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Cytochrome P450 enzymes are a large superfamily of membrane-bound heme-containing monooxygenases. They are essential for the oxidative metabolism of endogenous substrates such as steroids and fatty acids, and biotransformation of xenobiotic substrates such as pollutants and drugs. Although the highest expression of CYPs is found in the liver, their cardiovascular expression is not negligible with CYP450 subfamilies being responsible for the production of vasoactive lipids. Of importance, the enzymatic activity of all microsomal CYP450 isoenzymes is dependent on the cytochrome P450 reductase (POR), an electron donor.
In the first part of this work, the role of cytochrome P450 monooxygenases on the biotransformation of organic nitrates was investigated. Recombinant SupersomesTM were selected and incubated with NTG and PETN, where nitrite release was measured as a nitric oxide (NO) footprint. The capacity of the recombinant POR/CYP450 system to release nitrite from NO prodrugs was shown to be CYP-specific and dose-dependent. To study the involvement of CYP450 enzymes in the vascular biotransformation of organic nitrates in vivo, a smooth muscle-cell specific, inducible knockout model of POR (smcPOR-/-) was generated. Organ chamber experiments revealed that the vascular POR/CYP450 system had no impact on the dilator response of NTG and PETN. In line with previous publications, inhibition of ALDH2, known as the main enzyme responsible for the activation of NTG and PETN, and/or abolishment of the endogenous NO production did not reveal a contribution of the POR/CYP450 system to the dilator response of NTG and PETN. To better understand these results, we looked at the expression of the hepatic and vascular expression of the POR/CYP450 system where the hepatic was increased by 10- to 40-fold as shown by Western blot analysis. We concluded that due to insufficient vascular expression of CYP450 enzymes their contribution to the bioactivation of NTG and PETN is only minor.
The second part of this work focused on the cardiac relevance of endothelial isoenzymes. For that purpose, an endothelial cell-specific, tamoxifen-inducible knockout model of POR was generated and characterized in the present study. RNA-sequencing of the heart of healthy mice revealed that the CYP450 expression is cell-specific with cardiac endothelial cells (ECs) exhibiting an enrichment in the expression of the Cyp4 family (ω-oxidation of fatty acids) and of the Cyp2 family (production of EETs). Under non-stredded conditions (i.e. 30 days after inducing the knockout by tamoxifen feeding), endothelial deletion of POR was associated with cardiac remodelling as observed by an increase in the ratio of heart weight to body weight and an increase in the cardiomyocyte area. RNA-sequencing of cardiac ECs suggested that loss of POR might alter ribosomal biogenesis and protein synthesis, which could potentially affect the cardiac contractility in ecPOR-/- mice. Metabolomics from cardiac tissue of CTL and ecPOR-/- mice were not indicative for an important metabolic function of the endothelial POR/CYP450 system in the heart. The combination of transverse aortic constriction (TAC) with endothelial deletion of POR accelerates the development of heart failure in mice as detected by a reduction in cardiac output and stroke volume. These effects were mediated most likely by a reduction in vascular EETs production, which increases vascular stiffness, resulting in cardiac remodeling.
Hintergrund: Amblyopie ist nach Fehlsichtigkeit die häufigste Sehstörung bei Kindern. Sie ist eine wesentliche Ursache für eine lebenslange Minderung der bestkorrigierten Sehschärfe und ist meist unilateral. Eine Asymmetrie in der Qualität des visuellen Eindrucks während der sensiblen Phase führt in der Regel zu einer unzureichenden Entwicklung des binokularen Sehsystems. Die Standardtherapie der Amblyopie besteht aus optimaler optischer Korrektur vorhandener Brechungsfehler und der direkten Okklusion, wobei das funktionsbessere Auge zeitweise mit einem Augenpflaster abgedeckt wird. Bisherige Studien haben gezeigt, dass besonders bei Patienten mit tiefer Amblyopie, die Therapietreue oft mäßig ist. In einigen Fällen kann das amblyope Auge nicht mit der Foveola fixieren. Diese exzentrische Fixation beeinflusst den Therapieerfolg negativ. Unser Ziel war, bei dieser speziellen Patientengruppe die Okklusionsdauer objektiv zu registrieren und deren Auswirkung auf die Visusentwicklung und die Fixationsänderung in Abhängigkeit vom Alter über einen langen Zeitraum zu untersuchen.
