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In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass Hyperforin wichtige Funktionnen von Keratinozyten beeinflusst. Hyperforin triggert die Ausdifferenzierung der epidermalen Zellen und inhibiert gleichzeitig ihre Proliferation. Diese Ergebnisse zeigen die physiologische Relevanz der Hyperforin-vermittelten Effekte, da diese beiden Prozesse in der Haut normalerweise gegenläufig ablaufen. Weiterhin war die von Hyperforin ausgeübte Ausdifferenzierungs-Zunahme und Proliferationshemmung vergleichbar mit den Effekten einer hohen [Ca2+]ex, die in vivo die Funktionen von Keratinozyten steuert. Die Frage, die aus diesen Ergebnissen resultierte, war, über welchen Mechanismus Hyperforin die Effekte in Keratinozyten beeinflusst. Die Untersuchung des Mechanismus der Hyperforin-induzierten Effekte zeigte, dass Hyperforin über die Aktivierung des TRPC6-Kanals einen Calcium-Influx in Keratinozyten bewirkt und resultierend daraus die Ausdifferenzierung von Keratinozyten anregt. Auch hier ergeben sich Parallelen zu der durch hohes [Ca2+]ex -induzierten Ausdifferenzierung, die ebenfalls einen Calcium-Einstrom in Keratinozyten auslöst. Eine Microarray-Analyse von Hyperforin-inkubierten Keratinozyten und anschließende Experimente mit selektiven Inhibitoren zeigte die Beteiligung der PKC/Ras/MEK/ERK-Signalkaskade. Interessanterweise gibt es hier ebenfalls Ähnlichkeiten zwischen Hyperforin und einer hohen [Ca2+]ex, da bekannt ist, dass eine hohe [Ca2+]ex die Ausdifferenzierung zumindest teilweise über diesen Signatransduktions-Weg steuert. Aufgrund der Parallelen zwischen der Hyperforin- und Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung und den vermehrten Hinweisen auf die wichtige Rolle von TRPC-Kanälen in Keratinozyten, stellte sich die Frage, ob eine hohe [Ca2+]ex ebenfalls zur Aktivierung von TRPC-Kanälen führt. Tatsächlich konnten wir in dieser Arbeit zeigen, dass Calcium in Keratinozyten mehrere TRPC-Kanäle aktiviert und so einer Erhöhung der [Ca2+]i führt. Hierdurch konnte zum ersten Mal auch die Beteiligung von DAG-aktivierten TRPC-Kanälen an der Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung gezeigt werden. Bei der Untersuchung von Psoriasis-Keratinozyten, die eine Hyperproliferation und erniedrigte Ausdifferenzierung in vivo aufweisen, konnte in der vorliegenden Dissertation eine grundlegende Störung des Calcium-Haushaltes festgestellt werden. Dabei zeigten die Psoriasis-Keratinozyten im Vergleich zu gesunden hPKs eine abnorme Antwort auf unterschiedliche Stimuli, die zu einer Erhöhung der [Ca2+]i führen. Sowohl eine hohe [Ca2+]ex, als auch Hyperforin führte zu einem deutlich erniedrigten Calcium-Einstrom in den Keratinozyten der Psoriasis-Patienten. Aus diesen Ergebnissen resultiert die Frage nach den Ursachen dieser Störungen. Da in dieser Arbeit bereits gezeigt werden konnte, dass Hyperforin und eine hohe [Ca2+]ex über TRPC-Kanäle die Ausdifferenzierung in Ketatinozyten beeinflussen, untersuchten wir die Expression von TRPC-Kanälen in Psoriasis-Keratinozyten. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression aller TRPC-Kanäle signifikant erniedrigt war. Vor dem Hintergrund der wichtigen Rolle der TRPC-Kanäle für die Calcium-Homöostase und Ausdifferenzierung von epidermalen Zellen, ist dies durchaus eine denkbare und plausible Erklärung für die Defekte der Psoriasis-Keratinozyten. Weiterhin zeigten unsere Ergebnisse, dass der CaR in Psoriasis-Keratinozyten vermindert exprimiert wird. Da dem CaR eine wichtige Rolle in der Regulation der [Ca2+]i als Antwort auf eine Änderung der [Ca2+]ex zugeschrieben wird, könnte dies eine weitere mögliche Erklärung für die gefundenen Störungen der Psoriasis-Keratinozyten sein.
