Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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In der vorliegenden Arbeit wird die Identifizierung von Genen der Carotinoid Biosynthese (crt) aus den Coryneformen Bakterien Brevibacterium linens und Brevibacterium flavum beschrieben. Hierbei konnten sechs neue crt Gene durch funktionelle Komplementierung bestimmt werden. Außerdem wurde erstmalig die Carotinoid Biosynthese von B. flavum, darunter auch drei neue Carotinoide, beschrieben. Voraussetzung für die Klonierung der crt Gene aus B. linens war die Entwicklung eines geeigneten Komplementierungssystems. Dieses System wurde in Carotinoidmutanten von B. flavum entwickelt. So konnte eine B. linens ExpressionsBibliothek nach Passage durch mehrere E. coliStämme, unter Umgehung des starken B. flavumRestriktionssystems, in B. flavumCarotinoidmutanten auf crt Genexpression hin untersucht werden. . Durch Komplementierung der Carotinoidmutanten von B. flavum konnte das Gen der Phytoen Synthase (crtB) aus B. linens funktionell kloniert werden. Mit diesem Gen als Sonde wurde aus einer B. linensCosmid Bibliothek das gesamte crt Gencluster isoliert. Auf dem sequenzierten DNAFragment von B. linens befanden sich 14 offene Leseraster mit Ähnlichkeiten zu Sequenzen aus Datenbanken. Durch Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen konnte die Gene einer GGPP Synthase (crtE), einer Phytoen Synthase (crtB) und einer Phytoen Desaturase (crtI) bestimmt werden. Außerdem wurden erstmalig die Gene einer IPP Isomerase und einer DNAPhotolyase in einem crt Gencluster identifiziert. Durch heterologe Expression in B. flavum konnte das neue Gen einer bCarotin Desaturase (crtU) funktionell nachgewiesen werden. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das bCarotin in das aromatische Carotin Isorenieraten umsetzt. Ebenfalls durch heterologe Expression in B. flavum wurden zwei neue Gene (crtYc und crtYd) gefunden, deren Genprodukte gemeinsam die Zyklisierung von Lycopin zu bCarotin katalysieren. Die errechnete Molmasse dieser beiden Lycopin Zyklasen ist mit 12,5 und 13,9 kDa ungewöhnlich klein. Die zwei Lycopin Zyklasegene aus B. linens kodieren für eine neue Klasse von Lycopin Zyklasen. Es bestehen keine Sequenzähnlichkeiten dieser neuen Gene zu bisher bekannten Lycopin Zyklasegenen oder zu anderen Genen bekannter Funktion. Durch die partielle Deletion einer cDNA mit Lycopin Zyklase und Phytoen Synthaseaktivität (crtYB) aus dem Pilz Xanthophyllomyces dendrorhous konnte gezeigt werden, daß die Zentren der beiden Aktivitäten in unterschiedlichen Regionen des gebildeten Polypeptids sitzen. Die Phytoen Synthaseaktivität des Genproduktes geht auf einen Bereich des Polypeptids zurück, der Sequenzähnlichkeiten zu Phytoen Synthasen anderer Organismen aufweist. Das Zentrum der Lycopin Zyklaseaktivität liegt in dem Nterminalen Bereich des Polypeptids, der interessanterweise Sequenzähnlichkeiten zu den beiden Lycopin Zyklasen aus B. linens aufweist. Dieses Fusionsgen crtYB ist das erste bekannte Gen einer pilzlichen Lycopin Zyklase. Die Entwicklung der pilzlichen crtYB Fusionsgene aus crtB und Lycopin Zyklasegenen des in B. linens gefundenen Typs wird diskutiert. Die Hauptcarotinoide von B. flavum wurden als die C 50 Carotinoide Decaprenoxanthin, Decaprenoxanthin Monoglucosid und Decaprenoxanthin Diglucosid bestimmt. Bei der Analyse von B. flavumPigmentmutanten wurden außerdem die neuen Carotinoide Nonapren [2(3Methyl2butenyl)e, ycarotin], Flavuxanthin [2,2'Bis(4hydroxy3 methyl2butenyl)y, ycarotin] und Nonaflavuxanthin [2(4Hydroxy3methyl2 butenyl)y, ycarotin] als Intermediate identifiziert. Basierend auf den nachgewiesenen Carotinoiden konnte der vermutliche C 50 Carotinoid Biosyntheseweg für B. flavum vorgeschlagen werden. Durch Sequenzanalyse von B. flavumTransposonmutanten konnten erstmalig crt Gene der C 50 Carotinoid Biosynthese isoliert werden. Auf dem crt Gencluster von B. flavum konnten die Gene