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Gastropod molluscs were collected by the author between May and September 1962 from a variety of freshwater habitats in Ethiopia. Twenty-eight forms are represented in the collection of which a total of eleven have not been previously recorded from Ethiopia or have been recorded with doubt by previous authors. Two forms in each of the genera Bulinus and Ancylus appear to be new. It is considered that seven of the forms recorded from Ethiopia for the first time belong to the African component in the fauna, whereas only three are possibly of palaearctic origin. It is concluded that the wide distribution and diversity of some of the palaearctic forms justify the importance attached by Bacci (1951) to the palaearctic element in the molluscan fauna of the Ethiopian Plateau.
Die Chilopoden, über welche ich im folgenden berichte, stammen von einer Forschungsreise durch Kärnten, welche ich irn Herbst 1938, und zwar vom 20. September bis 18. Oktober, unternommen habe. Der Preußischen Akademie der Wissenschaften, welche mich durch ein Stipendium unterstützte, spreche ich meinen herzlichsten Dank aus. Verwiesen sei hier auf meine "Diplopodenfauna Kärntens in ihren Beziehungen zu den Nachbarländern und in ihrer Abhängigkeit von den Vorzeiten", Zool. Jahrb. (Syst.), Bd. 73, 1939, S. 63 bis 110, sowie meine Arbeit über die Isopoda terrestria Kirntens in den Abhandl. d. Preuß. Akad. d. Wiss., math.-naturw. Klasse, 1939, Nr. 15. Im ersteren Aufsatz, und zwar im 8. Kapitel S. go, bin ich bereits auf das quantitative Auftreten der karntnerischen Chilopoden im Vergleich mit Diplopoden und Isopoden eingegangen und will nur wiederholen, daß neben 1048 Stück Diplopoden und 352 Stück Isopoden von Chilopoden 112 Stück untersucht wurden. Von letzteren soll also im folgenden die Rede sein. Ich will auch betonen, daß diese quantitativen Verhältnisse der drei Tiergruppen keine zufälligen sind, sondern sich in den meisten Alpenländern in ähnlicher Weise wiederholen. Die geringere Zahl der Chilopoden beruht auf ihrer räuberischen Natur gegenüber der überwiegend vegetabilischen der beiden anderen Gruppen. Da sich unter den 23 Chilopoden-Formen, welche ich im Herbst 1939 in Kärnten beobachtet habe, einige Nova befinden, müssen diese zunächst klargestellt werden....
Die allgemein angewandten Namen der europäischen Orchideentaxa belaufen sich derzeit auf über 580 Namen, Synonyme nicht eingeschlossen. Die Übersicht soll die Namensfülle der gebräuchlichen Taxa und ihrer Synonyme (soweit erforderlich) in alphabetischer Reihenfolge aufzeigen. Taxa auf der Rangstufe der Varietät sind nicht enthalten.
The present publication is intended to be a monograph on the family of Burmanniaceae. It is divided into three parts: General Part, Critical Part and Taxonomical Part. The first part, General Part, contains general remarks on the taxonomy, distribution and use of the family. The second part, Critical Part, contains general and geobotanical remarks on the genera of the family, whereas the third part, the Taxonomical Part, gives the determination keys to the tribes, subtribes, genera, sections, subsections and species, the description of these groups with literature, distribution and the indications of the types. New varieties, species and larger groups are described in the taxonomical part in foot-notes.
Shaped by some of the most dramatic tectonic events of the Cenozoic, the parts of southern and eastern Asia that have become known as the Oriental faunal region comprise vast areas of great geological complexity and ecological diversity. One of the four major groups of terrestrial elapid snakes in this region is the genus Bungarus. These nocturnal and predominantly ophiophagous snakes are widely known as kraits and are an important cause of snakebite mortality throughout their wide range that extends from Afghanistan to Vietnam and eastern China, and south to the Indonesian islands of Java and Bali. Although present on Borneo, kraits have not been found on any island of the Philippines, nor on Lesser Sunda Islands east of Bali. Despite their medical significance and the great importance of Bungarus toxins as tools in neuropharmacology, krait systematics and taxonomy have remained largely unstudied. Twelve species of Bungarus were recognized at the beginning of the present study. Many of these are rare in collections, and most aspects of their biology are unknown. While some species are highly distinct, most kraits are conservative morphologically, rendering molecular methods invaluable for the study of their diversity and biogeography. This study is the first to address the relationships within Bungarus and the historical biogeography of kraits based on molecular evidence. I inferred phylogeographic relationships based on analyses of new nucleotide sequences of the entire mitochondrial cytochrome b gene of 51 kraits and partial NADH dehydrogenase subunit 4 sequences of 40 kraits which I analyzed together with a representative sample of 32 published elapid and non-elapid outgroup taxa using Bayesian, maximum-likelihood, maximum-parsimony and neighbor-joining methods. I then used the recovered phylogeny to investigate the evolution of selected morphological characters and, together with collections-based geographical distribution information, in dispersal-vicariance analyses with models of variable taxonomic and biogeographic complexity. The phylogenetic analyses demonstrate that the current taxonomy of kraits does not adequately represent either the relationships or the genetic diversity in this genus. In contrast, I identified monophyletic groups that are congruent with recognized biogeographic units as well as extensive ecomorph evolution and morphologically cryptic speciation. The following additional conclusions are collectively supported by the mitochondrial phylogeny and morphological as well as biochemical synapomorphies: (1) Kraits are monophyletic with respect to the remaining taxa of the Elapidae; (2) Bungarus flaviceps and Bungarus bungaroides form the monophyletic sister clade of a clade formed by B. fasciatus, black-and-white-banded, and uniformly black taxa; (3) the remaining taxa are divisible into two sister clades, the South Asian species (Bungarus sindanus (Bungarus caeruleus, Bungarus ceylonicus)) vs. Himalayan, Burmese, Southeast and East Asian taxa; (4) within the latter, Burmese taxa form the sister clade to Southeast and East Asian taxa; (5) the widespread and medically significant species Bungarus candidus and Bungarus multicinctus are paraphyletic. The results of this study highlight the importance of vicariant geological events and sea level fluctuations for the cladogenesis of kraits. Events of particular importance in the evolution of kraits include the uplift of the Indo-Burman ranges (Arakan-Naga Hills) which separated black-and-white banded kraits in India and Southeast Asia, and the uplift of mountain ranges in Yunnan, China (e.g., the Gaoligong Shan), which coincided with lineage separation in two distantly related clades of kraits. Alternating dispersal and vicariance events due to Pleistocene climatic and sea level changes have caused complex phylogeographic patterns in kraits in Southeast Asia. Zones of contact between closely related evolutionary lineages of the B. candidus complex are identified in Thailand, Vietnam, and southern China (Hainan). Within this complex, two main clades are revealed. One includes populations from the Southeast Asian mainland and is in contact with B. multicinctus in southern China. The other consists of populations from Thailand, southern Vietnam, Java, and Bali. The phylogeny as well as genetic distances suggest a scenario in which a Pleistocene southward dispersal of B. candidus to Sumatra, Java, and Bali during times of low sea levels was temporarily interrupted by vicariant events (rising sea levels, especially flooding of the Malacca Strait between Sumatra and the Malay Peninsula, and of the Bali Strait between Java and Bali). In this context, the close phylogenetic relationship between haplotypes from southern Vietnam and those from Java and Bali suggests that "southern" B. candidus dispersed directly via colonization of the widely receded South Chinese Sea, and not by taking a detour via the Malay Peninsula and Thailand, which were already inhabited by other populations of B. candidus. Using these phylogenetic estimates as the framework for a study on the diversity and evolution of krait venom components, I applied biochemical and molecular genetic approaches to identify and quantify polypeptide and protein toxins in krait venom, focusing on the distribution and molecular evolution of alpha-bungarotoxin, an irreversible competitive antagonist of nicotinic acetylcholine receptors with an exceptionally high applied significance as a receptor probe. I was specifically interested in the medically relevant question of intraspecific and interspecific variability in toxin diversity, and whether receptor-binding postsynaptic toxins evolve at rates different from those of presynaptic neurotoxins like beta-bungarotoxin, which act by destroying the nerve terminal and are believed to exhibit hypervariable functional diversification due to an accelerated mode of molecular evolution. In the context of this question, I isolated and purified the major lethal neurotoxins from B. candidus venoms by sequential steps of liquid chromatography for structural and functional characterization studies. Cloning and sequence analysis of toxin-coding genomic DNAs showed that the gene encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, originally isolated from B. multicinctus venom, is widely present and highly conserved in multiple populations of B. candidus and is expressed as the principal postsynaptic neurotoxin at least in Javan B. candidus. In addition to the widespread presence of genomic DNAs encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, the present study also revealed the partial genes of three novel alpha-bungarotoxin isoforms in addition to the previously known alanine-31 and valine-31 variants, all of which share an invariant exon 3 coding region. While alpha-bungarotoxin is the principal postsynaptic neurotoxin of Taiwanese B. multicinctus and Javan B. candidus, the main postsynaptic neurotoxin of Thai B. candidus both by quantity and lethality was a novel polypeptide of similar toxicity with a mass of 8030 Da and 73 amino acid residues, whose characterization at the genetic and protein levels revealed a novel subgroup of krait neurotoxins, here named alpha-delta-bungarotoxins and represented by four sequences from Bungarus caeruleus and B. candidus. alpha-delta-Bungarotoxins share high sequence homology with alpha-bungarotoxins but the purified, 8030 Da alpha-delta-bungarotoxin-1 exhibits only reversible, low affinity binding to nicotinic receptors and high site-selectivity for the acetylcholine binding site at the alpha-delta-subunit interface of the receptor. These properties render alpha-delta-bungarotoxin not only the first snake long-chain neurotoxin with reversible binding and binding-site selectivity, but also an exciting natural tool with which to address structure-function relationships at the subunit interfaces of the human receptor. The results of comparisons of the number of non-synonymous nucleotide substitutions per nonsynonymous site (dN) to the number of synonymous nucleotide substitutions per synonymous site (dS) strongly suggest that positive selection is acting on exon 2 of the alpha-bungarotoxin and probably also of the alpha-delta-bungarotoxin genes. In addition, the numbers of nucleotide substitutions per site of intron (dI) compared to the dS value of the toxin-coding exon regions provide strong evidence for accelerated molecular evolution in exon 2 of alpha-delta-bungarotoxins —whose value of dI is only one-eighth of the value of dS—whereas the hypothesis of accelerated evolution is rejected for 13 unique genomic DNAs encoding five alpha-bungarotoxin isoforms from B. candidus and B. multicinctus....
Das Epsilon-Proteobakterium Wolinella succinogenes wächst unter anaeroben Bedingungen durch Nitrit-Atmung. Als Elektronendonoren werden Formiat oder Wasserstoff verwendet. Die terminale Reduktase der Elektronentransportkette von Formiat zu Nitrit ist der Cytochrom C-Nitrit-Reduktase-Komplex (NrfHA), welcher die Reduktion von Nitrit zu Ammonium katalysiert. Menachinon dient als Redoxmediator. Die katalytische Untereinheit NrfA ist ein Pentahäm Cytochrom c, dessen Struktur bekannt ist. Die Häm c-Gruppe im aktiven Zentrum von NrfA wird über ein ungewöhnliches CXXCK-Motiv kovalent gebunden, während die übrigen vier Häm c-Gruppen über konventionelle CXXCH-Motive gebunden werden. Der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs ist der axiale Ligand des Häm-Eisens der Häm-Gruppe im katalytischen Zentrum. Die Untereinheit NrfH ist ein membranständiges Tetcahäm-Cytochrom C, das den Elektronentransport von Menachinol zu NrfA katalysiert. Im Nitrit-Reduktase-Operon nrfHAIJ wird das Nrfl-Protein kodiert, das ähnlich zu verschiedenen Cytochrom c-Biogenese Proteinen (Ccsl und CcsA) anderer Organismen ist. Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von Mutanten, in denen der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs (K134) von NrfA ausgetauscht wurde oder konservierte Aminosäure-Reste am katalytischen des NrfAProteins ausgetauscht wurden. Weiterhin wurden Mutanten konstruiert und charakterisiert, in denen das nrfl-Gen inaktiviert wurde. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Es wurde eine Mutante konstruiert (W. succinogenes K134H), in der das CXXCK-Motiv im aktiven Zentrum von NrfA in ein konventionelles CXXCH-Motiv gewandelt wurde. Die spezifische Nitrit-Reduktase-Aktivität, gemessen mit reduziertem Benzylviologen als Elektronendonor, betrug maximal 40% der Aktivität des Wildstammes. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug 6% der Aktivität des Wildstamms. Durch MALDI-Massenspektroskopie wurde gezeigt, dass das NrfA-Protein aus dieser Mutante, ebenso wie das Protein aus dem Wildstamm, fünf Häm-Gruppen enthielt. In W. succinogenes Mutanten, in denen der Lysin-Rest 134 gegen Leucin oder Glutamin ausgetauscht wurde, ließ sich das Nrf-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht mehr nachweisen. 2. In W. succinogenes R114L, Y21 8F, H277L wurden konservierte Aminosäure-Reste in NrfA ausgetauscht, die nach dem postulierten Mechanismus der Nitrit-Reduktion an der heterolytischen Spaltung der ersten N-O-Bindung des Nitrits beteiligt sind. Alle diese Mutanten wachsen nicht durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes H277L und R114L besitzen keine Nitrit-Reduktase-Aktivität, obwohl das NrfA-Protein in allen Mutanten nachweisbar war. Die Elektronentransport-Akivität von Formiat zu Nitrit in W. succinogenes Y218F betrug 6% im Vergleich zum Wildstamm und die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug 14% gegenüber dem Wildstamm. Aus der Struktur von W. succinogenes NrfA ist ersichtlich, dass der Glutamin-Rest 276 Teil eines Substrat-Kanals ist, der von der Oberfläche des NrfA-Proteins zur Häm-Gruppe im aktiven Zentrum führt (Einsle et al. 2000). in W. succinogenes Q276E wurde der Glutamin-Rest gegen einen negativ geladenen Glutamat-Rest ausgetauscht. W. succinogenes Q276E wächst nicht durch Nitrit-Atmung. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug in dieser Mutante 6% im Vergleich zum Wildstamm. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität war gegenüber dem Wildstamm um 90% erniedrigt. 3. In der Mutante W. succinogenes stopl wurde das nrfl-Gen durch Einführen von zwei Stop-Codons an den Positionen 47 und 48 inaktiviert. Diese Mutante wächst nicht durch Nitrit-Atmung und besitzt keine Nitrit-Reduktase-Aktivität. Im NrfA-Protein aus W.succinogenes stopl fehlte die über das CXXCK-Motiv ligandierte Häm-Gruppe im aktiven Zentrum, während die übrigen über konventionelle CXXCH-Motive ligandierten Häm-Gruppen vorhanden waren. 4. Die Mutante W. succinogenes Kl34H/stopl, in der das stopl-Gen inaktiviert war und das CXXCK-Motiv in ein fünftes CXXCH-Motiv geändert wurde, entsprach in ihren Eigenschaften dem Stamm W. succinogenes K134H. Daraus ist zu folgern, dass das Nrfl-Protein speziell am Einbau der Häm-Gruppe am CXXCK-Motiv in NrfA beteiligt ist, während Nrfl für den Einbau an CXXCH-Motiven entbehrlich ist. Nrfl ist vermutlich eine spezielle Häm-Lyase, die den Lysin-Rest des CXXCK-Motivs erkennt. 5. Campylobacter jejuni kodiert ein NrfA-Protein, das fünf CXXCH-Motive anstelle von einem CXXCK-Motiv und vier CXXCH-Motiven enthält. In C. jejuni wird die vermutliche Häm-Gruppe des aktiven Zentrums von einem CMNCH-Motiv ligandiert, während in W. succinogenes die Bindung an einem CWTCK-Motiv erfolgt. In den Mutanten W. succinogenes CMNCK und W. succinogenes CMNCH wurde das Häm-Bindemotiv im aktiven Zentrum von NrfA dem von C. jejuni angeglichen. Keine der beiden Mutanten wuchs durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes CMNCK katalysierte den Elektronentransport von Formiat zu Nitrit mit 6% der Aktivität des Wildstamms. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug unter 3% im Vergleich zum Wildstamm. In W. succinogenes CMNCH war das NrfA-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht nachzuweisen. 6. Um die Präparation des NrfA-Proteins und des NrfHA-Komplexes zu erleichtern und um die Präparation der Untereinheit NrfH zu ermögiichen, wurden W, succinogenes Mutanten konstruiert, die einen Hexa-Histidin-Tag an NrfA oder einen Strep-Tag II am N- oder C-terminus von NrfH tragen. Es war aber nicht möglich, den Nitrit-Reduktase-Komplex oder einzelne Untereinheiten durch entsprechende Affinitätschromatographien anzureichern.
Bis zur Entfaltung der Wirkung eines Pharmakons laufen zahlreiche komplexe Vorgänge ab, die sich in drei wesentliche Phasen unterteilen lassen. Die pharmazeutische Phase umfasst mit der Applikation und dem Zerfall der Arzneiform sowie dem Auflösen des Wirkstoffes Vorgänge, die im wesentlichen von den galenischen Eigenschaften des Arzneistoffes abhängen. In der pharmakokinetischen Phase erfolgt mit der Resorption die Aufnahme des Wirkstoffes in den Organismus, dem sich die Verteilung in die unterschiedlichen Gewebe über die Blutbahn anschließt. Durch verschiedene Eliminationsprozesse wird der Wirkstoff zuletzt wieder aus dem Körper ausgeschieden. Mit dem Erreichen des Wirkortes beginnt die pharmakodynamische Phase, in der die pharmakologischen Effekte des Arzneistoffes zur erwünschten klinischen Wirkung führen. Der Nachweis des Pharmakons am Wirkort in klinisch-relevanten Konzentrationen ermöglicht somit Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Arzneistoffes, aber unter bestimmten Voraussetzungen auch auf dessen Wirkmechanismus. Während mittlerweile ein Großteil neuer Arzneistoffe mit Hilfe unterschiedlicher Mechanismen durch exaktes Drug Targeting an den Wirkort gesteuert werden, weisen andere Substanzen teilweise ungewollt eine gewebespezifische, dirigierende Komponente auf, die neben der eigentlichen Hauptwirkung weitere unterstützende oder auch unerwünschte Effekte auslösen. Von besonderem Interesse ist diese Gewebespezifität für pflanzliche Arzneistoffe, deren Wirkkomponenten bislang noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Gemeinsam mit anderen pharmakologischen Befunden kann der analytische Nachweis eines wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffes am Wirkort in ausreichenden Konzentrationen ein weiterer deutlicher Hinweis auf dessen Wirkbeteiligung sein. Besonders vor dem Hintergrund einer rationalen, evidenz-basierten Pharmakotherapie, deren Anforderungen die pflanzlichen Arzneien mittlerweile ebenso wie die synthetischen Wirkstoffe erfüllen müssen, ist die Erforschung sowohl des Wirkprinzips als auch der Pharmakokinetik des Wirkstoffes von besonderer Bedeutung. Obwohl Johanniskrautextrakte bereits seit dem 17. Jahrhundert gegen die Melancholie und somit als Antidepressivum eingesetzt wurden, sind sowohl der exakte Pathomechanismus der Depression als auch die Wirkkomponente und der Wirkmechanismus der Extrakte aus Hyperici herba noch immer Gegenstand umfassender Forschung. Vor allem wegen der geringen Nebenwirkungsrate sind Johanniskrautpräparate gegenüber synthetischen Antidepressiva eine bevorzugte Alternative für die Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen. Ähnlich den Effekten der synthetischen Antidepressiva sind Johanniskrautextrakte in der Lage, durch eine Wiederaufnahmehemmung der Neurotransmitter Noradrenalin, Serotonin, Dopamin, sowie GABA und L-Glutamat deren Konzentration im synaptischen Spalt zu erhöhen, was zu einer nachfolgenden adaptiven Veränderung der jeweiligen Rezeptoren führt. In mehreren Studien konnten diese Effekte vornehmlich den Phloroglucinolderivaten Hyperforin und Adhyperforin zugeordnet werden. Unterstützt wurden diese in vitro und in vivo Befunde durch die Ergebnisse einer Vielzahl verhaltenspharmakologischer Untersuchungen, die einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit in antidepressiven Modellen und dem Gehalt an Hyperforin in den Extrakten ergeben haben. Zahlreiche klinische Studien belegen darüber hinaus die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Johanniskrautextrakten. ...
Ziel dieser Arbeit war es, zentrale Wirkungen von Statinen näher zu untersuchen. Hierbei sollten zum einen die Statin-Effekte auf die zerebrale und membranäre Cholesterinhomöostase näher untersucht werden, zum anderen sollten Effekte von Statinen auf die APP-Prozessierung sowie auf apoptotische Regulatoren im Gehirn in vivo analysiert werden. Einfluss unterschiedlicher Applikationsformen auf zentrale Statin-Effekte Bislang ist noch nicht vollständig aufgeklärt, ob und inwieweit Statine die zerebrale Cholesterin- oder Isoprenoidsynthese beeinflussen. Statine werden in tierexperimentellen in vivo-Studien bei oraler Wirkstoffapplikation über unterschiedliche Applikationsformen verabreicht wie Schlundsondierung, über das Trinkwasser oder das Futter – der Einfluss der unterschiedlichen Applikationsformen auf die zentralen Statineffekte ist allerdings nicht bekannt. Die zerebralen Statinkonzentrationen wurden bislang nur nach Applikation per Schlundsonde im Tiermodell bestimmt. Für alle anderen oralen Applikationsformen liegen keine Konzentrations-Zeit-Profile der zerebralen Statinspiegel vor. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten über einen direkten Vergleich der Applikation von Lovastatin und Pravastatin über das Futter und per Schlundsonde zeigen, dass zentrale Statin-Effekte insbesondere auf membranärer Ebene entscheidend durch die Wahl der Applikationsform beeinflusst werden. Effekte von Simvastatin auf die zerebrale Cholesterinhomöostase – Vergleich Maus – Meerschweinchen In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von Simvastatin auf die zentrale und periphere Cholesterinhomöostase in zwei verschiedenen in vivo-Modellen, Mäusen und Meerschweinchen, untersucht. Sowohl Mäuse wie auch Meerschweinchen stellen etablierte Tiermodelle für Untersuchungen des Cholesterin- und Lipoprotein-Metabolismus dar. Allerdings weisen Meerschweinchen eine grössere Ähnlichkeit zum Menschen im Bezug auf den Lipidstoffwechsel auf als die Maus. Die auffälligste Übereinstimmung zwischen Mensch und Meerschweinchen ist, dass auch bei Meerschweinchen die Mehrheit des Cholesterins in LDL transportiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass insgesamt eine subchronische Simvastatin-Behandlung in Mäusen und Meerschweinchen nicht die gleichen Effekte auf die periphere und zentrale Cholesterinhomöostase hat. Allerdings belegen die Ergebnisse an beiden Tiermodellen, dass generell eine subchronische Simvastatin-Gabe die zerebrale Cholesterinhomöostase nicht negativ beeinflusst. Allerdings werden insbesondere die Serumcholesterinspiegel, die Cholesterinkonzentration in synaptosomalen Plasmamembranen und die DPH-Anisotropie in den beiden Tiermodellen vermutlich aufgrund von Speziesunterschieden im Lipidstoffwechsel in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst, so dass Speziesunterschiede bei der Interpretation tierexperimentellen Statin-Studien immer beachtet werden sollten. Effekte von Simvastatin auf die APP-Prozessierung in vivo Es ist bekannt, dass Statine einen unmittelbaren Einfluss auf die membranäre Cholesterinhomöostase ausüben und dabei vermutlich über eine Veränderung von Raft-Strukturen die APP-Prozessierung modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt einer subchronischen Simvastatin-Gabe auf die APP-Prozessierung in einem transgenen AD-Mausmodell (APP751SL-Mäuse) untersucht. Durch die Simvastatin-Behandlung wird eine Umverteilung des Cholesterins aus dem cytofacialen Membranblatt ins exofaciale Membranblatt in synaptosomalen Plasmamembranen induziert und die Proteinexpression des Raft-Markers Flotillin wird signifikant reduziert. Diese Veränderungen innerhalb der synaptosomalen Plasmamembranen sind mit einer Zunahme der Spiegel von unlöslichem Abeta im Gehirn der APP751SL-Mäuse assoziiert. Vermutlich war die Cholesterinsenkung in der Membran nicht stark genug, um die an der APP-Prozessierung beteiligten Sekretasen per se zu inaktivieren. Es scheint vielmehr zu einer Dislokalisation der Rafts zu kommen, die über eine räumliche Annäherung von APP und β-Sekretase/γ-Sekretase letztendlich zu einer erhöhten APP-Prozessierung führt. Darüberhinaus ist in unserer Studie eine Abnahme der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Gehirn der Simvastatin behandelten APP751SL-Mäuse nachweisbar sowie eine gleichzeitige Erhöhung der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Plasma. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Clearance von zerebralem löslichem Abeta1-40 ins Blut durch Simvastatin erhöht wurde. Neuroprotektive Effekte von Simvastatin Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass Statine neben ihrer cholesterinsenkenden Wirkung zentrale protektive Effekte im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer Demenz (AD) oder ischämischem Schlaganfall vermitteln. In einer vorangehenden Studie an Mäusen konnten wir zeigen, dass eine subchronische Simvastatin-Gabe eine erhöhte Genexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 induziert. In der vorliegenden Arbeit kann dieser Befund im Gehirn von Meerschweinchen bestätigt werden und darüberhinaus kann nachgewiesen werden, dass Simvastatin eine Reduktion der Proteinexpression des proapoptotischen Proteins Bax im Gehirn der behandelten Meerschweinchen induziert. An dissoziierten Hirnzellen wurde anschließend untersucht, ob die signifikante Reduktion der Ratio Bax/Bcl-2 durch Simvastatin-Gabe im Gehirn von Meerschweinchen auf mitochondrialer Ebene protektiv wirkt gegen oxidativen und nitrosativen Stress sowie gegen den Bcl-2 Antagonisten HA 14-1. An dissoziierten Hirnzellen der behandelten Meerschweinchen wirkt Simvastatin über eine Senkung der Ratio Bax/Bcl-2, nachfolgende Hemmung der Caspase-Aktivierung und eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials protektiv. Diese protektiven Wirkungen von Simvastatin sind im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie der AD und dem ischämischem Schlaganfall von großer Bedeutung, da bei diesen Erkrankungen Apoptose und mitochondriale Dysfunktion eine Schlüsselrolle in neurodegenerativen Prozessen spielt.
