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The data on average hadron multiplicities in central A+A collisions measured at CERN SPS are analysed with the ideal hadron gas model. It is shown that the full chemical equilibrium version of the model fails to describe the experimental results. The agreement of the data with the off-equilibrium version allowing for partial strangeness saturation is significantly better. The freeze-out temperature of about 180 MeV seems to be independent of the system size (from S+S to Pb+Pb) and in agreement with that extracted in e+e-, pp and p{\bar p} collisions. The strangeness suppression is discussed at both hadron and valence quark level. It is found that the hadronic strangeness saturation factor gamma_S increases from about 0.45 for pp interactions to about 0.7 for central A+A collisions with no significant change from S+S to Pb+Pb collisions. The quark strangeness suppression factor lambda_S is found to be about 0.2 for elementary collisions and about 0.4 for heavy ion collisions independently of collision energy and type of colliding system
The transverse momentum and rapidity distributions of net protons and negatively charged hadrons have been measured for minimum bias proton-nucleus and deuteron-gold interactions, as well as central oxygen-gold and sulphur-nucleus collisions at 200 GeV per nucleon. The rapidity density of net protons at midrapidity in central nucleus-nucleus collisions increases both with target mass for sulphur projectiles and with the projectile mass for a gold target. The shape of the rapidity distributions of net protons forward of midrapidity for d+Au and central S+Au collisions is similar. The average rapidity loss is larger than 2 units of rapidity for reactions with the gold target. The transverse momentum spectra of net protons for all reactions can be described by a thermal distribution with temperatures' between 145 +- 11 MeV (p+S interactions) and 244 +- 43 MeV (central S+Au collisions). The multiplicity of negatively charged hadrons increases with the mass of the colliding system. The shape of the transverse momentum spectra of negatively charged hadrons changes from minimum bias p+p and p+S interactions to p+Au and central nucleus-nucleus collisions. The mean transverse momentum is almost constant in the vicinity of midrapidity and shows little variation with the target and projectile masses. The average number of produced negatively charged hadrons per participant baryon increases slightly from p+p, p+A to central S+S,Ag collisions.
Two-particle correlation functions of negative hadrons over wide phase space, and transverse mass spectra of negative hadrons and deuterons near mid-rapidity have been measured in central Pb+Pb collisions at 158 GeV per nucleon by the NA49 experiment at the CERN SPS. A novel Coulomb correction procedure for the negative two-particle correlations is employed making use of the measured oppositely charged particle correlation. Within an expanding source scenario these results are used to extract the dynamic characteristics of the hadronic source, resolving the ambiguities between the temperature and transverse expansion velocity of the source, that are unavoidable when single and two particle spectra are analysed separately. The source shape, the total duration of the source expansion, the duration of particle emission, the freeze-out temperature and the longitudinal and transverse expansion velocities are deduced.
A statistical model of the early stage of central nucleus--nucleus (A+A) collisions is developed. We suggest a description of the confined state with several free parameters fitted to a compilation of A+A data at the AGS. For the deconfined state a simple Bag model equation of state is assumed. The model leads to the conclusion that a Quark Gluon Plasma is created in central nucleus--nucleus collisions at the SPS. This result is in quantitative agreement with existing SPS data on pion and strangeness production and gives a natural explanation for their scaling behaviour. The localization and the properties of the transition region are discussed. It is shown that the deconfinement transition can be detected by observation of the characteristic energy dependence of pion and strangeness multiplicities, and by an increase of the event--by--event fluctuations. An attempt to understand the data on J/psi production in Pb+Pb collisions at the SPS within the same approach is presented.
Elliptic flow from nuclear collisions is a hadronic observable sensitive to the early stages of system evolution. We report first results on elliptic flow of charged particles at midrapidity in Au+Au collisions at sqrt(s_NN)=130 GeV using the STAR TPC at RHIC. The elliptic flow signal, v_2, averaged over transverse momentum, reaches values of about 6% for relatively peripheral collisions and decreases for the more central collisions. This can be interpreted as the observation of a higher degree of thermalization than at lower collision energies. Pseudorapidity and transverse momentum dependence of elliptic flow are also presented.
We present the first measurement of fluctuations from event to event in the production of strange particles in collisions of heavy nuclei. The ratio of charged kaons to charged pions is determined for individual central Pb+Pb collisions. After accounting for the fluctuations due to detector resolution and finite number statistics we derive an upper limit on genuine non-statistical fluctuations, perhaps related to a first or second order QCD phase transition. Such fluctuations are shown to be very small.
The transverse mass spectra of Omega, J/psi and psi' in Pb+Pb collisions at 158 AGeV are studied within a hydrodynamical model of the quark gluon plasma expansion and hadronization. The model reproduces the existing data with the common hadronization parameters: temperature T=T_H = 170 MeV and average collective transverse velocity v_T = 0.2.
The transverse mass spectra of J/psi and psi' mesons and Omega hyperons produced in central Au+Au collisions at RHIC energies are discussed within a statistical model used successfully for the interpretation of the SPS results. The comparison of the presented model with the future RHIC data should serve as a further crucial test of the hypothesis of statistical production of charmonia at hadronization. Finally, in case of validity, the approach should allow to estimate the mean transverse flow velocity at the quark gluon plasma hadronization.
Experiment NA49 at the Cern SPS uses a large acceptance detector for a systematic study of particle yields and correlations in nucleus-nucleus, nucleon-nucleus and nucleon-nucleon collisions. Preliminary results for Pb+Pb collisions at 40, 80 and 158 A*GeV beam energy are shown and compared to measurements at lower and higher energies.
Directed and elliptic flow of charged pions and protons in Pb + Pb collisions at 40 and 158 A GeV
(2003)
Directed and elliptic flow measurements for charged pions and protons are reported as a function of transverse momentum, rapidity, and centrality for 40 and 158A GeV Pb + Pb collisions as recorded by the NA49 detector. Both the standard method of correlating particles with an event plane, and the cumulant method of studying multiparticle correlations are used. In the standard method the directed flow is corrected for conservation of momentum. In the cumulant method elliptic flow is reconstructed from genuine 4, 6, and 8-particle correlations, showing the first unequivocal evidence for collective motion in A+A collisions at SPS energies.
