläche von B. lusitaniae lokalisiertes Lipoprotein, welches eindeutig zur heterologen Erp-Proteinfamilie gehört. Interessanterweise ist bei BlCRASP-3 jener Bereich am C-Terminus konserviert, der als Faktor H-Bindungsstelle erachtet wird. Die nicht konservierten Austausche einzelner Aminosäuren innerhalb der vermuteten Bindungsregion und das Fehlen höher geordneter Strukturen, wie z.B. coiled-coils, könnten die stark reduzierte Bindungskapazität von Faktor H an BlCRASP-3 erklären. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die schwache Bindung von Faktor H und die Inhibition der komplementregulatorischen Aktivität von Faktor H, als Ursachen für den fehlenden Schutz vor der durch Komplement vermittelten Lyse angenommen werden kann, wodurch die untersuchten B. lusitaniae-Isolate einen serumsensiblen Phänotyp aufweisen. Des Weiteren konnten bei allen untersuchten B. lusitaniae Isolaten erp-homologe Gensequenzen auf Plasmiden unterschiedlicher Größe nachgewiesen werden. Manche Isolate wiesen multiple erp-Loci auf. Durch PCR konnten erp-homologe Gensequenzen amplifiziert werden, die für ErpL/ErpY-orthologe Proteine kodieren und nicht mit Faktor H interagieren. Welche Funktion diese Proteine für Borrelien besitzen bleibt weiterhin ungeklärt. Es ist denkbar, dass diese Proteine bei der Erregerpersistenz oder dem Immunescape in der Eidechse als natürlichem Wirt eine wichtigen Rolle spielen oder Borrelien ermöglichen, sich an andere Reservoirwirte anzupassen.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Interaktion von A. baumannii mit humanem Plasminogen untersucht. Mit dem Translations-Elongationsfaktor TufAb, dem äußeren Membranprotein OmpW sowie dem Lipoprotein p41 konnten insgesamt drei Plasminogen-bindende Proteine von A. baumannii identifiziert werden. Außerdem wurde ein grundlegender Beitrag zur funktionellen Charakterisierung von TufAb sowie p41 von A. baumannii erbracht.
Es konnte nachgewiesen werden, dass gereinigtes TufAb humanes Plasminogen bindet und diese Interaktion teilweise durch Lysin-Reste vermittelt und von der Ionenstärke beeinflusst ist. An TufAb-gebundenes Plasminogen war für den Plasminogen-Aktivator u-PA zugänglich und konnte zu Plasmin aktiviert werden, welches das chromogene Substrat S-2251, das physiologische Substrat Fibrinogen und die zentrale Komplementkomponente C3b proteolytisch spaltete. Schließlich konnte TufAb als „Moonlighting“-Protein auf der Zelloberfläche von A. baumannii identifiziert werden.
Für das Lipoprotein p41 konnte ebenfalls gezeigt werden, dass dieses an Plasminogen bindet. Die Bindung von Plasminogen an p41 erfolgte ebenfalls über Lysin-Reste, zeigte sich allerdings von der Ionenstärke unbeeinflusst. Im Fall von p41 konnte mit Hilfe von C-terminal verkürzten p41-Konstrukten gezeigt werden, dass C-terminale Lysin-Reste an der Bindung von Plasminogen beteiligt sind. Weitere Versuche mit p41-Proteinen, bei welchen vier C-terminale Lysin-Reste durch Alanin-Reste substituiert wurden, ergaben, dass die beiden Lysin-Reste K368 und K369 essentiell für die Bindung von Plasminogen an p41 sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass sowohl Kringle-Domäne 1 als auch Kringle-Domäne 4 von Plasminogen bei der Interaktion mit p41 involviert sind. An p41 gebundenes Plasminogen ließ sich durch u-PA zu Plasmin aktivieren, welches Fibrinogen sowie die zentrale Komplementkomponente C3b degradierte. p41 ist außerdem in der Lage, die Komplementkomponenten C3, C3b und C5 zu binden und den alternativen Weg zu inhibieren. Zudem ergaben Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit erste Hinweise darauf, dass zumindest die Plasminogen-bindende Region auf der Zelloberfläche von A. baumannii lokalisiert ist.