Die adoptive Immuntherapie mit hochaufgereinigten NK-Zellen bei pädiatrischen Patienten mit malignen Erkrankungen nach haploidenter SZT ist eine mögliche Therapieoption, um einen verstärkten GvL/GvT-Effekt zu bewirken und möglicherweise die Immunregeneration zu fördern. Als schwerwiegende Nebenwirkung ist bisher noch nicht eindeutig belegt, ob neben T-Zellen auch NK-Zellen in der Lage sind, eine GvHD auszulösen. In der Frankfurter Universitätskinderklinik wurden 7 Patienten (4xALL, 1xAML, 1xRMS IV und 1xM. Hodgkin) mit hochaufgereinigten unstimulierten NK-Zellen und 3 Patienten (3xNB IV) mit IL-2 stimulierten NK-Zellen nach haploidenter SZT behandelt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in vitro untersucht, ob NK-Zellen durch die Stimulierung mit IL-2 einen gesteigerten GvL/T-Effekt aufweisen. Es wurden NK-Zellen von 5 verschiedenen gesunden Spendern (2 im Rahmen von Validierungsläufen und 3 zur Behandlung der 3 Patienten mit NB) zunächst immunomagnetisch im klinischen Maßstab mittels CD3-Depletion und darauffolgender CD56-Selektion aufgereinigt. Danach erfolgte die Aktivierung mit IL-2 (Proleukin®S) über 14 Tage unter GMP. Während sich die NK-Zellen aller Spender nach Aufreinigung in eine kleine Population CD56+CD16- immunregulatorischer NK-Zellen (2,3 bis 7,1 %) und eine große Population zytotoxischer CD56+CD16+ NK-Zellen (92,9 bis 97,7 %) unterteilen ließen, zeigte sich nach IL-2 Stimulierung ein heterogenes Bild von CD16+ zu CD16- NK-Zellen. Durch die 9-tägige IL-2 Stimulierung vergrößerte sich der Anteil KIRnegativer NK-Zellen. Es konnte auf den NK-Zellen aller Spender gezeigt werden, dass durch die IL-2 Stimulierung wichtige Rezeptoren (NKG2D, NCR), die für ein hohes zytotoxisches Potential stehen, verstärkt auf der NK-Zelloberfläche exprimiert wurden. Die gesteigerte Zytokinproduktion der IL-2 stimulierten NK-Zellen untermauerte die Funktionalität der ex vivo stimulierten NK-Zellen und dies konnte in funktionalen Assays, die die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen belegen, bewiesen werden. Durch die IL-2 Stimulierung der NK-Zellen konnte die Killing Aktivität gleichmäßig auf über 90 % gesteigert werden. Interessanterweise wies Spender A bei den funktionellen und phänotypischen Analysen eine Sonderrolle auf. Die NK-Zellen dieses Spenders zeigten bereits vor IL-2 Stimulierung eine hohe Zytotoxizität gegenüber malignen Zellen, welches auf eine Voraktivierung, gemessen an der Expression von Aktivierungsmarker CD69, schließen lässt. Die in vivo Untersuchungen zeigten, dass bei einer verabreichten T-Zell-Dosis unter 50 x 103/KG, nur milde GvHDs (Grad I/II) auftraten. Bis zu 60 x 106 NK-Zellen/KG wurden gut toleriert. Nebenwirkungen wie Fieber und Schüttelfrost waren transient und gingen einher mit erhöhten Zytokinspiegeln von inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8, IFN-γ) im Serum der Patienten. Ein engmaschiges Monitoring nach der NK-Zell-Applikation der IL-2 stimulierten NK-Zellen zeigte, dass die NK-Zellen in 5/6 Applikationen aus der peripheren Blutbahn abwanderten, einhergehend mit der Migration von Antigen-präsentierenden Zellen. Bei der Untersuchung des langfristigen Einflusses von adoptiver NK-Zell-Immuntherapie auf die Immunrekonstitution bei Patienten nach haploidenter SZT wurde vorausgehend eine Normwertstudie zu verschiedenen Leukozytensubpopulationen von 100 gesunden Kinder und Erwachsenen vorgenommen. Nach der Entwicklung eines stufenlosen, nicht-linearen Regressionsmodells konnte der Einfluss auf die Immunrekonstitution der Patienten nach SZT altersgerecht beurteilt werden. Weiterhin wurden Patientengruppen, die ebenfalls haploident transplantiert wurden, den NK-Zell-Studienpatienten gegenübergestellt. Eine signifikante Verbesserung durch die Gabe von NK-Zellen konnte nicht beobachtet werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass die NK-Zellzahl innerhalb des ersten Monats nach SZT Normwerte erreichte, gefolgt von den zytotoxischen CD3+CD8+ T-Zellen 5-6 Monate nach haploidenter SZT, den THelfer Zellen und den B-Zellen nach über einem Jahr nach haploidenter SZT. Die allogene additive NK-Zell-Immuntherapie ist eine vielversprechende Therapieoption bei Patienten mit malignen Erkrankungen wie bspw. dem NB. Die NK-Zell-Aktivierung mit IL-2 bewies den Erhalt der Immunkompetenz. Dies war erkennbar an der gesteigerten zytotoxischen Funktionalität, der Zytokinproduktion und der Hochregulierung von zytotoxisch aktiven Rezeptoren. Eine verbesserte Immunrekonstitution kann durch das neue altersgerechte Lymphozyten-Norm-Modell besser beurteilt werden. Allerdings ist die Patientenanzahl und die Beobachtungszeit bisher zu gering, um in vivo ein verbessertes Überleben mit additiver NK-Zell-Immuntherapie wirklich abschätzen zu können.