New results from the energy scan programme of NA49, in particular kaon production at 30 AGeV and phi production at 40 and 80 AGeV are presented. The K+/pi+ ratio shows a pronounced maximum at 30 AGeV; the kaon slope parameters are constant at SPS energies. Both findings support the scenario of a phase transition at about 30 AGeV beam energy. The phi/pi ratio increases smoothly with beam energy, showing an energy dependence similar to K-/pi-. The measured particle yields can be reproduced by a hadron gas model, with chemical freeze-out parameters on a smooth curve in the T-muB plane. The transverse spectra can be understood as resulting from a rapidly expanding, locally equilibrated source. No evidence for an earlier kinetic decoupling of heavy hyperons is found.
The large acceptance and high momentum resolution as well as the significant particle identification capabilities of the NA49 experiment at the CERN SPS allow for a broad study of fluctuations and correlations in hadronic interactions. In the first part recent results on event-by-event charge and p_t fluctuations are presented. Charge fluctuations in central Pb+Pb reactions are investigated at three different beam energies (40, 80, and 158 AGeV), while for the p_t fluctuations the focus is put on the system size dependence at 158 AGeV. In the second part recent results on Bose Einstein correlations of h-h- pairs in minimum bias Pb+Pb reactions at 40 and 158 AGeV, as well as of K+K+ and K-K- pairs in central Pb+Pb collisions at 158 AGeV are shown. Additionally, other types of two particle correlations, namely pi p, Lambda p, and Lambda Lambda correlations, have been measured by the NA49 experiment. Finally, results on the energy and system size dependence of deuteron coalescence are discussed.
Rapidity distributions for $\Lambda$ and $\bar{\Lambda}$ hyperons in central Pb-Pb collisions at 40, 80 and 158 A$\cdot$GeV and for ${\rm K}_{s}^{0}$ mesons at 158 A$\cdot$GeV are presented. The lambda multiplicities are studied as a function of collision energy together with AGS and RHIC measurements and compared to model predictions. A different energy dependence of the $\Lambda/\pi$ and $\bar{\Lambda}/\pi$ is observed. The $\bar{\Lambda}/\Lambda$ ratio shows a steep increase with collision energy. Evidence for a $\bar{\Lambda}/\bar{\rm p}$ ratio greater than 1 is found at 40 A$\cdot$GeV.
Bose-Einstein correlations of charged kaons were measured near mid-rapidity in central Pb+Pb collisions at 158 A GeV by the NA49 experiment at the CERN SPS. Source radii were extracted using the Yano-Koonin-Podgoretsky and Bertsch-Pratt parameterizations. The results are compared to published pion data. The measured m_perp dependence for kaons and pions is consistent with collective transverse expansion of the source and a freeze-out time of about 9.5 fm.
We study the behaviour of the effective temperature for K+ in several energy domains. For this purpose, we apply the recently developed SPheRIO code for hydrodynamics in 3+1 dimensions, using both Landau-type compact initial conditions and spatially more spread ones. We show that initial conditions given in small volume, like Landau-type ones, are unable to reproduce the effective temperature together with other data (multiplicities and rapidity distributions). These quantities can be reproduced altogether only when using a large initial volume with an appropriate velocity distribution.
We suggest that the fluctuations of strange hadron multiplicity could be sensitive to the equation of state and microscopic structure of strongly interacting matter created at the early stage of high energy nucleus-nucleus collisions. They may serve as an important tool in the study of the deconfinement phase transition. We predict, within the statistical model of the early stage, that the ratio of properly filtered fluctuations of strange to non-strange hadron multiplicities should have a non-monotonic energy dependence with a minimum in the mixed phase region.
The data on mT spectra of K0S K+ and K- mesons produced in all inelastic p + p and p + pbar interactions in the energy range sqrt(s)NN=4.7-1800GeV are compiled and analyzed. The spectra are parameterized by a single exponential function, dN/(m_T*dm_T)=C exp(-m_T/T), and the inverse slope parameter T is the main object of study. The T parameter is found to be similar for K0S, K+ and K- mesons. It increases monotonically with collision energy from T~30MeV at sqrt(s)NN=4.7GeV to T~220MeV at sqrt(s)NN=1800GeV. The T parameter measured in p+p and p+pbar interactions is significantly lower than the corresponding parameter obtained for central Pb+Pb collisions at all studied energies. Also the shape of the energy dependence of T is different for central Pb+Pb collisions and p+p(pbar) interactions.
Observation of an exotic S = -2, Q = -2 baryon resonance in proton-proton collisions at the CERN SPS
(2003)
Results of resonance searches in the Xi- pi-, Xi- pi+, antiXi+ pi- and antiXi+ pi+ invariant mass spectra in proton-proton collisions at sqrt s=17.2 GeV are presented. Evidence is shown for the existence of a narrow Xi- pi- baryon resonance with mass of 1.862+/-0.002 GeV/c^2 and width below the detector resolution of about 0.018 GeV/c^2. The significance is estimated to be 4.0 sigma. This state is a candidate for the hypothetical exotic Xi_(3/2)^-- baryon with S = -2, I = 3/2 and a quark content of (d s d s ubar). At the same mass a peak is observed in the Xi- pi+ spectrum which is a candidate for the Xi_(3/2)^0 member of this isospin quartet with a quark content of (d s u s dbar). The corresponding antibaryon spectra also show enhancements at the same invariant mass.
Fluctuations of charged particle number are studied in the canonical ensemble. In the infinite volume limit the fluctuations in the canonical ensemble are different from the fluctuations in the grand canonical one. Thus, the well-known equivalence of both ensembles for the average quantities does not extend for the fluctuations. In view of a possible relevance of the results for the analysis of fluctuations in nuclear collisions at high energies, a role of the limited kinematical acceptance is studied.
A non-monotonic energy dependence of the K + / pi + ratio with a sharp maximum close to 30 A GeV is observed in central Pb+Pb collisions. Within a statistical model of the early stage, this is interpreted as a sign of the phase transition to a QGP, which causes a sharp change in the energy dependence of the strangeness to entropy ratio. This observation naturally motivates us to study the production of multistrange hyperons (Xi, Omega) as a function of the beam energy. Furthermore it was suggested that the kinematic freeze-out of Omega takes place directly at QGP hadronization. If this is indeed the case, the transverse momentum spectra of the Omega directly reflect the transverse expansion velocity of a hadronizing QGP. In this report we show preliminary NA49 results on Omega - and Omega + production in central Pb+Pb collisions at 40 and 158 A GeV and compare them to measurements of Xi - and Xi + production in central Pb+Pb collisions at 30, 40, 80 and 158 A GeV.