Die Inaktivierung des p41-kodierenden Gens führte zu einer signifikanten Abnahme im Überleben von A. baumannii-Zellen in der Gegenwart von NHS. Zudem zeigte die Mutante Δp41 einen Defekt in der Plasmin-abhängigen Transmigration durch einen Endothelzell-Monolayer. Beide Versuche untermauern die physiologische Relevanz für die Interaktion von A. baumannii mit Plasminogen.
Untersuchungen zu molekularer Expressionsregulation und biologischer
Funktion von Interleukin-22
(2011)
IL-22 wird hauptsächlich von aktivierten Leukozyten produziert, wirkt aber ausschließlich auf nicht-leukozytäre Zellen vor allem epithelialen Ursprungs. Die Funktionen des Zytokins sind strikt kontextabhängig. Einerseits aktiviert es bei infektionsgetriebenen Entzündungen die angeborene Immunität und wirkt gewebeprotektiv, andererseits weist IL-22 im Rahmen von Autoimmunerkrankungen pathogenes Potenzial auf, was vor allem auf die proliferationsfördernde Aktivität des Zytokins zurückzuführen ist. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Regulation der humanen IL-22 Expression auf molekularer Ebene charakterisiert. Insbesondere die Regulation des humanen IL-22 Promotors ist bislang nicht untersucht. Darüber hinaus wurden einige biologische Eigenschaften des Zytokins näher beleuchtet. Durch Untersuchungen an der gut charakterisierten humanen T-Zelllinie Jurkat sowie durch ergänzende Versuche an humanen Primärzellen (PBMC, CD3+ T-Zellen) konnte eine relevante Funktion der Transkriptionsfaktoren NF-ATc2 und CREB sowie des IKK/NF-ΚB Signalweges bei der Regulation der IL-22 Expression nachgewiesen werden. Sowohl für NF-ATc2 als auch für den IKK-Komplex konnte dabei CsA Sensitivität gezeigt werden. CsA wird, wenn nötig, in der Therapie schwerer Verlaufsformen der Psoriasis eingesetzt und bewirkt in den Patienten unter anderem eine Reduktion der im Rahmen der Erkrankung beobachteten IL-22 Expression. Die hier vorgestellten Ergebnisse belegen erstmals eine direkte Rolle von CsA in der Reduktion der IL-22 Produktion bei immunmodulatorischer Therapie. Darüber hinaus konnte ich am Beispiel von B. burgdorferi zeigen, dass PBMC unter dem Einfluss extrazellulärer Bakterien Mediatoren freisetzen, welche die Aktivierung des IL-22 Promotors in benachbarten T-Zellen initiieren können. Dies passt zu Befunden, die belegen, dass PBMC nach Aktivierung durch B. burgdorferi eine rapide IL-22 Sekretion zeigen. Interessanterweise wird IL-17 in der frühen Phase der Aktivierung von PBMC durch B. burgdorferi nicht synthetisiert. Damit ergeben sich neue Einblicke in die Pathogenese der Spirochäteninfektion. So könnte IL-22 einen wichtigen Beitrag zum Schutz vor der borrelienassoziierten Lyme Borreliose leisten und die mangelhafte Immunabwehr, verursacht durch das Fehlen von IL-17, kompensieren. Außerdem konnte ich in der hier vorgelegten Arbeit belegen, dass Leberzirrhosepatienten signifikant erhöhte IL-22 Serumspiegel aufweisen. Da auch in Biopsien zirrhotischer Lebern IL-22 immunhistochemisch, vor allem in nicht-parenchymalen Zellen nachweisbar war, scheint die Leber der Syntheseort des im Serum detektierbaren Zytokins zu sein. Interessanterweise korrelierte IL-22 nicht nur mit der Mortalitätsrate bei Leberzirrhose, sondern auch mit der Krankheitsaktivität der betreffenden Patienten. Ein weiterer zu untersuchender Aspekt der hier vorgelegten Arbeit war die Identifizierung neuer IL-22 induzierbarer Gene. Dies geschah unter Verwendung der IL-22 responsiven, gut carakterisierten Kolonkarzinomzelllinien DLD-1 und Caco-2. Eine genomweite Expressionsstudie führte dabei zur Identifikation neuer IL-22 induzierbarer Gene, unter denen