1. Ein junger männlicher Steinmarder lernte in kurzer Zeit das Öffnen einer Schiebetür. Vor die Aufgabe gestellt, einen diese Tür verschließenden Riegel zu drehen, versagte er. Auch eine sekundäre Lösung, die auf dem Wege über eine Passivdressur angestrebt wurde, erfolgte nicht, ebensowenig wurde eine optische Orientierung auf Grund der Riegelstellung beobachtet. 2. Kleine Umwege in horizontaler und vertikaler Richtung wurden gut, in primärer Bewältigung der Aufgabe, genommen. 3. Eine einfache Ortsdressur (auf einen der Ecktöpfe einer dargebotenen Reihe von vier gleichen Töpfen) wurde unter Benutzung olfaktorischer Hilfen in kurzer Zeit zu dem gewünschten Erfolg gebracht. Eine kompliziertere Ortsdressur (Wahl des zweiten Topfes von links aus einer Reihe von fünf gleichen Töpfen) führte, bei strenger Vermeidung olfaktorischer Orientierungsmöglichkeiten, erst nach einer größeren Anzahl (etwa 220) Versuchen zum Ziele. Die Erlernung erfolgte auf Grund kinästhetischer, vor allem aber optischer Reize. Der Vorgang der optischen Gliederung der Reihe konnte genau festgestellt werden. 4. Ein mehrjähriger Iltisrüde wurde hinsichtlich der sich aus allgemeinen anatomischen und biologischen Unterschieden ergebenden Eigenheiten im psychischen Verhalten beobachtet und untersucht. Es ergaben sich bei einem Vergleich mit dem Steinmarder eine Reihe wichtiger artspezifischer Differenzen, die sich zumeist auf den Unterschied Bodentier-Klettertier zurückführen ließen. 5. Auch der Iltis lernte das Öffnen einer Schiebetür. Im horizontalen Umwegversuch wurden recht gute primäre, vor allem aber auch sekundäre Lösungen festgestellt. Auf Grund der sekundären Lösungen wird eine starke Entwicklung des kinästhetischen Sinnes angenommen. 6. Eine Helligkeitsdressur bei alternativer Wahl scheiterte an der Unmöglichkeit, die hauptsächlich auf der Intensität der kinästhetischen Empfindungen beruhenden Tendenzen einer ortsbedingten Wahl auszuschalten. 7. Eine multiple Ortsdressur, der des Steinmarders entsprechend, gelang, obwohl durch Hinzunahme von insgesamt vier neuen Aufstellungsarten die Aufgabe für den Iltis nicht unbedeutend erschwert wurde. Die große Bedeutung des Ortskriteriums für das Tier wurde im Verlaufe dieser Versuche besonders deutlich und konnte exakt nachgewiesen werden. 8. Eine Helligkeitsdressur bei multipler Wahl gelang. Ebenso konnte bei einer Rot-Blaudressur Blauwahl erreicht werden. 9. Im Anschluß an die vorhergehende Dressur kam Blauwahl nunmehr auch bei Anwendung der Alternativmethode zustande. 10. Es konnte gezeigt werden, daß die in 8 und 9 dargestellten Resultate auf Grund einer helligkeits-, nicht farb-bedingten Orientierung zustande kamen. Färb- und Graupapiere, die dem zur Dressur verwandten Heringschen Blau Nr. 12 helligkeitsverwandt waren, wurden mit diesem verwechselt. Dieser Befund läßt den Schluß auf das Vorhandensein einer Farbenschwäche oder Farbenblindheit zu. 11. Es wurde festgestellt, daß der Iltis sowohl in orts- als auch in helligkeitsbedingter Wahl sich nach relativen Kriterien richtete.
Glutamat ist der häufigste Neurotransmitter im menschlichen Hirn. Die Konzentration des Glutamats in der extrazellulären Flüssigkeit wird durch Glutamat-Transporter (Sekundärtransporter) kontrolliert. Liegt es in zu hoher Konzentration im synaptischen Spalt vor, kommt es zur Schädigung von Nervenzellen, ein Prozess, der als Exzitotoxizität bezeichnet wird. Eine Fehlfunktion oder fehlerhafte Produktion der Glutamat-Transporter im zentralen Nervensystem wird bei verschiedenen Krankheiten, wie der amyotrophen Lateralsklerose, der Ischämie, der Epilepsie, der Schizophrenie und der Alzheimer-Krankheit vermutet. Ziel dieser Arbeit war die Funktions- und Strukturanalyse der Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus und GltP aus E. coli, um die Familie der Glutamat-Transporter und die Entstehung der mit diesen Transportern in Verbindung gebrachten Krankheiten besser zu verstehen. Um die für diese Analysen gebrauchten Mengen an Protein herzustellen, mussten die Proteine heterolog produziert werden, da sie in natürlichen Geweben nicht in ausreichender Menge vorkommen. In dieser Arbeit wurde Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus funktional mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem überproduziert. Dazu wurden verschiedene Vektorkonstrukte hergestellt. Die routinemäßige Überproduktion des Transporters wurde im 8 l - Maßstab durchgeführt. In Zellen, die für die Produktion von GLT-1 mit rekombinanten, aktiven SF-Viren infiziert wurden, konnte eine sehr hohe Aktivität des Glutamat-Transporters nachgewiesen werden. Die Menge des hergestellten GLT-1 wurde in Bindungsexperimenten mit (2S,4R)-4-Methylglutamat quantifiziert: jede Zelle enthielt 3,5 x 106 Transporter: 61,04 pmol GLT-1/mg Gesamtprotein. Das entspricht einer Ausbeute von etwa 2-3 mg/8 l Zellkultur. Die hier durchgeführte Überproduktion des GLT-1-Glutamat-Transporters ist die erste Überproduktion eines eukaryotischen Sekundärtransporters mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem, bei dem große Mengen an aktivem Protein hergestellt werden konnten. Zudem ist die Ausbeute an funktionalem GLT-1 mit 61 pmol/mg Gesamtprotein verglichen mit den in der Literatur vorliegenden Daten zur Überproduktion eukaryotischer sekundärer Transporter mit anderen Expressionssystemen die höchste, die bis dato erreicht werden konnte. Der größte Anteil des heterolog produzierten GLT-1 war glykosyliert. Die gelelektrophoretische Analyse des aufgereinigten Transporters ergab zwei Banden, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 70-75 kDa und etwa 53-58 kDa hatten. In einer Western-Blot-Analyse konnten beide Banden des GLT-1-Transporters mit einem anti-His-Antikörper und einem anti-GLT-1-Antikörper nachgewiesen werden. Durch Deglykosylierung mit PNGase F und einer Trennung beider Banden durch Lektin-Affinitätschromatographie konnte gezeigt werden, dass es sich bei der 70-75 kDa-Bande um die glykosylierte Form und bei der 53-58 kDa-Bande um die nicht glykosylierte Form des Glutamat-Transporters handelte. Es wurde gezeigt, dass zwischen der Aktivität des GLT-1 und dessen Glykosylierung kein Zusammenhang besteht. Denn beide Formen lagen als vollständige, funktionale Transporter vor und transportierten nach Rekonstitution in Liposomen Glutamat. Der prokaryotische Glutamat-Transporter GltP aus E. coli wurde in dem E. coli-Stamm C43 (DE3) überproduziert. Die Ausbeute war etwa 2 mg pro Liter Kultur. Die Funktionalität des Transporters nach Rekonstitution in Lipidvesikel wurde durch spezifische Aufnahme von Glutamat gezeigt. Für die Solubilisierung beider Transporter aus den Zellmembranen wurden verschiedene Detergentien getestet. GltP ließ sich am besten mit DM oder DDM aus der Membran extrahieren, für die Solubilisierung des GLT-1 wurde mit großer Effizienz DDM oder CYMAL-7 eingesetzt. GltP und GLT-1 wurden mit einer Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie in großer Menge und hoher Reinheit angereichert werden. Die Aufreinigungsprozedur beeinträchtigte nicht die Funktionalität des prokaryotischen GltP. Bei dem eukaryotischen Transporter GLT-1 war nach der Ni2+-NTA-Säule keine Transportaktivität mehr messbar. Durch Zusatz von Asolectin in den Wasch- und Elutionspuffern während der Aufreinigung konnte die Funktionalität des Transporters jedoch erhalten werden. Aufreinigungen mit anderen Lipiden unter anderem in Kombination mit Cholesterin lieferten einen Glutamat-Transporter, der in seiner Konformation stabilisiert, jedoch nach Rekonstitution nicht aktiv war. Eine weitere Steigerung der Ausbeute an aktivem GLT-1 konnte durch den Einsatz von Reduktionsmitteln, wie DTT oder b-Mercaptoethanol, die die Aggregation des Transporters verhinderten, erreicht werden. GltP katalysiert den elektrogenen Transport von Glutamat bzw. Aspartat unter Symport von mindestens zwei Protonen. GLT-1 transportiert ein Molekül Glutamat zusammen mit drei Na+-Ionen und einem Proton im Austausch gegen ein K+-Ion. Durch Transportmessungen konnte der hochspezifische Glutamat-Transport der aufgereinigten Transporter belegt werden. Der Glutamat-Transport des in Liposomen rekonstituierten GltP zeigte eine klare Abhängigkeit von einem anliegenden Protonengradienten. Aufgereinigtes und rekonstituiertes GLT-1 transportierte nur Aspartat bzw. Glutamat, wenn ein Na+ und ein K+-Gradient vorhanden waren. Die Aspartat- bzw. Glutamat-Aufnahme konnte bei beiden Transportern durch den kompetitiven nichttransportablen Inhibitor (2S,4R)-4-Methylglutamat blockiert werden. Der Assoziationsgrad der Glutamat-Transporter GltP und GLT-1 und das Gleichwicht zwischen den verschiedenen oligomeren Zuständen wurde in dieser Arbeit eingehend mit biochemischen Methoden untersucht: 1. „Cross-linking“-Studien, 2. Blaue Nativgelelektrophorese, 3. Analytische Ultrazentrifugation, 4. Laserlichtstreuung, 5. Gelfiltrationschromatographie. Die dabei erhaltenen Ergebnisse bewiesen eine tetramere Assoziierung beider Proteine. Die Gelfiltrationsexperimente zeigten, dass die Transporter in Detergenzlösung in unterschiedlichen Assoziationsgraden vorliegen. Das Gleichgewicht zwischen den oligomeren Formen war reversibel und abhängig von der Art und Konzentration des Detergenz, der Proteinkonzentration und der Temperatur. Zur Untersuchung der Struktur der Glutamat-Transporter wurden vor allem mit GltP zahlreiche 2D-Kristallisationsexperimente durchgeführt. Trotz Variation aller denkbar möglichen Parameter konnten keine Kristalle erhalten werden. Das beste Ergebnis war ein guter Einbau des Proteins in Lipidvesikel (etwa 80%). Da keine Kristalle erhalten wurden, wurde für beide Proteine eine Einzelpartikelanalyse durchgeführt. Dabei wurde nach zweidimensionaler Alignierung und Klassifizierung die „random conical tilt“-Methode angewendet. Die daraus resultierenden dreidimensionalen Dichtekarten des GltP und GLT-1 waren sehr ähnlich und wiesen vier nicht exakt symmetrische Massen in annähernd quadratischer Anordnung auf. Die Auflösung war 26 Å bzw. 36 Å. Die Größe der Einzelpartikel (für GltP: Höhe 37 Å, Breite 75 Å bzw. 86 Å, Länge 100 Å). ihre annähernd quadratische Anordnung und ihre Symmetrie lassen vermuten, dass es sich dabei um Tetramere der Glutamat-Transporter handelt, die aus zwei nicht symmetrischen Dimeren zusammengesetzt sind. Die hier präsentierten Daten sind die ersten zur dreidimensionalen Struktur von Glutamat-Transportern. Schließlich wurde nachgewiesen, dass der in BHK-Zellen heterolog exprimierte Glutamat-Transporter GLT-1 vorwiegend in „lipid rafts“ lokalisiert ist. Die Größe der „rafts“, die anhand der Größe der „Proteininseln“ in Gefrierbrüchen bestimmt wurde, war etwa 200 nm im Durchmesser. Die „GLT-1-Inseln“ bzw. „lipid rafts“ konnten durch das teilweise Entfernen von Cholesterin aus der Membran zerstört werden. Damit ging eine Reduktion der Glutamat-Transporter-Aktivität von etwa 20% einher. Es ist das erste Mal, dass „lipid rafts“ durch die natürliche Assemblierung von Proteinen mit Hilfe von Gefrierbruchanalysen und Elektronenmikroskopie beobachtet wurden.
In der vorliegenden Arbeit sollte das basolaterale Targeting des Transmembranproteins shrew-1 in polarisierten Epithelzellen analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von shrew-1 mehrere spezifische basolaterale Sortingmotive enthält. Die Funktionalität dieser Motive wurde anhand Mutationsanalysen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Substitution dieser Aminosäuren führt zu einer apikalen Lokalisation von shrew-1 in polarisierten MDCK Zellen. Durch Analyse der Proteinverteilung von shrew-1 Varianten in polarisierten LLC-PK1 Zellen wurde deutlich, dass das Sorting von shrew-1 in die basolaterale Plasmamembran ein AP-1B-abhängiger Prozess ist. Außerdem konnte mittels Coimmunopräzipitation eine Interaktion zwischen shrew-1 und der Untereinheit my1B aus dem Adapterproteinkomplex AP-1B nachgewiesen werden. Untersuchungen des Targetings von shrew-1 Varianten in polarisierten MDCK und LLCPK1 Zellen mit Hilfe der Transzytoseexperimente zeigten, dass die apikal lokalisierte Mutante shrew-1-NTD5 auf dem Weg zur apikalen Membranregion, trotz fehlender Sortinginformation, die basolaterale Plasmamembran durchquert. Durch Inhibition der Membranfusion mittels Tanninsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Passage der basolateralen Plasmamembran für das Targeting von sowohl shrew-1 als auch von shrew-1-NTD5 essentiell ist. Die Beobachtungen des Turnovers von shrew-1 in der Plasmamembran von lebenden Zellen zeigten, dass shrew-1 aktiv endozytiert wird und dass nachfolgend ein Recycling des Proteins zur Plasmamembran stattfindet. Anhand der durchgeführten Untersuchungen lässt sich zusammenfassend ein Targetingmodell für shrew-1 in polarisierten Epithelzellen aufstellen, das ein postendozytotisches Sorting beschreibt: Dabei wird shrew-1 zunächst in Post-Golgi-Carriern auf unbekanntem Weg zur basolateralen Plasmamembran gebracht, wo seine unmittelbare Internalisierung und ein Weitertransport zum Recyclingendosom stattfinden. Der im Recyclingendosom lokalisierte und am Sorting beteiligte Adapterproteinkomplex AP-1B vermittelt dann den Rücktransport von shrew-1 zur basolateralen Plasmamembran.
Araneae : cinquième série ; précédée d'un essai sur l'évolution souterraine et son déterminisme
(1931)
Safety concerns associated with the use of viral vectors in gene therapy applications have attracted considerable attention towards the development of nonviral vectors as alternatives for DNA delivery. While nonviral vectors are commonly not associated with safety problems, they are still very inefficient compared to viral vectors, and require significant improvements to approach the efficiency of their viral counterparts. Meanwhile ligands or single-chain antibody fragments that bind to cell surface receptors for increased and/or specific cellular uptake, endosome escape activities, and nuclear localization sequences (NLSs) to enhance transport of plasmid DNA into the nucleus, have become available that can be incorporated into nonviral vectors to improve their efficacy. However, as gene delivery is a multistep process, the challenge is to incorporate multiple of these functional elements into a single nonviral vector system, while retaining their specific activities. A promising method to attach such entities to plasmid DNA is the use of multifunctional fusion proteins that bind to DNA through a DNA-binding domain. In principle, two types of DNA-binding domains/proteins can be used to anchor additional functional domains or peptides to a plasmid, namely sequence-specific DNA-binding domains, described in the first part of this thesis, or those that bind DNA independent of its sequence, exemplified in the second part of this work by a derivative of the human HMGB2 protein. The first fusion protein constructed and analyzed contained the E. coli LexA repressor as a sequence-specific DNA-binding domain. In addition, this DNA-carrier protein, termed TEL, included a bacterial translocation domain as an integrated endosome escape activity, and human TGF-a for specific targeting to the EGF-receptor (EGFR). TEL was expressed in E. coli and purified under both native and denaturing conditions. Purified, denatured TEL was refolded and subsequently shown to bind specifically to EGFR-expressing cells. However, inclusion of TEL in complexes of plasmid DNA and poly-L-lysine (pL) did not lead to increased gene delivery into EGFR-expressing COS-1 cells. Most likely this was due to the absence of DNA-binding activity of the LexA moiety in TEL. In contrast, native TEL was able to interact specifically with DNA. Nevertheless, since this interaction was rather weak, and refolding of denatured TEL had not resulted in functional activity of all of its protein domains, it seemed unlikely that fusion proteins containing LexA would exhibit gene transfer capabilities superior to those of similar DNA-carrier proteins previously constructed in our group. Further work therefore focused on the use of the E2C-Sp1C protein as an alternative sequencespecific DNA-binding domain. This artificial zinc-finger protein was fused to the single-chain antibody fragment scFv(FRP5), directed against the human ErbB2 growth factor receptor. The resulting 5-E2C fusion protein was expressed in E. coli and purified under native and denaturing conditions. Refolded and native 5-E2C were found to bind specifically to ErbB2-expressing cells, indicating that scFv(FRP5) in 5-E2C was functional in both preparations. In contrast, whereas refolded 5-E2C bound DNA only weakly, significant DNA binding was observed for native 5-E2C. In addition, it could not only be shown that the interaction of native 5-E2C with DNA containing its recognition sequence was specific, but also that this protein was able to bind DNA and recombinant ErbB2 simultaneously, demonstrating the functionality of both domains in native 5-E2C. Despite these encouraging results, the inclusion of native 5-E2C in pL- or polyethyleneimine (PEI)-DNA complexes did not lead to an (5-E2C-specific) enhancement of gene transfer efficiency, irrespective of the presence of the endosome-disruptive reagent chloroquine during transfection. In the second part of this thesis an alternative approach for the development of DNA-carrier proteins for nonviral gene delivery is described, based on human HMGB2, a DNA-binding protein without sequence specificity. HMGB2 contains an acidic C-terminus that has been found to decrease the affinity of the protein for DNA. Therefore, this C-terminal tail was deleted, resulting in an HMGB2-variant consisting of amino acids 1-186. HMGB2186, purified under native conditions from E. coli lysates, was able to interact with DNA and bound to the surface of different cell lines. Importantly, after binding to plasmid DNA HMGB2186 mediated gene delivery into COS-7 cells with higher efficiency than pL. In addition, HMGB2186-mediated gene transfer was strongly enhanced in the presence of chloroquine, indicating that the endocytic pathway was involved in cellular uptake. To improve internalization and intracellular routing of HMGB2186 as a DNA-carrier, a derivative containing the TAT47-57 cell-penetrating peptide (CPP), reported to facilitate cell entry independent of endocytosis, was constructed. Since this peptide also contains an NLS, in addition an HGMB2186-variant containing the SV40-NLS was constructed to investigate the effect of a peptide that has only nuclear localizing properties. Interestingly, the resulting TAT-HMGB2186 and SV40-HMGB2186 fusion proteins displayed DNA-binding activities similar to HMGB2186, but mediated gene delivery into different cell lines clearly more efficiently than the parental molecule. Furthermore, the efficacy of both fusion proteins was enhanced markedly in the presence of chloroquine, an indication that endocytosis was involved in the transfection process mediated by these proteins. This suggests that the increased transfection efficiency observed for TAT-HMGB2186 was more likely due to the NLS function present in the TAT47-57 peptide, rather than to its ‘cell penetrating properties’. Finally, the incorporation of functional peptides derived from human proteins into HMGB2186 was investigated. An uncharged CPP originating from Kaposi-FGF, reported to facilitate efficient cellular uptake of fused protein domains in an endocytosis-independent manner, was fused to HMGB2186 together with the SV40-NLS. Interestingly, the resulting KSV40-HMGB2186 fusion protein bound DNA similarly as previously tested DNA-carrier proteins, but did not mediate enhanced transfection compared to HMGB2186. In addition, the importin-b-binding (IBB) domain derived from human importin-a2 was investigated as a component of a DNA-carrier protein. Since the IBB domain can function as an NLS, it was fused to HMGB2186 resulting in the DNA-carrier protein IBBHMGB2186. Although IBB-HMGB2186 bound DNA in a similar manner as the other HMGB2186-derivatives, gene delivery mediated by IBB-HMGB2186 was only as effective as HMGB2186 mediated transfection, suggesting no significant role of the IBB domain. However, addition of chloroquine resulted in a remarkable enhancement of IBB-HMGB2186-mediated gene transfer, which was now more efficient than with any other HMGB2186-variant tested, and not much lower than gene transfer mediated by PEI, one of the most efficient transfection reagents available to date. To enhance nonviral gene delivery even further, the HMGB2186-based DNA-carrier proteins described in this thesis might now serve as building blocks for novel fusion proteins that include additional complementing activities. In this respect it seems particularly promising that, under conditions of effective end some escape, IBB-HMGB2186, which consists entirely of protein domains of human origin, was the most efficient of all proteins tested in this work.