The aim of the study was to investigate the role of the CX3C chemokine FKN in the role of platelet adhesion. The presence of the FKN receptor CX3CR1 in platelets is demonstrated and G-protein dependent activation of platelets with soluble FKN results in the increased adhesion of platelets to collagen and fibrinogen under flow 228 and adhesion of leucocytes to firmly attached platelets 231. Whether membrane-bound FKN is capable to promote the direct adhesion of platelets in flowing blood analogue to leucocytes was completely unknown. The adhesion mechanisms of FKN in mediating the adhesion of leucocytes under flow are well characterised and represent a novel unique mechanism of leucocyte capture and firm adhesion: FKN is responsible for immediate arrest of flowing CX3CR1 expressing leucocytes without the participation of additional adhesion receptors and ligands. This is in contrast to the classical leucocyte adhesion pathways, which are multistep processes involving leucocyte arrest, rolling and subsequent cell activation prior to firm arrest. In leucocytes, the FKN – CX3CR1 axis is sufficient to allow rapid arrest of leucocytes at low shear flow conditions 67, 101, 115, 122, 261. The set of data from this study demonstrates that immobilised FKN was capable to mediate the adhesion of platelets under low shear conditions, whereas there was no interaction in the absence of shear flow. In the presence of vWf in the adhesion matrix, FKN mediated the potent increased adhesion of platelets. This was in parts due to the activation of flowing platelets via CX3CR1 and the augmented translocation of platelets on FKN via the vWf receptor GPIbα. With respect to platelet activation, the function of endothelial FKN was comparable to leucocytes: in both cell types, the FKN dependent activation is mediated by its cognate receptor CX3CR1. This is in contrast to the adhesive capacity: in leucocytes, FKN dependent adhesion is mediated by CX3CR1, whereas in platelets, the adhesive capacity was mostly mediated by the vWf receptor GPIbα with only minor contribution from CX3CR1. In platelets, activation and adhesion by FKN were mediated by two distinct receptors, whereas in leucocytes, CX3CR1 is solely responsible for FKN dependent activation and adhesion. The presented results point out to a role of platelets in early stage of atherosclerosis. The in vivo expression of both, FKN and vWf is regulated by TNF-α, which is released in early stages of inflammation. The presence of vWf and FKN in the endothelial lining of blood vessels during these conditions is sufficient to initiate the capturing and translocation of platelets on the tunica interna. The rolling of platelets on the endothelium can induce endothelial damage and inflammation of the vessel, which might advance to the generation of clinically significant atherosclerotic plaques and fibrous atheroma.
Aß spielt im Krankheitsgeschehen der AD eine zentrale Rolle, es zeigt neurotoxisches Potential und wird deshalb auch direkt mit der Neurodegeneration in Zusammenhang gebracht. Vermittelt werden die Effekte mitochondrial über den intrinsischen Apoptoseweg. Jedoch kann basierend auf den vorliegenden Daten behauptet werden, dass altersbedingte Veränderungen der mitochondrialen Funktion überhaupt erst zur Bildung von Aß führen und Aß durch die intrazelluläre Kumulation über Jahre sein toxisches Potential entwickelt. Im Einzelnen zeigen Komplex I-Defiziente Mäuse erhöhte Aß-Spiegel im Gehirn. Desweiteren führt die Hemmung der Atmungskettenkomplexe I und III mit Rotenon oder Antimycin in den untersuchten HEK-Zellen zu erhöhter Superoxidanionradikal-Produktion und ist, wie auch die Erzeugung von oxidativem Stress mit H2O2 oder nitrosativem Stress mit SNP, von einem Anstieg der Aß-Produktion begleitet. Daraus geht hervor, dass die Aß-Produktion durch eine mitochondriale Fehlfunktion ROS-vermittelt induziert werden kann. Eine Senkung der ROS-Spiegel durch Ascorbinsäure reduziert die Aß-Produktion und belegt den Zusammenhang zwischen Aß- und ROS-Bildung. Die ROS-Abnahme ist zugleich mit einer verringerten BACE1-Aktivität assoziiert. Für dieses Enzym konnte vielfach eine ROS-vermittelte Aktivierung nachgewiesen werden. Aß selbst generiert ROS und induziert darüber seine eigene Bildung. Weiterhin beeinträchtigt Aß die mitochondriale Funktion. In HEK APPwt und APPsw sind morphologische und funktionelle Parameter dieser Organellen verändert. Die chronische Behandlung von HEK-293-Zellen bestätigt den Aß-Einfluss auf die mitochondriale Funktion und Morphologie. Mitochondrien scheinen ein direktes Target von Aß zu sein. So sind Kolokalisationen zwischen den Organellen und den Aß-Peptid-Aggregaten nachweisbar. Durch die Aß-bedingte mitochondriale Fehlfunktion können wiederum ROS entstehen und die Aß-Bildung und Kumulation fördern. Zwischen ROS und Aß entsteht ein Teufelskreislauf, der die zelluläre Funktion stört und in Apoptose und Nekrose mündet. Wie im HEK-Zellmodell lassen sich auch in der Peripherie von AD-Patienten Hinweise auf eine mitochondriale Fehlfunktion finden. So zeigen Lymphozyten von MCI- und AD-Patienten besondere Auffälligkeiten in basalen mitochondrialen Parametern, wie dem Membranpotential, der ROS-Produktion, der NAD(P)H-abhängigen Redoxenzymaktivität und der Apoptoserate. Im Einzelnen scheint der Komplex III betroffen zu sein, da sich nach Hemmung mit Antimycin besonders viele Unterschiede zwischen MCI- bzw. AD-Patienten und nichtdementen alten Kontrollen herauskristallisieren. Als Biomarker sind die Befunde derzeit nicht anzuwenden, da sie noch zu wenig spezifisch sind. Hier müssen weitere Untersuchungen folgen.