sich insbesondere CEACAM5 und NNMT befanden. Beide Proteine spielen eine Rolle in der Karzinogenese und könnten als bisher unbekannte Bindeglieder zwischen IL-22 und der Entstehung und Metastasierung maligner Entartungen fungieren. Darüber hinaus könnte sich durch NNMT, ein Enzym, das vornehmlich in der Leber exprimiert wird, eine Verbindung zur Rolle von IL-22 bei Leberzirrhose ergeben. Zusammengefasst eröffnen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht nur neue Einblicke in die Biologie von IL-22, sondern auch potenzielle Ansätze zur Therapie diverser Erkrankungen. So ist denkbar, in der Behandlung IL-22 getriebener Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Psoriasis, auf die von starken Nebenwirkungen begleitete Verabreichung von CsA zu verzichten und stattdessen, beispielsweise durch Inhibierung des IKK-Komplexes, regulatorisch auf IL-22 einzuwirken. Neben einer möglichen Beteiligung von CEACAM5 und NNMT an IL-22/STAT3 vermittelter Karzinogenese, implizieren die hier vorgestellten Ergebnisse eine Funktion des Zytokins bei Borrelieninfektion und Leberzirrhose, wobei die genauen Aufgaben von IL-22 im Rahmen dieser Krankheitsbilder bislang unbekannt sind. Weitere Untersuchungen müssen klären, ob eine Modulation der IL-22 Spiegel für die Therapie der jeweiligen Erkrankungen in Frage kommen könnte. Zumindest bei Leberzirrhose könnte die IL-22 Serumkonzentration aufgrund der hier vorgelegten Ergebnisse allerdings jetzt schon als neuer prognostischer Marker herangezogen werden.
Die Bindung von regulatorischen Proteinen an die Zelloberfläche ist eine wirkungsvolle Strategie, die sich humanpathogene Bakterien, insbesondere B. burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose, zu eigen gemacht haben, um der bakteriolytischen Wirkung von Komplement zu entgehen. Die Grundlage der Serumresistenz bei B. burgdorferi besteht vornehmlich in der Interaktion der Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 mit fünf verschiedenen Borrelienproteinen, die als Complement Regulator-Acquiring Surface Proteins bezeichnet werden. Bei der Genospezies B. burgdorferi s.s. nimmt das BbCRASP-2 Protein aufgrund seines spezifischen Bindungsverhaltens gegenüber Faktor H und FHL-1 eine Sonderstellung ein. In früheren Untersuchungen konnten vier potenzielle Bindungsregionen von Faktor H und FHL-1 im BbCRASP-2 Protein lokalisiert werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der detaillierten Charakterisierung der an der Bindung mit Faktor H und FHL-1 beteiligten Aminosäuren von BbCRASP-2 innerhalb der putativen Bindungsregionen 2, 3 und 4 sowie in einer Region, die eine coiled-coil Struktur aufweist. Dazu wurden selektiv Aminosäuren mittels gerichteter Mutagenese durch die neutrale Aminosäure Alanin ausgetauscht und das Bindungsverhalten der mutierten BbCRASP-2 Proteine untersucht. Mittels Ligandenaffinitätsblot-Analyse und ELISA konnten insgesamt 17 Aminosäuren – geladen, neutral polar, neutral unpolar - identifiziert werden, die nach Mutagenese eine erniedrigte Bindungskapazität oder keine Bindung gegenüber Faktor H und FHL-1 in mindestens einem der beiden Testmethoden aufwiesen. Von diesen Mutanten zeigen 6 Proteine (BbCRASP-2S72A, BbCRASP-2D84A, BbCRASP-2F91A, BbCRASP-2R139A, BbCRASP-2Y207A, BbCRASP-2Y211A) in beiden Testsystemen ein deutlich verändertes Bindungsverhalten. 