Report from NA49
(2004)
The most recent data of NA49 on hadron production in nuclear collisions at CERN SPS energies are presented. Anomalies in the energy dependence of pion and kaon production in central Pb+Pb collisions are observed. They suggest that the onset of deconfinement is located at about 30 AGeV. Large multiplicity and transverse momentum fluctuations are measured for collisions of intermediate mass systems at 158 AGeV. The need for a new experimental programme at the CERN SPS is underlined.
The transverse mass mt distributions for deuterons and protons are measured in Pb+Pb reactions near midrapidity and in the range 0<mt–m<1.0 (1.5) GeV/c2 for minimum bias collisions at 158A GeV and for central collisions at 40 and 80 A GeV beam energies. The rapidity density dn/dy, inverse slope parameter T and mean transverse mass <mt> derived from mt distributions as well as the coalescence parameter B2 are studied as a function of the incident energy and the collision centrality. The deuteron mt spectra are significantly harder than those of protons, especially in central collisions. The coalescence factor B2 shows three systematic trends. First, it decreases strongly with increasing centrality reflecting an enlargement of the deuteron coalescence volume in central Pb+Pb collisions. Second, it increases with mt. Finally, B2 shows an increase with decreasing incident beam energy even within the SPS energy range. The results are discussed and compared to the predictions of models that include the collective expansion of the source created in Pb+Pb collisions.
Event-by-event fluctuations of particle ratios in central Pb + Pb collisions at 20 to 158 AGeV
(2004)
In the vicinity of the QCD phase transition, critical fluctuations have been predicted to lead to non-statistical fluctuations of particle ratios, depending on the nature of the phase transition. Recent results of the NA49 energy scan program show a sharp maximum of the ratio of K+ to Pi+ yields in central Pb+Pb collisions at beam energies of 20-30 AGeV. This observation has been interpreted as an indication of a phase transition at low SPS energies. We present first results on event-by-event fluctuations of the kaon to pion and proton to pion ratios at beam energies close to this maximum.
Results are presented on event-by-event electric charge fluctuations in central Pb+Pb collisions at 20, 30, 40, 80 and 158 AGeV. The observed fluctuations are close to those expected for a gas of pions correlated by global charge conservation only. These fluctuations are considerably larger than those calculated for an ideal gas of deconfined quarks and gluons. The present measurements do not necessarily exclude reduced fluctuations from a quark-gluon plasma because these might be masked by contributions from resonance decays.
System-size dependence of strangeness production in nucleus-nucleus collisions at √sNN = 17.3 GeV
(2005)
Emission of pi, K, phi and Lambda was measured in near-central C+C and Si+Si collisions at 158 AGeV beam energy. Together with earlier data for p+p, S+S and Pb+Pb, the system-size dependence of relative strangeness production in nucleus-nucleus collisions is obtained. Its fast rise and the saturation observed at about 60 participating nucleons can be understood as onset of the formation of coherent partonic subsystems of increasing size. PACS numbers: 25.75.-q
Results are presented on Omega production in central Pb+Pb collisions at 40 and 158 AGeV beam energy. Given are transverse-mass spectra, rapidity distributions, and total yields for the sum Omega+Antiomega at 40 AGeV and for Omega and Antiomega separately at 158 AGeV. The yields are strongly under-predicted by the string-hadronic UrQMD model and are in better agreement with predictions from a hadron gas models. PACS numbers: 25.75.Dw
System size and centrality dependence of the balance function in A + A collisions at √sNN = 17.2 GeV
(2004)
Electric charge correlations were studied for p+p, C+C, Si+Si and centrality selected Pb+Pb collisions at sqrt s_NN = 17.2$ GeV with the NA49 large acceptance detector at the CERN-SPS. In particular, long range pseudo-rapidity correlations of oppositely charged particles were measured using the Balance Function method. The width of the Balance Function decreases with increasing system size and centrality of the reactions. This decrease could be related to an increasing delay of hadronization in central Pb+Pb collisions.
System size dependence of multiplicity fluctuations of charged particles produced in nuclear collisions at 158 A GeV was studied in the NA49 CERN experiment. Results indicate a non-monotonic dependence of the scaled variance of the multiplicity distribution with a maximum for semi-peripheral Pb+Pb interactions with number of projectile participants of about 35. This effect is not observed in a string-hadronic model of nuclear collision HIJING.
The hadronic final state of central Pb+Pb collisions at 20, 30, 40, 80, and 158 AGeV has been measured by the CERN NA49 collaboration. The mean transverse mass of pions and kaons at midrapidity stays nearly constant in this energy range, whereas at lower energies, at the AGS, a steep increase with beam energy was measured. Compared to p+p collisions as well as to model calculations, anomalies in the energy dependence of pion and kaon production at lower SPS energies are observed. These findings can be explained, assuming that the energy density reached in central A+A collisions at lower SPS energies is sufficient to transform the hot and dense nuclear matter into a deconfined phase.
Results are presented from a search for the decays D0 -> K min pi plus and D0 bar -> K plus pi min in a sample of 3.8x10^6 central Pb-Pb events collected with a beam energy of 158A GeV by NA49 at the CERN SPS. No signal is observed. An upper limit on D0 production is derived and compared to predictions from several models.
Low energy beam transport (LEBT) for a future heavy ion driven inertial fusion (HIDIF [1]) facility is a crucial point using a Bi+ beam of 40 mA at 156 keV. High space charge forces (generalised perveance K=3.6*10-3) restrict the use of electrostatic focussing systems. On the other hand magnetic lenses using space charge compensation suffer from the low particle velocity. Additionally the emittance requirements are very high in order to avoid particle losses in the linac and at ring injection [2]. urthermore source noise and rise time of space charge compensation [3] might enhance particle losses and emittance. Gabor lenses [4] using a continuous space charge cloud for focussing could be a serious alternative to conventional LEBT systems. They combine strong cylinder symmetric focussing with partly space charge compensation and low emittance growth due to lower non linear fields. A high tolerance against source noise and current fluctuations and reduced investment costs are other possible advantages. The proof of principle has already been shown [5, 6]. To broaden the experiences an experimental program was started. Therefrom the first experimental results using a double Gabor lens (DGPL, see fig. 1 ) LEBT system for transporting an high perveance Xe+ beam will be presented and the results of numerical simulations will be shown.
Rapidity distributions for Lambda and anti-Lambda hyperons in central Pb-Pb collisions at 40, 80 and 158 AGeV and for K 0 s mesons at 158 AGeV are presented. The lambda multiplicities are studied as a function of collision energy together with AGS and RHIC measurements and compared to model predictions. A different energy dependence of the Lambda/pi and anti-Lambda/pi is observed. The anti-Lambda/Lambda ratio shows a steep increase with collision energy. Evidence for a anti-Lambda/anti-p ratio greater than 1 is found at 40 AGeV.