Organismen besitzen die Fähigkeit sich Temperaturerniedrigungen anzupassen, wobei über die molekularen Mechanismen der Kälteadaptation wenig bekannt ist. Für die Untersuchung dieser Mechanismen stellt die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ein ausgezeichnetes Modellsystem aufgrund der einfachen Struktur und der Möglichkeit zur genetischen Manipulation dar. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Antwort von S. cerevisiae auf Kälte mit Hilfe von DNA Chips (6330 ORFs) charakterisiert, wobei Proben von Hefekulturen mit einer Inkubationsdauer von 10 und 30 min, 2, 12 und 60 h bei 10°C verwendet wurden. 634 Gene reagierten mit einer signifikanten Expressionsänderungen auf den Kälteeinfluss, wobei zwei distinkte Phasen, definiert als frühe und späte Kälteantwort, identifiziert wurden. Vergleiche der Kälteantwort mit Expressionsdaten verschiedener Umweltstressbedingungen ergaben differentielle Expressionsmuster. Im Vergleich zu anderen Stressreaktionen zeigten Gene der frühen Kälteantwort entweder ein entgegengesetztes Expressionsmuster (“inverser Hitzeschockeffekt”) oder keine transkriptionelle Reaktion. Dieser Effekt kehrte sich während der späten Kälteantwort in eine allgemeine Stressantwort um. Messungen des Trehalose- und Glykogengehalts sowie Studien mit einer in der Stressinduktion beeinträchtigten Doppelmutante Δmsn2/Δmsn4 bei 10°C zeigten, dass die allgemeine Stressantwort ein Teil der späten Kälteantwort ist. Dagegen deuten die Daten der frühen Kälteantwort auf eine Kälte-spezifische Reaktion hin, wobei Anpassung der Membranfluidität sowie RNA-Modifikation eine essentielle Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Kälteanpassung in S. cerevisiae wurde der ORF YBR255W mit unbekannter Funktion, dessen Deletion einen Kälte-sensitiven Wachstumsdefekt besitzt, auf molekular-biologischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die transkriptionelle Reaktion einer Δybr255w-Mutante bei Kälte (10ºC) wurde mit den Expressionsdaten des Wildtyps verglichen und zeigte starke Veränderungen während der frühen Kälteantwort, wobei nach 2 Stunden der größte Expressionsunterschied zum Wildtyp beobachtet wurde. 65% der Gene der frühen Kälteantwort zeigten YBR255Wabhängige Veränderungen, darunter Gene des Zellzyklus, des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung. Interaktionsstudien auf genetischer und Proteinebene ergaben, dass Ybr255p mit einer Komponente des „Mitotic Exit Network“ und Komponenten des PKC1-Wegs interagiert. Die Überexpression von Ybr225p zeigte drastische Veränderungen der Zellmorphologie, wie sie ebenfalls für Mutanten des „Mitotic Exit Network“ beschrieben sind. Zusammengenommen mit der transkriptionellen Reaktion der Δybr255w-Mutante auf Kälte deuten diese Ergebnisse auf eine essentielle Rolle von Ybr255p im Zellzyklus bei Kälte hin.
Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.
11 mit Salix spp. assoziierte Gallmücken-Arten (Diptera: Cecidomyiidae: Oligotrophini) wurden einer morphometrischen Analyse unterzogen. Dabei fanden 18 allgemeine und 10 geschlechtsspezifische Merkmale Berücksichtigung. Von sechs Arten wurden darüber hinaus 10 larvale Merkmale morphometrisch erfasst. Insgesamt wurden 325 Imagines und 45 Larven vermessen. Die Ergebnisse lassen eine neue systematische Einteilung auf Gattungs- und Artebene zu. Neben der morphologisch und biologisch bereits vorher eindeutig zu differenzierenden Gattung Iteomyia ist eine Aufteilung des verbleibenden Artenschwarms in drei Gruppen erkennen. Als wesentliche trennende Merkmale zeigen sich Antennen und geschlechtspezifische Charakteristika wie die Länge des Ovipositors bei den Imagines und die Ausbildung der für die Larven charakteristischen Spatula. Die morphologische Differenzierung findet ihre Entsprechung in qualitativen, biologischen Merkmalen der Tiere. Aus diesem Grund wird die Aufteilung der auf Salix spp. gallenbildenden Cecidomyiidae in mindestens vier Gattungen vorgeschlagen. Die Gattung Iteomyia behält ihren aktuellen Status und wird von der einzigen Art repräsentiert, die auf der Blattflächen von Weiden Gallen erzeugt (I. capreae). Die Dasineura-Gruppe enthält die sich in Blattrandgallen entwickelnden Gallmücken (D. auritae, D. marginemtorquens und D. roskami) sowie die inquilinen Arten, die zur Verpuppung einen Kokon anlegen und mindestens zwei Generationen im Jahr realisieren (in der vorliegenden Arbeit untersucht: D. schreiteri). In Rabdophaga werden jene Taxa integriert, die sich im Sproßbereich ihrer Wirtspflanzen unmittelbar unter der Rindeentwickeln, ohne ausgeprägte Gallenbildungen auszulösen (in der vorliegenden Arbeit untersucht: R. saliciperda und R. repentiperda) Ihre Entwicklung ist univoltin, die Verpuppung erfolgt ohne Anfertigung eines Kokons. In einer noch genauer zu definierenden vierten Gruppierung (hier provisorisch mit dem Gattungsnamen „Salicicola“ bezeichnet) fasst die Arten zusammen, die an den Sprossen ihrer Wirtspflanzen deutliche Gallenbildungen hervorrufen. Auch sie sind univoltin und verpuppen sich im Sproßbereich ohne Anfertigung eines Kokons. Die Zuordnung des in der vorliegenden Studie nicht untersuchten Artenkomplexes, den Knospengallenerzeugern, ist noch nicht geklärt. Eine endgültige Klärung der hier vorgeschlagenen systematischen Einteilung kann nur das Ergebnis einer umfassenden Revision sämtlicher mit Salix spp. assoziierten Gallmücken sein. Die polyphage Weidenrosenmücke Rabdophaga rosaria lässt sich mit Hilfe einer Hauptkomponenten-Analyse morphometrisch in vier Cluster gruppieren, die in der systematischen Aufteilung der von ihnen genutzten Salix spp. (alba, aurita/caprea/cinerea, purpurea und repens) ihre Entsprechung finden. Die festgestellte Auftrennung der Weidenrosenmücke illustriert anschaulich die Idee der sequentiellen Evolution, nach der aufgrund der engen phänologischen, biochemischen und physiologischen Interaktionen zwischen spezialisierten Phytophagen und ihren Wirtspflanzen eine schrittweise hochgradige Anpassung der beteiligten Organismengruppen zu erwarten ist. Wie im vorliegenden Fall steht am Ende solch einer Entwicklung die Herausbildung sogenannter Biotypen, deren Eigenständigkeit durch morphologische Unterschiede untermauert wird. Die Cecidomyiidae Iteomyia capreae ruft je nach genutzter Wirtspflanzenart verschiedene Gallenformen mit unterschiedlichem Verteilungsmuster auf den Blattflächen hervor. Die sich in den beiden Gallentypen entwickelnden Tiere unterscheiden sich morphologisch und lassen sich in Abhängigkeit der von ihnen genutzten Wirtspflanze ähnlich wie Rabdophaga rosaria in zwei Biotypen einteilen. Die auf Salix caprea lebenden Tiere weisen eine geringere Gallenzahl pro Blatt auf als die auf S. cinerea lebenden Tiere. Die beiden Biotypen zeigen signifikante Unterschiede hinsichtlich ihrer Fertilität. Der S. caprea-Typus, der seine einkammrigen Gallen über die gesamte Blattfläche verteilt, zeigt eine höhere Fruchtbarkeit als der S. cinerea-Typus, der ein- bis mehrkammrige Gallen entlang des Blattmittelnervs anlegt. Gleichzeitig zeigen sich signifikante Unterschiede in der durch Parasitoiden hervorgerufenen Mortalität. Die kleinen, über die gesamte Blattfläche verstreuten Gallen des S. caprea-Typs weisen eine geringere Parasitierungsrate auf als die großen, am Mittelnerv konzentrierten Gallen des S. cinerea-Typs. Von acht der elf untersuchten Gallmückenspezies wurde der Feindartenkomplex analysiert. Zu diesem Zweck wurden an 30 Standorten in Deutschland und Dänemark über 7500 Gallen gesammelt und in Zucht genommen. Aufgrund der vielkammrigen Gallen einzelner Arten konnten insgesamt mehr als 12500 Gallenkammern auf ihre Artenzusammensetzung hin analysiert werden. Insgesamt konnten 57 Parasitoiden-Arten nachgewiesen werden, die sich auf sieben Familien parasitischer Hymenopteren verteilen. Am artenreichsten vertreten sind die Pteromalidae und Platygasteridae mit einem Anteil von jeweils 24,56 % (14 spp). Der Artenreichtum ist mit fast zehn Spezies pro Gegenspielerkomplex ungewöhnlich hoch und liegt deutlich über den Werten anderer Gallenerzeuger-Gruppen. 27 Spezies (47,37 %) konnten keiner bekannten Art zugeordnet werden. Es wird vermutet, dass sich darunter zahlreiche, für die Wissenschaft neue Arten befinden. Insgesamt 42 spp. (73,7 %) der nachgewiesenen Parasitoidenarten wurden nur aus einer der untersuchten Wirtsarten gezüchtet, lediglich fünf Arten attackierten mehr als zwei der untersuchten Wirtsarten. Das Verhältnis von Idiobionten (töten den Wirt zum Zeitpunkt der Parasitierung ab) zu Koinobionten (erlauben dem Wirt zunächst ein weiteres Wachstum) ist mit 53,3 % zu 46,7 % annähernd gleich. Für 37 Taxa (64,91 %) konnten Angaben über ihre Wirtsbindung gemacht werden. Es zeigte sich, daß der Feindkomplex der untersuchten Gallmücken von stark spezialisierten Arten dominiert wird. Alle Arten sind bisher nur an gallenerzeugenden oder zumindest endophytisch lebenden Wirten nachgewiesen worden, 28 spp. sind darüber hinaus auf gallenbildende Cecidomyiidae spezialisiert, 10 spp. parasitieren nur cecidogene Gallmücken auf Weiden. Am artenreichsten war mit 24 spp. der Gegenspielerkomplex des Blattgallenerzeugers Iteomyia capreae, gefolgt von den Blattrandgallenerzeugern Dasineura auritae (12 spp.) und D. marginemtorquens (11 spp.), dem Sproßgallenerzeugern Rabdophaga salicis (10 spp.) und der Inquilinen-Art Dasineura schreiteri (10 spp.) sowie der unmittelbar unter der Rinde ihrer Wirtspflanzen lebenden sogenannten Schrotschuß-Gallmücke R. saliciperda (6 spp.). Mit nur drei bzw. vier Arten erwiesen sich die Gegenspielerkomplexe der Weidenrosen-Gallmücke Rabdophaga rosaria und der Sproßgallen erzeugenden R. degeeri am artenärmsten. Die Ähnlichkeits-Analyse der jeweiligen Gegenspielerspektren ließ eine große Eigenständigkeit erkennen, die geringen Ähnlichkeiten sprechen für einen hohen Anteil von Spezialisten in den Parasitoidenkomplexen. In den Gegenspielerspektren dominierten nur jeweils zwei bis fünf Arten. 19 der 57 Arten wiesen eudominante oder dominate Abundanz-Werte auf. Dabei waren vor allem die Arten der Gattungen Synopeas, Torymus, Platygaster und Aprostocetus von größerer Bedeutung für die Mortalitätsraten ihrer Wirte. Die Erreger der verschiedenen Gallentypen waren unterschiedlichen Mortalitätsraten durch Parasitoide unterworfen. Dasineura auritae und D. marginemtorquens, die Erzeuger von Blattrandgallen, wiesen die höchsten durchschnittlichen Parasitierungsraten auf (43,04 %), die Inquiline D. schreiteri die geringste (20,25 %). Die Sproßgallenerzeuger Rabdophaga salicis und R. degeerii wiesen nur eine geringfügig höhere Mortalität durch Parasitierung (24,31 %) auf, gefolgt von der Weidenrosen-Gallmücke Rabdophaga rosaria (25,47 %) und den Blattgallen von Iteomyia capreae (31,26 %). Der Feindkomplex der untersuchten Cecidomyiidae wurde mit dem der an Salix spp. gallenbildenden Tenthredinidae verglichen. Bislang sind für die mit Salix spp. assoziierten cecidogenen Gallmücken und Blattwespen in Nord- und Mitteleuropa über Gegenspielerarten nachgewiesen worden, von denen lediglich sieben in beiden Wirtsfamilien auftreten. Brutparasiten, die vor allem bei den Blattgallenerzeugern (Pontania spp.) vorhanden sind, fehlen bei den Gallmücken völlig. Sowohl Cecidomyiidae als auch Tenthredinidae werden vor allem von spezialisierten Parasitoiden attackiert, deren Wirtskreis sich auf diese gallenbildenden Herbivoren-Gruppen beschränkt. Innerhalb der Gegenspielerspektren sind jeweils über 80 % der Parasitoidenarten bislang nur in einem Gallentyp nachgewiesen worden. Der Artenpool der Blattwespen-Parasitoiden wird mit fast 60 % von den Ichneumonoidea dominiert. Bei den Gallmücken fehlt diese ParasitoidenÜberfamilie völlig, hier sind die Chalcidoidea mit über 70 % der Arten das bestimmende Element. Dagegen stellen die in den Tenthrediniden-Gallen lediglich mit zwei Arten vertretenen Platygasteroidea im Gegenspielerspektrum der Cecidomyiidae mehr als 25 % aller Spezies. Bei den Blattwespen tritt nur ein knappes Drittel der Parasitoidenarten, deren Biologie näher bekannt ist, als Koinobionten auf. Bei den Gallmücken erhöht sich der Anteil dieser Feindarten-Gilde auf über 50 %. Vergleicht man die einzelnen Gallentypen, so sind auch in der Parasitierungs-Strategie der beteiligten Arten große Unterschiede zu verzeichnen. Die meisten Parasitoide der Tenthredinidae befallen junge Wirtslarven, bei den Gallmücken ist dagegen der Typ des Junglarven-Parasitoiden nur selten anzutreffen: Wird ein frühes Wirtsstadium angegriffen (in der Regel durch Koinobionten), so erfolgt bereits die Belegung des Wirtseies. Blattwespen weisen höhere Mortalitätsraten als Gallmücken auf. Darüber hinaus zeigt sowohl bei den Blattwespen als auch bei den Gallmücken die durch Parasitierung hervorgerufene Mortalität prägnante Unterschiede zwischen den einzelnen Wirtsarten und Gallentypen, aber auch innerhalb einer Art gibt es je nach Lokalität und Untersuchungsjahr deutliche Schwankungen. Bei den Tenthredinidae liegt die durchschnittliche Parasitierungsrate der Blattgallenerzeuger (53,3 %) deutlich über den Werten der Sproßgallenerzeuger (41,7 %) Entsprechende große Unterschiede lassen sich für die Blattrandgallenerzeuger (43,04 %) und Sproßgallenerzeuger (24,31 %) der Cecidomyiidae feststellen.
Das Genom des anaeroben ε-Proteobakteriums Wolinella succinogenes codiert überraschenderweise für Enzymkomplexe, die typisch für die aerobe Atmung sind. Die entsprechenden Gene werd en unter bekannten Wachstumsbedingungen nicht
exprimiert. Darunter findet sich ein Operon ( sdhABE) für eine putative „Succinat-Dehydrogenase“, die hohe Sequenzhomol ogien zu sog. „nicht-klassischen“ archaealen Succinat-Dehydrogenasen zeigt. In der vorliegenden Arbeit sollte die „Succinat-Dehydro genase“ mit Hilfe des etablierten genetischen Systems zur Modifikation und Produktion der Chinol:Fumarat-Reduktase(QFR) homolog in W. succinogenes produziert und charakterisiert werden. Das genetische System besteht aus der QFR- Deletions-mutante ΔfrdCAB und dem Vektor pFrdcat2, der aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Rahmen dieser Arbeit sequenziert wurde.
The heat stress (hs) response is universal to all organisms. As the cell senses increase in temperature, heat stress transcription factors (Hsfs) are activated to upregulate the expression of a number of genes encoding heat stress proteins (Hsp) which act as molecular chaperones to protect cells against heat damages. In higher plants, the phenomenon seems to be unusually complex both at the level of Hsfs and Hsps (e.g., 21 Hsf encoding genes in Arabidopsis and at least 17 in tomato). Upon prolonged hs, another characteristic property of plant cells is the assembly of large cytosolic aggregates called heat stress granules (HSG), which are composed of Hsps, HsfA2, RNA and RNA-binding proteins. The present work was aimed to understand plant hs response using tomato as a model system. To study the function of tomato Hsfs in their native system, we generated transgenic tomato lines altered in expression of HsfA1, HsfA2, and HsfB1. Tomato plants with 10-fold overexpression of HsfA1 (OE plants) were characterised by integration of a single HsfA1 expression cassette, whereas the plants harbouring a tandem inverted repeat (IR) of the cassette showed cosuppression of HsfA1 (CS plants). The lack of HsfA1 expression in CS plants results from posttranscriptional gene silencing connected with the formation of small interfering RNA (siRNA). Under normal growth conditions, major developmental features were similar for wild-type (WT), OE and CS plants. However, in contrast to the former two, CS plants and fruits were extremely sensitive to elevated temperature because hs-induced synthesis of major chaperones and Hsfs was strongly reduced or lacking. Despite the complexity of the plant Hsf family, the function of tomato HsfA1 is unique as master regulator of induced thermotolerance. On the other hand, maintenance of essential chaperones in CS plants during seed development suggests involvement of other Hsfs and/or transcription factor(s). HsfB1 and HsfA2 transgenic tomato plants, unaffected in thermotolerance, further supported the function of HsfA1 as the major factor regulating hs-inducible genes. Hs87 independent phenotypes of plants with altered expression of HsfB1 indicates developmental role of this Hsf. Using transient reporter assays with mesophyll protoplasts from WT tomato, we demonstrated that plasmids encoding Hsfs A1, A2 and A3 were well expressed which could function as activators for reporter gene expression. However, in protoplasts derived from CS plants, plasmids encoding HsfA2 and HsfA3 were normally expressed but even higher amounts of HsfA1 expression plasmids were completely silenced. Therefore, silencing of HsfA1 in CS plants was also reproduced in its mesophyll protoplasts. Lacking thermotolerance in CS protoplasts could be restored after transformation with expression plasmids encoding functionally equivalent HsfA2 or HsfA3 resulting in (i) expression of chaperones, (ii) survival of the cells at otherwise lethal temperature, (iii) thermoprotection of firefly luciferase, and (iv) assembly of heat stress granules (HSGs). The strong silencing caused by an IR in CS plants opened the possibility of a broad use of RNAi for gene knock-down also in the transient system of mesophyll protoplasts. Using this technology, we attempted to dissect essential components of thermotolerance and HSG assembly. We demonstrated the previously reported function of chaperones such as Hsp70 and Hsp101, and could discriminate the in vivo chaperone functions of different isoforms of Hsp20 and Hsp70 proteins. Hsp17-CI, Hsp70 (hs-inducible isoforms), and Hsp101 are absolutely essential chaperones for thermotolerance in plants. Furthermore, the results also show that despite Hsp17-CI and -CII being major components of HSG complexes, they are dispensable for assembly of these complexes. Based on these results, it is proposed that in the transient protoplast system an approach with gene-specific IRs can be used to discriminate functions of closely related isoforms among protein-families and to dissect complex protein networks.