12 weitere BbCRASP-2 Mutanten fielen im ELISA durch ihre reduzierte Bindungskapazität auf, verhielten sich jedoch im Ligandenaffinitätsblot im Vergleich zu BbCRASP-2 in ihrer Bindungseigenschaft unverändert. Die für die Faktor H/FHL-1 Bindung relevanten Aminosäuren verteilten sich in allen der drei untersuchten Bindungsregionen, wobei Austausche in der C-terminal gelegenen Region 4 den größten Effekt auf die Bindung zeigten. Dies deutet darauf hin, dass dem C-Terminus eine essentielle Rolle bei der Interaktion zugeordnet werden kann. In Bezug auf die Ladungseigenschaften der identifizierten Aminosäuren ergab sich ebenfalls ein sehr heterogenes Bild. Da sowohl geladene als auch polare und unpolare Aminosäuren an der Bindung von Faktor H und FHL-1 partizipieren, ist davon auszugehen, dass gleichermaßen elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Bindung beteiligt sind. Zusätzlich konnte in der putativen coiled-coil Region eine Aminosäure (Phe91) identifiziert werden, die direkt oder indirekt an der Bindung von BbCRASP-2 und Faktor H/FHL-1 beteiligt ist. Für die Hypothese einer an der Interaktion beteiligten coiled-coil Struktur spricht, dass Aminosäuresubstitutionen an drei weiteren Positionen (Leu-94, Ile-98 und Tyr-101) eine reduzierte Bindung bewirkten. Die räumlich weit auseinander liegenden Positionen der als bindungsrelevant identifizierten Aminosäuren deuten darauf hin, dass sich der Bindungsmechanismus von BbCRASP-2 an Faktor H und FHL-1 komplexer darstellt, als zunächst vermutet. Es ist ferner zu erwarten, dass noch weitere Aminosäuren außerhalb der putativen Bindungsregionen die Interaktion von BbCRASP-2 mit den Regulatorproteine beeinflussen, da in dieser Studie gezeigt werden konnte, dass die Substitution von Phenylalanin an Position 91 einen deutlichen Einfluss auf die Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, obwohl sie außerhalb der ermittelten Bindungsregionen lokalisiert ist. Mit großer Wahrscheinlichkeit stellt die genaue Topologie des BbCRASP-2 Proteins ebenfalls einen entscheidenden Faktor für die Bindung dar. Deshalb sollte mit Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des BbCRASP-2 Moleküls eine genauere Beschreibung des molekularen Bindungsmechanismus möglich sein. Die vorliegenden Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Serumresistenz von B. burgdorferi tragen wesentlich zum Verständnis der komplexen Interaktion zwischen BbCRASP-2 mit Faktor H und FHL-1, den beiden Komplementregulatoren des alternativen Weges bei. Diese Erkenntnisse könnten langfristig gesehen für die Entwicklung eines Impfstoffs genutzt werden.
Durch die weltweite Verbreitung von bakteriellen Resistenzgenen wie der Carbapenemase New-Delhi-Metallo-β-Laktamase (NDM), die nahezu alle Beta-Laktamantibiotika spalten kann, und die langwierige Entwicklung neuer Antibiotika, hat die Erforschung von Resistenzdeterminanten eine hohe Priorität. In der vorliegenden Arbeit wurde die neu entdeckte Variante NDM 16b unter epidemiologischen Gesichtspunkten, mit einem in vivo Infektionsmodell sowie die Interaktion von NDM-Varianten mit dem menschlichen Komplementsystem untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit erfolgte eine epidemiologische Datenerhebung für 60 blaNDM tragende Patientenisolate des Zeitraums 2007 - 2017 auf Basis klinikinterner Datenbanken zu multiresistenten Erregern und zudem eine quantitative Empfindlichkeitstestung für 13 (Reserve-)Antibiotika. Es fiel eine kontinuierliche Zunahme an NDM-Isolaten und insbesondere von NDM-Varianten mit der Punktmutation M154L auf, da diese Mutation eine erhöhte Hydrolaseaktivität vermittelt. Deutlich erkennbar war eine Korrelation der M154L-Varianten und E. coli. Im Resistenzprofil der blaNDM-positiven Isolate zeigten sich hohe Resistenzraten (> 94%) gegen alle Beta-Laktam-Antibiotika und Fluorchinolone. Fosfomycin und Colistin waren in über 75% der Fälle noch wirksam.