Die vorliegende Arbeit hat es sich zur Aufgabe gemacht, mit der Themenstellung "Netzaktivismus" eine relativ aktuelle Entwicklung aufzugreifen. Als nötig erschien mir hierbei von vornherein, den eigentlichen Kontext des Netzaktivismus, das Internet, einigermaßen genau in den Blick zu bekommen. Ursprünglich war also vorgesehen, zur Einleitung die militärgeschichtliche Herkunft des Internet zu klären und zu bewerten, um dann, anhand der Genese des Internet zu einem Massenmedium unter dem Stichpunkt "Gegenwärtige Nutzungsformen des Internet" der Frage nach der Faszination an diesem neuen Medium nachzugehen. Herausfinden wollte ich dabei, ob die Nutzer sich vornehmlich aktiv oder passiv an dem neuen Medium beteiligen und ob die "Aktivitäten", um die es schließlich in meiner Arbeit geht, überhaupt eine Relevanz für den Großteil der Internetnutzer hat. Dies stellte sich aber als schwieriger heraus, als erwartet. So kann auch in dieser Arbeit wenig darüber gesagt werden, warum denn das Internet in der Gegenwart eine so wichtige Rolle zu spielen scheint. An gegebener Stelle wird noch darauf zurückzukommen sein.
Die Dokumente enthalten jeweils die gleiche Arbeit, allerdings in drei unterschiedlichen Varianten, die sich in der Qualität der Bilder und damit in der Filegröße unterscheiden: * Bilder in voller Druckqualität (8,2 MB): DissWFOM1.pdf (Dokument1) * Photos in reduzierter Auflösung (3,1 MB): DissWFOM2.pdf (Dokument2) * Photos und Zeichnungen in red. Auflösung (1,4 MB): DissWFOM3.pdf (Dokument3)
Cold target recoil ion momentum spectroscopy (COLTRIM) has been employed to image the momentum distributions of continuum electrons liberated in the impact of slow He2+ on He and H2. The distributions were measured for fully determined motion of the nuclei that is as a function of the impact parameter and in a well de ned scattering plane The single ionization (SI) of H2 leading to H2+ recoil ions in nondissociative states (He2+ + H+ -> He2+ + H+ + e-) and the transfer ionization (TI) of H2 leading to H2 dissociation into two free protons (He2+ H2 -> He+ + H+ + H+ + e-) were investigated. Similar measurements have been carried out for He target, the corresponding atomic two electron system, i.e. the single ionization (SI) (He2+ + He -> He+ + He2+ e- and the transfer ionization (TI) (He2+ + He -> He+ + He2+ + e-). These measurements have been exploited to understand the results obtained for H target. In comparing the continuum electron momentum distributions for H2 with that for He, a high degree of similarity is observed. In the case of transfer ionization of H2, the electron momentum distributions generated for parallel and perpendicular molecular orientations revealed no orientation dependence. The in scattering plane electron momentum distributions for the transfer ionization of H2 by He2+ and for the transfer ionization of He by He2e showed that the salient feature of these distributions for both collisions systems consists in the appearance of two groups of electrons with difeerent structures. In addition to the group of the saddle electrons forming two jets separated by a valley along the projectile axis we nd a new group of electrons moving with a velocity higher than the projectile velocity These new fast forward electrons result from a narrow range of impact parameters and appear as image saddle in the projectile frame. In contrast to the transfer ionization of He, the fast forward electrons group disappears in the in scattering plane electron momentum distribution generated for the single ionization of He. Instead of this group another new group of electrons appear These electrons exhibit an amount of backscattering These backward elec trons appear as image saddle in the target frame The structures that the saddle electrons show are owing to the quasi molecular nature of the collision process For the TI of H2, the TI of He and the SI of He, a pi-orbital shape of the electron momentum distribution is observed This indicates the importance of the rotational coupling 2-p-theta -> 2p-pi in the initial promotion of the ground state followed by further promotions to the continuum The backward electrons as well as the fast forward electrons are not discussed in the theoretical literature at all. However, a number of obvious indications of the existence of the backward and fast forward electrons could be seen in the experimental works of Abdallah et al. as well as in the theoretical calculations of Sidky et al One might speculate that electrons which are promoted on the saddle for some time during the collision could finally swing around the He+ ion in the way out of the collision, i.e. either around the projectile in the forward direction as in the TI case forming the fast forward electrons or around the recoil ion in the backward direction as in the SI case forming the backward electrons. This might be a result of the strong gradient, and hence the large acceleration of the screened He+ potential.
The cytochrome bc1 complex is a cornerstone in bioenergetic electron transfer chains, where it carries out tasks as diverse as respiration, photosynthesis, and nitrogen fixation. This homodimeric multisubunit membrane protein has been studied extensively for several decades and the enzyme mechanism is described with the modified protonmotive Q cycle. Still, the molecular and kinetic description of the catalytic cycle is not complete and questions remain regarding the bifurcation of electron transfer at the quinol oxidation (Qo) site, substrate occupancy, pathways of proton conduction, and the nature of the Rieske protein domain movement. We used competitive inhibitors to study the molecular architecture at the Qo site with X-ray crystallography. The structure of the enzyme with the substrate analog 5-n-heptyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazole (HHDBT) bound at the Qo site was determined at 2.5 Å resolution. Spectroscopic studies showed that HHDBT is negatively charged when bound at the active site. Mechanistic interpretations from inhibitor binding are in line with single occupancy model for quinol oxidation and structural analysis supports the proposed proton transfer pathway. For functional insight into the enzyme mechanism, redox-sensitive protonation changes were studied by Fourier transform infrared spectroscopy. The protein purification procedure was optimized for less delipidation and the isolated enzyme was more active. Furthermore, two new phospholipids were identified in the X-ray structures, including a cardiolipin. Strikingly, conserved lipid binding cavities were observed in structural comparison with homologous enzymes. The functional role of tightly bound phospholipids will be discussed. Finally, the Qo site is a target for various compounds of agricultural and pharmaceutical importance. Importantly, the X-ray structures permit detailed analysis of the molecular reasons for acquired resistance to and treatment failure of Qo site inhibitors, such as atovaquone, that is used to treat malaria and pneumonia, as discussed herein.