Die Alzheimer Demenz (AD) ist eine progressive, neurodegenerative Erkrankung, die weltweit die häufigste Form der Demenz darstellt und im mittleren bis späten Lebensabschnitt auftritt. Die auffälligsten histopathologischen Merkmale der AD beinhalten –neben dem Untergang von Nervenzellen und Synapsen vorwiegend im Temporal- und Parietallappen – das Auftreten von extrazellulären Ablagerungen aus fibrillogenem Aß1-42-Peptiden in senilen Plaques und intraneuronalen Akkumulationen von hyperphosphoryliertem Tau in so genannten neurofibrillären Bündeln. Derzeitig häufen sich Anhaltspunkte, nach denen die mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle beim Nervenzelluntergang bei der AD spielt. Um genauere Informationen über die Ursache der mitochondrialen Dysfunktion zu erhalten, wurden in dieser Arbeit der Einfluss von Alzheimer-relevanten Faktoren, wie der Aß- und der Tau-Pathologie, sowie das Alter als wichtigster Risikofaktor der AD auf die mitochondriale Funktion untersucht. Als Tiermodelle standen hierfür Thy-1 APP transgene Mäuse, welche erhöhte Aß-Level ab einem Alter von 3 Monaten aufweisen (Blanchard et al., 2003), P301L transgene Mäuse, bei denen es ab einem Alter von 6 Monaten zur NFT-Formation kommt (Gotz et al., 2001b) und NMRI-Mäuse als Altersmodell zur Verfügung. Isolierte Hirn-Mitochondrien von Thy-1 APP transgenen Mäusen weisen unter basalen Bedingungen ein signifikant erniedrigtes Membranpotential im Vergleich zu dem von non-tg Tieren auf. Die Inkubation mit H2O2 und SNP führt weiterhin zu einem signifikant reduzierten mitochondrialen Membranpotential in isolierten Mitochondrien von non-tg Tiere. Demgegenüber können Mitochondrien Thy-1 APP transgener Mäuse offenbar nicht durch oxidativen und nitrosativen Stress zusätzlich geschädigt werden, wofür wahrscheinlich eine Vielzahl von Kompensationsmechanismen verantwortlich ist. Im Gegensatz hierzu führt die Expression der human pathogenen Mutation P301L in isolierten Mitochondrien 15 Monate alter Mäuse zu einem nur tendenziell erniedrigten Membranpotential. In Anbetracht der weiteren Ergebnisse dieser Arbeit und publizierten Daten kann allerdings davon ausgegangen werden, dass das Membranpotential in P301L-Mitochondrien zu einem späteren Alter ebenfalls signifikant vermindert ist. Weiterhin demonstrierten fortführende Experimente einen Defekt der Komplex IV-Aktivität bei Thy-1 APP Mitochondrien und eine reduzierte Komplex I-Aktivität bei P301L-Mitochondrien. Passend zu diesen Daten sind sowohl Thy-1 APP- als auch P301L-Mitochondrien im Alter durch einen reduzierten Atmungskontrollindex gekennzeichnet, das heißt beide transgene Mauslinien weisen im Alter eine beeinträchtigte mitochondriale Atmungsrate auf. Ferner konnte der Einfluss von Aß auf die mitochondriale Atmungskette durch die Inkubation mit extrazellulär zugefügtem fibrillärem Aß zu non-tg Mitochondrien bestätigt werden. Die Inkubation mit Aß führt in non-tg Mitochondrien zu einer reduzierten State 3-Atmung, welche sich ebenfalls in einem verminderten Atmungskontrollindex widerspiegelt. Dieses Ergebnis verdeutlicht nochmals den Zusammenhang der mitochondrialen Dysfunktion mit Aß. Des Weiteren waren isolierte Hirn-Mitochondrien von Mäusen unterschiedlicher Altersstufen mit fortschreitendem Alter durch eine signifikant stärker ausgeprägte Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials gekennzeichnet. Daneben reagieren isolierte Mitochondrien von alten Tieren nach Inkubation mit spezifischen Inhibitoren der Komplexe I, III und IV mit einer stärkeren Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials als junge Tiere. Von besonderem Interesse für die hier vorliegende Arbeit war vor allem die erhöhte Empfindlichkeit der Komplexe I und IV in alten Mäusen, da diese Defizite ebenfalls mit der Tau- und Aß-Pathologie in Verbindung gebracht worden sind. Ferner ergab die direkte Messung der Komplex I Aktivität eine signifikante Verminderung der NADH-Ubiquinon-Reduktase-Aktivität im Alter. In Übereinstimmung weisen isolierte Mitochondrien unter Verwendung von Komplex I-Substraten eine mit dem Alter zunehmende Verminderung der Atmungsraten. Es scheint, dass das vermehrte Auftreten mitochondrialer Mutationen im Alter in Kombination mit spezifischen Defekten der Atmungsketten-Komplexe durch synergistische Effekte das späte Einsetzen der mitochondrialen Dysfunktion in Thy-1 APP und P301L transgenen Tieren bzw. bei der AD erklären könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Ginkgo biloba Extrakt als auch Piracetam protektive Effekte auf die mitochondriale Funktion ausüben. Nach jeweils 14-tägigen Behandlungsstudien konnte gezeigt werden, dass sowohl Gingko biloba Extrakt als auch Piracetam in der Lage waren, das mitochondriale Membranpotential nach oxidativem und nitrosativem Stress zu schützen. Des Weiteren konnte bei beiden Stoffen eine Stabilisation der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe nach einer Behandlung mit spezifischen Komplexinhibitoren beobachtet werden. Die protektiven Effekte von Ginkgo biloba können durch zwei Mechanismen erklärt werden, durch seine Radikalfänger-Eigenschaften und zum anderen durch seine stabilisierende Funktion der mitochondriale Funktion. Demgegenüber scheint Piracetam die Mitochondrien durch seine membranstabilisierenden Eigenschaften zu schützen. Durch die Erhöhung der Membranfluidität der inneren mitochondrialen Membran scheint Piracetam die Funktion der mitochondrialen Atmungsketten-Komplexe zu stabilisieren. Ginkgobiloba Extrakt und Piracetam scheinen demzufolge zwei sehr interessante Präventions- und Therapieoptionen bei Patienten mit leichten kognitiven Störungen bzw. bei Patienten mit AD dar.