Methoden: In unserer prospektiven multizentrischen Pilotstudie untersuchten wir amblyope Kinder mit exzentrischer Fixation im Alter von 3-16 Jahren während 12-monatiger Okklusionsbehandlung. Der Nahvisus wurde mittels Landoltringen und Lea-Symbolen (jeweils Reihenoptotypen) bestimmt. Die Okklusionsdauer wurde kontinuierlich mit einem TheraMon®-Mikrosensor aufgezeichnet, der am Augenpflaster angebracht wurde. Der Fixationsort am Augenhintergrund wurde mit einem direkten Ophthalmoskop bestimmt. Unsere Ziele waren: Evaluierung der Sehfunktion, Therapieadhärenz und Beurteilung des Fixationsortes des amblyopen Auges. Der Anteil des korrigierten Visusdefizits, die Dosis-Wirkungs-Beziehung und die Therapieeffizienz wurden berechnet.
Ergebnisse: In unserer Studie wurden 12 Patienten mit Schiel- und kombinierter Schiel- und Anisometropieamblyopie im Alter von 2,9-12,4 Jahren (im Mittel 6,5 ± 3,4 Jahre) untersucht. Der Anfangsvisus der amblyopen Augen nach 3 Monaten refraktiver Adaptationsphase lag im Mittel bei 1,4 ± 0,4 logMAR (Spannweite 0,9-2,0), und der 5 Führungsaugen bei 0,3 ± 0,3 logMAR (Spannweite -0,1-0,8). Die mittlere interokuläre Visusdifferenz (IOVAD, Visusunterschied zwischen dem amblyopen Auge und dem Führungsauge) zu Beginn betrug im Mittel 1,1 ± 0,4 log Einheiten (Spannweite 0,5-1,8). Die verschriebene Okklusionsdauer lag im Median bei 7,7 Stunden/Tag (Spannweite 6,6-9,9), die tatsächlich erreichte bei 5,2 Stunden/Tag (Spannweite 0,7-9,7). Nach 12 Monaten betrug die mediane Visusbesserung der amblyopen Augen 0,6 log Einheiten (Spannweite 0-1,6), die mediane IOVAD 0,3 log Einheiten (Spannweite 0-1,8). Multiple Regressionsanalyse mit Rückwärtselimination zeigte, dass sowohl das Alter (p=0,0002) als auch die Okklusionsdosis (p=0,046) signifikante Einflussfaktoren für den Visusanstieg waren. Kinder unter 4 Jahren zeigten das beste Ansprechen mit der niedrigsten Rest-IOVAD (Median 0,1 log Einheiten, Spannweite 0-0,3). Die Effizienzberechnung ergab eine Visusbesserung von etwa einer log Visusstufe pro 100 Stunden Okklusion in den ersten zwei Monaten und einer halben log Visusstufe nach 6 Monaten. Die Therapieeffizienz nahm mit zunehmendem Alter ab (p = 0,01). Trotz einer gewissen Visusbesserung auch bei Patienten im Alter von ≥8 Jahren (Median 0,4 log Einheiten), zeigten diese eine geringere Therapieadhärenz sowie -effizienz (mediane Rest-IOVAD 0,8 log Einheiten). Zentrale Fixation wurde von 9 Patienten nach im Median 3 Monaten erreicht (Spannweite 1-4 Monate). Drei Patienten (>6 Jahre) erreichten keine zentrale Fixation.
Schlussfolgerung: Amblyopie mit exzentrischer Fixation stellt auch bei guter Adhärenz eine Herausforderung für den Therapieerfolg dar. Unsere Studie zeigte erstmals prospektive quantitative Daten basierend auf elektronischer Erfassung der Okklusion bei dieser seltenen Patientengruppe. Es konnte die deutliche Abnahme der Therapieeffizienz mit zunehmendem Alter gezeigt werden. Die Visusbesserung wurde viel stärker vom Alter als von der Okklusionsdosis beeinflusst. Nur Kinder, die zum Okklusionsbeginn jünger als 4 Jahre waren, konnten im Studienzeitraum in ihren amblyopen Augen eine für ihr Alter annähernd normale Sehschärfe und eine IOVAD <0,2 log Einheiten erreichen. Demzufolge sind, trotz möglicher geringer Visusbesserung auch bei älteren Patienten, eine frühzeitige Diagnose und Therapie dieser Patientengruppe unerlässlich für den Therapieerfolg.