The cytochrome bc1 complex or ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (QCR) catalyses electron transfer from ubiquinol to cytochrome c in respiration and photosynthesis coupled to a vectorial proton transport across the membrane, in which the enzyme resides. In both bacteria and eukaryotic organisms, QCR participates in supramolecular assembly of membrane proteins that comprise the respiratory or photosynthetic chain. In the present work, proton transfer pathways, substrate binding and the supramolecular assembly of the respiratory chain in yeast were probed by structure-based site-directed mutagenesis and characterization of the variants. Both active sites centre P, the place of quinol oxidation, and centre N, where quinone reduction takes place, lack direct access to the bulk solvent necessary for proton release and uptake. Based on the X-ray structure, proton transfer pathways were postulated. Analysis at centre P showed, that E272 and Y132 of cytochrome b are important for QCR catalysis as indicated by increased superoxide production and lowered Cyc1p reductase activity in these variants. Pre-steady state heme reduction kinetics in combination with stigmatellin resistance indicated that charge and length of the side chain at position 272 are crucial for efficient docking of the ISP to form the enzyme substrate complex and for electron bifurcation at centre P. Variants of Y312 and F129, both residues of cytochrome b, showed an increased Km indicating participation of these residues in coordination of ubiquinol or the possible intermediate semiquinone anion radical. F129 proved to be crucial for a functional Q-cycle as indicated by respiratory negative growth phenotype and a lowered H+/e- stoichiometry of F129 variants. At centre N, the postulated CL/K and E/R proton transfer pathways are located at opposite sites of the bound ubiquinone. Variants in the surface residues R218 (cytochrome b) and E52 (Qcr7) of the E/R pathway and E82 (Qcr7) of the CL/K pathway showed instability upon purification indicating an important role of these residues for QCR integrity. The slowed down centre N reduction kinetics in H85 (CL/K), R218 and N208 (both E/R) variant was attributed to a destabilised semiquinone anion consistent with the observed decreased sensitivity towards the site-specific inhibitor antimycin and an increased Km. Variants of residues of both pathway, E82Q and R218M, exhibited a decreased H+/e- stoichiometry indicating a crucial role of both residue for maintaining a working Q-cycle and supporting the proposed protonation of the substrate via the Cl/K and the E/R pathway. Long-range interaction between centre N and centre P were observed by altered reduction kinetics of the high potential chain and increased superoxide production in the centre N variants. The role of the cation-pi-interaction between F230 of Cyt1p and R19 of cytochrome c in binding of the redox carrier to QCR was analysed. In F230L hydrophobic interaction were partially lost as was deduced from the ionic strength dependence of Cyc1p reductase activity and Cycp1 binding, as detected by ionic strength sensitive Kd and Km for Cyc1p. The decreased enzymatic rate of F230W could be explained by a disturbed binding of Cyc1p to the variant enzyme. F230 may influence the heme mid point potential and thereby the electron transfer rate to Cyc1p. Reduction of Cobp via both centre P and centre N was disturbed suggesting an interaction between high and low potential chain. Supramolecular association between QCR and cytochrome c oxidase (COX) in yeast mitochondria was probed by affinity chromatography of a his-tagged QCR in the presence of the mild detergent digitonin. In comparison to purification with laurylmaltoside, the presence of both QCR and COX subunits was detected in the elution fractions by SDS-PAGE, Cyc1p reductase and TMPD oxidase activity assays and immunoblot analysis. The CL-dependent formation of the supercomplex between QCR and COX was analysed by replacement variants in the CL-binding site of QCR in CL containing and CL free environment. With an increasing number of replacements of the three lysines the CL-binding pocket supercomplex formation was not abolished, when CL is present as shown by BN-PAGE analysis. This was supported by the synergetic decrease in enzyme activity for both enzymes upon increased number of replacements. In the CL-free environment, no supracomplex formation was observed for a wildtype CL binding site. By replacements of two lysines in the CL-binding pocket, supercomplex formation could be recovered as revealed by BN-PAGE. This indicates, that CL may serve as a charge neutralizer for the lysines near the presumed interaction domain between complex III and complex IV. The obtained results for centre P provide new information of residues critical for stabilisation of ubiquinol and controlling electron short circuit reactions. The observations for centre N variants clearly support the proposed two proton transfer pathways and the role of the bound phospholipids in centre N kinetics. Variants in the Cyc1p binding site suggest a role for F230 both in Cyc1p binding and electron transfer. Clear interaction between the high and low potential chain in both Cyt1p and centre N variants strongly support long-range interactions in the complex. Studies on the supramolecular association of complex III and complex IV indicate a new role of Cl in stabilising a supracomplex.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
Das Projekt zum Thema - literarisch-essayistische Reisen zu Beginn der 70er Jahre bei Rolf Dieter Brinkmann, Rom, Blicke und Bernward Vesper, Die Reise stellt ein Experiment dar. Es geht um die wissenschaftliche Bestandsaufnahme des Phänomens 1968 und um das Motiv "Resignation". Die Annäherung erfolgt im Teil A auf wissenschaftlicher Basis, die sich im Teil B in eine literarische Herangehensweise wandelt.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