crtE, crtB und crtI aufgrund von Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen bestimmt werden. Heterologe Expression in E. coli und Geninaktivierung durch homologe Rekombination in B. flavum zeigten, daß die Produkte von drei weiteren Genen ausreichen, um die C 50 Carotinoide von B. flavum zu bilden. Das Produkt eines neuen Lycopin Elongasegens (crtEb) verlängert Lycopin an Position C2 und C2' um jeweils eine C 5 Isopreneinheit und bildet ein azyklisches C 50 Carotinoid. Dieses wird von den Produkten der neuen C 50 Zyklasegene crtYe und crtYf zu einem zyklischen C 50 Carotinoid umgesetzt. Die Ergebnisse zeigen, daß entgegen früherer Vorstellungen, die Addition einer Isopreneinheit und die Zyklisierung bei der Bildung von zyklischen C 50 Carotinoiden zwei getrennte Schritte sind.
Isolation des Carotinoidbiosynthese Genclusters aus Flavobacterium spec P99-3. Das isolierte Gencluster von 15 kb Größe zeigt 7 offene Leseraster, die auf Grund ihrer Sequenzhomologie Carotinoidgenen zugeordnet werden können oder anhand von Komplementationen in einem heterologen Expressionssystem in E. coli mit anschließender HPLC-Analayse eine eindeutige Funktion im Biosysnthesewegs des selten vorkommenden Myxols zugeordnet werden kann.
Time-resolved spectroscopic analysis of fucoxanthin-chlorophyll proteins and isolated carotenoids
(2011)
The aim of this thesis was to elucidate the excitation energy transfer in the fucoxanthin-chlorophyll proteins (FCPs) isolated from the diatom Cyclotella meneghiniana in detail and to clarify the role of the different pigments contained. In a first step the excited state dynamics of the free pigments were studied by means of time-resolved absorption spectroscopy. The FCPs contain three different carotenoid species. Besides the main light-harvesting carotenoid fucoxanthin (fx) the xanthophyll cycle pigments diadinoxanthin (ddx) and diatoxanthin (dtx) are found in substoichiometric amounts. Fx is contained in an unusual carotenoid-to-chlorophyll ratio of about one. In case of ddx and dtx, changing the solvent polarity showed no significant effects on the absorption spectrum and the excited state dynamics were hardly influenced. In contrast, a solvent dependence is observed in the absorption spectrum and excited state dynamics of fx. The S1 lifetime depends strongly on the solvent polarity and an additional broad excited state absorption band red shifted compared to the S1 excited state absorption appears. The occurrence of the described features can be explained with an intramolecular charge transfer state, which is stabilized in a polar environment and appears only in carotenoids with a conjugated carbonyl group. Despite its rather short excited state lifetimes of less than 200 fs (S2) and 30-60 ps (S1), fx acts as a very efficient energy donor in the FCPs. The ultrafast energy transfer dynamics of the isolated proteins FCPa and FCPb were investigated in a comprehensive study using transient absorption in the visible and NIR spectral region complemented with polarized transient absorption spectroscopy. The excitation energy transfer was not influenced significantly by changing the light conditions during the growth, which yields an altered amount of ddx and dtx. It can be concluded that the contribution of the xanthophyll cycle pigments to the energy transfer is not significant. The altered oligomerization state results in a more efficient energy transfer for the trimeric FCPa, which is also reflected in different Chl a fluorescence quantum yields. Thus, an increased quenching in the higher oligomers of FCPb can be assumed. The observed dynamics change drastically for two different excitation wavelengths λ = 500 nm and λ = 550 nm, which both lead to the population of the S2 excited state of individual carotenoids, namely blue and red absorbing fx molecules. The differing absorption maxima result from distinct microenvironments within the protein. For FCPa an additional slow