Vascular occlusive diseases are one of the leading mortality causes in westernised countries. Occlusions of one of the major arteries can be overcome without devastating consequences provided a timely induction of compensating collateral arteries occurs. Perhaps the most outstanding feature of collateral vessel growth is the proliferation of smooth muscle cells (SMCs). Understanding the molecular mechanisms and identifying key molecular players of SMC proliferation would contribute significantly to the development of efficient therapies to intervene with all processes involving neointima formation, including collateral growth. mRNA and protein coding for co-transcription factor Egr1 were found to be up-regulated in growing collateral vessels 6, 12 or 24 hours following femoral artery ligation in mice. Since Egr1 is required for SMC proliferation in vitro and in vivo and likely to be implicated in the initiation of collateral artery growth, the key signalling mediators regulating Egr1 expression specifically in proliferating vascular SMCs were investigated. Northern blot and Western blot analysis revealed a strong up-regulation of Egr1 within 2 hours of stimulation with PDGF-AB and FGF-2. These two potent SMC mitogens involved in neointima formation were used to stimulate vascular SMCs not only to delineate the regulators of Egr1 expression but also to identify additional key mediators of SMC proliferation. FGF-2 but not PDGF-AB led to a drastic reduction of desmin amount in proliferating SMCs, correlating closely with the phenotypic modulation of SMCs in vivo. Both growth factors triggered a dramatic increase in DNA-synthesis rate with a concomitant loss of p27 exp Kip1. Stimulation with PDGF-AB and FGF-2 triggered a rapid and transient activation of PDGFRβ and FGFR1 respectively, thus providing the basis for activation of down-stream targets. Analysis of an array of signalling pathways demonstrated a strong activation of the Ras-Raf-MEK-ERK cascade in response to both factors as measured by the level of phosphorylation of prominent members MEK, ERK1/2 and c-Myc. SAPK/JNK and p38, which also belong to the superfamily of MAP kinases, did not become activated following stimulation with either PDGF-AB or FGF-2. The analysis of various PKC isoforms identified PKCδ and PKCθ to be the key mediators of PDGF-AB- and FGF-2-induced mitogenesis in proliferating SMCs. Whereas PDGF-AB potently stimulated PKB/Akt with concomitant GSK3β phosphorylation, FGF-2-induced inactivation of GSK3β was independent of PKB/Akt. Specific inhibition in order to evaluate the contribution of individual pathways to Egr1 expression and vascular SMC proliferation revealed that inhibition of the Raf-MEK-ERK module by UO126 completely abolished DNA-synthesis and Egr1 expression without a compensation by alternative pathways. Surprisingly, inhibition of PI3K led to a switch to the mitogenic RafMEK-ERK signalling cascade which resulted in an augmented Egr1 expression. In conclusion, in porcine vascular SMCs, activation of the Ras-Raf-MEK-ERK signalling module appears to be the main prerequisite for Egr1 expression and DNA synthesis induction in response to PDGF-AB and FGF-2 whereas related kinases SAPK/JNK and p38 play no significant role. Inhibition of the PI3K-Akt cascade represents an alternative way to activate ERK1/2 and induce Egr1 expression. Whereas MEK is the central regulator of mitogenic effects in proliferating vascular SMCs, the PI3K-Akt pathway most likely exerts survival function. Inactivation of MEK by its specific inhibitors identified hyperphosphorylation as ayet unknown mechanism of kinase inhibition.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Insektenzellen /Baculovirus-System für die heterologe Expression der NTPDase6 etabliert. Nach der Herstellung und Selektion des NTPDase6-positiven Baculovirus wurden drei Insektenzelllinien hinsichtlich der optimalen Expressions-bedingungen für die NTPDase6 analysiert. In Sf9(+Serum)-, Sf9(-Serum)- und High FiveTM-Zellen wurde eine Expression und Sekretion des aktiven Enzyms nachgewiesen. Ferner konnte durch die Analyse mit PNGaseF eine partielle N-Glykosilierung experimentell gezeigt werden. Die Aktivität im Kulturüberstand übertraf generell die Aktivität in der löslichen Zellfraktion. Die höchste GDPase-Aktivität war mit 22,96 nmol Pi /(106 Zellen x min) nach 6 Tagen im Kulturüberstand der SF9(-Serum)-Zellen zu verzeichnen. Nachdem die Erntequelle sowie der Erntezeitpunkt feststanden, wurden in den folgenden Experimenten verschiedene chromatographische Verfahren für eine Reinigung der NTPDase6 analysiert. Eine Bindung der NTPDase6 konnte für die Chromatographie mit Con A-Sepharose 4B, Q Sepharose Fast Flow, Reactive Red 120-Agarose, Reactive Green 19-Agarose, Cibacron Blue 3GA-Agarose und die Reactive Brown 10-Agarose verzeichnet werden. Hingegen wurde eine nur partielle Bindung der NTPDase6 für die Reactive Yellow 86-Agarose, Reactive Blue 4-Agarose und die Ni2+-NTA-Agarose nachgewiesen. Nicht oder kaum NTPDase6-bindend waren die CM Cellulose, GDP-Agarose, Protino Ni-TED und BD TALON. Ebenfalls analysiert wurde die Größenausschluss-Chromatographie mit Sephacryl S-100 HR unter verschiedenen Bedingungen. Für das finale Reinigungsschema wurde die Con A-Sepharose 4B-Chromato-graphie aufgrund der geringen Kosten und des großen Volumens als erster Reinigungsschritt eingesetzt. Als zweite Phase der sequentiellen Reinigung wurde die Cibacron Blue 3GA-Agarose ausgewählt, da in der Pilotstudie über die Reaktivfarbstoffe mit diesem Material die höchste Elution der GDPase-Aktivität beobachtet werden konnte. Für den dritten Schritt wurde aufgrund der hohen Trennschärfe die Ni2+-NTA-Agarose verwendet. Insgesamt wurde mit diesen drei Schritten eine 180 fache, partielle Reinigung der NTPDase6 erreicht. Es erwies sich, dass die erhaltene Proteinmenge für die geplanten Röntgenstrukturanalyse und die Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nicht ausreichte. Als weitere Möglichkeit für die Untersuchung des angereicherten Enzyms stand die MALDI-TOF-Analyse zur Verfügung. In diesen Untersuchungen wurde die Aminosäuresequenz zu 43,9 % verifiziert und es ergaben sich Hinweise darauf, dass die potenzielle N256-Glykosilierungssstelle bei der heterologen Expression in Insektenzellen nicht genutzt wird. Weiterhin wurden die potenziellen N-terminale Signalpeptide und Spaltstellen der NTPDase6 in silico mit Hilfe des SignalP 3.0-Algorithmus analysiert. Diese Untersuchungen ergaben putative Spaltstellen an den Aminosäurepositionen L25 und A40 mit einer Wahrscheinlichkeit von 37 % und 7 %. Mit Triton X-114-Separationen wurde ferner nachgewiesen, dass 60,7 % der NTPDase6 in der Zelle in löslicher Form und 39,3 % in membrangebundener Form vorliegen. Die hier erbrachten Nachweise einer putativen N-terminalen Spaltstelle und der intrazellulären Spaltung des hydrophoben Signalpeptides deuten darauf hin, dass es sich bei der Sekretion des Proteins um einen physiologischen Vorgang handelt. Es ist wahrscheinlich, dass die gleichzeitige Lokalisation des Enzyms im Golgi-Apparat und im Kulturüberstand einen physiologisch relevanten Mechanismus darstellt und das Enzym extra- sowie intra-zellulär für die Hydrolyse von 5’-Nukleosid-Diphosphaten verantwortlich ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Lokalisation der NTPDase6 in vivo untersucht. Dazu wurden NTPDase6-Antikörper hergestellt und mit Hilfe von Immunoblots sowie in der Immunzytologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase6-Antikörper nur in der Immunzytologie verwendet werden können. Zur Untersuchung der zellspezifischen Expression der NTDPase6 wurden anschließend immunhistologische Analysen am adulten Rattengehirn durchgeführt. Markierte Zellen präsentierten sich z.B. im gesamten Kortex des Gehirns, im Gyrus dentatus des Hippokampus, im Corpus striatum und im Septum. Die markierten Zellen zeigten eine organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns, die eine Markierung von Golgi-Stapeln vermuten lässt. Nur in Zellen mit einem großen Nukleus, bei welchen es sich um große Nervenzellen handeln dürfte, konnte die beschriebene Fluoreszenz nachgewiesen werden. Diese Markierungen als NTPDase6-spezifisch zu beurteilen ist jedoch schwierig, da die Präimmunkontrollen eine schwache, organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns von Zellen mit einem großen Nukleus aufwiesen. Insgesammt liefern die Untersuchungen einen neuen Beitrag zum Verständnis der Struktur und der Prozessierung der NTPDase6 sowie ein Verfahren zur heterologen Expression und zur anschließenden partiellen Aufreinigung des Enzyms.
Traditionell-morphologisch begründete Hypothesen zur Großphylogenie der Metazoa sind im Verlauf der letzten Jahre durch molekularbiologische Untersuchungen grundsätzlich in Frage gestellt worden. Die molekularbiologisch begründete Metazoen-Großphylogenie wird seit einem Übersichtsartikel von ADOUTTE et al. (2000) meist als „New Animal Phylogeny“ bezeichnet (kurz: NAP); sie beinhaltet eine Restrukturierung des Stammbaumes (kladogenetischer Aspekt) und die Infragestellung einer morphologischen Komplexitätssteigerung nach dem Schema acoelomat-pseudocoelomat-coelomat (anagenetischer Aspekt). Hinsichtlich der Kladogenese steht die Neueinteilung der Bilateria in drei Superphyla Deuterostomia, Ecdysozoa und Lophotrochozoa im Vordergrund; die Genealogie innerhalb dieser drei Großgruppen ist aber z.Z. relativ schlecht aufgelöst, so daß sich Vergleichsmöglichkeiten mit morphologischen Vorgängermodellen schnell erschöpfen. Aus diesem Grunde wird in vorliegender Arbeit der anagenetische Aspekt als Ausgangspunkt für eine umfassende morphologische Interpretation der molekularbiologischen Resultate gewählt. Momentan wird auf molekularsystematischer und vergleichend-entwicklungsgenetischer Basis davon ausgegangen, daß die frühesten Bilaterier eine acoelomate Organisation aufwiesen, von hier aus eine relativ komplexe, polymer-coelomate Organisation erwarben, welche dann aber in zahlreichen Bilaterierlinien sekundär reduziert wurde. Die ursprünglich acoelomate Organisation wird rezent nur durch eine sehr isolierte Linie, die Acoela (ggf. auch Nemertodermatida) vertreten, während alle anderen Bilaterier von einem polymer-coelomaten „Urbilaterier“ abstammen sollen. In vorliegender Arbeit wird die Auffassung vertreten, daß die morphologische Deutung eines solchen anagenetischen Szenarios am ehesten anhand der Hydroskelett-Theorie von W. F. GUTMANN (1972 et mult.), sowie späteren auf diesem Entwurf aufbauenden Arbeiten (insbesondere der Gallertoid-Hypothese, BONIK et al. 1976) möglich ist, d.h. auf konstruktionsmorphologischer Grundlage. Um den Nachweis einer weitgehenden Übereinstimmung von NAP und Gallertoid-Hydroskelett-Theorie zu führen, werden für 36 Metazoenbaupläne (4 Nonbilaterier, 32 Bilaterier) aktuelle molekularphylogenetische Befunde den jeweiligen konstruktionsmorphologischen Interpretationen gegenübergestellt. Für die vier Nonbilateria-Linien ergibt sich eine Vereinbarkeit auf kladogenetischer Ebene insbesondere dann, wenn die Placozoa vor den Porifera abzweigen (z.Z. aufgrund von mtDNADaten anzunehmen); auf anagenetischer Ebene aufgrund von Studien, welche die „Diploblastica/ Triploblastica“-Unterteilung in Frage stellen (Mesoderm-Problem). Für die Bilateria ist u.a. festzuhalten, daß im Rahmen der Hydroskelett-Theorie kein Schwestergruppenverhältnis Annelida + Arthropoda angenommen wurde, so daß die umstrittene neue Großgruppe Ecdysozoa unproblematisch ist: Ecdysozoa werden durch Ableitung der „Aschelminthen“ von polymeren Vorformen einer Deutung zugänglich. Die Molekularsystematik der Annelida, aber auch der Deuterostomia ist mit konstruktionsmorphologischen Interpretationen vereinbar, bei den Deuterostomia v.a. der hochderivierte Status der Pterobranchia und Tunicata. Als kennzeichnendste Übereinstimmung ist die Einordnung der Tentaculata als hochabgeleitete Protostomier hervorzuheben, was sowohl als „Grundstein“ der NAP gilt (HALANYCH et al. 1995) als auch eine sehr spezifische Position der Hydroskelett-Theorie darstellt. Es wird gefolgert, daß die Gallertoid- Hydroskelett-Theorie zentrale Resultate der NAP besser zu integrieren vermag als andere Entwürfe. Konsequenzen für merkmalsmorphologische Deutungen werden aufgezeigt.
Membranes are essential for life, because a cell must separate itself from the environment to keep its molecules from dissipating away and also must keep out foreign molecules that disturb them or their cell components. However, the cell must communicate with the environment and adapt to the external conditions, needs to pump in nutrients and release toxic products of its metabolism. Membrane proteins present in the membranes of the cell and cell organelles, help the cell to gather information about the environment and perform various biological processes. Membrane proteins perform a wide range of biological functions including respiration, signal transduction and transport. Despite their high importance in biological function, only few structures have been determined because of the difficulties in producing high amounts of membrane proteins and obtaining good quality crystals. This Ph. D. thesis involves the study of different kinds of cytochrome oxidases and a membrane anchored cytochrome oxidase electron donor. Though structures of many cytochrome oxidases are known to date, there exist many different types of oxidases in different organisms, which help the organism to survive under unfavorable environmental conditions. The structural differences between these terminal oxidases which make the organism to survive in extreme environments are unclear. To investigate these, structures of different types of oxidases are necessary. Therefore, we are interested in revealing the structural details of different types of oxidases. The different types of oxidase I worked with were the caa3 HiPIP:oxygen oxidoreductase from Rhodothermus marinus, the aa3-type quinol oxidase from Acidianus ambivalens and bd-type quinol oxidase from three different organisms (Escherichia coli, Bacillus thermodenitrificans and Aquifex aeolicus). Besides the protein from E. coli all other proteins are from thermophilic organisms from which the proteins obtained are generally believed to be highly stable. The presence of a high content of charged amino acids that enhances the occurrence of salt bridges contributes to the stability of thermophilic proteins. ....
Leukämien sind maligne Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, die teilweise mit einer sehr schlechten Prognose einhergehen. Die Phänotypen sowie die verursachenden Mutationen in den hämatopoietischen Vorläuferzellen sind vielfältig. 5-10 % aller Akuten Leukämien korrelieren mit genetischen Veränderungen des MLLGens auf Chromosom 11q23. Besonders häufig findet man reziproke, chromosomale Translokationen. Leukämien mit diesen Mutationen zählen fast ausschließlich zu den Hochrisiko-Leukämien, wobei der Partner des MLL-Gens Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung hat. Bisher sind 43 Translokationspartner des MLL-Gens bekannt, von denen jedoch in der Routinediagnostik nur die 6 häufigsten, MLLT2, MLLT1, MLLT3, MLLT4, ELL und MLLT10 untersucht werden. Seltene oder unbekannte Partnergene werden von den Analysen ausgenommen. Da das Partnergen aber wichtig für die Risikoeinstufung der Erkrankung ist, ist es notwendig, dieses rasch zu identifizieren, um ein optimales Therapieprotokoll anwenden zu können. Aus diesem Grund wurde eine universelle, PCR-Methode entwickelt und etabliert, die es erlaubt, jede MLL-Translokation, auch ohne vorherige Kenntnis des Partnergens, zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, sowohl das Partnergen, als auch den chromosomalen Bruchpunkt basengenau auf DNA-Ebene zu analysieren. Mit dieser Technik sind im Verlauf der Studie 501 Patienten untersucht worden (319 Kinder, 179 Erwachsene, 3 ohne Altersangabe). Bei diesen Analysen wurden 9 neue Partnergene entdeckt: ACACA, SELB, SMAP1, TIRAP, ARHGEF17, BCL9L, KIAA0284, MAML2 und APBB1IP. Für alle positiven Patientenproben sind außer den Partnergenen auch die basengenauen Bruchpunkte kartiert worden. Die Kenntnis des Patienten-spezifischen Bruchpunktes erlaubt eine exakte Quantifizierung der Blastenlast mittels qPCR und ermöglicht somit ein empfindliches Monitoring des Krankheitsverlaufs unter Therapie und die Detektion einer minimalen Resterkrankung (MRD).
Zur erfolgreichen Behandlung von Tumorerkrankungen sind effiziente Therapien notwendig. Oftmals kommt es nach einer klassischen Tumortherapie zum Auftreten von Rezidiven, die aus residuellen Tumorzellen hervorgehen. Grund hierfür können eine bereits erfolgte Metastasierung oder Resistenzmechanismen der Tumorzellen sein. Auf Grund ihrer Fähigkeit Gewebe aktiv zu infiltrieren bietet der Einsatz zytotoxischer Lymphozyten im Rahmen einer zellulären Immuntherapie den Vorteil, auch bereits metastasierte Tumorzellen zu erreichen. Dadurch können auch Tumorzellen eliminiert werden, die Resistenzmechanismen meist im oberen Teil apoptotischer Signalkaskaden aufweisen. Eine spezifische Ausrichtung zytotoxischer Lymphozyten auf Tumorantigene ist grundsätzlich über chimäre Antigenrezeptoren möglich. Dabei bietet die Generierung von Tumor-spezifischen zytotoxischen Effektorzelllinien den Vorteil, Zellklone mit definierter Aktivität und Spezifität bereitstellen zu können. Im Hinblick auf einen klinischen Einsatz scheint hierfür die Natürliche Killerzelllinie NK-92 besonders geeignet. Die Ergebnisse einer klinischen Studie mit parentalen NK-92 Zellen zeigten eine gute Verträglichkeit ohne Nebenwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NK-92 Zellen genetisch so modifiziert, dass sie chimäre Antigenrezeptoren mit Spezifität für die Tumorantigene CD20, EpCAM, GD2 und CD138 exprimieren. In der Tumortherapie stellen das mit Tumoren der B-Zell-Reihe assoziierte CD20-Molekül und das auf den meisten Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimierte EpCAM-Protein wichtige Zielantigene monoklonaler Antikörper dar. Studien zeigten, dass auch die auf Tumorzellen des Neuroblastoms bzw. Multiplen Myeloms exprimierten Moleküle GD2 bzw. CD138 geeignete Angriffspunkte für immuntherapeutische Ansätze sein könnten. Die chimären Antigenrezeptoren sind aus einem Antigenspezifischen scFv-Antikörperfragment aufgebaut, das über ein Fragment der CD8alpha-Kette mit der CD3zeta-Kette als Signaltransduktionsdomäne verbunden ist. Nach retroviraler Transduktion zeigte sich eine hohe und homogene Oberflächenexpression dieser Rezeptoren auf modifizierten NK-92 Zellen. Auf das Oberflächenprotein CD20 ausgerichtete NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen wiesen gegen CD20- positive Tumorzelllinien und primäre Tumorzellen eine hohe zytotoxische Aktivität auf. Im Vergleich waren parentale NK-92 Zellen gegen diese Tumorzellen nicht oder deutlich weniger aktiv. Dabei war die zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen mit dem monoklonalen anti-CD20 Antikörper Rituximab kompetitierbar. Mit Hilfe der gegen parentale und modifizierte NK-92 Zellen resistenten Zelllinie NIH3T3 wurde gezeigt, dass allein über die stabile Expression des CD20-Proteins in NIH3T3 Zellen die Resistenz gegen modifizierte NK-92 Zellen überwunden werden kann. NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen waren in der Lage, CD20-positive NIH3T3-CD20 Zellen auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen effizient abzutöten. In Mischkulturen aus NIH3T3 und NIH3T3-CD20 Zellen war zudem eine selektive zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen ausschließlich gegen Antigen-positive Zellen nachweisbar. Über die Analyse von Zellkonjugaten zwischen zytotoxischen Effektorzellen und ihren Zielzellen, deren Bildung grundsätzliche Voraussetzung für eine Eliminierung ist, wurden Hinweise erhalten, dass der chimäre Antigenrezeptor hierzu keinen Beitrag zu leisten scheint, sondern vor allem die anschließende Aktivierung der modifizierten NK-92 Zellen bewirkt. Mit EpCAM-spezifischen NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen war auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen eine effiziente Abtötung von unterschiedlichen Tumorzelllinien epithelialen Ursprungs möglich. Eine erfolgreiche Blockierung dieser zytotoxischen Aktivität mit dem monoklonalen Antikörper MOC31 bestätigte, dass diese spezifisch über den chimären Antigenrezeptor vermittelt wurde. Die untersuchten epithelialen Zelllinien erwiesen sich dagegen als vollkommen resistent gegen parentale bzw. mit demleeren Expressionsvektor modifizierte NK-92-Mock Zellen. Weitere Ergebnisse zeigten, dass die zytotoxische Aktivität von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen tatsächlich über Granzym B vermittelt wird. Eine erhöhte FasL-Oberflächenexpression infolge der Cokultur mit Antigen-positiven Zielzellen war dagegen nicht nachweisbar. Anhand dieser Ergebnisse kann eine signifikante Beteiligung von FasL an der zytotoxischen Aktivität der modifizierten NK-92 Zellen ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden therapeutische Effekte von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen in einem Xenograftmodell in NOD-scid/scid Mäusen mit einer humanen EpCAM-positiven Tumorzelllinie untersucht. Hier wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe durch Behandlung mit EpCAM-spezifischen NK-92 Zellen, unerwarteterweise aber auch mit NK-92-Mock Zellen, ein signifikant längeres Überleben der Tiere beobachtet. Nach der Ableitung CD138-spezifischer NK-92-scFv(B-B4)-Zeta Zellen wurde zwar eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CD138-positive Zelllinien erhalten. Es war jedoch keine im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen weiter verstärkte Zytotoxizität nachweisbar. Als Ursache hierfür ist eine mangelnde Funktionalität des scFv-Antikörperfragments im Kontext des chimären Antigenrezeptors denkbar. Da die Bindungseigenschaften von scFv-Fragmenten entscheidend durch die Anordnung ihrer schweren und leichten Antikörperketten zueinander beeinflusst werden können, wurden NK-92 Zellen etabliert, die ein scFv-Fragment mit umgekehrter Orientierung der Antikörperketten in ihrem chimären Antigenrezeptor tragen. Diese werden derzeit im Rahmen einer externen Zusammenarbeit auf ihre Funktionalität hin überprüft. Zur Konstruktion gegen das Disialogangliosid GD2 gerichteter chimärer Antigenrezeptoren wurden parallel zwei scFv-Fragmente des Antikörpers ch14.18 eingesetzt, die sich in der Orientierung der schweren und leichten Antikörperketten zueinander unterscheiden. Mit den Antigenrezeptorkonstrukten modifizierte NK-92 Zellen zeigten eine im Vergleich zu parentalen NK-92 und NK-92-Mock Zellen stark erhöhte Zytotoxizität gegen GD2 exprimierende humane Tumorzelllinien. Dabei wurde weder bei der Expressionsdichte der chimären Antigenrezeptoren noch in der zytotoxischen Aktivität modifizierter NK-92 Zellen mit unterschiedlicher Anordnung der variablen Antikörperdomänen im scFv Antikörperfragment ein signifikanter Unterschied beobachtet. Mit der extrazellulären Domäne von CTLA-4 als Modellprotein wurde der mögliche Einsatz einer zu scFv-Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomäne geprüft. CTLA-4 wird normalerweise auf T-Zellen exprimiert und bindet an CD80 bzw. CD86 auf APCs. CD80- und/oder CD86-positive Zielzellen wurden von NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen spezifisch und mit hoher Effizienz lysiert. In Zytotoxizitätsassays wurde mit Hilfe einer sowohl gegen parentale als auch modifizierte NK-92 Zellen resistenten Tumorzelllinie gezeigt, dass allein die stabile Expression des CD86 Proteins in dieser Zelllinie ausreicht, um die Resistenz gegen NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen aufzuheben. Daraus kann geschlossen werden, dass grundsätzlich auch der Einsatz von zu scFv- Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomänen eine spezifische Ausrichtung und effiziente Aktivierung von NK-92 Zellen gewährleistet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die genetische Modifikation der Natürlichen Killerzelllinie NK-92 zur Ausrichtung auf Tumor-spezifische Zielstrukturen einen grundsätzlich geeigneten Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen darstellt. Eine Weiterentwicklung Antigen-spezifischer NK-92 Derivate als mögliche Zelltherpeutika erscheint daher sinnvoll und vielversprechend.
Membrane proteins play vital role in a variety of cellular processes, such as signal transduction, transport and recognition. In turn they are involved in numerous human diseases and currently represent one of the most prevalent drug targets. A comprehensive understanding of the mechanisms mediated by membrane proteins requires information about their structures at near-atomic resolution, although structural studies of membrane proteins remain behind those of soluble proteins. A bottleneck in the study of membrane proteins resides in the difficulties that are encountered during their high-level production in cell based systems. However, many toxic effects attributed to the over production of membrane proteins are eliminated by cell-free expression, as viable host cells are no longer required. Therefore, the objective of this study was to obtain adequate amounts of selected membrane transport proteins for their structural studies using a cell-free expression system. For the establishment of the cell-free system for membrane proteins, the transporters YbgR and YiiP from Salmonella typhimurium LT2, PF0558 and PF1373 from Pyrococcus furiosus, from the cation diffusion family (CDF), BetP from Corynebacterium glutamicum from the betaine/carnitine/choline transporter (BCCT) family and Aq-2030 from Aquifex aeolicus VF5 from the monovalent cation/proton antiporter-2 (CPA2) family were selected. An Escherichia coli S-30 extract based cellfree system was established by generating the best expression constructs of the target proteins, preparing T7 RNA polymerase and an S-30 extract with high translation efficiency. The functionality of the S-30 extract was shown by the cell-free expression of correctly folded Green Fluorescent Protein (GFP). Essential factors of the cell-free system such as the Mg2+ concentration, the bacterial S-30 extract proportion in the reaction mixture and the time-course of cell-free reactions have been optimized. For the cell-free production of membrane proteins in soluble form, the possibility to supplement cell-free reactions with detergents was explored. A wide range of non-ionic or zwitterionic detergents, were found to be compatible with cell-free synthesis, while ionic detergents and non-ionic detergents at high concentrations had an inhibitory effect. Moreover, high concentrations of polyoxyethylene-alkyl-ethers (Brij) detergents were found to have enhancing effect on the production levels as well as on the solubility of cell-free produced proteins. As membrane proteins tend to misfold and aggregate in a membrane-free translation system, the possibility to supplement the cell-free reactions with inner membrane vesicles (IMVs) to obtain correctly folded target transport proteins was explored. All the target proteins were successfully produced in the batch cell-free reactions and were found to be incorporated in the IMVs. A continuous exchange cell-free (CECF) system was established, where consumable substrates (amino acids, nucleotides and energy regenerating compounds) were supplied to the cell-free reaction mixture through a dialysis membrane, which in consequence resulted in high-level production of target proteins compared to the batch system. The osmosensing and osmoregulated sodium-coupled symporter BetP from C. glutamicum was chosen for the large scale production in CECF set-up. The protein is easily produced in E. coli and is functional as assayed by its transport activity, after purification and reconstitution in liposomes. It is therefore possible to compare in-vivo and cell-free production. High-level cell-free production of BetP was achieved in CECF mode in different forms: (i) as precipitate, (ii) as soluble form in detergent, and (iii) incorporated in IMVs. Cell-free production of BetP resulted in the yield of about 0.5 mg of purified BetP from 1 ml of CECF reaction. The yield of purified BetP was increased to 1.6 fold by addition of 1% polyoxyethylene-(20)-cetyl-ether (Brij58) detergent in the reaction mixture. Moreover, the high level cell-free production of BetP (0.5 mg purified BetP/ml reaction mixture) incorporated in IMVs was shown for the first time in this work.However, it was observed that oligomerization of BetP was not efficient in the cell-free system. Factors that can promote the folding of membrane proteins such as lipids and chaperones were investigated. Addition of lipids and molecular chaperone GroE facilitated correct folding of BetP resulting in increased yield and stability of cell-free produced BetP. The results obtained indicate that most of the cell-free produced BetP exists in functional oligomeric form. The possibility of obtaining milligram amounts of BetP, a 12 trans-membrane protein from the cell-free reactions holds promise for structural and functional studies of other membrane proteins. In any case, the strategies adapted in this study should prove extremely valuable for the production of membrane proteins in the E. coli cell-free expression system.
Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-Beta-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
Im Jahr 1991 trat das Abkommen zur Erhaltung der in Europa und den außereuropäischen Arealstaaten vorkommenden Populationen der Arten der Säugerordnung Chiroptera in Kraft (EUROBATS: The Agreement on the Conservation of Populations of European Bats). Zuvor waren die Säuger allgemein schon in dem „Übereinkommen zur Erhaltung der wandernden wildlebenden Tierarten“ in Anhang II (Oktober 1985) aufgelistet. Auch in der Liste der in Deutschland vorkommenden Arten der Anhänge II, IV und V der FFH-Richtlinie (92/43/EWG) sind alle einheimischen Fledermausarten (Anhang II und IV) erwähnt. Für die Erhaltung der Fledermäuse ist der Schutz wichtiger „Stätten“ (z. B. Zwischenquartiere, Winterschlafquartiere, Wochenstubenquartiere) unumgänglich. Die Erhaltung und der Schutz, sowohl der Quartiere als auch der Futterplätze, vor Beschädigung oder Beunruhigung sind nach diesem Abkommen sicherzustellen. Diese Arbeit über die Stoffwechseldaten soll klarstellen, wie wichtig der Schutz der Fledermausquartiere - vor allem im Winter – ist. Der Energieverbrauch und die Anpassung der einheimischen Arten an Umgebungstemperaturen (Ta) soll mit Messwerten untermauert und mit der tropischen Art Carollia perspicillata verglichen werden. Weiterhin ist es Ziel dieser Arbeit, einen alternativen Versuchsaufbau zu entwickeln, der die Berechnung der Stoffwechselrate (SWR) ohne das Fangen der Tiere ermöglichen soll. Mit Hilfe einer IR-Kamera sollen Bilder von der Körperoberflächentemperaturverteilung und gleichzeitig Stoffwechselmessungen gemacht werden. Da die Körpertemperatur (Tb) und die SWR bei den einheimischen Fledermausarten direkt voneinander abhängig sind (HANUS 1959), könnte diese Methode hier angewandt werden. Nach der Erstellung einer Datenbank (SWR/IR-Bild) kann dann nur durch die IR-Bilder Rückschlüsse auf die SWR gezogen werden. Bei nordamerikanischen Arten konnte bestimmt werden, dass mindestens 75 % der Energiereserven, die eine Fledermaus für den Winterschlaf zur Verfügung hat, während der Aufwachphasen verbraucht werden (THOMAS et al. 1990). Eine Störung im Winterquartier führt zum Erwachen der Tiere. Nach einem Aufwachvorgang sind die Abstände des Wiedererwachens zunächst kürzer. Je kürzer die Fledermäuse im Torpor sind, desto schneller wachen sie auf. Dies verstärkt die Aufwachwahrscheinlichkeit und die damit verbundene Kettenreaktion, je öfter die Störungen auftreten (THOMAS et al. l.c.). Dies führt zu einem zusätzlichen Energieverbrauch. Der Einfluss einer Störung ist noch bis zu 8 h später in einem Winterquartier durch erhöhte Flugaktivität zu bemerken (THOMAS 1995). Dies lässt sich daraus erklären, dass die Tiere, die aufgewacht sind und aktiv sind, andere Fledermäuse durch ihre Aktivität aufwecken (Berührung, Wärme, Reproduktionsverhalten etc.). Dies soll nun auch für einheimische Arten überprüft werden. Aus den vorliegenden Erkenntnissen und den eigenen Messergebnissen sollen dann folgende weitere Fragen beantwortet werden: - Warum besteht die Notwendigkeit die Winterquartiere vor Störungen zu schützen? Welche tatsächliche Bedeutung haben Störungen im Winterquartier auf die Energetik der Fledermäuse? - Wie viel Energie verbrauchen die Fledermäuse im Sommer in Abhängigkeit von der Ta? - Gibt es Unterschiede zwischen der SWR der tropischen Art Carollia perspicillata und den einheimischen Arten? Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist durch identische Messbedingungen gewährleistet. - Lassen sich aus den SWR unterschiedliche Abhängigkeiten (Körpermasse (bm), Ta etc.) ableiten? - Hat die Nahrung den erwarteten Einfluss auf den RQ-Wert? Die Stoffwechseldaten sind deshalb so wichtig, da man damit zeigen könnte, welch extremer Ressourcenverlust für die Fledermaus mit einer Störung verbunden ist. Die Notwendigkeit des Schutzes der Fledermäuse vor Störungen im Quartier, sowohl der Sommer-, als auch die Winterquartiere, wäre dann mit Messdaten belegt. Die Unterschiede in der Abhängigkeit der SWR von der Ta, der bm, der Ernährungsform und der Tb sowohl im Wachzustand als auch im Torpor, soll für verschiedene Arten geklärt werden.
Die Verarbeitung von Informationen im zentralen Nervensystem beruht auf dem Zusammenspiel von erregender und hemmender Neurotransmission. Die Übertragung von Signalen zwischen Neuronen erfolgt chemisch über die Ausschüttung von Neurotransmittern an spezialisierten Kontaktstellen, den Synapsen. Glyzin und gamma-Aminobuttersäure (GABA) sind die bedeutendsten inhibitorischen Neurotransmitter im zentralen Nervensystem von Säugern, welche Rezeptoren vom Glyzin- (GlyR) und GABAA-Typ (GABAAR) aktivieren. Diese ligandengesteuerten Ionenkanäle sind in postsynaptischen Membranen angereichert und mit intrazellulären Proteinen assoziiert. Die Rekrutierung der Rezeptoren in postsynaptischen Domänen ist ein an das zytoplasmatisch lokalisierte Protein Gephyrin gekoppelter Prozess. So bindet Gephyrin spezifisch an die intrazelluläre Domäne der beta-Untereinheit des GlyR (GlyR beta) und bildet für die Verankerung des Rezeptors ein gerüstartiges Netzwerk unterhalb der synaptischen Membran. Die gezielte Inaktivierung des Gephyrin-Gens führt in Mäusen zu einem postnatal letalen Phänotyp und zu dem Verlust der synaptischen Anreicherung des GlyR und bestimmter GABAA-Rezeptoren auf zellulärer Ebene. Gephyrin ist ein 93 kDa großes Protein, das nicht nur im zentralen Nervensystem (ZNS), sondern auch in anderen Organen wie Leber und Niere exprimiert wird, in denen es an der Synthese des Molybdän-Kofaktors von Oxido-Reduktasen beteiligt ist. Das Gephyrin-Protein wird durch 30 Exons codiert, von denen zehn als sogenannte Kassetten alternativ gespleißt werden können. Die bestuntersuchte Spleißvariante besitzt 736 Aminosäuren und ist in eine N- und eine C-terminale Domäne (Aminosäuren 1-181 bzw. 318-736) sowie eine zentrale Linker-Domäne unterteilt. Die N- und die C-terminalen Bereiche von Gephyrin sind den Proteinen MogA und MoeA aus E. coli homolog und werden daher auch als G-Domäne (N-terminal) bzw. E-Domäne (C-terminal) bezeichnet. In kristallographischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die G- und E-Domänen zur Tri- bzw. Dimerisierung befähigt sind. Diese speziellen Oligomerisierungseigenschaften der beiden Gephyrindomänen bilden wahrscheinlich die Grundlage für die Entstehung von Gephyrin-Clustern sowie eines hexagonalen Gephyrin-Gerüstes. Dieses Gerüst stellt den Verknüpfungspunkt zwischen Rezeptoren und dem Zytoskelett dar und ermöglicht somit die effiziente Clusterbildung und die zielgerichtete Anordnung einer großen Anzahl inhibitorischer Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit sollten die Rolle dieser beiden Domänen bei der Bildung membranassoziierter Gephyrinaggregate und die molekularen Mechanismen der Clusterbildung des Gephyrinmoleküls untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden durch zielgerichtete Mutagenese unterschiedliche Gephyrin-Mutanten hergestellt, um die Fähigkeit der Oligomerisierung der G- und E-Domäne gezielt zu modifizieren. Dadurch sollte die Bedeutung der Oligomerisierung hinsichtlich der Aggregat- bzw. Clusterbildung untersucht werden. Außerdem sollten die Wechselwirkungen zwischen Gephyrin und anderen Proteinen und deren Einfluss auf die synaptische Lokalisation analysiert werden. Für diese Untersuchungen wurden auf der Basis von Röntgenstruktur-Daten spezifische Aminosäurereste an den bei der Oligomerisierung beteiligten Kontaktstellen ausgetauscht. In der G-Domäne wurden zu diesem Zweck vier separate Aminosäuren des Trimer-Interface durch Arginin ersetzt (GephRRRR). Analog hierzu wurden in der EDomäne einzelne Aminosäuren durch Arginin bzw. Glutamat substituiert (GephRER), um dadurch eine Dimersierung zu verhindern. Für die Kassette C5’ wird angenommen, dass deren Vorhandensein die Interaktion zwischen Gephyrin und GlyR beeinträchtigt, wodurch GlyR aus GABAergenen Synapsen ausgeschlossen wird. Daher wurde der Einfluss dieser Gephyrin-Spleißvariante (GephC5’), die zu einer Peptidinsertion innerhalb der G-Domäne führt, und einer Gephyrin-Mutante (Gephmut), die den Verlust der Wechselwirkung mit dem GlyR bedingt, auf die Aggregatbildung von Gephyrinoligomeren untersucht. Bei dem Konstrukt Gephmut wurden, basierend auf Daten von Röntgenstrukturuntersuchungen, neun Aminosäuren (713-721) am Cterminalen Ende der E-Domäne durch den homologen Bereich des bakteriellen MoeA Proteins aus E. coli ersetzt. Zunächst wurden die einzelnen isolierten Domänen mittels Gelfiltration hinsichtlich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Die Mutationen wurden hierzu in verkürzte Proteine eingeführt, bei denen nur die G- bzw. die E-Domäne exprimiert wurden. Diese Konstrukte wurden daher als GRRRR, GC5’ bzw. ERER und Emut bezeichnet. Bei diesen zeigte sich, dass die G-Domäne des Gephyrin-Wildtyps zu trimeren Proteinkomplexen oligomerisiert. Im Gegensatz hierzu war die Mutante GRRRR nicht in der Lage, Trimere zu bilden. Das Einfügen der C5’-Kassette führte ebenfalls zu einer Störung der Trimerisierung. Gelfiltrationsexperimente mit der E-Domäne ergaben, dass die mutierte Domäne ERER, im Gegensatz zum Wildtyp-Konstrukt, keine Dimere ausbildet. Bisherige Studien haben jedoch gezeigt, dass das Emut Polypeptid zur Dimerisierung befähigt ist. Das Oligomerisierungsverhalten des kompletten Gephyrin-Proteins wurde mittels blauer nativer Gelelektrophorese (BN-PAGE) analysiert. Für die hier beschriebenen Untersuchungen mit BN-PAGE wurde rekombinantes Gephyrin in Xenopus laevis Oozyten heterolog exprimiert. Die Analyse ergab, dass Wildtyp Gephyrin nativ als Hexamer vorliegt, welches durch ansteigende Konzentrationen des Detergenzes Natriumdodecylsulfat (SDS) in Trimere, Dimere und Monomere zerfällt. Sowohl GephRRRR und GephC5’ liegen nativ fast ausschließlich als Dimere vor, während GephRER nur trimere Aggregate formt. Die entsprechende Doppelmutante mit Mutationen in Gund E-Domäne war wie erwartet nur noch als Monomer existent. Die als Kontrolle eingesetzte Glyzinrezeptor-Bindungsmutante Gephmut bildete, ebenso wie der Wildtyp, Hexamere aus. Daraus folgt, dass die Oligomere der G- bzw E-Domäne Zwischenprodukte der Hexamerbildung darstellen. Die Analyse der Oligomerisierungseigenschaften der Mutanten wurde nachfolgend in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293T) untersucht. Nach heterologer Expression von Wildtyp Gephyrin in HEK 293T-Zellen formen sich große, charakteristische Gephyrinaggregate. Die Oligomerisierungs-Mutanten GephRRRR, GephRER und GephC5’ aggregierten jedoch nicht, sondern waren diffus im Zytoplasma verteilt. Die wiederum als Kontrolle eingesetzte Bindungsmutante Gephmut hingegen wies eine normale Aggregation auf. Diese Ergebnisse bestätigen die grundlegende Rolle der Oligomerisierung von G- und E- Domänen für die Aggregatbildung von Gephyrin. Mittels GST-Pulldown und Kolokalisationsanalysen in HEK Zellen wurde die Wechselwirkung der Gephyrinmutanten mit der GlyR beta, dem Motorkomplexprotein Dynein light chain-1 (Dlc-1) und dem Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Collybistin (Cb) untersucht. Beide Ansätze weisen darauf hin, dass die Trimerisierung der G-Domäne an der Interaktion von Gephyrin mit Dlc-1 und die Dimerisierung der E-Domäne bei der Bindung an GlyR beta und Cb beteiligt ist. Die Mutante Gephmut zeigte in beiden Fällen einen totalen Verlust der Bindungsfähigkeit sowohl an das GlyR beta Bindungsmotiv als auch an Cb. Der Einbau der C5’ Kassette in Gephyrin scheint jedoch nicht dessen Bindung an den GlyR zu beeinflussen. Für die Analyse der Clusterbildung und des zielgerichteten Transports in Neuronen wurden Wildtyp und mutiertes Gephyrin in hippocampalen und spinalen Primärkulturen der Ratte exprimiert. Zur Überprüfung einer synaptischen Lokalisation wurde Gephyrin gemeinsam mit dem vesikulären inhibitorischen Aminosäure-Transporter (VIAAT), einem präsynaptischen Marker-Protein, detektiert. In beiden Kulturen wies Gephyrin eine punktartige Verteilung in den Neuriten auf und wurde gezielt an Synapsen angereichert. Im Kontrast dazu zeigten alle Oligomerisierungsmutanten, GephRRRR, GephC5’ und GephRER keine Ausbildung von Clustern sondern eine diffuse Verteilung im Zellkörper und in Dendriten. Das Konstrukt Gephmut wies jedoch Clusterbildung und eine punktförmige Verteilung auf. Diese Daten belegen, dass die Oligomerisierung der G- wie auch der E-Domänen für die Clusterbildung und synaptische Lokalisation von Gephyrin unerlässlich ist. Die Wechselwirkung mit dem GlyR und/oder Collybistin ist ebenfalls für die Anreicherung in der Synapse erforderlich, nicht jedoch für die Bildung der Gephyrin-Cluster. Die dargestellten Ergebnisse belegen die Rolle der spezifischen Oligomerisierungseigenschaften der G- und E-Domäne für die Ausbildung des hexagonalen Gephyringerüstes und dessen grundlegende Bedeutung für die spezifische Anreicherung von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen in Neuronen.
Ein gen-interner Transkriptionsstart koinzidiert mit einem Rekombinations-Hotspot imhumanen MLL-Gen
(2006)
Chromosomale Veränderungen des humanen MLL-Gens sind für 5-10% der akuten Leu-kämien im Säuglings- und Erwachsenenalter verantwortlich. Davon entstehen wiederum 5-10% der MLL-Aberrationen therapiebedingt. Das auf Bande 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homo-log of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Mittlerweile sind fast 90 cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40%), AF9 (27%), sowie ENL (7%), AF6 (6%), ELL (~5%) und AF10 (4%). Die Bruchpunkte von MLL-Translokationen sind nicht einheitlich über das 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in einer ca. 8.3 kb großen Bruchpunkts-clusterregion (bcr). Innerhalb dieser Region sind die Bruchpunkte nicht homogen verteilt. Bruchpunkte von Patienten mit de novo-Leukämien und einem Alter von über einem Jahr sind überwiegend in der 5’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster I (SCI), lokalisiert. Die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien sowie Säuglingen (<1 Jahr) liegen dagegen vornehmlich in der 3’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster II (SCII). Da DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSB) auf zwei unterschiedlichen Chromosomen eine aus-reichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind, stellte sich die Frage, ob aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte innerhalb der MLL bcr, bestimmte Bereiche dieser Region für DNA-DSB besonders anfällig sind. Bisher konnte aufgeklärt werden, dass in SCII, durch Apoptose-auslösende Ereignisse oder cytotoxische Agenzien DNA-DSB sehr leicht induziert werden können. Durch Arbeiten in unserer Gruppe konnte im SCII ein ca. 200 bp großer Bereich um die MLL Intron 11/Exon 12-Grenze lokalisiert werden, in dem sich der größte Teil aller Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche konzentrierte. Dies galt jedoch nicht für eine perfekte TopoisomeraseII Konsensussequenz im Exon 12, die bisher mit einer Vielzahl Therapie-assoziierter Translokationsbruchpunkte in Verbindung gebracht wurde. Dieser Hotspot kolokalisiert außerdem mit einer scaffold/matrix attachment region (S/MAR), sowie einer DNaseI-hypersensitiven Stelle. Des Weiteren fanden sich in der Literatur Hinweise, dass SCII im Gegensatz zu SCI eine verstärkte Histonacetylierung besitzt. Die potentielle Anwesenheit eines Promotors wurde durch Computeranalysen bestätigt. In einer murinen embryonalen Fibroblasten-Zelllinie, die durch die Insertion einer LacZ/Neo-Kassette in Exon 4 des Mll-Gens einen Transkriptionsstop trug, wurden in anschließenden RT-PCR Experimenten sowohl alle Möglichkeiten des alternativen Spleißens ausge-schlossen, als auch der Start eines Transkripts unmittelbar vor Exon 12 detektiert. Zusätzlich durchgeführte Affymetrix-Chip-Experimente bestätigten die Anwesenheit von Mll-Transkript-signalen in der verwendeten Mll k.o.-Zelllinie. In nachfolgenden Versuchen konnte durch eine weitere Kartierung der Transkriptionsstart auf bis zu +/- 15 bp an der Intron 11/Exon12-Grenze festgelegt werden. Um nun die im Mausmodell gewonnenen Resultate auch im humanen System zu überprüfen, wurden die homologen Regionen des murinen und humanen Mll/MLL-Gens vor ein Luci-ferasereportergen kloniert. Durch RT-PCR konnte der gen-interne Transkriptionsstart im SCII des humanen MLL-Gens ebenfalls lokalisiert werden. Damit wurde gezeigt, dass genetische Instabilität und Transkriptionsinitiation im SCII des humanen MLL-Gens kolokalisieren. Durch die anfangs durchgeführten in silico-Analysen in Maus und Mensch, wurden Deletions-mutanten generiert, mit deren Hilfe die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotor-region ermittelt wurde. Hierbei zeigte sich, dass die Anwesenheit von zwei Retroelementen in der menschlichen Sequenz eine Enhancer-Funktion vermittelt. Dagegen zeigte die homologe murine Sequenz, für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-DSB bekannt ist, nur schwache Promotoraktivität. Da Histon Modifikationen beim Prozess der Transkription eine entscheidende Rolle spielen, wurde auch die nähere Umgebung des gen-internen Promotors in den murinen k.o.-Zellen untersucht. In der k.o.-Linie zeigte die Region stromaufwärts der putativen Transkriptionsinitiation die Signatur von inaktivem Chromatin (di-methyliertes H3 K9), wohingegen stromabwärts von Mll Exon 12 Chromatinstrukturen nachgewiesen wurden, die aktiv transkribiert werden (tri-methyliertes H3K4), und damit einen weiteren Beweis für die besondere Chromatinstruktur dieser Region lieferten. Durch Western-Blot Experimente wurde das Protein, das durch das Transkript des gen-internen Promotors kodiert wird, nachgewiesen. Das verkürzte murine Mll-Protein wird also, wie sein humanes Pendant, proteolytisch durch die Taspase1 gespalten, so dass sich ein MLL-Mini-Komplex ausbilden kann.
G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest membrane protein family and play an essential role in signal transduction through the cell membrane. They are currently the targets of approximately 50 % of the pharmaceuticals on the market (Klabunde and Hessler, 2002). However, only one high-resolution GPCR structure has been determined up to now, that of bovine rhodopsin (Palczewski et al., 2000). The GPCR activation and regulation mechanisms are still unknown and other GPCR structures are thus required. MePNet (Membrane Protein Network) was a European consortium dedicated to structural studies of GPCRs. The approach was to produce 100 GPCRs in three expression systems (Escherichia coli, Pichia pastoris and Semliki Forest Virus infected mammalian cells) in order to select at each step of the process (production, solubilization, purification) the constructs that fulfilled quantity and quality (functionality) requirements for crystallization trials. In our team, we screened 38 of the 100 targets in P. pastoris. For each receptor, the clone with the highest production level was identified by dot-blot. The size and homogeneity of each receptor were then analyzed by Western-blot. The human adenosine A2A receptor showed a well-defined and pronounced single band and was thus selected for further characterization. The adenosine A2A receptor is a GPCR mainly localized in the central nervous system and, as it antagonizes dopaminergic activity, it has great potential as a drug target for the treatment of Parkinson’s disease. Functional characterization by binding assays with the specific antagonist [3H]-ZM241385 demonstrated a Bmax of 56 +/- 3 pmol/mg i.e. pmol of binder per milligram of total membrane protein, and a KD of 0.40 +/- 0.02 nM. Receptor production was then improved by lowering the induction temperature, decreasing the induction time and adding DMSO to the medium. For large-scale production, fermention reached around 300 g cells (wet weight)/L culture, which provided 43 mg of functional receptor in membranes per liter of culture. Functional solubilization was achieved with dodecyl-β-D-maltoside and the soluble yield was increased to 70-80 % of the membrane content by addition of cholesteryl hemisuccinate and increasing the ionic strength. The receptor was successfully purified via Ni-NTA and monomeric avidin chromatography in the presence of the antagonist ZM241385. This strategy produced a pure, homogeneous and stable receptor preparation with functionality demonstrated by radioligand binding assays. The total receptor yield after purification was routinely around 20 % of the membrane functional receptor content and 2 g of membranes provided 4 mg of pure receptor for crystallization trials. GPCRs are very difficult targets for crystallization, and co-crystallization with antibody fragments has been shown to be a successful method for crystallization of membrane proteins. In order to develop such a tool for the adenosine A2A receptor, a single-chain Fv (scFv) fragment specific to the purified receptor was selected by phage display. The receptor was functionally immobilized on the surface of streptavidin beads and after two rounds of selection, 6 different phages were identified several times. After production in E. coli and purification via Ni-NTA affinity chromatography, 4 out of the 6 scFv fragments were sufficiently enriched to be tested by ELISA. For the ELISA, the receptor was functionally immobilized via the biotinylation domain of the construct in a 96-well streptavidin-coated plate. The antibody fragments binding to the receptor were identified based on interaction with HRP-conjugated protein L. One scFv fragment gave a positive ELISA signal 10 fold above background and titration of the scFv fragment binding to the receptor was specific and saturable. However no complex of scFv fragment and receptor was observed on gel filtration. In order to have a more sensitive detection method, the scFv fragment was labeled with fluorescein: a complex was then observed up on gel filtration but the binding appeared to be non-specific. A pull-down assay with immobilized non-labeled scFv fragment finally confirmed the specificity of the binding, but also the low affinity of the interaction. Affinity maturation of this specific scFv fragment by a random mutagenesis and selection process should improve this parameter in order to obtain an adapted tool for co-crystallization.