Remodeling of extracellular matrix (ECM) is an important physiologic feature of normal growth and development. In addition to this critical function in physiology many diseases have been associated with an imbalance of ECM synthesis and degradation. In the kidney, dysregulation of ECM turnover can lead to interstitial fibrosis, and glomerulosclerosis. The major physiologic regulators of ECM degradation in the glomerulus are the large family of zinc-dependent proteases, collectively refered to matrix metalloproteinases (MMPs). The tight regulation of most of these proteases is accomplished by different mechanisms, including the regulation of MMP gene expression, the processing and conversion of the inactive zymogen by other proteases such as serine proteases and finally the inhibition of active MMPs by endogenous inhibitors of MMPs, denoted as tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). Namely, the MMP-9 has been shown to be critically involved in the dysregulation of ECM turnover associated with severe pathologic conditions such as rheumatoid arthritis or fibrosis of lung, skin and kidney. In the present work I searched for a possible modulation of MMP-9 expression and/or activity in glomerular mesangial cells which are thought as key players of many inflammatory and non-inflammatory glomerular diseases. I found that various structurally different PPARalpha agonists such as WY-14,643, LY-171883 and fibrates potently suppress the cytokine-induced MMP-9 expression in renal MC. Furthermore, I demonstrate that the inhibition of MMP-9 expression by PPARalpha agonists was paralleled by a strong increase of cytokine-induced iNOS expression and subsequent NO formation, suggesting that PPARalpha-dependent effects on MMP-9 expression level primarily result from alterations in NO production which in turn reduces the MMP-9 mRNA half-life. Searching for the detailed mechanism of NO-dependent effects on MMP-9 mRNA stability, I found that NO either given from exogenous sources or endogenously produced increases the MMP-9 mRNA degradation by decreasing the expression of the mRNA stabilizing factor HuR. Furthermore, I demonstrate a reduction in the RNA-binding capacity of HuR containing complexes to MMP-9 ARE motifs in cells treated with NO. Since the reduction of HuR expression can be mimicked by the cGMP analog 8-Bromo-cGMP, I suggest that NO reduces in a cGMP-dependent manner the expression of HuR. Finally, I elucidated the modulatory effect of extracellular nucleotides, mainly ATP, on cytokine-triggered MMP-9 expression. Interestingly, I found that in contrast to NO, gamma-S-ATP the stable analog of ATP potently amplifies the IL-beta mediated MMP-9 expression. The increase in mRNA stability was paralleled by an increase in the nuclear-cytosolic shuttling of the mRNA stabilizing factor HuR. Furthermore, I demonstrate an increase in the RNA-binding capacity of HuR containing complexes to the 3'-UTR of MMP-9 by ATP. In summary, the data presented here may help to find new targets (posttranscriptional regulation) that could be used to manipulate or modulate the expression of not only MMP-9 but also other genes regulated on the level of mRNA stability.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
Die Komplexität des durch 2-Aminoacetophenon (AAP) ausgelösten "Untypischen Alterungstones" (UTA) in Weinen wurde im Zusammenhang mit pflanzenbaulichen und mikrobiologischen Einflussfaktoren diskutiert. Neben einem Überblick über den Stand der Forschung wurde der Wirkzusammenhang zwischen Pflanzen- und Mikroorganismenstress verdeutlicht. Indol-3-essigsäure (IAA) gilt als wesentliche Vorstufe für die Bildung von AAP. Die Funktion und Wirkung des Pflanzenhormons IAA wurde vorgestellt, um die Bildung und den Stoffwechsel in der Pflanze in Verbindung mit der Metabolisierung durch Mikroorganismen zu diskutieren. Die mögliche Bedeutung des Elicitors Jasmonsäure konnte gezeigt werden. Um die Faktoren der typischen Weinentwicklung von denen der atypischen zu trennen, wurden zunächst die Einflüsse verschiedener Rebsorten, Rebsortenklone und der Gärungsbedingungen als substratdeterminierende Faktoren für die Hefen durch Mikrovinifikationen und Modellgärungen auf wertbestimmende Inhaltsstoffe untersucht. Die Zusammenhänge zwischen Umwelt- und Substrateinflüssen einerseits und dem Auftreten des UTA andrerseits wurden untersucht. Zum Schutz der Pflanze vor UV-B-Strahlung wurde ein Absorber in die Laubwand bzw. Traubenzone versprüht. Der Einfluss kurzwelliger energieintensiver Strahlung (UV-B) auf die Bildung fehltonrelevanter Verbindungen wie AAP und Skatol wurde festgestellt. Die in Verbindung mit dem UTA stehenden Substanzen AAP und Skatol konnten durch UV-B-Schutzmassnahmen sowie einer Blattdüngung und einer Argininsupplementierung des Mostes reduziert werden. Die Bildung wertbestimmender Inhaltsstoffe während der Weinbereitung steht im engen Zusammenhang mit pflanzenbaulichen und mikrobiologischen Parametern. Der Wirkungs-zusammenhang zwischen Pflanzen- und Mikroorganismenstress und seine Auswirkungen auf die Bildung von dem "UTA" zuzurechnenden unerwünschten Aromasubstanzen wurde aufgezeigt. Ein Stress-Organismus-Reaktions-Modell für Pflanzen zur Beschreibung von Stressreaktionen auf Umwelteinflüsse und ein Erklärungsansatz des "UTA" wurde erstellt. Vor dem Hintergrund der Beobachtungen wurde eine Stressdefinition für Mikroorganismen entwickelt.
Es wurden Untersuchungen über die Stoffwechselleistungen der im Most und Wein vorkommenden Essigsäurebakterien der Gattungen Acetobacter (13 Stämme) und Gluconobacter (2 Stämme) während der Weinbereitung durchgeführt. Die 15 Stämme der Essigsäurebakterien stammten aus der Sammlung des Fachgebiet Mikrobiologie und Biochemie Forschungsanstalt Geisenheim sowie aus der CCM (Czechoslovak Collection of Microorganisms). Die Stoffwechselleistungen, die unter Berücksichtigung des Zucker-Säure-Stoffwechsels beobachtet wurden, wurden bei Trauben der Sorten Riesling, Rotberger, Portugieser und Reichensteiner, den Mosten der Sorten Riesling, Portugieser und Rotberger und den Weißweinen der Sorten Riesling, Müller Thurgau und Rotwein eines Sortengemisches sowie Weiß- und Rotweinen verschiedener Jahrgänge aus Tunesischen Weinanbaugebieten durchgeführt. Die Essigsäurebakterien wurden auf die Nährböden (Traubenbeeren, Moste und Weine) beimpft und nach festgelegten Zeiten geerntet und analysiert. Die Beimpfung der Traubenbeeren erfolgte durch Besprühen der intakten und angestochenen Beeren mit den Bakterienkulturen. Im Verlauf der Arbeit wurden verschiedene Analyseverfahren angewandt. Dünnschichtchromatographie wurde für die qualitative Analyse der Zuckersäure eingesetzt. Die Ketozuckersäuren wurde durch Flüssigchromatographie sowie HPLC bestimmt. Außerdem auch für die Bestimmung organischer Säuren, Zucker und Alkohole. Ethanol wurden auch mit Titration nach der Methode von Rebelein bestimmt. Gluconsäure, Essigsäure, Glucose, Fructose, D- und L-Milchsäure sowie Dihydroxyaceton wurden enzymatisch spektrophotometrisch quantifiziert. Der Vergleich der Ergebnisse von intakten und angestochenen Beeren zeigte, dass bei angestochenen Beeren ein schnelleres Wachstum der Essigsäurebakterien und damit auch höhere Stoffwechselleistungen erfolgten. Gluconsäure, 2-Ketogluconsäure, 5-Ketogluconsäure sowie 2,5-Diketogluconsäure können von verschiedenen Essigsäurebakterienstämmen produziert werden. Es scheint so, als ob die verschiedenen Arten der Essigsäurebakterien spezifische Muster der Gluconsäure Oxidationprodukte aufweisen. In synthetischen Medien produzierten Essigsäurebakterien große Menge Gluconsäure. Nach 30 Tage produzierten Essigsäurebakterien der Stämme Acetobacter aceti var. aceti, A. liquefaciens Stamm 1347-2, A. xylinum und Gluconobacter oxydans var. suboxydans im Glucosemedium jeweils mehr als 40 g/l Gluconsäure. 