time constant of 25 ps was found after excitation at 500 nm. By means of polarized transient absorption spectroscopy applied to FCPa different transition dipole moments for the S1 and the ICT state of fx could be identified. Based on the presented studies a detailed model explaining the excitation energy transfer pathways could be developed. In agreement with the faster overall transfer rate which is also evident in the anisotropy data in case of 550 nm excitation, upon excitation at 500 nm one slow transfer channel is active. It can be attributed to a blue absorbing fx not strongly associated with a Chl a molecule. Most likely excitation energy transfer takes place between the S1/ICT states of two different fx molecules before the energy is transferred to Chl a. Additional transient absorption experiments with an improved time resolution were performed to investigate the oscillations observed. These coherent effects superimposed the kinetics of isolated carotenoids as well as FCPs within the first 500 fs. The oscillations showed a very unusual damping behavior and vanished already after two oscillation periods. In case of fx, the solvent environment as well as the excitation wavelengths had an influence on the oscillations. The frequencies of the oscillations were 70-100 cm^-1 for fx in solvents with varying polarity and 50-80 cm^-1 for the FCPs. These results could further confirm the assumption that the red absorbing fx molecules are located in a more polar environment within the protein compared to the blue absorbing fx. To clarify the origin of the oscillations in more detail, further experiments with a controlled chirp of the applied pulses and comparison between different carotenoids in various solvents are required. This approach promises to give further insight in the excited state dynamics and to answer the question whether dark states are involved. Right now, the coherent excitation of the strongly coupled excited states 1Bu+ (S2) and 1Bu- resulting in electronic quantum beats and the existence of an additional short lived excited state absorption (S2-SN2) in the visible spectral region are the most reasonable explanations for the occurrence of the coherent effects in the transient absorption spectra of carotenoids.
In dieser Arbeit wurde der Hefepilz Xanthophyllomyces dendrorhous als vielseitige biotechnologische Plattform für die Produktion von Carotinoiden verwendet. Durch genetische Modifikationen der Carotinoidbiosynthese wurde ein Astaxanthin-Hochproduzent zur Akkumulation des farblosen Phytoens, das die menschliche Haut vor der schädlichen Wirkung der UV-Strahlung schützt und des gelben Zeaxanthins, das zur Förderung und Erhalt der Sehfähigkeit beiträgt, befähigt. Zur Generierung eines Phytoen-Hochproduzenten wurde das Gen crtI (Phytoen-Desaturase) inaktiviert und der Phytoengehalt durch Überexpression der Gene HMGR, crtE und crtYB gesteigert. Die Generierung eines Zeaxanthin-Hochproduzenten beinhaltete die Inaktivierung des Gens asy (Astaxanthin-Synthase) und die heterologe Expression einer bakteriellen ß-Carotin-Hydroxylase CrtZoXd.
Die Inaktivierung der Gene erfolgte mit spezifischen Knock-Out-Konstrukten, die mittels homologer Rekombination in crtI oder asy integrierten. Nachdem die Transgene auf Vektoren mit verschiedenen Antibiotikaresistenzen kloniert wurden, wurde die Überexpression durch genomische Integration in die ribosomale DNA erreicht. Anschließend wurde die Carotinoidzusammensetzung der Zellextrakte durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie an einer C18-Trennsäule oder durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Der Knock-Out-Nachweis erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion und Amplifikation der Genloci, während die Anzahl integrierter Carotinoidgene durch quantitative Real-Time-PCR bestimmt wurde. Die Kultivierungen von X. dendrorhous wurden sowohl in Schikanekolben als auch in einem 2L-Bioreaktor durchgeführt.