Förderung: bereitgestellt durch den Forschungspreis des Vereins „Augenstern e.V.“
Aim: The cytochrome P450 reductase (POR) along with the cytochrome P450 enzymes (CYP) are responsible for the metabolism of a multitude of metabolites important for the maintenance of tissue function. Defects in this system have been associated with cardiovascular diseases. These enzymes are known to produce vasoactive lipids that modulate vascular tone. The aim of this study was to identify the consequence of a loss in endothelial POR for vascular function.
Methods and Results: To identify the endothelial contribution of the POR/CYP450 system to vascular function, we generated an endothelial-specific, tamoxifen-inducible POR knockout mouse (ecPOR-/-). Under basal condition ecPOR-/- already exhibited endothelial dysfunction in aorta and mesenteric vessels (acetylcholine-dependent relaxation, LogEC50 -7.6M for CTR vs. -7.2M for ecPOR-/- in aorta) and lower nitric oxide levels in the plasma (CTR: 236.8 ±77.4; ecPOR-/- 182.8 ±34.1 nmol/L). This dysfunction was coupled to attenuated eNOS function detected by the heavy arginine assay and decreased eNOS phosphorylation on S1177. Furthermore, insulin-induced phosphorylation of the eNOS activator, AKT, was also attenuated in the aorta from ecPOR-/- mice as compared to control mice. CYP450-dependent EET production was lower in plasma, lung and aorta of ecPOR-/- mice and this was accompanied with increased levels of vasoconstriction prostanoids (lipidomics of aorta, plasma and lung freshly isolated from CTR and ecPOR-/- mice). MACE-RNAseq from these aortas also showed a significant increase in genes annotated to eicosanoid production. In an in vivo angiotensin II model, acute deletion of POR increased the blood pressure as measured by telemetry and tail cuff (137.4 ± 15.9 mmHg in WT; 152.1 ± 7.154 mmHg in ecPOR-/-). In a rescue experiment using the NSAID naproxen, the increase in blood pressure induced by deletion of endothelial POR was abolished.
Conclusion: Collectively, in endothelial cells POR regulates eNOS activity and orchestrates the metabolic fate of arachidonic acid towards the vessel dilating EETs and away from deleterious prostanoids. In the absence of POR this endothelial regulation is compromised leading to vascular dysfunction.
The role of lncRNAs in the CVS and the endothelium is highly diverse and has been subject to a substantial amount of research over the last decade. The identification of lncRNAs as clinically relevant biomarkers and as co-regulatory molecules let to the appreciation of the functional relevance of lncRNAs.
In the present study, LINC00607 was identified as an endothelial-enriched, human-specific lncRNA. With its distinct functions, LINC00607 maintains and supports the endothelial homeostasis especially in response to VEGF-A signalling.
In the first part of this study, LINC00607 was functionally characterized in human endothelial cells. LINC00607 is highly and specifically expressed in endothelial cells and is differentially regulated in CVDs. Depletion of LINC00607 resulted in decreased angiogenic sprouting, reduced integration of ECs in a newly formed vascular network in vivo, enhanced endothelial migration and differential expression of many important genes for endothelial cell homeostasis. Functionally, LINC00607 maintains ERG-driven endothelial gene expression programs through BRG1. BRG1 secures stably accessible enhancer regions as well as TSS of ERG target genes, thus enabling transcription of endothelial gene programs.
The second part of this study proposes an additional mode of action for LINC00607. The strongly impaired response to VEGF-A after LINC00607 KO can only be partially explained by its’ expression control of ERG target genes. It rather appears that LINC00607 is involved in the control of alternative splicing of VEGF receptor FLT1. The differential splicing of FLT1 produces the anti-angiogenic soluble isoform of FLT1. Even though further validation is needed to uncover the underlying mechanism, there is the potential of a more general role of LINC00607 in splicing control through BRG1. As AS of FLT1 is a clinical marker in preeclampsia, LINC00607 might qualify to be an additional marker for the onset and manifestation of the pregnancy disorder.