Im zweiten Teil wurden Infektionsversuche mit dem Modellorganismus Galleria mellonella (Larve der großen Wachsmotte) durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die NDM-Produktion der injizierten Erreger keinen Einfluss auf die Pathogenität hatte. Zudem konnte in Therapieversuchen mit Imipenem im lebenden Organismus gezeigt werden, dass über die bakterielle NDM-Produktion die Resistenz gegen Imipenem vermittelt wird.
Im dritten Teil der Arbeit wurden die NDM-Varianten NDM 1Δ28, NDM 4Δ28 und NDM 16bΔ28 hinsichtlich ihres inhibitorischen Potentials auf Komplement untersucht. Mit den erzielten Ergebnissen der funktionellen Tests konnte für den klassischen und den Lektinweg eine signifikante Hemmung durch alle drei NDM Varianten nachgewiesen werden. Ein direkter Vergleich der einzelnen NDM-Varianten ergab, dass NDM 1Δ28 die stärkste und NDM 16bΔ28 die schwächste Inhibition auf den klassischen Komplementweg ausübte. Bindungsanalysen mit einzelnen Komplementkomponenten (C3, C3b, C3c, C4 und C4b) ließen auf eine Interaktion von NDM 1Δ28 mit C4b schließen.
Zusammenfassend leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Fortführung epidemiologischer Untersuchungen von NDM Varianten und erbringt den in vivo Nachweis für Resistenzvermittlung durch NDM. Weiterhin wurde gezeigt, dass NDM neben der Carbapenemasefunktion auch eine immunmodulierende Wirkung erfüllt, indem der klassische und Lektinweg des Komplementsystems gehemmt wird. Damit liegt die Vermutung nahe, dass die globale Ausbreitung von NDM-produzierenden Erregern nicht nur durch die Vermittlung der Antibiotikaresistenz, sondern auch durch eine Immunevasion bedingt ist. Zukünftig könnte somit die Erforschung des Mechanismus der Immunevasion ebenso interessant sein wie die Suche nach wirksamen Inhibitoren der NDM.
Da HRS-Zellen im cHL nur eine Minderheit und CD4+ T-Zellen die Mehrheit im Begleitinfiltrat ausmachen, wurde innerhalb der vorliegenden Dissertation das Begleitinfiltrat und der Tumorzellgehalt von 24 HIV-assoziierten cHL-Fällen mit 15 HIV-negativen cHL-Fällen immunhistochemisch verglichen. Das reaktive Begleitinfiltrat im HIV-assoziierten cHL zeigte eine deutlich geringere Anzahl an CD4+ T-Zellen und einen höheren Gehalt an CD163+ Makrophagen als das HIV-negative cHL. Es konnte kein Unterschied in der Anzahl der CD30+ HRS-Zellen und S100+ dendritischen Zellen zwischen beiden Gruppen festgestellt werden. Mit Kokultur-Versuchen im Labor und darauf folgenden Zellausstrichen dieser Kokulturen konnte bestätigt werden, dass sich CD14+ Monozyten ebenso gut wie CD4+ T-Zellen als Rosetten um HRS-Zellen anordnen können. Im immunkomprimierten HIV-Patienten ersetzen die langlebigen CD163+ Makrophagen die CD4+ T-Zellen. Die Makrophagen werden vermutlich ebenso wie CD4+ T-Zellen mittels Zytokine/Chemokine (z. B. CCL5) zum Tumorgewebe rekrutiert, bilden Rosetten um die Tumorzellen und unterstützen diese in ihrer Proliferation.
Aufgrund der besonderen Zusammensetzung des Begleitinfiltrats sollte das HIV-assoziierte cHL von Pathologen als eigenständiger Subtyp des cHL betrachtet werden.