Die allogene Nierentransplantation ist im Vergleich zur extrakorporalen Blutreinigung die optimale Therapie, um Patienten mit terminaler Nieren-insuffizienz eine signifikante Erhöhung der Lebenszeit bei gleichzeitig hoher Lebensqualität zu ermöglichen. Die schwerwiegendsten Komplikationen und die in Bezug auf das Transplantatüberleben limitierenden Faktoren bei einer Nieren-transplantation haben ihren Ursprung in immunologischen Prozessen. IL-18, auch bekannt als Interferon-gamma(IFN-gamma)-induzierender Faktor, ist ein proximaler Mediator in der Regulation der angeborenen sowie erworbenen Immunabwehr. Es wird konstitutiv in Zellen des Immunsystems wie Makrophagen und in verschiedenen Gewebetypen in einer inaktiven pro-Form exprimiert und bis zu seiner Aktivierung gespeichert. Aktiviertes IL 18 induziert die Bildung einer Vielzahl proinflammatorischer Mediatoren, darunter sind IFN-gamma, TNF-alpha, IL 1beta und ver-schiedene Chemokine. Gleichzeitig ist IL 18 als Kostimulator von IL-12 an der Steuerung des Gleichgewichtes der Th1- und Th2-Antwort beteiligt. Damit könnte IL-18 maßgeblich zu der Entstehung von Abstoßungsreaktionen sowie einem verzögerten Funktionsbeginn des Nierentransplantates („Delayed Graft Function“ = DGF) beitragen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Beteiligung von lokal in der menschlichen Niere exprimiertem IL-18 an immuno-logischen Prozessen prinzipiell möglich ist, da die Expression von IL-18 und weiterer für seine Funktion essentieller Komponenten auf mRNA- und Protein-ebene in der gesunden menschlichen Niere nachgewiesen wurde. Über immun-histochemische Färbungen konnte eine Lokalisation des IL-18 im distalen Tubulussystem und Sammelrohrabschnitten der Niere nachgewiesen werden. Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen von IL-18 zusammen mit Proteinen, die für einzelne Tubulus- und Sammelrohrabschnitte spezifisch sind, zeigten, dass IL-18 in den Schaltzellen des distalen Konvolutes, des Verbindungstubulus und des Sammelrohrs lokalisiert ist. Weiterhin sind die für die Aktivierung von IL-18 notwendigen Komponenten, der purinerge Rezeptor P2X7 und Caspase-1, in der Niere mit IL-18 kolokalisiert. Damit sind grundlegende Voraussetzungen für eine Aktivierung von IL-18 in diesen Bereichen gegeben. Im Zuge von Abstoßungs-reaktionen nach Nierentransplantation könnte das im Nierengewebe exprimierte IL-18 an immunologischen Vorgängen beteiligt sein. Es wurde festgestellt, dass die Menge an konstitutiv exprimiertem IL-18 in den Schaltzellen von Tubulus- und Sammelrohrabschnitten bei akuten Abstoßungen sowie bei der chronischen Allograftnephropathie im Vergleich zur gesunden Niere abnahm, gleichzeitig lagen vermehrt infiltrierende Makrophagen sowie T- und B-Lymphozyten im Nieren-parenchym vor. Diese Beobachtung lässt die Spekulation zu, dass durch eine Ausschleusung von aktivem IL-18 aus den Schaltzellen eine Immunantwort unterhalten wird, und es im Zuge dessen zu einer Infiltration von Immunzellen kommt. Durch immunhistochemische IL-18 Färbungen an Transplantatbiopsien konnte keine de novo Expression von IL-18 in Bereichen der Tubuli oder der Glomeruli bei immunologischen Komplikationen nach Nierentransplantation nachgewiesen werden. Bei der chronischen Allograftnephropathie wurde IL-18 an kleineren Blutgefäßen nachgewiesen, was für eine Beteiligung von IL-18 an atherosklerotischen Veränderungen bei dieser Diagnose spricht. Weitere Rückschlüsse auf einen Effekt des IL-18 bei Komplikationen nach Nierentransplantation sollten durch die Analyse von IL-18 Genpolymorphismen erhalten werden. Funktionelle Einzelbasenaustausch-Polymorphismen („Single Nucleotide Polymorphisms“ = SNP´s) des IL-18 Promotors scheinen sich auf die Expression von IL-18 auszuwirken und wurden für eine Beteiligung an der Entstehung oder dem Verlauf verschiedener Erkrankungen verantwortlich gemacht. In dieser Arbeit wurde durch Assoziationsanalysen und Haplotypen-analysen gezeigt, dass sich die IL-18 Promotor SNP´s 607C/A und 137G/C des Empfängers auf die Entstehung einer DGF auswirken. Der 137CC Genotyp und das -137C Allel sowie der kombinierte Genotyp -607CA und -137CC des Empfängers sind mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer DGF assoziiert. Im Gegensatz dazu scheinen sich Unterschiede in der Genexpression des IL 18, welche durch die SNP´s 607C/A und 137G/C verursacht werden, nicht auf die Entstehung von Abstoßungsreaktionen auszuwirken. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass aus dem Empfänger stammendes IL 18 sowie lokal im Spenderorgan exprimiertes IL-18 an immunologischen Komplikationen nach Nierentransplantation beteiligt sein könnte. Durch seine Stellung am Beginn von proinflammatorischen Kaskaden stellt das IL-18 ein attraktives Target für die Entwicklung neuer Immunsuppressiva dar.