Taken together, LINC00607 is a target in future for molecular therapy in CVD to restore a healthy endothelial phenotype and has the potential to serve as a biomarker in preeclampsia.
Ziel unserer retrospektiven Studie war es, die refraktiven und kornealen Veränderungen nach DMEK bei pseudophaken Patienten, die sich auf Grund einer endothelialen Hornhauterkrankung behandeln ließen, zu untersuchen. Durch unsere einheitlich pseudophake Patientenkohorte wollten wir untersuchen, ob sich die refraktiven Veränderungen nach DMEK von den bereits bekannten Änderungen bei einer simultan durchgeführten Katarakt- und DMEK-Operation sogenannte „Triple“-DMEK unterscheiden. Primärer Endpunkt der Studie war die Veränderung der Refraktion unter besonderer Berücksichtigung des sphärischen Äquivalents (SEQ) des jeweiligen pseudophaken Auges nach DMEK. Sekundäre Endpunkte umfassten die Entwicklung des Visus, der CCT, der ECD und verschiedener kornealer Parameter, die mittels Scheimpflug- Tomographie ermittelt wurden.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte hierzu die retrospektive Analyse von Daten, die in den Patientenakten dokumentiert und digital gespeichert waren (Pentacam® HR). Es wurden 109 Augen von 95 Patienten, die sich im Zeitraum von Februar 2015 bis Dezember 2018 mittels DMEK in unserem Zentrum behandeln ließen, in die Studie eingeschlossen. Davon stammten 66 Augen (61%) von weiblichen und 43 Augen (39%) von männlichen Patienten. Es handelte sich bei 61 Augen (56%) um ein linkes und bei 48 Augen (44 %) um ein rechtes Auge. Die Patienten waren 20 bis 91 Jahre alt. Das mittlere Alter zum Zeitpunkt der DMEK-Operation betrug 71,9 Jahre (SD ±10,23). Der Altersmittelwert der Männer lag bei 70,4 Jahren (SD 11,23, Spannweite: 20-84) und der der Frauen bei 72,9 Jahren (SD 9,49, Spannweite: 47-91). Der mittlere Nachbeobachtungszeitraum betrug 10,47 Monate (SD 6,78, Spannweite: 1-28 Monate).
Für das SEQ konnte bei Betrachtung aller ausgewerteten Daten eine leichte Tendenz in Richtung eines „hyperopen shifts“ mit einer mittleren Veränderung des SEQ von + 0,1 D gezeigt werden, die jedoch nicht statistisch signifikant war. Zwischenzeitlich kam es im Nachbeobachtungszeitraum zu einer klaren Tendenz hinsichtlich einer Myopisierung bei Betrachtung aller ausgewerteten Daten. Der „hyperope shift“ konnte erst am Ende, möglicherweise infolge einer deutlich reduzierten Patientenzahl, beobachtet werden. In der Subgruppe „vollständige Kontrollen“ für das SEQ zeigte sich eine Tendenz hinsichtlich einer leichten Abnahme des SEQ, die jedoch ebenfalls nicht statistisch signifikant war und aufgrund der geringen Gruppengröße (n=32) kritisch betrachtet werden sollte. In unserer Kohorte konnte somit keine eindeutige Aussage über eine postoperative Änderung des SEQ in Richtung eines „hyperopen shifts“ oder „myopen shifts“ gemacht werden. Die Refraktion verhielt sich in unserem Patientenkollektiv nach DMEK insgesamt weitestgehend stabil. Insofern sind refraktive "Überraschungen", wie sie weiterhin häufig nach "Triple"-DMEK zu beobachten sind, bei zuvor pseudophakisierten Patienten in einem weitaus geringeren Maße zu erwarten. Unter den mittels Scheimpflug-Technologie untersuchten kornealen Parametern wies lediglich der posteriore Astigmatismus signifikante Veränderungen im Sinne einer Reduktion der kornealen Krümmung auf. Indirekt heben unsere Ergebnisse damit die Bedeutung des posterioren Hornhautprofils auf die postoperative Refraktionsentwicklung und somit auch auf die IOL-Kalkulation bei "Triple"-DMEK-Prozeduren hervor. Außerdem scheint der postoperative Anstieg der Sehschärfe mit den gleichfalls signifikanten Änderungen der kornealen Densitometrie in der 2-6 mm Zone, des Hornhautvolumens und der zentralen Hornhautdicke umgekehrt korreliert zu sein.