Im Zuge der genetischen Modifikationen konnte der Ploidiegrad des Wildtyps bestimmt werden, der bis dahin unbekannt war. Durch das Auftreten von instabilen heterozygoten Stämmen und deren Überführung zu stabilen Homozygoten wurde die Existenz eines diploiden Genoms nachgewiesen. Um die für die biotechnologische Anwendung notwendige Stabilität der Carotinoidbiosyntheseleistung zu erreichen, wurden zwei Strategien entwickelt. Hierbei erfolgte die Stabilisierung der Stämme als Folge mitotischer Rekombination nach Subkultivierung und anschließender Farbselektion oder durch Induktion des sexuellen Zyklus und Sporulation.
Der crtI-Knock-Out führte zur Akkumulation von 3,6 mg/g dw Phytoen. Anschließend wurde die Limitierung der Phytoensynthese durch crtYB-Überexpression aufgehoben und die Versorgung der Carotinoidbiosynthese mit Vorläufermolekülen durch HMGR- und crtE-Überexpression erhöht. Im Bioreaktor wurde durch die Anwendung eines dreistufigen Fed-Batch-Prozesses, der eine effiziente Glucoseverwertung sicherstellte, mit 10,4 mg/g dw die höchste bis dato publizierte zelluläre Phytoenkonzentration im stabilisierten Hochproduzenten erreicht.
Der asy-Knock-Out führte zur Akkumulation von 4,5 mg/g dw ß-Carotin, das anschließend durch heterologe Expression der codon-optimierten ß-3,3-ß-Hydroxylase crtZoXd im Hochproduzenten zu 3,5 mg/g dw Zeaxanthin umgesetzt wurde. Zur Optimierung des Vorgehens wurden Knock-In-Konstrukte entwickelt, mit denen beide Schritte (Knock-Out und Integration von Carotinoidgenen) in nur einem molekular-biologischen Schritt durchgeführt und 94 % des in einem Wildtypstamm vorhanden ß-Carotins zu Zeaxanthin umgesetzt wurden. Die Optimierung der Wachstumsbedingungen bei der Bioreaktor-Kultivierung des stabilisierten Zeaxanthinproduzenten führte mit 10,8 mg/L zu einem 5-fach höheren Zeaxanthingehalt im Vergleich zur Schikane-Kultivierung.
Durch den Einsatz der Pentosen Arabinose und Xylose als alternative Kohlenstoffquellen wurde der Carotinoidgehalt der Phytoen- und Zeaxanthin-Hochproduzenten um 70 bzw. 92 % im Vergleich zur Glucose-Kultivierung gesteigert, wobei die Gründe für diesen Effekt in einer stärkeren Kohlenstoffverwertung und der Hemmwirkung von Glucose vermutet wurden. Aus verschiedenen pflanzlichen Abfallstoffen kann Xylose durch Hydrolyse freigesetzt werden, deren Nutzung zum Aufbau einer nachhaltigen und kostengünstigen biotechnologischen Carotinoidproduktion beitragen kann.
Darüber hinaus wurden multioxigenierte Zeaxanthinderivate, von denen eine positive Wirkung auf die menschliche Gesundheit vermutet wird, durch kombinatorische Biosynthese erhalten. Durch die schrittweise Integration der Gene crtZoXd, crtG (ß-2,2-Hydroxylase) und bkt (ß-4,4-Ketolase) in eine ß-Carotinmutante wurde die Biosynthese von Zeaxanthin, Nostoxanthin und schließlich von 4-Keto-Nostoxanthin und 4,4-Diketo-Nostoxanthin erreicht. Anschließend erfolgte die chemische Reduktion zu den neuartigen Carotinoiden 4-Hydroxy-Nostoxanthin und 4,4-Dihydroxy-Nostoxanthin und der zweifelsfreie Nachweis aller vier Carotinoide anhand der mittels Massenspektrometrie bestimmten Molekülmassen und Fragmentierungsmuster.