Dopamin-D2- und -D3-Rezeptorliganden als pharmakologische Werkzeuge und potenzielle Arzneistoffe
(2007)
Mit der Identifizierung der D2-ähnlichen Rezeptoren D2, D3 und D4 um das Jahr 1990 herum, begann die Erforschung deren physiologischer Bedeutung und die Suche nach selektiv bindenden Liganden. Die einzelnen Rezeptorsubtypen unterscheiden sich in ihrer Struktur, chromosomalen Lokalisation, Expressionsrate, anatomischen Verteilung und intrazellulären Signalweiterleitung. Verglichen mit D2-Rezeptoren sind D3-Rezeptoren insgesamt geringer an ihrer Zahl, weisen aber ein charakteristisches Verteilungsmuster im ZNS auf. Um eine vorwiegende Wirkung über D3-Rezeptoren hervorrufen zu können, ist eine Bindungsselektivität der Liganden gegenüber D2-Rezeptoren erforderlich, durch die die unterschiedliche Häufigkeit der beiden Rezeptorsubtypen wieder ausgeglichen wird. In einer richtungsweisenden Arbeit wurde 2003 die Rolle der D3-Rezeptoren in der Therapie des Morbus Parkinson und der Entstehung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien aufgezeigt. Neuste Untersuchungen geben valide Hinweise auf klinisch relevante neuroprotektive und neuroregenerative Effekte bei Behandlung der neurodegenerativen Erkrankung mit D3-Rezeptoragonisten. Das Rückfallrisiko ehemals Drogenabhängiger durch mit dem Suchtstoff in Zusammenhang gebrachte Umweltstimuli ist entscheidend mit dem gleichen Rezeptorsubtyp verbunden. Die mögliche Behandlung Drogenabhängiger mit D3-Rezeptorliganden wird gegenwärtig intensiv untersucht. Mangels geeigneter Tiermodelle bisher wenig erforscht ist die therapeutische Bedeutung der D3-Rezeptorliganden bei schizophrenen Erkrankungen.Möglicherweise liegt hier ein besonderes Potential in der Behandlung von Negativsymptomen. Der im Handel befindliche Arzneistoff Pramipexol (Sifrol®) diente als Leitstruktur für die Synthese zahlreicher Liganden an D2- und D3-Rezeptoren. Weitere Leitstrukturen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit identifiziert und variiert. In einem ersten Schritt wurde die Bedeutung der 2-Aminogruppe an der Thiazolstruktur des Pramipexols untersucht. Sollte diese entgegen der in der Literatur verbreiteten Ansicht für die Ligand-Rezeptorinteraktion entbehrlich sein, könnten Verbindungen mit höherer Lipophilie und damit optimierter ZNS-Gängigkeit geschaffen werden. Für das L-Etrabamin, einem 2-unsubstituierten Derivat des Pramipexols, wurde bereits 1978 in einem Patent eine dopaminerge Aktivität beschrieben. Entgegen der in der Literatur verbreiteten Auffassung konnten durch Austausch der Aminogruppe gegen verschiedene Substituenten affine Derivate des Pramipexols entwickelt werden. Darüber hinausgehende Veränderungen der Leitstruktur dienten dem Aufbau umfangreicher Struktur-Wirkungsbeziehungen. Die Entwicklung einer konvergenten Synthesestrategie ermöglichte die Darstellung einer größeren Anzahl komplexer zusammengesetzter Etrabaminderivate. Die Umsetzung von Pramipexolderivaten zu den entsprechenden Diazoniumsalzen und anschließende Reduktion mit Hypophosphoriger Säure verbesserte die Verfügbarkeit von Etrabamin und seinen Derivaten gegenüber in der Literatur beschriebenen Synthesen. Das resultierende Etrabaminderivat konnte mit Aldehyden unter Verwendung komplexer Hydride reduktiv alkyliert werden. Die Aldehyde wurden entweder durch Acetalhydrolyse oder durch SWERN-Oxidation von Alkoholen erhalten. ....