Anhand einer osmotischen Auffschlussmethode für B. subtilis konnte ohne Zugabe von Detergenzien erreicht werden, dass die beiden Modifikationsproteine SpaB und SpaC in löslicher Form vorliegen. Demzufolge handelt es sich bei dem Subtilin-Synthetase-Komplex nicht um einen starren membranständigen Komplex, sondern um eine transiente Assoziation der SpaB/C-Proteine mit dem Transportprotein SpaT während der Modifikationsreaktion. Durch Interaktionsstudien mit heterolog produzierten Subtilinpräpropeptid (SubHAHis) konnte eine spezifische Interaktion mit dem löslichen SpaC-Protein gezeigt werden. Komplementationsversuche zeigten, dass der DspaC amyE::spaS-Stamm durch das SpaCsowie das EriC-, jedoch nicht durch das NisC-Protein komplementiert wird. Ebenfalls ist ein C-terminal verkürztes bzw. verlängertes SpaC-Protein nicht in der Lage ist, Subtilin richtig zu modifizieren. Mit Hilfe einer in vitro Mutagenese der ligandierenden Aminosäuren Cystein 303, Cystein 349 und Histidin 350 konnte gezeigt werden, dass das Zink-Ion des SpaC-Proteins an der katalytischen Reaktion beteiligt ist. Beim Ausschalten der Aminosäuren Histidin 212 und Tyrosin 304 konnte ebenfalls ein Ausfall der Subtilinproduktion beobachtet werden. Es wäre denkbar, dass beide Aminosäuren in einer Säure/Base-Reaktion bei der Subtilinmodifikation involviert sein könnten. Die Aminosäure Tryptophan 302 hingegen bildet mit dem C-terminalen ALL-Motiv des Proteins ein hydrophobes Cluster, was eine Rolle beider Elemente in Stabilisation des Reaktionszentrums und Substratbindung nahe legt. Für das SubHAHis konnte gezeigt werden, dass es von der Modifikationsmaschinerie akzeptiert und auch produziert wird, jedoch entsteht ebenfalls ein Heterodimer zwischen dem SubHAHis und den Modifikationsproteinen SpaB und SpaC, an dessen Formation der Hexa-Histidin-Tag maßgeblich beteiligt ist. Eine mögliche Heterodimerformation im Subtilinproduzenten ATCC 6633 konnte unter bestimmten Bedingungen ebenfalls nachgewiesen werden, was auf eine mögliche kovalente Zwischenstufe bei der Lanthioninbrückenbildung hinweist. Des Weiteren konnte durch in vitro Mutagenese-Studien gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion des SpaC-Proteins an der Heterodimerformation beteiligt ist. Das SpaC-SubHAHis Heterodimer konnte erfolgreich angereichert und mittels Peptidmassenkartierung eindeutig als kovalentes Heterodimer zwischen den beiden Proteinen identifiziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Modifikation des Subtilinpräpropeptids durch das SpaC-Protein eine transiente kovalente Bindung zwischen dem Präpropeptid und dem SpaCProtein ausgebildet wird. Die Bildung eines möglichen Heterodimers zwischen SpaC und dem Subtilinpräpropeptid konnte ebenfalls unter bestimmten Bedingungen beim Wildtyp nachgewiesen werden. Dieser Befund legt nahe, dass es sich bei der Heterodimerbildung um eine katalytische Zwischenstufe bei der Modifikation des Präpropeptids durch das SpaC handeln könnte, welches durch die Anwesenheit des Hexa-Hisitidin-Tags arretiert wird. Neben dem bekannten Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 konnten weitere Stämme der W23-Untergruppe der Spezies B. subtilis als Subtilinproduzenten identifiziert werden, was impliziert, dass ein Merkmal der W23-Gruppe die Produktion von Subtilin ist und diese als Biomarker dienen könnte. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass ein um die Aminosäuren Glycin und Serin C-terminal verlängertes Subtilin (Subtilin-GS) eine gesteigerte Subtilin-Autoinduktion hervorruft. Durch die Zugabe von Mangan zu einer Subtilin-Produzierenden Kultur konnte ebenfalls gezeigt werden, dass das Mangan alleine einen steigernden Einfluss auf die Induktion des PspaB-Promotors besitzt, während eine gesteigerte Aktivität des PspaS-Promotors nur bei der gleichzeitigen Anwesenheit von Subtilin beobachtet werden konnte. Durch die gezielte Zugabe von Mangan und Subtilin-GS ist es dementsprechend möglich, eine erhöhte Autoinduktion und somit eine erhöhte Produktion an Subtilin zu erreichen.
Die Arbeit stellt einen Beitrag zur Fauna von Rovigno dar. Sie enthält eine kritische Übersicht der in der Adria gefundenen Holothurienarten und einen Bestimmungsschlüssel, der sich hauptsachlich auf äußere Merkmale stützt. Der Bestimmungsschlüssel, die Beschreibung der Arten, sowie die Fundkarten und Abbildungen sollen das Auffinden und genaue Bestimmen der Holothurien ermöglichen. Daran schließen sich einige Bemerkungen über ihr Vorkommen in Abhängigkeit von der Meerestiefe und Bodenbeschaffenheit an. An verschiedenen Stellen sind biologische Notizen eingefügt, die sich auf die Lebensweise und Fortpflanzung (jedoch nicht auf Larvenformen, über die verhältnismäßig wenig bekannt ist) beziehen. Die Angaben über die Fortpflanzungszeit besitzen großes praktisches Interesse, weil neuerdings auch in der Adria einige Holothurienarten (H. tubulosa und polii) zur Herstellung von "Trepang" gefischt werden sollen. Da im Gegensatz zu anderen Meeren die Adria bei großem Artenreichtum sehr individuenarm ist, dürfte durch ungehemmtes Ausfischen in kurzer Zeit die Individuenzahl so stark herabgesetzt sein, daß sich ein Fischen gar nicht mehr lohnt. Es scheint daher notwendig, während der Hauptfortpflanzungszeiten dieser Arten streng durchzuführende Schonzeiten festzulegen. Die Arbeit stützt sich vor allem auf eigene Beobachtungen und Untersuchungen. Die meisten Tiere wurden längere Zeit hindurch in Aquarien gehalten und lebend beobachtet. Die voneinander stark abweichenden Beschreibungen der älteren Untersucher verlangten aber auch ein eingehendes Studium der Holothurien-Literatur der Adria. Die verwendete Literatur ist in dem Literaturverzeichnis aufgeführt.
The North Arnerican species of the genus Cremastocheilus are reviewed. These belong to 5 subgenera, Macropodina, Trinodea, Anatinodia, Mymcotonus, and Cremastocheilus. Taxonomie changes are: She inclusion of Crernastocheilus nitens and C. chapini in the subgenus Cremastocheilus rather than Myrmecotonus. Also Anatinodia is elevated to subgeneric status. A key to the subgenera is provided, as is a key to the species of the 5 subgenera, recognizing that the 35 species in the subgenus Cremastocheilus are in need of revision. A critical review of the host records, geographic distribution, and ecology of the Tribe Crernastocheilini (Family Scarabaeidae. subfamily Cetoniinae) is provided. This contains enormous numbers of new records for both the genera Genuchinus and CremastocheiLus both from the literature and from the extensive field work that is reported here for the first time. A Summary of the host records is presented in tabular form. This table shows the association of all species of Cremastocheilus with ants as adults and the larvae either associated with the vegetable material of the ant nests or with vegetable material in rodent burrows. Genuchinus is shown to be a general predator on soft bodied insects while the other genera of the Cremastocheilini are associated with plants, particularly bromeliads. A detailed study of the external morphology and sexual dimorphism of the genera Genuchinus and Crernastocheilus is presented. All species of Cremastocheilus can be sexed with the naked eye by the difference in the shapes of the abdominal terminal Segments, wherein males have the posterior border of the last ventral abdominal segment either straight or slightly bowed, while females have this border broadly rounded. There are other microscopic sexual differences in the structure of the legs. The rest of the external morphology is also presented, particularly from the point of view of adaptations to either a predaceous or rnyrmecophilous existente. Particularly adapted for predation are the pointed maxillae which are used for piercing prey. Particularly adapted for myrmecophily are the mentum, the maxillae, the generally thick exoskeleton, trichomes on both the anterior and posterior angles of the pronotum, the elytra, and the legs (which are adapted to the nest substrate of the host ant nests. Exocrine glands are described for Genuchinus ineptus and at least 1 species of each of the 5 subgenera of Cremastocheilus. In general, there are no gland cells nor glandular areas in Genuchinuc that are comparable to those of Cremastocheilus. The gland cells and glandular areas are quite extensive andvariable arnong species of Cremastocheilus. The frontal gland of some Cremastocheilus (strongly developed in C. castaneus and the C. canaliculatus species group, but weakly developed in the C. wheeleri species group) is described for the first time. Because these glands are not found in Genuchinus ineptuc, a species with general predatory habits, it is thought that these play a role, as yet unknown, in interactions with ants. The life cycles of the subgenera of Cremastocheilus are described. The general life cycle entails adult beetles eclosing in ant nests during the summer and then undertaking dispersal flights. The adults then enter ant nests and ovenivinter there, eating ant larvae during the Winter. Another dispersal flight occurs in the spring during which the adults mate and enter ant nests again. The females then lay eggs and the adults die. The eggs hatch and the larvae spend 3 instars feeding upon vegetable material in the nests. The lmae then pupate in typical scarabaeine earthen cells made of fecal material and soil. These eclose in the summer and the cycle is repeated. Variation from species to species is largely in the timing. Leaving the nest in late Summer, mating seems to be triggered by rainfall in all the species studied. Mating of C. (Macropodina) beameri takes place in rodent burrows. Males seem attracted to females from a distance but the mechanism of this remains obscure. In the subgenus Trinodia, mating takes place on sandy washes or roadsides where females land. In the subgenus Myrmecotonus, maüng also takes place in sandy areas. In C. (Cremastocheilus) mating takes place on sand bars along rivers in the southeastern U.S. and in sand dunes in northeastern U.S. The femaies dig down into the sand. Males locate these places by some unknown mechanism and then dig down to copulate with the females. Field experiments showed unequivocaily that males dig only into areas occupied by females. No sex-specific Sex attractant glands have been located in females so far. Dispersal to ant nests occurs after mating except for C. (Macropodina) beameri which lays its eggs in the rodent burrows and then probably disperses to ant nests. Beetle activity going in and out of nests was studied using wire hardware cloth screens over entrances to Mynnecocystus nests. The mesh size was such that the ants could move freely in or out but the beetles got stuck by their thoraces. The direction then could be interpreted by the direction in which they got stuck. By this method, C. stathamae was shown to leave nests from 23 June to 1 September with a peak on 6 July, just after the beginning of the summer rains. Beetles entered nests from June 23 to August 3, however 39% entered on July 16, probably pulsed by the leaving time which was correlated with the rains. Life cycle timing: C. (Macropodina) develop in the nests of Wood rats (Neotoma sp.]. Females lay about 40 eggs each. The 3 larval instars to pupation take about 1 month. Pupae are found from late August to weil into September. In other subgenera as well, larvae are found in parts of the nest devoid of ants, The timing is similar in all the subgenera found with ants. Mortality factors: While ants attack Cremastocheilus adults, there is no evidence that they are ever killed by ants nor is there evidence that ants kill larvae nor hard earthen pupae cases which protect the pupae. During dispersal fiights and mating, the adults are exposed to predation and evidence is presented that shows predation by horned toads, spiders, magpies, and tiger beetles. Probably most mortality occurs in the larval and pupd stages where the beetles are attacked by internal parasites and fungus. Further rnortality is caused by limitation of the food supply during the larval stage. Reentering nests: Females of C. (Macropodina) beameri select specific rodent and other burrows, attract males for rnating. and then enter the burrow for oviposition. C. stathamae are carried into the ants nests from as far away as 25ft. The beetles appear to land spontaneously after flying randomly over M. depilis nesting areas. Then the wander about waiting for the ants to carry them into the nests. Cremastocheilus hirsutus fly low over the ground searching for Pogonomyrrnex barbatus nests, land. and move straight for the nest entrances which they enter unhindered. Among all species, the ants frequently eject beetles but the net rnovement is in. Ants frequently attacked Cremastocheilus in laboratory observation nests when they were introduced. These attacks seldom resulted in the death of the beetles and the beetles were eventually ignored. When the beetles entered brood chambers, where they fed upon larvae, they were mostly ignored and even licked assiduously by the ants. A principle defensive behavior by the beetles is feigning death (letisimulation). The beetles give off an unpleasant "dead fish odor when collected in the I field. Experiments show that this substance functions to fend off some predators but further experiments indicated that these substances were ineffective against both ants and kangaroo rats. Experiments with various species of Cremastocheilus adults indicate that the adults eat only ant larvae. The beetles will eat larvae of non-host ants but show preferences for the larvae of their normal hosts. Under the same experimental conditions. Genuchinus ineptus adults will feed on a variety of insect adults and larvae. Field experiments on the function of trichome secretions did not indicate that they function to attract ants at a distance nor are they involved in worker acceptance. Laboratory experiments in which areas with a high concentration of gland cells were presented to ants showed that no ants were attracted. Laboratory introduction of Cremastocheilus hamisii adults into Fomica schau.si nests yielded many interactions including ants licking the anterior pronotal angles, the mentum area where the frontal glands empty and a carina over the eye with a dense pad of short setae. These are areas of concentration of gland cells and these are the first observations of licking by ants in specific sites containing exocrine glands. Radioisotope experiments showed food exchange among ants but never from ants to beetles. Other experiments showed that ants can pick up radioactivity from the beetles without feeding on trichome secretions. Evolutionary pathways: Adult Cremastocheilini probably followed the evolutionary route from adult predation on soft bodied insects to specialized feeding upon ant brood and the subsequent development of the beetle larvae in vegetable material in the ant colonies. Thus Genuchininseptus makes a logical outgroup in that they are general predators probably feeding mostly on Diptera larvae associated with Sotol plants in the field. The rnajor evolutionary step taken by Cremastocheiluswas to specialize on ant brood. Then the species radiated into ant colonies inhabiting southwestem North Arnenca. Most of the ant hosts invaded have quantities of vegetable material in their nests sufficient to support several developing scarab larvae. Host colonies are large, contain accessible brood, and are usually dominant foragers Evidence supports the idea that the species of Cremastocheilus have differentes in behavior and morphology that reflect adaptation to the behavioral ecology of different species of ants rather than different evolutionary levels of integration into ant colonies.
Rhizostomen von Ambon
(1898)
Die im Folgenden behandelten Rhizostomen wurden bei der Insel Ambon (Molukken) im Januar und Februar 1893 von Herrn Prof. R. SEMON gesammelt. Die Sammlung enthält 34 wohl erhaltene Individuen, die sich mit je einer Art auf 8 Genera vertheilen. Davon waren 2, den Polyrhiziden angehörige Gattungen noch nicht bekannt, Cassiopeja und Toxoclytus, letztere bisher nur im Atlantischen und - wenn wir die fragliche Cephea Dubreuillii von Reynaud auch zu Toxoclytus ziehen wollen - irn Indischen Ozean gefunden, sind in je einer neuen Art vertreten. Die umfangreiche, mehrere Originale (zum Theil aus den Museum GODEFPROY) enthaltende Rhizostomensammlung des Zoologischen Instituts in Jena und des Museums für Naturkunde zu Berlin, für deren Benutzung ich Herrn Geh. Rath MÖBIUS und Herrn Dr. W. WELTNER zu grosseln Dank verpflichtet bin, lieferten mir werthvoIles Vergleichsmaterial. Bei der anatomischen und systematischen Vergleichung ging ich in erster Linie auf die grundlegende Monographie der Medusen von HAECKEL zurück, die dessen System und untereinander sich befehdenden Vorschläge von CLAUS und VANHÖFFEN zur Kontrolle jeder einzelnen Bestimmung heranziehend.
In allen bislang durchgeführten Experimenten zur Mutagenese von embryonalen Stammzellen war auffällig, dass Gene, die für sekretierte oder membranständige Proteine kodieren, stark unterrepräsentiert waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Genfallen untersucht, die speziell diese Gene mutieren sollten. Als Selektionskassetten tragen beide Genfallen den 5' Bereich des humanen CD2, der eine kryptische Spleißakzeptorsequenz enthält und für eine Transmembrandomäne kodiert, als Fusion mit der bakteriellen Neomycinphosphotransferase. U3Ceo trägt diese Kassette als klassische retrovirale Genfalle im LTR des Mouse Molony Leukemia Virus, wogegen die ebenfalls retrovirale FlipRosaCeo Genfalle die Selektionskassette im Viruskörper enthält. Diese wird von Rekombinaseerkennungssequenzen flankiert, welche eine konditionale Aktivierung der Mutation für die spätere Analyse in einem Mausmodell ermöglichen. Beide Genfallen zeigten mit ca. 80% aller Integrationen eine hohe Spezifität für Gene, die für sezernierte und membranständige Proteine kodieren. Allerdings war die Frequenz für Insertionen in sogenannte „hot spots“ bei beiden Genfallen aufgrund der geringeren Zahl an Zielgenen höher als bei anderen im GGTC verwendeten Genfallen (z.B. FlipRosabetageo). Innerhalb dieser „hot spots“ zeigte sich die bekannte Präferenz retroviraler Genfallenvektoren, in das 5’ Ende von Genen zu integrieren, wobei hier meist die größten Introns zu finden sind. Ebenso zeigte sich für die in dieser Arbeit untersuchten sekretorischen Genfallen genau wie bei anderen bekannten Genfallen eine bevorzugte Integration in Chromosomen mit einer hohen Gendichte. Die Funktionalität der konditionalen Genfalle konnte in vitro sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten durch Einbringen der Genfalle und der jeweiligen Rekombinasen bestätigt werden. In ES Zellen, die eine X-chomosomale Integration aufwiesen, wurde der Mechanismus durch transiente Expression der Rekombinasen in Klonen überprüft. Hierbei stellte sich heraus, dass das Wildtyptranskript eines mutierten Gens nach der einmaligen Rekombination der FlipRosaCeo wieder exprimiert wird und nicht durch die auf dem Gegenstrang befindliche Genfalle beeinflusst wird. Nach einer weiteren Rekombination mittels FLPe konnte der mutagene Ausgangszustand der Genfalle wieder hergestellt werden. Die Mutagenität der beiden Genfallen wurde durch Überprüfung der Konzentration der restlichen endogenen Transkripts der mutierten Gene per quantitativer PCR an X-chromosomalen Klonen analysiert. Hier konnte bei etwa 80% der untersuchten Klone eine sehr starke Mutation des jeweils getroffenen Gens festgestellt werden. Zur in vivo Überprüfung der U3Ceo Genfalle wurde ein Mausmodell durch Blastozysteninjektion des ES Zellklons M076C04 generiert. Die Integration der Genfalle in das erste Intron des Gens C030019F02Rik sollte eine deutliche Verkürzung des membranständigen Genproduktes bewirken. In Gehirnen von homozygoten Mäusen konnte die Expression des Wildtyptranskripts nicht mehr festgestellt werden, so dass diese Mauslinie eine Nullmutation des Gens trägt. Die in dieser Arbeit untersuchte KO Maus zeigte bisher keinen feststellbaren Phänotyp, obwohl das Genprodukt in vielen Spezies hoch konserviert vorliegt und auch nur in bestimmten Bereichen im Organismus nachweisbar ist, so dass eine wichtige Funktion des Proteins anzunehmen ist. Eine weitere Analyse dieser Mauslinie wird sich dieser Arbeit anschließen.
Die Rolle des cAMP/CREB-Signalwegs in der noradrenergen Differenzierung sympathischer Nervenzellen
(2006)
Um die sympathische Differenzierung in Abwesenheit von CREB zu untersuchen, wurden zunächst Embryonen von CREB-Null-Mäusen analysiert. In diesen Mäusen wiesen die sympathischen Ganglien an Embryonaltag E10,5 und E12 keine Unterschiede in der Differenzierung zu heterozygoten und wildtyp-Ganglien auf. Es wurde deshalb vermutet, dass die mit CREB interagierenden Transkriptionsfaktoren CREM und ATF1 den Verlust von CREB im sympathischen Ganglion funktionell kompensieren. Da Mäuse mit einem Knock-out von CREB und CREM bereits vor E10 sterben, konnte die Entwicklung sympathischer Ganglien in diesen Mäusen nicht weiter untersucht werden. Durch Immunfärbung gegen ATF1 in CREB-deletierten Mäusen und in situ-Hybridisierung gegen CREM und ATF1 wurde gezeigt, dass im Rumpf der CREB-KO-Maus keine drastische Hochregulation der Expression beider Gene stattfindet. Eine geringfügige Hochregulation konnte aber nicht ausgeschlossen werden kann. Um die cAMP/CREB-Signaltransduktion in Ganglienvorläuferzellen auszuschalten, und Kompensation durch CREM und ATF1 zu umgehen, wurden die dominant-negative Effektoren ACREB und PKA-R(I)mut verwendet. ACREB blockiert die Funktion von CREB, CREM und ATF1 (Ahn et al., 1998). Durch PKA-R(I)mut sollte die Aktivität von PKA inhibiert werden. Die Funktionalität beider Effektoren wurde in differenzierenden Zellkulturen bestätigt. Um in vivo geeignete Expression der Inhibitoren zu erzielen, wurden verschiedene Methoden des Gentransfers im Huhnembryo erprobt. Durch Infektion der Neuralplatte des Embryos mit Retroviruskonzentrat konnte frühe embryonale Expression der dominant-negativen Effektoren in Neurallleistenzellderivaten erzielt werden. Die Expression von ACREB im Embryo zeigte, dass CREB in der initialen adrenergen Differenzierung bis E4 erforderlich ist, die sympathischen Ganglien wiesen reduzierte adrenerge Genexpression auf. In späteren Embryonalstadien ist dieser Effekt nicht mehr nachzuweisen. Im Gegensatz zur Inhibition von CREB, hatte die Inhibition von PKA durch PKAR(I)mut keine Auswirkungen auf die Ganglienentwicklung in vivo. Durch pharmakologische Inhibition von PKA wurden kleinere Ganglien erzielt, ein selektiver Effekt auf die adrenerge Differenzierung wurde auch in diesem in vivo Experiment nicht beobachtet. Dies widerspricht den Hinweisen aus Zellkultur auf die selektive Funktion von PKA in der adrenergen Differenzierung. Der Befund, dass die Funktion von CREB in vivo auf die initiale adrenerge Differenzierung sympathischer Neurone beschränkt ist, und nicht für den Erhalt adrenerger Differenzierung erforderlich ist, wurde in vitro in differenzierten sympathischen Neuronen des Embryo bestätigt. ACREB und PKA-R(I)mut hatten keine bzw. nur geringe Auswirkungen auf den Anteil TH-positiver Neurone in Kulturen sympathischer Neurone aus Embryonen der Embryonaltage E7 und E12. Somit konnte erstmals in vivo eine physiologische Rolle für CREB in der Differenzierung sympathischer Neurone gezeigt werden: CREB ist für die initiale Expression von TH erforderlich.
Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind eine Familie von Enzymen, die die Fähigkeit besitzen, die Hydrolyse der mittleren (sn-2) Esterbindung aus Phospholipiden zu katalysieren. Die Produkte dieser Hydrolyse, freie Fettsäuren und Lysophospholipide, sind nicht nur Bausteine für die Synthese von Lipiden, sondern sie haben wichtige Funktionen als Lipid „second-messenger“ in zellulären Signaltransduktionsprozessen. In der Klasse der sekretorischen PLA2 wurden in Säugern bisher 10 Isoenzyme identifiziert, wobei die sPLA2-IIC beim Menschen nur als Pseudogen vorkommt. In der murinen Epidermis scheinen eines oder mehrere dieser Enzyme eine Rolle bei der Bildung der epidermalen Permeabilitätsbarriere zu spielen. Darüber hinaus kontrollieren sie die Freisetzung von Arachidonsäure für die Produktion von Eicosanoiden, die sowohl für die Proliferation der Keratinozyten als auch für inflammatorische Prozesse und die Entstehung von Tumoren in der Haut von entscheidender Bedeutung sind. Da bislang weder das detaillierte Expressionsmuster der einzelnen sPLA2-Enzyme noch deren spezifische Funktionen in muriner Epidermis bekannt war, wurde in der vorliegenden Arbeit eine umfassende Analyse an Schnitten von neonataler Maushaut und an murinen Papillomschnitten durchgeführt. Zusätzlich zum Nachweis der sPLA2-Expression in vivo wurden primäre murine Keratinozyten in vitro verwendet, um die Auswirkungen der Differenzierung der Keratinozyten auf die Expression der verschiedenen sPLA2-Enzyme zu untersuchen. Die Tumorzellinie HEL30 wurde zur Durchführung funktioneller Studien und für Kolokalisationsstudien verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut in vivo sowie in isolierten primären murinen Keratinozyten alle bisher bekannten sPLA2 Enzyme exprimiert sind. Für die sPLA2-IB, -IIE, -IIF, -V und -XII konnte sowohl in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut als auch in den primären Keratinozyten eine Expression vor allem in den differenzierten Zellen nachgewiesen werden. Dass diese Enzyme somit wahrscheinlich mit Differenzierungsprozessen gekoppelt sind, zeigte sich am Beispiel der sPLA2-V, die im murinen Papillom, welches vorwiegend aus proliferierenden Keratinozyten steht, nicht exprimiert war. Hingegen waren sPLA2 -IIA, -IID, und -X fast ausschließlich in Keratinozyten der Basalzellschicht der Epidermis und in den proliferierenden primären Keratinozyten exprimiert. Dies läßt vermuten, dass diese Enzyme eventuell eine Rolle bei der (Hyper-)Proliferation von Keratinozyten spielen. Darüber hinaus sind diese Enzyme auch in der Lage, Arachidonsäure freizusetzen, und sind somit eventuell an der Eicosanois-Homöostase beteiligt. Um eine eventuelle Beteiligung der basal exprimierten sPLA2 Enzyme an der Eicosanoidbiosynthese nachzuweisen, wurden Immunfluoreszenzstudien an neonataler Maushaut und an murinen Hautpapillomen des 2-Stufen-Tumorpromotionsmodells durchgeführt. Wie zuvor beschrieben waren alle drei Enzyme in der Basalzellschicht der neonatalen Maushaut exprimiert. Im Gegensatz dazu war die sPLA2-IIA im murinen Papillom nur am äußersten, nicht mehr hochproliferativen, Papillomrand zu detektieren. Die sPLA2-X dagegen zeigte eine starke Expression in den hochproliferativen basalen Keratinozyten dieses Gewebes. Für die sPLA2-IID konnte im Papillom ein Expressionsmuster festgestellt werden, das bis in die suprabasalen Schichten reicht. Betrachtet man die Expression der phospho-cPLA2, so konnte dieses Enzym in der neonatalen Maushaut vor allem in der Basalzellschicht, aber auch suprabasal im Stratum spinosum detektiert werden. Im Papillom zeigt dieses Enzym dagegen eine sehr starke Expression im gesamten Gewebe. Wie erwartet konnte COX-2 in der neonatalen Maushaut nicht detektiert werden, während das Expressionsmuster dieses Enzymes im Papillom mit dem der sPLA2-IID und phospho-cPLA2 korreliert Um Hinweise über die Expression und Funktion von sPLA2 –IID, -X und cP LA2 im Karzinom zu bekommen, wurde als Modellsystem die murine Karzinomzelllinie HEL30 verwendet. Diese Zellen produzieren bereits konstitutiv eine hohe Menge an PGE2. Eine TPA Stimulation dieser Zellen induziert eine zusätzlich stark erhöhte PGE2 Produktion. Anhand der Ergebnisse aus den Western Blot Analysen konnte gezeigt werden , dass sPLA2-IID und -X in den HEL30-Zellen auf Proteinebene exprimiert sind, jedoch konnte keine Veränderung der Proteinexpression dieser beiden Enzyme nach TPA-Behandlung der HEL30 Zellen detektiert werden. Dies führte zu der Annahme, dass diese Enzyme eventuell, wie die cPLA2, über ihre Enzymaktivität oder eine zelluläre Translokation reguliert werden. Durch den Einsatz des sPLA2-Inhibitors Me-Indoxam konnte jedoch weder die konstitutive noch die TPA-stimulierte PGE2 Produktion gehemmt werden, was vermutlich, wie die anschließenden siRNA Studien zeigen, auch an der Eigenschaft dieses Inhibitors liegen könnte nicht membrangängig zu sein. Weiterhin konnte durch den Einsatz des COX-2-spezifische Inhibitors Celecoxib und des COX-1-präferierende Inhibitor Indomethazin gezeigt werden, dass COX-2 vor allem an der TPA induzierte PGE2-Freisetzung, und COX-1 sowohl an der konstitutiven als auch an der der TPA induzierten PGE2-Freisetzung aus HEL30 Zellen beteiligt sind. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit dem cPLA2-Inhibitor Pyrrolidin-1 lassen vermuten, dass in diesen Zellen die cPLA2 vor allem an der TPA induzierten PGEs-Synthese beteiligt ist, aber nicht an der konstitutiven Freisetzung. Während in unbehandelten HEL30 Zellen die sPLA2-IID im Cytosol exprimiert ist und eine schwache Kolokalisation mit COX-2 zeigt, verlagert sich dieses Enzym nach 20 minütiger TPA Stimulation, in Richtung Kernmembran und zeigt nun eine sehr starke Kolokalisation mit COX-2. Nach Inkubation der HEL30 Zellen mit einer siRNA, die die Expression der sPLA2-IID ausschalten sollte, war sowohl die konstitutive als auch die TPA-induzierte PGE2-Biosynthese signifikant reduziert. Gleichzeitig konnte durch den Einsatz der siRNA eine Reduktion des sPLA2-IID-Proteins beobachtet werden. Dies deutet an, dass die sPLA2-IID mit beiden Cyclooxygenasen gekoppelt sein könnte und ihr Substrat je nach Stimulation und Änderung der Lokalisation dem einen oder dem anderen Enzym zur Verfügung stellt. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die sPLA2-IID intrazellulär katalytisch aktiv ist und signifikant zur PGE2-Biosynthese beiträgt. Um genauere Aussagen über die Bedeutung dieser sehr interressanten Ergebnisse machen zu können, sind weitere Untersuchungen nötig, um herrauszufinden, ob die Herunterregulierung der sPLA2-IID - z.B. in Form einer sPLA2-IID-knockout-Maus - Konsequenzen für die Hyperproliferation derKeratinozyten hat, und somit einen Einfluß auf die Progression der Tumorpromotion ausüben könnte. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein spezifisches Expressionsmuster für die Gruppen I, II, V, X und XII sPLA2 in der murinen Haut beschrieben werden, welches mit der Regulation von Wachstum und Differenzierung verbunden ist. Hieraus läßt sich schließen, dass die einzelnen sPLA2 Enzyme unterschiedliche Funktionen in der epidermalen Homöostase sowohl unter normalen als auch pathologischen Bedingungen ausüben.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Allergie gegen Süßkirsche untersucht. Zunächst wurde die Leistungsfähigkeit eines professionellen Tests mit re-kombinanten Allergenen aus Süßkirsche untersucht. Hierzu wurden rPru av 1, 3 und 4 einzeln eingesetzt, um die Sensibilisierungsmuster von Kirschallergikern aus Mitteleuropa und Spanien zu untersuchen. Vor allem die Untersuchung LTP-sensibi-lisierter Patienten aus diesen Regionen in einer Zahl, die einen statistischen Ver-gleich ermöglichte, offenbarte neue Aspekte des Phänomens schwerer Reaktionen bei solchen Patienten. Die drei rekombinanten Kirschallergene wurden auch kombiniert in einem einzigen Test eingesetzt, um schwer standardisierbare Proteinextrakte als Hilfsmittel zur in vitro Diagnose zu ersetzen. Um die Leistungsfähigkeit dieses Tests umfassend beurteilen zu können, wurde sie mit der des SPT in Birkenpollenallergikern mit und ohne Kirschallergie verglichen. Die mögliche Bedeutung unbekannter Allergene oder Isoformen wurde durch die Abschätzung des Beitrags der bekannten Kirschallergene zum IgE-Bindungsanteil von Kirschextrakt untersucht. Mit dem ImmunoCAP konnten die bereits veröffentlichten regional unterschiedlichen Sensibilisierungsmuster bestätigt werden. Die dominierende Rolle des Bet v 1-Homologen Pru av 1 in Patienten aus Mitteleuropa und damit die Bedeutung der Birkenpollenassoziation in dieser Region, konnte ebenso bestätigt werden wie die überragende Relevanz von Pru av 3 für Kirschallergiker aus Spanien. Der Vergleich der größten bisher publizierten und für statistische Untersuchungen ausreichend großen Gruppe LTP-sensibilisierter Patienten aus Mitteleuropa mit solchen Patienten aus Spanien, legte im Gegensatz zu früheren Studien keine ausschließlich auf die molekularen Eigenschaften von Pru av 3 beschränkte Assoziation von sys-temischen Reaktionen und einer Sensibilisierung gegen LTPs nahe. Die Assoziation scheint eher zwischen der Herkunft LTP-sensibilisierter Patienten und systemischen Reaktionen zu bestehen. Diese Schlussfolgerung konnte gezogen werden, da bei keinem der LTP-sensibilisierten Patienten aus Mitteleuropa systemische Reaktionen auftraten. Weder eine Co-Sensibilisierung gegen Pollen noch eine Allergie gegen andere Nahrungsmittel wie zum Beispiel Pfirsich korrelierten mit dem Auftreten sys-temischer Reaktionen. Eine Erklärung für dieses Phänomen konnte aus den vor-liegenden Daten daher nicht abgeleitet werden. Die Leistungsfähigkeit des rMix-ImmunoCAP mit rPru av 1, 3 und 4 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche war exzellent. Weder der kommerziell erhältliche Extrakt-ImmunoCAP noch der ImmunoCAP, der einen optimierten Extrakt an der Festphase trug konnte mit diesem Test konkurrieren. Die klinische Sensitivität des rMix-ImmunoCAP war mit ≥95% hervorragend, und der Test stimmte in 92% der Fälle mit dem SPT überein. Eine Unterscheidung zwischen Birkenpollenallergikern ohne Allergie gegen Süßkirsche und Kirschallergikern war hingegen weder mit dem rMix-ImmunoCAP noch mit dem SPT möglich. Die Spezifität beider Tests war von klinisch insignifikanter IgE-Reaktivität gegen Pru av 1 beeinträchtigt und auch die Konzentration spezifischen IgEs erlaubte keine Unterscheidung zwischen beiden Gruppen auf der Ebene einzelner Patienten. Der rMix-ImmunoCAP ist aber sehr gut geeignet eine Sensibilisierung bei einem Verdacht einer Allergie gegen Süßkirsche nachzuweisen, ohne auf weitere Allergene wie Pru av 2 oder Isoformen von Pru av 1 zurückgreifen zu müssen. Damit wurde zum ersten Mal ein diagnostischer Test ein-gesetzt, der einen Proteinextrakt aus Früchten vollständig ersetzen kann Die quantitative Abschätzung des Beitrages der bereits bekannten Allergene aus Süßkirsche zur IgE-Bindung mittel EAST-Inhibition hat gezeigt, dass bei einem Großteil der untersuchten Seren erhebliche Anteile des IgEs gegen Süßkirsche nicht erfasst werden. Die Ursache für dieses Phänomen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend aufgeklärt werden, aber es ist als sehr wahrscheinlich anzu-sehen, dass die neu identifizierte Isoform von Pru av 1 zumindest bei einem Teil der Seren hierfür verantwortlich ist. Darüber hinaus waren im Immunoblot bei Seren bei denen die IgE-Bindung nicht vollständig zu inhibieren war IgE-Reaktivität gegen noch unbekannte Strukturen zu erkennen. Neben der Beteiligung glykosilierter Proteine war auch eine Beteiligung von Pru av 2 nicht vollständig auszuschließen, wenngleich im Verlauf dieser Arbeit keine Hinweise auf eine Relevanz dieses Allergens in dem untersuchten Patientenkollektiv gefunden werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Grundlagen gelegt, um die Allergenität von Süßkirsche in einem in vitro Modell zu reduzieren. Es wurden Isoformen von Pru av 1 mit einer Kombination aus molekularbiologischen und proteinchemischen Methoden untersucht. Es wurden hierzu Techniken gewählt, die eine weitgehend um-fassende und zuverlässige Identifizierung von Isoformen ermöglichten. Ferner wurde der Gehalt an Pru av 1 von verschiedenen Kirschsorten verglichen, das Splice-Intron von Pru av 1 sequenziert, um die Herstellung eines spezifischen und wirksamen RNAi-Konstruktes zu ermöglichen, sowie die Eignung in vitro regenerierter Kirschpflanzen als Zielorganismus durch den Nachweis von Pru av 1 in den Blättern solcher Pflanzen geprüft. Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden haben sich als geeignet erwiesen zuverlässig Isoformen von Allergenen zu identifizieren. Es konnte mit Hilfe einer syn-ergistischen Kombination aus einer cDNA-Bibliothek, PCR, und 2-D-PAGE / MS mit Pru av 1.02 eine neue Isoform von Pru av 1 identifiziert werden. Die mit den molekularbiologischen Methoden erzielten Ergebnisse stimmten dabei mit den Re-sultaten der proteinchemischen Untersuchungen sehr gut überein. In beiden Fällen wurden zwei Pru av 1 Isoformen nachgewiesen und lediglich die eine Variante von Pru av 1.02 mit sehr hoher Sequenzidentität konnte nicht als Protein nachgewiesen werden. Die auf Protein- und DNA-Ebene übereinstimmenden Ergebnisse bezüglich der beiden IgE-bindenden Isoformen, lassen darüber hinaus auf eine weitgehend vollständige Erfassung der Pru av1 Isoformen schließen. Pru av 1.02 besteht aus drei Varianten und zeigte ein anderes IgE-Bindungs-verhalten als das bereits bekannte Pru av 1.0101. Diese Isoform ist daher sowohl für eine zukünftige gentechnische Reduzierung der Allergenität von Süßkirsche als auch für diagnostische Zwecke bedeutsam. Für eine erfolgreiche Reduzierung der Aller-genität von Süßkirsche muss die Expression aller IgE-reaktiven Isoformen des in Mitteleuropa dominierenden Allergens Pru av 1 unterdrückt werden. Wenngleich Pru av 1.0201 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche nicht not-wendig erscheint, könnte sie jedoch sowohl einen Einfluss auf die Höhe der gemes-senen IgE-Werte und die Ausbildung von Symptomen haben, als auch besser ge-eignet sein zwischen Birkenpollenallergikern mit und ohne Allergie gegen Süßkirsche zu unterscheiden. Abschließend wurden dann die Grundlagen für die gentechnische Redu-zierung der Allergenität von Süßkirsche geschaffen. Der Gehalt an Pru av 1 war in allen elf Kirschsorten sehr ähnlich, und erlaubt daher alle untersuchten Kirschsorten als Ausgangsmaterial einzusetzen. Die Sequenzierung des Splice-Introns aus Pru av 1 ermöglicht es jetzt ein intron-spliced hairpin RNAi-Konstrukt herzustellen. Dieses Konstrukt könnte dann eingesetzt werden, um die Reduktion der Allergenität von Süßkirsche experimentell in einem in vitro Modell zu zeigen. Mit dem Nachweis von Pru av 1 in den Blättern in vitro regenerierter Kirschpflanzen konnte gezeigt werden, dass die Voraussetzungen hierzu gegeben sind.
In dieser Arbeit wurde die Verteilung von Glykolyseenzymen in Kulturzellen unter normalen und die Glykolyse stimulierenden und hemmenden Bedingungen untersucht. Die Hauptfunktion, die der Strukturbindung und -Bildung von Glykolyseenzymen zugeschrieben wird, ist das so genannte metabolite-channelling bzw. substratechannelling, also die effiziente, lokale Bereitstellung von ATP. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen stand Aldolase (EC 4.1.2.13). Unter allen Bedingungen liegt Aldolase, wie die meisten anderen Glykolyseenzyme gleichzeitig sowohl in strukturgebundener, als auch in gelöster Form im Cytoplasma vor. Unter normalen Kulturbedingungen wurde die strukturgebunde Aldolase an Stressfasern sowie dem fibrillären Aktin-Netzwerk des Zellkortex vorgefunden. Diese Beobachtungen wurden an fixierten Zellen gemacht; an lebenden Zellen konnte die Bindung an Stressfasern durch Mikroinjektion fluorochromierter Aldolase direkt nachgewiesen werden. Ferner wurde beobachtet, dass Aldolase selbst, unabhängig vom Vorhandensein von Aktin in der Zelle netzwerkartige Strukturen bilden kann. Das Hinzufügen von Aldolase zu in vitro polymerisierten Aktinfilamenten führte zu einer Bündelung der Aktinfilamente, die wahrscheinlich auf eine quervernetzende Wirkung dieses Enzyms zurückzuführen ist. Durch Injektionen mit Gemischen unterschiedlich markierter Glykolyseenzyme konnte gezeigt werden, dass diese Enzyme auch in gelöster Form nicht völlig homogen in den Zellen verteilt sind. In Gegenwart hoher Substratkonzentrationen wurde entdeckt, dass Aldolase in großem Ausmaß an Intermediärfilamente gebunden wird. Da dieses Verhalten zwar unabhängig von der Präparationsmethode auftrat, in vitro durch Kosedimentation aber nicht bestätigt werden konnte, ist anzunehmen, dass neben dem Substrat weitere Faktoren bei diesem Phänomen eine Rolle spielen. Die Applikation von Insulin führte zu keinerlei mikroskopisch beobachtbaren Änderungen im Bindungsverhalten der Aldolase. Dennoch konnte eine geringe Steigerung der Aktivität in der unlöslichen Fraktion des Zellproteins nachgewiesen werden. Die Mikroinjektion unphysiologisch hoher Mengen von Aldolase führte zu einem drastischen Abbau von Aktinfilamenten und Stressfasern in den injizierten Zellen. Andere Glykolyseenzyme (GAPDH, PGM, LDH und TIM) zeigten dagegen keinerlei Wirkung. Der selbe Effekt ist bereits für PFK beschrieben worden, wo er durch eine starke Assoziation der PFK mit Gelsolin hervorgerufen wird. Der Wirkungsmechanismus bei der Aldolase ist dagegen bislang nicht bekannt. Durch die Inkubation fixierter Zellen mit fluorochromierter Aldolase wurden eine große Zahl freier Bindungsstellen an Mikrotubuli entdeckt. Allerdings konnten keine Bedingungen ermittelt werden, unter denen die intrazelluläre Aldolase an Mikrotubuli bindet. Weiterhin wurde ein Experiment entworfen, um die lokale Bereitstellung von Energie in Form von ATP und metabolite-channelling nachzuweisen. Dazu wurden Monolayerkulturen durch Hemmung von Atmung und Glykolyse ATP-entleert und durch Permeabilisierung alle löslichen Bestandteile freigesetzt. Die Gabe verschiedener ATP-Konzentrationen führte in diesem Fall zu einer Kontraktion der verbleibenden Zellbestandteile, wobei die Kontraktionsgeschwindigkeit abhängig von der gegebenen ATPKonzentration war. Durch die Gabe von FBP und ADP konnte diese Kontraktion ebenfalls ausgelöst werden, was für die Konversion von ADP zu ATP wodurch ein von FBP und den strukturgebundenen Enzymen unterhaltener glykolytischen FluSS und somit metabolite-channelling nachgewiesen wurde.
Ziel der vorliegenden Arbeit sind Strukturuntersuchungen an geplant gezüchteten Einkristallen elektronenreicher Iod- und Schwefel-Verbindungen, ergänzt durch zugehörige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen. Besonderes Augenmerk gilt insbesondere Molekülen mit Thiophenyl-Substituenten R-S-(C6H5) und ihren isovalenzelektronischen Derivaten vom Typ R-NH-(C6H5) sowie den bisher unbekannten Donator/Akzeptor-Komplexen des Iodanils. Durch optimierte Auswahl jeweils geeigneter Lösungsmittel und Kristallisationsbedingungen gelingt es, zahlreiche unterschiedliche Typen kristalliner Nichtmetall-Verbindungen zu züchten. Die Strukturen der isolierten Einkristalle werden durch Vergleich mit bereits literaturbekannten sowie anhand quantenchemischer Berechnungen diskutiert und vertiefen das Verständnis der experimentellen Befunde wesentlich. ... Insgesamt belegen die in der Dissertation detalliert beschriebenen Ergebnisse, daß Kombinationen von gezielter Kristallzüchtung, anschließender Strukturbestimmung und quantenchemische Berechnungen zahlreiche Informationen über Wechselwirkungen in Kristallen liefern. So verdeutlicht die anschauliche Betrachtung der I2-Komplexe durch zugehörige Einkristallstrukturen sowie quantenchemische Modellrechnungen, daß auch geringe Wechselwirkungen teils beträchtliche Einflüsse auf Stöchiometrien und Strukturparameter in Kristallen ausüben. Das Schlußbeispiel Tris(thiophenyl)methan-Dimer belegt durch alle notwendigen Messungen wie Kristallstrukturanalyse, quantenchemische hochkorrelierte Berechnungen und massenspektrokopische Messungen, wie sich durch das Zusammenwirken moderner Methoden unerwartete Ergebnisse für einen neuartigen Verbindungstyp festigen lassen. Die lohnenden Ergebnisse der Untersuchungen erweitern die Kenntnisse statischer Aspekte bei Selbstorganisations-Phänomenen.