Des Weiteren wurde das Begleitinfiltrat der typisch knotigen NLPHL Typen A und C mit dem des diffusen NLPHL Typen E (THRLBCL-like NLPHL) und dem THRLBCL immunhistochemisch verglichen. Aufgrund histologischer und klinischer Ähnlichkeiten zwischen dem diffusen NLPHL und dem THRLBCL fällt eine Differenzierung dieser Entitäten schwer. Es konnte festgestellt werden, dass das Begleitinfiltrat im THRLBCL-like NLPHL dem Begleitinfiltrat im THRLBCL mehr ähnelt als dem typischen NLPHL und zwar in Bezug auf Makrophagengehalt und Anzahl der follikulären TFH-Zellen. Es konnten Rosetten im Begleitinfiltrat von THRLBCL nachgewiesen werden, obwohl Rosettenformationen um Tumorzellen im THRLBCL in der Literatur kein charakteristisches Merkmal darstellen. Es ist naheliegend, dass das THRLBCL-like NLPHL und das THRLBCL ein und dieselbe Krankheit ist und möglicherweise eine aggressivere Variante des NLPHL darstellt.
Im Anbetracht aller Ergebnisse kommt dem Immunstatus eines Patienten eine ausschlaggebende Rolle auf das Begleitinfiltrat im Tumorgewebe zu und dieser beeinflusst so auch den klinischen Verlauf der Lymphomerkrankung.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Vlp15/16 und GlpQ aus B. miyamotoi hinsichtlich ihrer Eigenschaft, mit Plasminogen zu interagieren, charakterisiert.
Da einige Fälle von ZNS-Beteiligungen bei B. miyamotoi-Infektionen berichtet wurden, ist anzunehmen, dass diese Borrelienspezies über molekulare Mechanismen zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke verfügt. Eine solche Strategie könnte die Bindung wirtseigener Proteasen wie z.B. Plasminogen sein, um Komponenten der extrazellulären Matrix zu degradieren und dadurch die Dissemination des Erregers zu erleichtern.
Während Vmps, zu welchen auch Vlp15/16 gehört, als membranständige Proteine durch Variation der antigenen Oberflächenmatrix zur Immunevasion des Erregers beitragen, ist GlpQ bei der Hydrolyse von Phospholipiden in den Zellstoffwechsel eingebunden. Trotz dieser unterschiedlichen Funktionen, die den beiden Proteinen zukommen, binden beide Moleküle Plasminogen. Die Eigenschaften dieser Interaktion wurden in dieser Arbeit im Detail untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass Vlp15/16 und GlpQ Plasminogen konzentrationsabhängig binden und die Dissoziationskonstanten (Vlp15/16:Kd = 354 nM ± 62 nM; GlpQ: Kd = 413 nM ± 72 nM) für beide Proteine im Bereich der Serumkonzentration von 2 µM liegen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass den beiden Proteinen unterschiedliche Mechanismen zugrunde liegen, Plasminogen zu binden. Während die erhobenen Daten für Vlp15/16 darauf hindeuten, dass Lysin-Reste essenziell für die Interaktion sind, scheinen bei GlpQ ionische Wechselwirkungen von Bedeutung zu sein.
Um die Beteiligung von C-terminal lokalisierten Lysin-Resten für die PlasminogenBindung von GlpQ nachzuweisen, wurden Varianten mit einzelnen Lysin-Substitutionen an zwei unterschiedlichen Positionen (333 und 334) sowie eine Variante mit einer Zweifach-Substitution (GlpQ-K333A-K334A) generiert. Die Bindungsanalysen ergaben, dass insbesondere der Lysin-Rest an Position 334 bei der Interaktion mit Plasminogen beteiligt ist.
Die funktionellen Analysen zeigten, dass das an Vlp15/16 beziehungsweise GlpQ gebundene Plasminogen zu Plasmin aktiviert werden konnte und darüber hinaus dazu in der Lage war, das physiologische Substrat Fibrinogen zu degradieren.