Darüber hinaus lässt sich festhalten, dass auch unsere Untersuchung in einem gewissen Maße die Überlegenheit der DMEK gegenüber etablierten Techniken, wie beispielsweise der PK verdeutlicht. Sowohl anhand der refraktiven Stabilität als auch der Visusergebnisse konnten wir belegen, dass das DMEK-Verfahren nach der anfänglichen Lernkurve die wohl besten funktionellen Ergebnisse in der Behandlung von Patienten mit endothelialen Hornhauterkrankungen liefert. Besonders bei bereits pseudophaken Patienten weist die DMEK durch die zu erwartende hohe postoperative refraktive Stabilität viele Vorteile auf
und erscheint insbesondere hinsichtlich der Vorhersagbarkeit des postoperativen refraktiven Ergebnisses der „Triple“- DMEK überlegen.
Hintergrund: Seit mehr als 50 Jahren werden in Deutschland Herzschrittmacher-Implantationen durchgeführt, mittlerweile mit mehr als 100.000 Implantationen pro Jahr. Obwohl es sich um einen gängigen Eingriff handelt, existieren wenig prospektiv randomisierte Studien zu technischen Aspekten der Implantation, insbesondere dem Wundverschluss am Ende der Operation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, an einem Kollektiv von Patienten unerwünschte Ereignisse und kosmetische Ergebnisse, in Abhängigkeit des beim Hautverschluss verwendeten Nahtmaterials (resorbierbarer bzw. nicht-resorbierbarer Faden), miteinander zu vergleichen.
Methoden: In einem Zeitraum von Juli 2018 bis April 2019 wurden Patienten mit geplanter de novo Herzschrittmacher-Implantation ohne Defibrillationstherapie prospektiv in die Studie eingeschlossen und anhand einer Randomisierungliste in zwei Probandengruppen eingeteilt: nicht-resorbierbares Nahtmaterial (Gruppe Prolene®) bzw. resorbierbares Nahtmaterial (Gruppe Monocryl®).
Ein Tag (Beobachtungszeitpunkt 1), sechs Wochen (Beobachtungszeitpunkt 2) und ein Jahr post-OP (Beobachtungszeitpunkt 3) erfolgte die Beurteilung der Narbe bezüglich des kosmetischen Ergebnisses und klinisch relevanter, unerwünschter Ereignisse. Zur kosmetischen Beurteilung diente die Wundbreite in mm, eine auftretende Kelloidbildung und die „Patient and Observer Scar Assessment Scale“ (POSA-Score). Dieser wurde zu Beobachtungszeitpunkt 1 seitens des Patienten auf zwei Fragen (Schmerzhaftigkeit, Juckreiz) reduziert. Die erhobenen klinisch relevanten Parameter waren Nachblutungen, Infektionen, Insuffizienz der Naht und Revisions-OP aufgrund eines Lokalbefundes.
Ergebnisse: Es konnten 114 Patienten in die Studie eingeschlossen werden. Zu Beobachtungszeitpunkt 2 und Beobachtungszeitpunkt 3 belief sich die Anzahl auf jeweils 92 Probanden. Zu allen drei Beobachtungszeitpunkten konnte zwischen beiden Gruppen weder ein signifikanter Unterschied im kosmetischen Ergebnis noch im Auftreten klinisch relevanter Ereignisse festgestellt werden.
Schlussfolgerung: Anhand der vorliegenden Studie scheint das verwendete Nahtmaterial keinen großen Einfluss auf das kosmetische Ergebnis der Narbe, sowie auf das Auftreten von unerwünschten Ereignissen zu haben. Eine multizentrische prospektiv randomisierte Studie mit größerer Patientenanzahl ist notwendig, um die hier erhobenen Daten zu verifizieren.