Die Alzheimer-Demenz (AD) ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen bestehend aus dem Amyloidbeta-Peptid (Aß), durch neurofibrilläre Bündel bestehend aus dem Tau-Protein, massiven Neuronenverlust und synaptische Dysfunktion. Weiterhin ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der AD spielt. Mit Hilfe von dissoziierten Hirnzellen von NMRI, Thy1-APP-, P301L Tau- und JNK-Knockout-Mäusen wurden Veränderungen, verursacht durch genetisch, alters- und geschlechtsbedingten Risikofaktoren, auf die mitochondriale Funktion untersucht. Die Abeta-Belastung der untersuchten Thy1-APP Mäuse führte zu einer mitochondrialen Fehlfunktion durch intrazelluläres Abeta und damit zu einem Energiedefizit. Aß hemmte die Atmungskette, vor allem die COX-Aktivität, indem es an die COX-Untereinheit bindet und damit die Anlagerung von Cytochrom C verhindert. Eine zusätzliche Mutation wie PS1M146L verursacht eine größere und früher einsetzende Abeta-Akkumulation im Gehirn der Mäuse und führte zu größerer mitochondrialer Schädigung im Vergleich zu den APP transgenen Mäusen. Der Grad der Abeta-Schädigung ist auch von dem Aggregationszustand von Abeta abhängig. Eine Akkumulation von intra- und extrazellulären Oligomeren reicht aus, um das mitochondriale Membranpotential zu erniedrigen. Die Aß-Belastung nimmt im Alter zu und es bilden sich ab dem 6. Monat Amyloid-Plaques im Gehirn der Thy1-APP Mäuse aus, die zu einem veränderten Verhältnis von Bcl-xL und Bax in Richtung Bax führten. Bax und Bcl-2 sind an der Bildung der mitochondrialen Pore beteiligt. Durch die Öffnung der mitochondrialen Pore sinkt das mitochondriale Membranpotential und die ATP-Spiegel. Bax begünstigt zusätzlich die Freisetzung von Cytochrom C und Smac. Der Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, die geringen ATP-Spiegel und die Cytochrom C Freisetzung werden mit der Apoptose in Verbindung gebracht und erklären die erhöhte Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber oxidativem Stress. Desweiteren muss die JNK3 berücksichtigt werden. Sie ist der mitochondrialen Fehlfunktion vorgeschaltet und löst eine degenerative Apoptose aus. Abeta und Tau werden bei der Entstehung von AD miteinander in Verbindung gebracht. Dieser Synergismus führt zu einer mitochondrialen Fehlfunktion im Kortex der Mäuse. Aufgrund des unveränderten Transmembranpotentials der dissoziierten Hirnzellen im Gehirn der Thy1APP Mäuse ab dem 6. Monat scheinen nur die aggregierten Polypeptide für die Neurotoxizität bei der AD eine Rolle zu spielen. Die COX-Aktivität wurde im Alter ebenfalls wieder verbessert und stabilisierte dadurch die ATPSpiegel. Die P301L-Taumäuse entwickeln ebenfalls erst im Alter neurofibrilläre Bündel (NFT) durch die Akkumulation von hyperphosphorylierten Tau. Ab dem 2. Lebensjahr der Mäuse wurde ein starker signifikanter Abfall des mitochondrialen Membranpotentials und der ATPSpiegel beobachtet. Der Anstieg der ROS-Spiegel der zwei Jahre alten Mäuse führte direkt zu einer Reduzierung der Komplex-I-Aktivität. Für diese Neurotoxizität scheint die Bildung der NFT verantwortlich zu sein. Die Wirkung von Ginkgo-biloba-Extrakt (EGb 761) und Piracetam auf die mitochondriale Fehlfunktion in jungen und alten NMRI-Mäusen untersucht. Eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials und die Normalisierung der ATP-Spiegel konnte mit Hilfe von EGb 761 und Piracetam festgestellt werden. Besonders bei alten Mäusen konnte die schon angefangene mitochondriale Fehlfunktion fast komplett kompensiert werden. EGb 761 und Piracetam waren in der Lage nach zweiwöchiger Behandlung der APP transgenen Mäusen die löslichen Abeta-Spiegel im Gehirn signifikant zu senken. Durch diese Entlastung wurde die durch Abeta-verursachte Destabilisierung der mitochondrialen Membranen aufgehoben und die Mitochondrien vor oxidativen Schädigungen geschützt. Drei wichtige Angriffspunkte werden aufgrund der Daten für Piracetam vorgeschlagen: 1. die Senkung der Abeta-Spiegel im Gehirn, 2. die Stabilisierung der mitochondrialen Membranen und eine dadurch verbesserte Membranfluidität und 3. die Verbesserung der mitochondrialen Funktion vor altersbedingten Schädigungen. Die drei Punkte sind miteinander verknüpft, aufgrunddessen, dass Abeta die mitochondriale Membranen destabilisiert und dies zu einer mitochondrialen Fehlfunktion führen kann. Die neuroprotektiven Effekte von EGb 761 wurden durch 1. Senkung der Aß-Spiegel, 2. Mitochondrienmembranstabilisierende Wirkungen, 3. antioxidative Effekte, und 4. durch Modulation von Chloridkanälen hervorgerufen. In APP transgenen Mäusen wird trotz gleicher APP Expression in weiblichen Mäuse eine erhöhte Beta-Sekretasespaltung von APP mit verstärkter Bildung von C99 und Abeta (unlösliches und lösliches) im Vergleich zu den männlichen Tieren gebildet. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, dass die erhöhten Abeta-Spiegel und der damit verbundene oxidative Stress in transgenen Mäusen zusätzlich die Mitochondrien der weiblichen Tiere besonders schädigen und die Atmungskette beeinträchtigen. Damit bestätigt sich, dass das Geschlecht ein weiterer Risikofaktor der AD ist. Daher unterstützen die im Rahmen dieser Doktorarbeit erhobenen Befunde grundsätzlich die weitere Erforschung pharmakologischer Ansätze besonders von Ginkgo-biloba-Extrakt und Piracetam zur Verbesserung kognitiver Störungen als Therapie oder auch zur Prophylaxe der Alzheimer Krankheit. Der Schutz von EGb 761 und Piracetam auf die Mitochondrien vor oxidativem Stress kann daher zur Vorbeugung vor allgemeinen Alterungsprozessen dienen. Abeta und Tau spielen zusammen beim Untergang der Neurone eine große Rolle. Therapien, welche die Ablagerungen von Abeta im Gehirn verringern, sollten in einem frühen Stadium der Krankheit besonders wirksam sein. In einem späteren Stadium wären hingegen zusätzlich Medikamente nötig, die gegen die neurofibrilläre Bündel gerichtet sind. Damit ließe sich theoretisch der fortschreitende Zelluntergang bei Alzheimerpatienten zu mindestens verlangsamen.