Abschließend wurde die Plasminogen-Bindung an nativen B. miyamotoi-Zellen mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie nachgewiesen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen Vlp15/16 und GlpQ als Plasminogen-bindende Proteine aus, mit deren Hilfe B. miyamotoi befähigt ist, Komponenten der extrazellulären Matrix zu degradieren und somit prinzipiell zur Dissemination des Erregers beizutragen.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Fragestellung, inwieweit ORF10 von B. recurrentis, dem Erreger des Läuserückfallfiebers, mit verschiedenen Komplementkomponenten interagieren kann.
Mit funktionellen Komplementtests konnte gezeigt werden, dass ORF10 den klassischen, den alternativen sowie den Lektin-Weg inhibiert, wobei sich die stärkste Inhibition gegenüber dem alternativen Weg manifestierte. Darüber hinaus ließ sich in einem Zell-basierten Hämolyse-Assay eine Inhibition des terminalen Komplementweges durch ORF10 nachweisen.
Die durchgeführten Bindungsanalysen mit verschiedenen Komplementkomponenten führten zu dem Ergebnis, dass ORF10 mit C1q, C1s, C3, C3b, C4b und C5 interagiert und diese Protein-Protein-Interaktion mit den Komplementkomponenten C1q, C3, C3b und C4b durch einen dosisabhängigen Verlauf charakterisiert ist. Eine Bindung von C1r, C2, C4, FB, FH sowie FI konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.
Auf Basis der modellierten Struktur von ORF10 wurden mithilfe der In-vitro-Mutagenese drei verschiedene Varianten generiert, die jedoch nicht affinitätschromatographisch aus E. coli-Zelllysaten isoliert werden konnten und deshalb nicht für weiterführende funktionelle Analysen zur Verfügung standen.
Die Ergebnisse der Serumbakterizidie-Tests mit einem „gain of function“-Borrelienstamm, welcher ORF10 heterolog produzieren sollte, ergaben, dass keine erhöhte Resistenz gegenüber Humanserum nachgewiesen werden konnte. Inwieweit ORF10 bei der intrinsischen Serumresistenz von B. recurrentis beteiligt ist, lässt sich abschließend nicht vollumfänglich erklären.
Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beinhaltet die funktionelle Analyse von fünf Oberflächenproteinen von B. recurrentis die die Fähigkeit besitzen, die Aktivierung von humanen Komplement zu inhibieren und Borrelien vor Bakteriolyse zu schützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei immunologische Testverfahren mit hoher Sensitivität sowie Spezifität entwickelt und mit zahlreichen Patientenseren evaluiert. Die entwickelten Tests könnten in Zukunft als zuverlässige Instrumente für eine gesicherte Diagnose von LRF eingesetzt werden.
Eine Sequenzanalyse führte zur Identifizierung eines neuen Proteinclusters, welches die fünf untersuchten Komplement-inhibierenden Proteine als „Cluster of Complement-targeting and Host-interacting Proteins“ oder „Chi-Gencluster“, zusammenfasst. Diese Oberflächenproteine wurden als ChiA, ChiB, ChiC, ChiD und ChiE bezeichnet. Weiterführende Sequenzanalysen ergaben, dass das Chi-Gencluster extrem hoch konserviert ist und sowohl in den ersten B. recurrentis-Isolaten aus den 1990er Jahren als auch in B. recurrentis-Stämmen nachgewiesen werden konnte, die 2015 aus Patienten isoliert wurden.
Durch funktionelle Analysen konnte gezeigt werden, dass alle fünf Chi-Proteine in der Lage sind den alternativen und terminalen Komplementweg zu inhibieren. Ebenfalls konnte für die Proteine ChiB, ChiD sowie ChiE nachgewiesen werden, dass die Interaktion mit der Komplementkomponente C5 dosisabhängig verläuft.
Die strukturelle Aufklärung des Proteins ChiB ermöglichte es Aminosäuren zu identifizieren, von denen angenommen wurde, dass sie für die Interaktion mit Komplement eine Rolle spielen könnten. Durch in vitro Mutagenese konnten insgesamt fünf verschiedene Varianten von ChiB generiert werden, die jedoch keine Veränderungen in ihrem Komplement-inhibierenden Potential gegenüber dem unveränderten ChiB-Protein aufwiesen. Weder in der Inhibition des alternativen oder des terminalen Komplementweges, noch in der Interaktion mit den untersuchten Komplementkomponenten C3b, C5 und C9.