Role of Orphan G-protein-coupled receptor GPRC5B in smooth muscle contractility and differentiation
(2019)
G protein coupled receptors (GPCRs) are the largest family of cell-surface receptors encoded in the human genome. They mediate the cellular responses to a wide variety of stimuli, ranging from light, odorants, and metabolic cues to hormones, neurotransmitters, and local mediators. Upon ligand binding, the GPCR undergoes conformational changes resulting in the activation of heterotrimeric G-proteins belonging to the families Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13, which in turn mediate the downstream signaling. While most of the 360 non-olfactory GPCRs are well studied, approximately 120 GPCRs are still considered "orphan", meaning that their mechanism of activation and biological function is unknown. GPCRs have been functionally described in the regulation of almost all organ systems, and their dysregulation has been implicated in the pathogenesis of a multitude of diseases. In the vascular system, the contractile tone of vessels is crucially regulated by GPCRs. Substances that act through G12/13- and Gq/11-coupled GPCRs are associated with facilitation of contraction, while Gs-coupled GPCRs are usually associated with the induction of relaxation. Furthermore, while Gq/11 pathway activation promotes proliferation and dedifferentiation of vascular smooth muscle cells (VSMC), G12/13 and Gs signaling pathways promote expression of contractile proteins and differentiation.
The functional properties of VSMC depend on the anatomical location, and a recent single-cell expression analysis showed that VSMC from different vascular beds have different patterns of GPCR expression. Interestingly, smooth muscle cells (SMCs) from resistance arteries not only express various GPCRs for known modulators of vascular tone, but also a number of orphan GPCRs. These results suggest a potential role of orphan GPCRs in the modulation of blood pressure. Orphan GPCR GPRC5B was one of the GPCRs enriched in resistance arteries, and this receptor was also upregulated in dedifferentiated aortal SMC. The function of GPRC5B in these types of SMC is currently unknown. In vitro studies suggested that GPRC5B negatively regulates obesity, inflammation, insulin secretion and fibrotic activity, but there are no data available with respect to its function in regulation of vascular tone or other SMC functions.
Our study aimed at the identification of the specific functions of GPRC5B in SMC. To do so, we generated a SMC-specific GPRC5B-deficient mouse line by crossing Gprc5bfl/fl mice with smooth muscle-specific, tamoxifen-inducible Myh11-CreERT2 mice. We found that SMC-specific deletion of GPRC5B did neither affect myogenic tone in pressure myography, nor the response to the contractile agonists in wire myography. In contrast, vessel relaxation in response to prostacyclin analogues cicaprost and iloprost, which act on the prostacyclin receptor IP, were increased. These results suggested a selective improvement of IP receptor signaling. The IP receptor is coupled to Gs protein, it promotes vasorelaxation and acts as a restraint on platelet activation. Using overexpression of IP and GPRC5B in HEK cells, we found that GPRC5B physically interacts with the IP receptor and controls IP trafficking and membrane localization. Furthermore, we found that membrane IP receptor expression was increased in GPRC5B-deficient human aortic SMC and in resistance vessels of SMC-specific GPRC5B. To investigate the importance of increased IP-mediated signaling in SMC in vivo, we measured blood pressure in two mouse models of hypertension. We found that SMC-deletion of Gprc5b resulted in a significant reduction of blood pressure compared with control mice, which suggested that Gprc5b negatively regulated relaxation in hypertensive disease by decreasing IP mediated relaxation. In line with this notion we found that application of the IP antagonist Cay10441 largely abrogated the beneficial effect of GPRC5B inactivation in this hypertension model. Another important function of the IP receptor is the regulation of SMC differentiation, which led us to investigate the differentiation state of GPRC5B-deficient SMC. We found that deletion of GPRC5B enhanced expression of contractile genes and reduced expression of proliferative markers. This improved differentiation was, at least partially, due to increased IP signaling in SMC. Moreover, in a mouse model of atherosclerosis SMC-specific deletion of Gprc5b reduced plaque area and contributed to a more stable fibrous cap by promoting differentiation.
In conclusion, deletion of GPRC5B in SMC significantly improved contractility and differentiation by increasing IP receptor membrane availability and signaling.
Aim: Long noncoding RNAs (lncRNAs) belong to the interface of epigenetics and exhibit diverse functions. Their features depend on their sequence, genomic location and tertiary structure. The aim was to identify novel lncRNAs and characterise their physiological functions and mechanisms in endothelial cells. Three different approaches were performed:
The hypothesis that pseudogene-annotated lncRNA NONHSAT073641 regulates the expression of their parental gene platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1 (PAFAH1B1) was examined.