Extrazelluläre Ablagerungen aus aggregierten Abeta-Peptiden stellen das pathologische Hauptmerkmal der Alzheimer Demenz dar. Schrittweise Veränderungen der Gleichgewichtsspiegel an Abeta im Gehirn begründen den Beginn der Amyloid Kaskaden Hypothese, in deren Folge es zu einer vermehrten Bildung und Aggregation von Abeta kommt. Im Zuge dieser Arbeit wurde im Zellmodell untersucht, welche Faktoren die Aggregation und die Bildung von Abeta initiieren bzw. verstärken. Etliche Arbeiten deuten darauf hin, dass der Amyloid-Metabolismus eng mit dem zellulären Cholesteringehalt verknüpft ist. In den hier verwendeten Modellsystemen bestätigte sich dieser Befund, da die Reduktion von Cholesterin durch Lovastatin und selektive Inhibitoren der Cholesterinbiosynthese mit einer signifikanten Abnahme der Abeta-Produktion einherging. Der Statin-Effekt konnte dabei nachweislich auf die Cholesterinreduktion bezogen und gegenüber pleitropen Isoprenoid-Effekten abgegrenzt werden, da die Inhibition der Isoprenoid- Transferasen FTase und GGTase zu keiner verminderten Abeta-Sekretion führte. Für eine mechanistische Analyse wurde die Rolle des freien Cholesterins als determinierender Faktor der Membranfluidität untersucht. Die APP-Prozessierung ist in der Membran lokalisiert und unterliegt daher dem Einfluss von Cholesterin als Modulator der physikalisch-chemischen Membraneigenschaften. Die Reduktion von Cholesterin bewirkt eine Zunahme der Membranfluidität, während hohe Cholesterinspiegel zu einer starren Membran führen. Beide Zustände wurden unabhängig vom Cholesteringehalt durch den Membranfluidizer Benzyl-Alkohol und den Membranrigidizer Pluronic F68 simuliert. Die Zunahme der Membranfluidität nach der Behandlung mit Benzyl Alkohol resultierte in einer signifikant verminderten Abeta-Sekretion. Pluronic F68 hingegen führte cholesterinunabhängig zu einer Abnahme an Membranfluidität, die mit einer verstärkten amyloidogenen APP-Prozessierung einherging. Die Befunde weisen die Membranfluidität explizit als regulatorisches Element der Abeta-Produktion aus. Benzyl Alkohol und Pluronic F68 zeigten außerdem eine starke Beeinflussung der Membranorganisation in Bezug auf die Formation von Lipid Rafts als potentielle Domänen der amyloidogenen APP-Prozessierung. Benzyl Alkohol führte zu einer diffusen Lokalisation von GM-1 und Cholesterin, während Pluronic F68 eine Kondensation der Raftlipide bewirkte. Abeta selbst interagiert mit der Plasmamembran und stört deren Integrität. Eine Reihe von Daten deutet darauf hin, dass Abeta spezifisch an Komponenten der Lipid Rafts bindet. Die vorliegende Arbeit bestätigt die Kolokalisation von GM-1 und Abeta und belegt, dass die Interaktion zu einer Abnahme der Membranfluidität führt. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Abeta zu einer verstärkten amyloidogenen APP-Prozessierung führt und so einen selbstverstärkenden Mechanismus der Abeta-Produktion initiiert. Der Effekt konnte in proliferierenden Zellen durch langfristige Inhibition der Abeta-Sekretion rückgängig gemacht werden. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell entworfen, in dem die Aggregation von gebundenem Abeta zu einer Vernetzung von Lipid Rafts führt und so die amyloidogene APP-Prozessierung stimuliert. Die Hypothese wurde mit Hilfe von Antikörperinduzierter Quervernetzung von GM-1 überprüft und bestätigt. Zusammengenommen zeigt die vorliegende Arbeit, dass 1.) die Lovastatin-induzierte Abnahme der Abeta-Sekretion in den verwendeten Zellmodellen auf die Reduktion von Cholesterin, bzw. die daraus resultierende Zunahme der Membranfluidität zurückzuführen ist, 2.) die Membranfluidität unabhängig vom Cholesteringehalt Einfluss auf die APP-Prozessierung nimmt, wobei eine fluide Membran die nicht-amyloidogene und eine starre Membran die amyloidogene APP-Prozessierung begünstigt, 3.) die Vernetzung bzw. Kondensation von Lipid Rafts zu einer verstärkten amyloidogenen Prozessierung führt und 4.) Abeta selbst durch Bindung an die Membran diesen Zustand bedingt und damit einen Teufelskreislauf initiiert, in dem es die eigene Produktion stimuliert. Damit fügt die Arbeit dem Puzzle um die Genesis der sporadischen Form der Alzheimer Demenz einige Stücke hinzu und bietet neue Aspekte für die therapeutische Intervention der Erkrankung an.
Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.