Weiter konnte gezeigt werden, dass die lytische Aktivität von Humanserum durch Vorinkubation mit ChiB, ChiC, ChiD und ChiE drastisch reduziert werden konnte, sodass Serum-sensible Borrelienzellen in Gegenwart von Komplement überlebten. „Gain-of-function“ B. garinii-Transformanten, welche mit dem entsprechendem Chi-kodierenden Gen transformiert wurden, bestätigten die mit den gereinigten Proteinen erhobenen Ergebnisse.So konnte nachgewiesen werden, dass ChiB-, ChiC- oder ChiD-produzierende „Gain-of-function“ B. garinii Transformanten, nicht jedoch ChiE- produzierende Zellen, in der Lage waren einen Serum-resistenten Phänotypen auszubilden. Für Transformanten, die zwei-, drei- oder vier Chi-Proteine in verschiedenen Kombinationen gleichzeitig produzierten, konnte allerdings die Fähigkeit in Gegenwart von Humanserum zu überleben nicht bestätigt werden.
Molekulare Analysen mit verschiedenen RF-Borrelienstämmen führten zum Nachweis, dass die fünf Chi-kodierenden Gene bei allen Isolaten vorhanden sind und unter in vitro Bedingungen exprimiert werden. Im Gegensatz zu B. recurrentis PAbJ, ließ sich das HcpA kodierende Gen in B. duttonii LAI nicht nachweisen, jedoch alle dem Chi-Cluster zugehörigen Gene. Bei B. duttoni V fehlte das gesamte Chi-Cluster sowie die für CihC- und HcpA-kodierenden Gene. Durch eine Western Blot-Analyse konnte mit spezifischen Antikörpern bestätigt werden, dass die Proteine CihC, HcpA und ChiB in B. recurrentis A17 unter in vitro Bedingungen produziert wurden.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden durch die Analyse der IgM- und IgG-Immunreaktivitäten der LRF-Patientenseren zwei Proteine identifiziert, CihC und GlpQ, die als potenzielle Antigene für die Serodiagnostik des LRF evaluiert wurden. Eine initiale Evaluierung des IgM Lineblot-Immmunoassays zeigte jedoch nur eine geringe Sensitivität für die beiden Antigene, während der IgG Lineblot-Immunoassay eine sehr hohe Sensitivität aufwies. Der ELISA hingegen zeigte bei einer Kombination beider Antigene sehr gute Sensitivitäten und Spezifitäten. Um die starke Hintergrundfärbung bei den Lineblot-Immunoassays, welche eine korrekte Bewertung der Reaktivitäten gegenüber CihC erheblich erschwerten, zu minimieren, wurde ein „Epitop-Mapping“ durchgeführt, um immunogene Regionen innerhalb des CihC-Proteins zu lokalisieren. Eine zweite Evaluierung mit dem immunreaktiven N-terminalen CihC-Fragment CihC-N führte zu einer deutlichen Verbesserung der IgG Lineblot-Immunoassays mit einer Sensitivität von 100 % und einer starken Reduktion der Hintergrundfärbung. Zusätzlich konnte die Sensitivität der IgM-ELISA deutlich verbessert werden. Die Verwendung von CihC-N führte beim IgG-ELISA zur Herabsetzung des Cut-off-Wertes und zu einer besseren Unterscheidung zwischen den positiven LRF-Seren und den verwendeten Kontrollseren. Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit zwei serologische in vitro Diagnostika entwickelt werden, die als zuverlässige Point-of-Care-Diagnostik in klinischen Studien eingesetzt werden könnten. Zur Steigerung der Sensitivität des IgM-Lineblot-Immunoassays sollten allerdings weiterführende Untersuchungen mit weiteren immunreaktiven Antigenen, wie z.B. den Vmp-Proteinen von B. recurrentis, angestrebt werden.