The physiological functions and in vivo relevance of most lncRNAs are still unknown, therefore a part of this work aimed to identify lncRNAs in response to a pathophysiological stimulus (high amplitude stretch) in endothelial cells.
The long intergenic noncoding RNA antisense to S1PR1 (LISPR1) gene, is located within the promotor of sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) and shares a part of the promotor region. This study examined additionally the hypothesis that LISPR1 controls the S1PR1 expression in endothelial cells.
Methods: The angiogenic functions of NONHSAT073641 and LISPR1 were examined with spheroid-outgrowth and scratch wound assays. Furthermore, stretch experiments were performed in order to identify differently expressed lncRNAs in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). In addition, the in vivo relevance of both lncRNAs was examined in samples from pulmonary arterial hypertension patients. Knockdown (e.g. LNA GapmeRs), knockout (CRISPR/ Cas9) and overexpression experiments (e.g. CRISPR activation) were performed to analyse target genes. The molecular mechanism of LISPR1 was investigated with RNA and Chromatin immunoprecipitation.
Results: NONHSAT073641 and PAFAH1B1 exhibited angiogenic function in endothelial cells. It could be observed that NONHSAT073641 is not regulating the expression of PAFAH1B1. The pro-angiogenic feature of PAFAH1B1 might be attributed to the target gene matrix Gla protein (MGP). NONHSAT073641 and PAFAH1B1 were significantly induced in CTEPH samples and might be important in the development of this disease. It could be speculated that NONHSAT073641 is regulating the expression of the cell-cycle regulator BCL2L11 as has been investigated in mice.
LISPR1 is a cis-acting lncRNA which maintains S1PR1 gene transcription by intercepting the transcriptional repressor ZNF354C and enabling Polymerase II (PolII) to bind. ZNF354C regulates S1PR1 expression in HUVECs. However, the role of ZNF354C in pulmonary arterial hypertension (PAH) is unknown. LISPR1 and S1P1 receptor were both significantly depleted in COPD samples. It can be assumed that due to higher S1P production, the signalling is attenuated through reduction of the lncRNA LIPSR1 and thus the receptor S1P1.
The stretch experiments present a possible in vitro model in order to mimic the condition of endothelial cells during high blood pressure, such as in PAH. Referring to published data, it could be confirmed that stretching of endothelial cells alters the gene expression, which is on the other hand linked to cardiovascular disease. In cardiovascular disease mechanical stretch altered genes, which are participating in the vascular remodelling process. The role of differently expressed lncRNAs (TGFβ2-AS1, CTD-2033D15.2, INHBA-AS1, RP11-393I2.4, TAPT1-AS1, TPM1-AS1, CFLAR-AS1 and HIF1α-AS2) upon mechanical stretch is yet not clarified.
Conclusion: NONHSAT073641 and LISPR1 are important for the endothelial angiogenic function. Both lncRNAs were deregulated in PAH samples. The pathophysiological stimulus had an impact on the expression of different lncRNAs (e.g. TGFβ2-AS1) and pathways (e.g. TGF-β) in endothelial cells.
Hintergrund: CD34+ Zellen besitzen eine essenzielle Rolle in der Hämatopoese und vaskulären Homöostase. Das Ziel unserer Studie war, erstens, in vitro die Rolle des thrombozytären JAM-C bei der Adhäsion und anschließenden Differenzierung von humanen CD34+ Zellen zu endothelialen Progenitorzellen zu analysieren sowie zweitens, seine Assoziation mit dem thrombozytären P-Selektin bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit zu untersuchen.