5-Ketogluconsäure wurden in allgemein mehr als 2-Ketogluconsäure produziert. Von allen beobachteten Stämmen produzierte nur A. liquefaciens 2,5-Diketogluconsäure. Sowohl in den roten- als auch in den weißen Traubenbeeren produzierten sie Gluconsäure und ihre Oxidationsprodukte. In 15 Tagen wurden bis 11,5 g/l Gluconsäure, 5,3 g/l 2-Ketogluconsäure und bis 9,8 g/l 5-Ketogluconsäure produziert. Das Wachstum der Essigsäurebakterien in den Weinen verlief sehr langsam. In den Weinen wurden von den Essigsäurebakterien nur Essigsäure produziert. Die Produktion von Essigsäure war bei den unterschiedlichen Stämme sehr verschieden. A. aceti var. aceti produzierte die höchste Konzentration von Essigsäure sowohl bei Rotwein als auch bei Rieslingwein. A. aceti var. aceti produzierte bis 87 g/l in Rotwein und bis 61 g/l in Rieslingwein Bei Untersuchungen fertiger Weine wurden außer Gluconsäure auch 2-Ketogluconsäure, 5-Ketogluconsäure und 2,5-Diketogluconsäure gefunden, die auf den Stoffwechsel der Essigsäurebakterien aus Glucose und Gluconsäure zurückgeführt werden müssen. In den untersuchten fertigen Weinen aus Tunesien wurde 0,2 - 7,4 g/l Gluconsäure, 2 - 35 mg 2-Ketogluconsäure, 6 - 30 mg/l 5-Ketogluconsäure und bis 14 mg 2,5-Diketogluconsäure analysiert. Nach den vorliegenden Untersuchungsergebnissen stammen die hohen Gluconsäurekonzentrationen in den Weinen von Gluconobacter oxydans. Die Herkunft der Gluconsäure in diesen Weinen aus dem Stoffwechsel von Essigsäurebakterien wird durch die hochsignifikanten Beziehungen zwischen Gluconsäure und 2-Ketogluconsäure, sowie 2,5-Diketogluconsäure belegt.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kurzlebiges Gas, welches in biologischen Systemen verschiedene Funktionen übernehmen kann. Abhängig von der Konzentration ist NO ein zweischneidiges Schwert bezüglich seiner biologischen Effekte, da es in hohen Dosen proapoptotisch und in physiologischen Dosen anti-apoptotisch wirkt. Das von der eNOS in Endothelzellen gebildete NO ist ein wichtiger Faktor für die Gefäßrelaxation, ein antiinflammatorisches Molekül, ein zentraler Faktor für die Angiogenese und es inhibiert die Apoptose. Die reversible Modifikationen der Funktion von Zielproteinen durch S-Nitrosylierung ist ein Mechanismus, wie NO seine Effekte mediert. In den letzten Jahren sind eine Vielzahl von Zielproteinen entdeckt worden, deren Funktion durch S-Nitrosylierung modifiziert werden, die deutlich machen, dass S-Nitrosylierung die Funktion eines Signaltransduktionsmechanismus übernimmt. Da in humanen T-Zellen zum erstenmal auch eine Denitrosylierung beobachtet werden konnte, sollten in dieser Arbeit Mechanismen, die der Balance zwischen S-Nitrosylierung und Denitrosylierung zu Grunde liegen, untersucht werden. Dafür wurden zunächst Methoden zum Nachweis der S-Nitrosylierung etabliert. Zum einen zur Quantifizierung der S-Nitrosylierung in Endothelzellen der modifizierte Saville- Griess Assay und der DAN-Assay und zum anderen zur qualitativen Analyse der S-Nitrosylierung die biotin switch method. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Stimulation der NO-Freisetzung mittels Applikation von laminarer Schubspannung der Gehalt an S-Nitrosylierung in HUVEC erhöht wird und auch die katalytische Untereinheit der Caspase-3 p17, ein bekanntes Zielprotein, verstärkt S-nitrosyliert wird. In einem in vitro Modell des Alterns konnte gezeigt werden, dass einhergehend mit der Reduktion der Proteinexpression der eNOS auch der Gehalt an S-Nitrosylierung, und damit die Bioverfügbarkeit von NO, reduziert ist. Nach Inkubation mit dem pro-apoptotischen TNFa und dem pro-atherogenen oxLDL konnte eine drastische Zunahme der Apoptosesensitivität von alternden HUVEC gegenüber diesen Stimuli beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die zentrale Rolle der Bioverfügbarkeit von NO für das Überleben der Endothelzelle. Zusätzlich konnte eine Denitrosylierung nach Inkubation von Endothelzellen mit TNFa oder oxLDL nach 18 h nachgewiesen werden. Durch Analyse mittels der biotin switch method wurde deutlich, dass dabei nicht nur der Gesamtgehalt an S-nitrosylierten Molekülen reduziert wird, sondern auch spezifische Zielproteine in unterschiedlicher Stärke denitrosyliert werden. Diese Daten machen deutlich, dass es sich bei der S-Nitrosylierung um einen differentiell regulierten Signaltransduktionsmechanismus handelt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Strategie zur Identifizierung einer potentiellen Nitrosylase entwickelt, bei dem ein synthetisches, in vitro S-nitrosyliertes Peptid als Substrat verwendet wird. Weiterhin sollten neue Zielproteine für die S-Nitrosylierung identifiziert werden. Tatsächlich konnte ein neues Zielprotein für die S-Nitrosylierung, die Oxidoreduktase Thioredoxin identifiziert werden. Thioredoxin wird ubiquitär in Säugetierzellen exprimiert und ist ein essentieller Faktor für die Aufrechterhaltung des intrazellulären Redox-Status. Mit den Cysteinen an Position 32 und 35 besitzt Thioredoxin eine redox-regulatorische Domäne, die essentiell für seine Funktion als Oxidoreduktase ist. Neben seiner Funktion als Redox- Regulator, kann Thioredoxin Transkriptionsfaktoren wie z.B. NfK-B aktivieren und über die redox-regulatorische Domäne die pro-apoptotische Kinase ASK-1 binden und inhibieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Thioredoxin an Cystein 69 S-nitrosyliert wird und dass der Gehalt an S-nitrosylierten Molekülen von der Proteinexpression des Thioredoxin abhängt. Desweiteren ist die S-Nitrosylierung von Thioredoxin in Endothelzellen wichtig für die Entfaltung seiner vollständigen Reduktaseaktivität. Für die zum erstenmal in Endothelzellen gezeigte anti-apoptotische Funktion von Thioredoxin wird sowohl die S-Nitrosylierung an Cystein 69 als auch die redox-regulatorische Domäne benötigt. Durch diese Experimente konnte eine neue wichtige Funktion von Thioredoxin für NOproduzierende Zellen beschrieben werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die S-Nitrosylierung in Endothelzellen ein Signaltransduktionsmechanismus ist, der sowohl durch protektive, als auch durch pathophysiologische Stimuli spezifisch reguliert wird. Die weitere Charakterisierung dieser Vorgänge könnte einen tieferen Einblick in die Biologie und Funktion der Endothelzelle geben. Zusätzlich konnte durch das neue Zielprotein Thioredoxin die direkte Verknüpfung von NO mit dem Redox-Status der Zelle und die zentrale Rolle von Thioredoxin für den Gehalt an S-Nitrosylierung in Endothelzellen gezeigt werden. Identifizierung weiterer Regulationsmechanismen für die S-Nitrosylierung könnte ein genaueres Verständnis dieses Wirkmechanismus von NO und somit eine bessere Protektion des Endothelzellmonolayers in den Gefäßen ermöglichen.