Methoden und Ergebnisse: Mittels Durchflusszytometrie beobachteten wir, dass in vitro die JAM-C-Expression auf der Oberfläche von Thrombozyten, nach Thrombozytenaktivierung, erhöht ist. Die JAM-C-Expression korrelierte mit der Expression des thrombozytären P-Selektin in Patienten mit koronarer Herzkrankheit (r=0,301, P=0,01). Die Rolle des JAM-C und seines Counter-Rezeptors MAC-1 bei der Adhäsion von humanen CD34+ Zellen über immobilisierten Thrombozyten, wurde jeweils, unter Verwendung eines neutralisierenden löslichen Proteins (sJAMC-Fc) und eines monoklonalen Antikörpers gegen JAM-C oder Integrin MAC-1 (CD11b/CD18), untersucht. Die Behandlung mit löslichem JAM-C-Fc, anti-JAM-C oder anti-MAC-1 ergab, im Gegensatz zu einer Vorbehandlung mit Control-Fc oder IgG1, eine signifikant verminderte Adhäsion von humanen CD34+ Zellen an immobilisierten Thrombozyten unter statischen Bedingungen (P<0,05). Um unsere Ergebnisse unter hoher Scherspannung, ähnlich der arteriellen Strömung, zu validieren, führten wir Perfusionsexperimente in einer Flusskammer durch. Auch unter hoher Scherspannung führte die Hemmung der JAM-C/MAC-1 Interaktion zu einer signifikant verringerten Adhäsion von CD34+ Zellen über immobilisierten Thrombozyten (P<0,05). Mittels endothelialer Kolonienbildungstests und Kokulturen konnten wir zeigen, dass die Thrombozyten-vermittelte Differenzierung von CD34+ Zellen zu Endothelzellen oder Makrophagen/Schaumzellen, durch die Hemmung der JAM-C/MAC-1-Achse, unbeeinflussbar bleibt.
Schlussfolgerungen: In Anbetracht dieser Ergebnisse kann man behaupten, dass thrombozytäres JAM-C die CD34+ Zelladhäsion unterstützt. Dieser Mechanismus kann möglicherweise am Homing sowie an der Domizilierung von humanen CD34+ Zellen beteiligt sein.
Die NADPH-Oxidasen stellen eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (Reactive oxygen species; ROS) im Organismus dar. Hierbei dienen die NADPH-Oxidasen nicht nur der Pathogenabwehr, sondern haben einen Einfluss auf eine Vielzahl an oxidativen, physiologischen Prozessen. Unter den NADPH-Oxidasen ist NOX4 einzigartig, da es hauptsächlich im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert ist, konstitutiv aktiv ist und Wasserstoffperoxid (H2O2) produziert. Wir vermuten, dass diese besonderen Eigenschaften eine Konsequenz aus der Interaktion mit bislang unentdeckten NOX4-interagiereden Proteinen ist.
Zweidimensionale blau-native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) kombiniert mit SDS-PAGE zeigte NOX4 in makromolekularen Komplexen. Interagierende Proteine wurden durch eine quantitative SILAC (stable isotope labeling of amino acids in cell culture)-Co-immunopräzipitation (Co-IP) in NOX4-überexprimierenden HEK293-Zellen gescreent. Hierdurch konnten verschiedene interagierende Proteine identifiziert werden, wobei Calnexin die robusteste Interaktion aufwies. Calnexin konnte zudem in NOX4-haltigen Komplexen durch Complexome Profiling der BN-PAGE oder gleichzeitiger Antikörperfärbung nachgewiesen werden. Die Calnexin-NOX4-Interaktion konnte mittels reverser Co-IP und Proximity ligation assay bestätigt werden, während NOX1, NOX2 und NOX5 nicht mit Calnexin interagierten. Calnexin-Defizienz, untersucht in embryonalen Mausfibroblasten oder durch shRNA gegen Calnexin, reduzierte die NOX4-Proteinexpression und ROS-Bildung, wobei die mRNA-Expression unverändert blieb. Des Weiteren wurde untersucht, ob der bekannte Interaktionspartner von NADPH-Oxidasen, p22phox, wirklich essentiell für die Expression oder Aktivität von NOX4 ist, da es nur in manchen der NOX4-Co-IPs nachgewiesen wurde. Um den Einfluss von p22phox für NOX4 aufzuklären wurde ein CRISPR/Cas9 Knockdown in NOX4-überexprimierenden HEK293 Zellen etabliert. p22phox zeigte keinen Einfluss auf die NOX4-Expression, jedoch war die NOX4-abhängige ROS-Produktion in p22phox-Knockout Zellen verschwunden.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass endogenes NOX4 makromolekulare Komplexe mit Calnexin ausbildet, welches für die korrekte Reifung, Prozessierung und Funktion von NOX4 im ER nötig ist. Darüber hinaus ist p22phox nicht für die Reifung von NOX4, aber für dessen Aktivität nötig. Diese Ergebnisse zeigen eine vielfältige Regulation von NOX4 auf Proteinebene.