Fourier-Transform Infrarot Differenz Spektroskopie ist eine Methode. die es erlaubt, selbst kleinste konformelle Änderungen in der Umgebung der katalytischen Zentren in Enzymen selektiv und mit hoher Zeitauflösung zu messen. Diese Technik wurde an Oxidasen von Paracoccus denitrificans, Thermus thermophilus und Escherichia coli angewandt, um einen Einblick in strukturelle und molekulare Prozesse der Bindung und Dynamik von Liganden am binuklearen Zentrum zu erhalten. Die pH- und Temperatur-Abhängigkeit von CO Schwingungsmoden sowie deren Verhalten nach der Photolyse konnten zeitaufgelöst untersucht und miteinander verglichen werden. Bei Temperaturen >180K war die Bestimmung von thermodynamischen Parametern wie Enthalpie-Barrieren und Arrhenius-Vorfaktoren möglich. Aus dem Verlauf der Rückbindungskinetiken ließen sich ferner Rückschlüsse über die konformelle Heterogenität der Bindung ziehen. Für Temperaturen um 140K konnte das Protein im "quasistationären" Zustand vermessen werden, da Rückreaktionen des Liganden an die Bindungsstelle des Häm a3 unterbunden waren. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit und analoger Funktion zeigten diese typischen Oxidasen große Unterschiede sowohl im Reaktionszentrum als auch im kinetischen Verhalten des Liganden. Die kinetischen Parameter für alle untersuchten Oxidasen weichen deutlich voneinander ab und spiegeln unter anderem die Stärke der Bindung am CUB wider. Die Temperaturabhängigkeit der Populationen der CO-Konformere und die äquivalente Rückbindungs-Kinetik der unterschiedlichen Konformere in den Oxidasen aus dem thermophilen System weisen auf ein strukturelles Merkmal in der Nähe des binuklearen Zentrums hin, das den Populations-Austausch in anderen Oxidasen unterbindet. Aufgrund der pH-Abhängigkeit der entsprechenden Oxidasen kann man schließen, daß diese Eigenschaft durch eine oder mehrere protonierbare Gruppen bewirkt wird, die die unterschiedlichen Konformere in bestimmten Positionen fixiert hält. Die Rückbindungsraten des Liganden zeigen für die T. thermophilus Oxidasen eine Rückbindung erster Ordnung. was auf eine homogene Verteilung der zwei Konformer-Populationen im Enzym deutet. Hingegen zeigte die Oxidase aus P. denitrificans für die Rückbindung eine Verteilung der Reaktionsraten. Ursache dafür ist ein sehr heterogenes Ensemble an Proteinen, das minimale strukturelle Unterschiede im Konformationsraum des Reaktionszentrums aufweist. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war die Beobachtung von Absorptionsbanden der Hämpropionate an Cytochrome c Oxidase von Paracoccus denitrificans nach CO Rückbindung. Sowohl über 13C-isotopenmarkierte Hämpropionate als auch über ortsgerichtete Mutagenese in deren unmittelbarer Umgebung konnten definierte Banden-Zuordnungen im IR-Differenzspektrum erhalten werden. Experimente am Enzym mit Mutationen an der Stelle Asp 399 zeigten, daß die strukturellen Eigenschaften des Häm a3-CuB Zentrums im wesentlichen von dieser Veränderung nicht beeinflußt werden. Jedoch war die pH-Abhängigkeit der CO Konformere hier unterbunden, was auf deren Einfluß auf eine Protonierbarkeit im Wildtyp-Enzym hinweist. Rückschlüsse anhand der Mutante Asp399Asn zeigten (über den Verlust der pH-Abhängigkeit) ganz klar, daß alle unterschiedlichen CO-Konformere funktionell intakt sind. FT-IR Messungen an einem weiteren Enzym, der isolierten Cytochrom bd Oxidase aus E. coli, zeigten bei einer Untersuchung der CO Rückbindungs-Eigenschaften bei 84K die ausschließliche Rückbindung an das Häm d. der möglichen Sauerstoff-Bindungsstelle. Die Bindungsstelle an Häm b, die zu ca. 5% ebenfalls CO bindet, kann bei diesen Temperaturen nicht wiederbesetzt werden. Im typischen Spektralbereich von 1680 bis 1760 cm hoch minus 1 konnten eindeutig die Absorptionsbanden von Asparagin- oder Glutaminsäure-Seitenketten identifiziert werden. Über einen direkten Vergleich der Spektren, die über Redox-Reaktion und CO Rückbindung erhalten wurden, konnten diese Signale als klar in der direkten Umgebung des binuklearen Zentrums lokalisiert zugeordnet werden. Eine Rolle als vorübergehender Protonen-Akzeptor/Donor auf dem Weg zur Sauerstoff-Bindungsstelle ist naheliegend.