Pflanzliche Arzneimittel erfreuen sich nach wie vor einer großen Beliebtheit. Da sie sich in enger Konkurrenz zu den auf Wirksamkeit und Unbedenklichkeit untersuchten chemisch definierten Arzneistoffen befinden, reicht es heute häufig nicht mehr aus, wenn Phytopharmaka sich nur auf ihre tradierte und dokumentierte Verwendung berufen. „Rationale“ Phytopharmaka müssen dieselben Anforderungen erfüllen, wie synthetische Arzneimittel. Das führt dazu, dass sich die Forschung neben der Aufklärung der chemischen Strukturen und Zusammensetzung der Pflanzenzubereitung, darüber hinaus auch der in-vitro und in-vivo Wirkung von Phytopharmaka widmet. Bei einigen dieser Untersuchungen konnte nicht nur die Wirkung des untersuchten Phytopharmakons aufgeklärt, sondern ebenso neue Indikationsgebiete eröffnet werden. So führte die Aufklärung des Wirkmechanismus des traditionell in der indischen Volksmedizin als Antirheumamittel angewandten Boswellia serrata-Extraktes dazu, dass Weihrauchzubereitungen heute in klinischen Studien auf Ihre Wirksamkeit bei der Behandlung des peritumoralen Hirnödems geprüft werden. In vorausgegangenen Tierstudien und klinischen Pilotstudien mit Glioblastom-Patienten konnte nämlich eine Reduktion des Hirnödems unter Weihrauchtherapie beobachtet werden. Die antiinflammatorischen, zytostatischen wie auch antiödematösen Effekte werden den im Weihrauch enthalten Boswelliasäuren zugeschrieben. Vor allem die ketylierten Boswelliasäuren KBA und AKBA zeigen in in-vitro Untersuchungen eine sehr hohe Wirksamkeit und gelten deshalb auch als Leitsubstanzen in der Monographie Boswellia serrata des DAC. Während einige Daten zur Bioverfügbarkeit von KBA bereits vorliegen, reichen die bisher zur Verfügung stehenden analytischen Methoden nicht aus, um die wesentlich geringere AKBA-Konzentration im Plasma zu bestimmen. Des Weiteren fehlte bisher der Nachweis, ob die Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirnschranke in der Tat überwinden können, um im ZNS zu wirken. Für die parallele Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirnmatrix wurde deshalb in dieser Arbeit eine sensitive analytische Methode entwickelt und gemäß internationalen Richtlinien validiert. Diese Methode ist charakterisiert durch eine sehr einfache Probenaufarbeitung mittels sorbensgestützter Flüssig-Flüssig-Extraktion auf Kieselgurbasis, gefolgt von einer chromatographischen Trennung auf einer RP-18-Säule und einer massenspektrometrischen Detektion anhand der Übergänge m/z 471,2 --> 95,1 für KBA und m/z 513,4 --> 91,1 für AKBA im positiven MRM-Modus. Die Quantifizierung erfolgte über die pentazyklische Triterpensäure „Asiatische Säure“, die als interner Standard eingesetzt wurde. Bei der anschließenden Validierung konnte die Spezifität der Methode nachgewiesen, sowie die international anerkannten Grenzen für die Linearität, die Nachweisgrenze sowie die inter- und intraday Präzision und Richtigkeit eingehalten werden. Die Stabilität der Plasma- und Hirnproben konnte bei T=-20°C für fünf Monate, bei Raumtemperatur für 24 Stunden und nach mehreren Einfrier-Auftauzyklen belegt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelte analytische Methode zur Aufnahme von Plasma-Spiegel-Kurven von KBA und AKBA nach oraler Administration von Weihrauchzubereitungen eingesetzt werden kann. Gegenüber den bereits beschriebenen HPLC-UV- und GC-MS-Methoden besitzt die neu entwickelte Methode den Vorteil, dass mit der Nachweisgrenze von 5 ng/ml für KBA und AKBA, auch die Plasmakonzentrationen von AKBA erstmals valide erfasst werden konnten. Da sie darüber hinaus eine einfache Probenaufarbeitung mit einer kurzen Analysenzeit von 6 Minuten verbindet, ist sie für die Durchführung von Pharmakokinetikstudien gut geeignet. Wie wichtig derartige pharmakokinetische Studien für die Etablierung von Weihrauch als rationales Phytopharmakon sind, erbrachte der Vergleich der Bioverfügbarkeit von H15™-Ayurmedica mit einem Referenzpräparat. Hierbei wurde deutlich, dass für die Resorption von KBA und AKBA neben der Extraktzusammensetzung auch die Arzneiform eine entscheidende Rolle spielt. Für die Zukunft stellt daher die Erhöhung der Bioverfügbarkeit von KBA und AKBA z.B. durch eine verbesserte technologische Formulierung einer der wichtigsten Meilensteine im Sinne einer verbesserten Therapie mit Weihrauchextrakt dar. Im Hinblick auf die potentielle Indikation von Boswellia serrata Extrakt für die Therapie des tumor-assoziierten Hirnödems wurde darüber hinaus untersucht, ob die beiden Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirn-Schranke überwinden und in das Hirn gelangen können. Dazu wurden die Konzentrationen von KBA und AKBA im Hirn nach einem Fütterungsversuch an neun gesunden Ratten bestimmt. Es konnten Spiegel von 99 ng/g für KBA und 95 ng/g für AKBA drei Stunden nach Gabe von 240 mg/kg Körpergewicht H15™-Ayurmedica detektiert werden. Bei gliominplantierten Ratten konnte mit der 3-mal täglichen Gabe dieses Präparates in dieser Dosierung eine Reduktion des Ödemvolumens, eine Zunahme von apoptotischen Zellen und eine Verlängerung der Überlebenszeit beobachtet werden. Interessant ist deshalb auch die Frage, wie es sich mit den Konzentrationen der Keto-Boswelliasäuren in Tumorgeweben verhält. Zur Klärung dieses Aspektes könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte LC-MS/MS-Methode beitragen. Häufig können die Chemotherapeutika in den Tumorzellen nicht die Spiegel des gesunden Gewebes erreichen. Dies kann in vielen Fällen in Verbindung mit der Effluxpumpe P-Glycoprotein (Pgp) gebracht werden. Dieses membranständige Transportprotein hindert Arzneistoffe daran in das Cytoplasma zu gelangen. Inwieweit eine Pgp vermittelte Resistenz bei den Glioblastomen eine Rolle spielt, ist derzeit noch nicht vollständig geklärt. Pgp ist darüber hinaus in seiner physiologischen Funktion an der schnellen Ausscheidung von Fremdstoffen und am Schutz spezieller Kompartimente, wie dem Gehirn, beteiligt. Eine Interaktion von Arzneistoffen mit Pgp kann deshalb auch die Pharmakokinetik dieser Substanzen empfindlich beeinflussen. Unter diesen Gesichtspunkten wurden in dieser Arbeit auch die pharmakologisch wichtigen Inhaltsstoffe des Weihrauchextraktes auf eine mögliche Modulation der Pgp-Funktion untersucht. Dieser Test erfolgte mittels zellbasierten Calcein-AM-Assays in Schweinehirnendothel-Zellen (PBCEC-Zellen) und in einer Pgp-expremierenden humanen Leukämiezelllinie (VLB-Zellen). In beiden Zellsystemen erwies sich Weihrauchextrakt (84Mikrogramm/ml H15™-Ayurmedica) als ein Modulator der Transportfunktion von Pgp. Bei der Untersuchung der einzelnen Boswelliasäuren, stellte sich heraus, dass die im Extrakt am häufigsten vorkommenden Beta-Boswelliasäuren und Acetyl-Beta-Boswelliasäuren für diesen Effekt nicht verantwortlich sind. Auch die Alpha-Boswelliasäure und Acetyl-Alpha-Boswelliasäure beeinflussen ebenfalls die Transportaktivität nicht. Eine Interaktion mit dem Transportprotein konnte dagegen bei den Keto-Boswelliasäuren KBA (10 MikroM) und AKBA (3 MikroM) in den Schweinehirnendothelzellen beobachtet werden. In der Leukämiezelllinie konnte bei beiden Keto-Boswelliasäuren ebenfalls einen Einfluss auf die Transportaktivität des Pgp festgestellt werden, der allerdings nur bei AKBA (3 MikroM) signifikant war. Um zu verifizieren, ob die 11-Ketogruppe für die modulierende Wirkung der Boswelliasäuren verantwortlich ist, wurde Glycyrrhetinsäure, eine pentazyklische Triterpensäure, die wie KBA und AKBA eine Ketofunktion an Position 11 besitzt, getestet. Da im Calcein-AMAssay bei dieser Substanz ein mit AKBA vergleichbarer Effekt auftrat, scheint für eine Wechselwirkung des P-Glycoproteins mit Boswelliasäuren die 11-Ketogruppe essentiell zu sein. In dieser Arbeit wurde ein erster Hinweis auf eine Wechselwirkung zwischen Keto-Boswelliasäuren und Pgp erbracht. Inwiefern diese in-vitro-Daten auch auf in-vivo klinische Relevanz besitzen, muss noch in weiteren Studien mit Weihrauch geklärt werden. Gerade für die Behandlung des peritumoralen Hirnödems von Glioblastom-Patienten wäre es wichtig, den Mechanismus der Wechselwirkung von KBA und AKBA mit P-Glycoprotein näher zu untersuchen. Da Weihrauchextrakt häufig in der Co-Medikation verwendet wird, sollte auch im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit geprüft werden, ob es zu Arzneimittelinteraktionen auf Pgp-Ebene mit Weihrauchextrakt kommen kann.
Die Aufrechterhaltung des physiologischen Gleichgewichtes in einem mehrzelligen Organismus erfordert Mechanismen, welche die Balance zwischen der Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen und der Auslösung einer Immunantwort ermöglichen. Diese Mechanismen werden unter dem Begriff periphere Toleranz zusammengefasst. Regulatorische T-Zellen (Treg) sind eine T-Zell-Subpopulation, die für periphere Toleranz und Homöostase des Immunsystems von großer Bedeutung sind (Powrie et al., 2003). Durch ihre suppressiven Eigenschaften sind Treg in der Lage, die Proliferation von konventionellen T-Zellen (Tcon) sowohl in vivo als auch in vitro zu hemmen und so eine Immunantwort von autoreaktiven TZellen einzudämmen. Für die Hemmung von Tcon in vitro wird der direkte Zellkontakt zwischen Treg und Tcon benötigt (Thornton und Shevach, 1998). Der molekulare Mechanismus humaner Treg ist bislang jedoch nur unzureichend geklärt. In der hier vorgestellten Forschungsarbeit wurden TZR-abhängige Signaltransduktionskaskaden analysiert, um den molekularen Mechanismus humaner Treg sowohl auf Ebene der Treg als auch auf Ebene der gehemmten Tcon zu entschlüsseln. Hierzu wurden im Rahmen der hier beschriebenen Experimente in unserer Abteilung die ex vivo Isolation und die in vitro Expansion humaner Treg etabliert. Mit Hilfe sensitiver Analysemethoden der TZR-abhängigen Signaltransduktionskaskaden konnte für humane Treg gezeigt werden, dass sie nach Stimulation über ihren TZR einen geringeren Ca2+-Einstrom im Vergleich zu dem in Tcon aufweisen. Ein weiteres Ergebnis der hier vorliegenden Arbeit ist, dass Treg im Zuge ihrer Aktivierung eine geringere Phosphorylierung einiger, für die TZR-induzierte-Signalkaskade relevante Signalmoleküle wie ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Für gehemmte Tcon aus der Kokultur mit humanen Treg wurde in dieser Forschungsarbeit ein zu Kontroll-Tcon vergleichbarer Ca2+-Einstrom detektiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen außerdem, dass Tcon aus der Kokultur mit Treg eine verringerte Phosphorylierung der Signalmoleküle ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Die hier veröffentlichten Ergebnisse ermöglichen einen ersten Einblick in die molekulare Signaltransduktion von humanen Treg und zum ersten Mal auch in die von gehemmten Tcon. Dieses Verständnis stellt eine Grundlage für weitere Experimente dar und ermöglicht einen Schritt in Richtung der vollständigen Entschlüsselung des molekularen Mechanismus humaner Treg, die eine Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz dieser Zellen ist. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, den Einfluss apoptotischer Zellen auf die Immunantwort zu untersuchen. Für die Gewebehomöostase mehrzelliger Organismen ist die effiziente und immunologisch unauffällige Eliminierung apoptotischer Zellen unabdingbar (Fadok et al., 1998; Lauber et al., 2004; Skoberne et al., 2005; Steinman und Nussenzweig, 2002). Im Rahmen der hier erläuterten Experimente wurden in vitro Studien durchgeführt, die einen inhibierenden Effekt apoptotischer Zellen auf die Reifung humaner dendritischer Zellen zeigen. Es konnte bestätigt werden, dass dendritische Zellen nach Phagozytose apoptotischer Zellen weniger proinflammatorische Moleküle sekretieren und eine geringere Oberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle aufweisen. Nach Etablierung zweier in vitro Modellsysteme wurde in weiteren Experimenten gezeigt, dass T-Zellen durch dendritische Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben, eine geringere Stimulation erfahren. Diese Ergebnisse deuten auf einen anti-stimulatorischen Effekt dendritischer Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben hin, und sie bilden die Basis für eine anschließende in vitro Analyse der molekularen Auswirkungen auf dendritische Zellen und T-Zellen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Glukoneogenese und der Glyoxylat-Zyklus in den humanpathogenen Hefen Candida albicans und Candida glabrata untersucht und Komponenten dieser Stoffwechselwege charakterisiert. Durch Aktivitätsmessungen konnten Homologe der Enzyme von Glukoneogenese und Glyoxylat-Zyklus in C. glabrata nachgewiesen werden, und gezeigt werden, dass ihre Aktivität einer kohlenstoffquellen-abhängigen Regulation unterliegt. Die Gene der Enzyme des Glyoxylat-Zyklus wurden mittels funktioneller Komplementation in S. cerevisiae isoliert. In S. cerevisiae unterliegen die Enzyme aus C. glabrata derselben Regulation wie die nativen Enzyme aus S. cerevisiae, was darauf hindeutet, dass die aus S. cerevisiae bekannte Regulationskaskade zumindest teilweise in C. glabrata konserviert ist. In C. glabrata konnten ferner Homologe der Transkriptionsaktivatoren Cat8p und Sip4p identifiziert werden. Beide Proteine werden nur bei Wachstum auf nichtfermentierbaren Kohlenstoffquellen gebildet und sind dann im Zellkern lokalisiert. CgCat8p und CgSip4p sind in der Lage, in einem heterologen System die Expression der Gene des Glyoxylat-Zyklus von C. glabrata kohlenstoffabhängig zu aktivieren. Im Vergleich zu ihren S. cerevisiae Homologen, unter denen Cat8p den Hauptregulator darstellt, waren beide Proteine im gleichen Maße in der Lage, ihre Zielgene zu aktivieren. Dies deutet daraufhin, dass die Regulation der Glukoneogenese und des Glyoxylat-Zyklus in C. glabrata redundanter organisiert ist als in S. cerevisiae. Auch in C. albicans konnte ein Cat8p-Homolog identifiziert werden. Das CaCat8p ist in der Lage, in einem heterologen System die Expression der Gene der Glukoneogenese und des Glyoxylat-Zyklus von C. albicans kohlenstoffabhängig zu aktivieren. Die Cat8p-vermittelte Aktivierung erfolgt dabei zumindest teilweise über Sequenzen, die einen ähnlichen Konsensus aufweisen wie die UAS/CSRE des ScCat8p. Eine Deletion von CaCAT8 in C. albicans zeigt aber keinen sichtbaren Phänotyp, was auf die Existenz eines weiteren Aktivators hindeutet. Die Stoffwechselwege der Glukoneogenese und des Glyoxylat-Zyklus sind innerhalb der Hefen konserviert. Auffällig ist allerdings dass die humanpathogenen Hefen C. albicans und C. glabrata im Vergleich zu S. cerevisiae mehrere fast gleichberechtigte Aktivatoren dieser Stoffwechselwege besitzen. Das unterstreicht die Bedeutung, die diese Stoffwechselwege für diese Hefen haben.
Durch Beobachtungen individuell farbmarkierter Meisen und Kleiber an einer Futterstelle zwischen Sommer und Frühjahr konnte erstmals die Struktur gemischter Meisenschwärme und ihre Veränderung im Jahresverlauf systematisch analysiert werden. Nur im Winter bilden sich sehr kompakte Schwärme von durchschnittlich 27 Individuen, die sich schnell fortbewegen und nur zehn bis fünfzehn Minuten an der Futterstelle verweilen. Ihr Auftreten ist sowohl mit der Tageslänge als auch direkt mit der Temperatur korreliert. Eine Erniedrigung der Temperatur führt zu einem engeren Zusammenschluß der Individuen, vor allem auch verschiedener Arten. Dieses Verhalten ermöglicht eine effizientere Nahrungssuche, weil die Individuen von den Kenntnissen der übrigen Schwarmmitglieder über Nahrungsquellen profitieren und weil sie weniger Zeit zum Sichern aufwenden müssen. Die Schwarmgröße ist jedoch nicht temperaturabhängig. Sie wächst mit der Anzahl der Individuen, die an einem Tag die Futterstelle nutzen. Demnach erweitern die Individuen im Winter ihre Aktionsräume, vermutlich aufgrund des erhöhten Nahrungsbedarfs. Dadurch begegnen sich mehr Individuen bei der Nahrungssuche und bilden größere Schwärme. Die individuelle Zusammensetzung der Schwärme verändert sich dabei ständig. Es gibt keine Gruppen fester Zusammensetzung, die auch nur tage- oder stundenweise zusammen blieben. Während die Neigung der Individuen, sich anderen Meisen anzuschließen, im Winter sehr stark ist, spielen individuelle Bindungen für die Schwarmbildung offensichtlich keine Rolle. Dieser offenen Struktur der Schwärme entsprechend, wurde bei der Kohlmeise, die den größten Anteil an den gemischten Schwärmen hatte, nur eine schwach entwickelte, nicht strikt lineare Rangordnung gefunden. Lediglich das Männchen, in dessen Brutrevier die Futterstelle lag, war allen anderen Individuen eindeutig überlegen. Territorialität beeinflußte bei Männchen und Weibchen die Aggressivität. Männchen sind aggressiver als Weibchen, jedoch nicht immer dominanter, das Alter spielt für die Dominanz keine Rolle. Männchen sind um so dominanter, je schwerer sie sind. Männchen, die bis Ende Juli im Gebiet eintreffen oder im Vorjahr schon ansässig waren, sind dominanter als Männchen, die erst ab Oktober eintreffen. Bei jungen Männchen wird die Dominanz hauptsächlich von der Aggressivität bestimmt. Die einzige nachweisbare individuelle Bindung bei Kohlmeisen in Winterschwärmen ist die Paarbindung, die im Gegensatz zu bisherigen Vermutungen bereits ab Oktober besteht. Die Wahl von Freßkumpanen ist dennoch nicht völlig beliebig. Männchen meiden einander, und Weibchen ziehen andere Weibchen als Freßkumpaninnen vor, weil sie von Männchen vom Futter verdrängt werden könnten. Bei einander bereits bekannten Brutvögeln ist dies jedoch nicht festzustellen. Männchen, die sich gegenseitig einschätzen können, meiden einander nicht grundsätzlich. Auch verpaarte Weibchen meiden bekannte Männchen nicht. Sie profitieren vielleicht auch vom Status ihres Männchens. Sowohl die schwach ausgeprägte Rangordnung als auch das Fehlen individuell aneinander gebundener Gruppen bei Kohlmeisen widerspricht der einzigen systematischen Freilanduntersuchung zur Sozialstruktur der Kohlmeise, die in einer Population der japanischen Unterart P. m. minor feste Gruppen konstanter Zusammensetzung fand. Ein selektiver Vorteil von Gruppen konstanter Zusammensetzung ist nicht zu erkennen, da keine gemeinsamen Territorien verteidigt werden und sich Individuen verschiedener Gruppen frei mischen. Die zwischenartliche Dominanzstruktur in den gemischten Schwärmen war eindeutig. Kleiber, die sich einzeln oder paarweise Meisenschwärmen anschließen, dominieren alle Meisenarten, Kohlmeisen dominieren Blau- und Sumpfmeisen. Letztere sind allen anderen Arten unterlegen. Dementsprechend bevorzugen Sumpf- und Blaumeisen Artgenossen als Freßkumpane. Kohlmeisen ziehen jedoch die schwächeren Blaumeisen ihren eigenen Artgenossen vor. Dominante Arten profitieren von der gemeinsamen Nahrungssuche mit untergeordneten Arten, weil sich die Nahrungskonkurrenz, die mit der Schwarmbildung immer verbunden ist, auf sie weniger negativ auswirkt. Als schwächste Art bleiben die Sumpfmeisen innerhalb gemischter Schwärmen meist deutlich unter sich und mischen sich nur im Winter stärker mit anderen Arten. Durch den erhöhten Nahrungsbedarf und die stark herabgesetzte Aggressivität der Individuen in dieser Zeit übersteigt dann der Vorteil großer Schwärme für die Nahrungssuche den Nachteil der Konkurrenz auch für unterlegene Individuen.
The objective of this study is the avifauna of the North American Green River Formation. Five new Green River bird species as well as several new specimens of already known species are described. * Galliformes: Gallinuloides wyomingensis EASTMAN 1900 A second specimen of the galliform Gallinuloides wyomingensis could be identified. Gallinuloides wyomingensis resembles closely Paraortygoides MAYR 1999, which is known from Messel and the London Clay. The new specimen exhibits characters such as a cup-like cotyla scapularis of the coracoid that clearly indicate that Gallinuloides is a stem-group representative of galliforms. * Eurypygidae: Eoeurypyga olsoni gen. et sp. nov. Eoeurypyga is the only fossil representative of the Eurypygidae. Eoeurypyga and the modern sunbittern Eurypyga helias share the typical long bill, the caudally situated neck and the elongated vertebrae cervicales. Additional synapomorph characters were found. The new species indicates a North American origin for the Eurypygidae. * Messelornithidae: Messelornis nearctica HESSE 1992 The original description of Messelornis nearctica was based on a single specimen. Ten new specimens, described in this study, reveal additional information. Messelornis nearctica shows the same large intraspecific size range as Messelornis cristata HESSE 1988 from Messel, the type species of the genus. * Apodidae: Wyomingcypselus pohli gen. nov. sp. nov. Wyomingcypselus pohli is the first described fossil apodiform bird for North American. Due to characters of the wing, especially the position of the processus musculi extensor metacarpi radialis, Wyomingcypselus is referrred to the Apodidae. * Trogoniformes: unnamed species The Green River birds include a poorly preserved, but apparently heterodactyl specimen, which also resembles trogons in overall appearance. * Primobucconidae: Primobucco mcgrewi BRODKORB 1970 Originally, Primobucco mcgrewi was only known from a partial skeleton consisting of the right wing. Three new specimens could be referred to the species. Primobucco mcgrewi clearly exhibits an anisodactyl foot, which makes the assignment to the zygodactyl Bucconidae highly doubtful. Instead, Primobucco mcgrewi is referrred to the Coraciiformes s.s. Thus, Primobucconidae are the first New World representatives of stem-group Coraciiformes. * ?Leptosomidae: Plesiocathartes wyomingensis sp. nov. and Plesiocathartes major sp. nov. Plesiocathartes wyomingensis and Plesiocathartes major represent the first North American record for the genus. Both species exhibit the diagnostic characters for the Leptosomidae as listed by MAYR (2002a, b). * Primoscenidae: Eozygodactylus americanus gen. et sp. nov. and unnamed species Eozygodactylus americanus is the first North American member of this taxon. Both Eozygodactylus americanus and the unnamed species show the zygodactyl foot and the large processus intermetacarpalis of the carpometacarpus, which are typical for Primoscendiae. Due to differences mainly of the humerus, it was placed in a new genus. Besides the descriptionof new species, the avifauna of the Green River Formatin was studied and compared with the avifauna of Messel. The formations show a high concordance, more than 60 % of the Green River taxa also occur in Messel. Such a high concordance is also found for mammals. This is due to the existence of two landbridges, the Thule landbridge and the de Geer landbridge, between Europe and North America during the early Eocene.
Shrew-1 wurde bei der Suche invasivitätsassoziierter Gene mittels eines DDRT-PCR-Ansatzes aus invasiven Zellen isoliert. Wie computergestützte Analysen der Sequenz ergaben, wies das bis dahin unbekannte Protein keinerlei Ähnlichkeiten mit bereits bekannten Proteinen auf und homologe Proteine wurden bisher nur in Vertebraten gefunden. Expressionsanalysen mit einem GFP-markierten shrew-1 zeigten, dass es an der basolateralen Plasmamembran lokalisiert, wo es mit dem E-Cadherin vermittelten Adhäsions-Komplex kolokalisiert. Eine Integration in diesen Komplex geschieht höchstwahrscheinlich durch direkte Interaktion mit β-Catenin. Ein weiteres Molekül das als potenzieller Interaktionspartner von shrew-1 identifiziert wurde und das in der Literatur oft als Tumorsuppressor diskutiert wird, ist Caveolin-1. Ferner konnten Überexpressionexperimente bereits zeigen, dass shrew-1 die Invasivität von HT1080-Zellen erhöhen kann. Das Ziel dieser Arbeit war es, zum einen mit Hilfe des Hefe-Split-Ubiquitin-Systems eine Interaktion von shrew-1 und Caveolin-1 zu bestätigen und zum anderen neue Interaktionspartner zu identifizieren, die helfen könnten, die Rolle von shrew-1 in invasiven Vorgängen zu erklären. Um eine mögliche Verbindung von shrew-1 und einem neuen Interaktionspartner in Bezug auf die Zellinvasivität zu untersuchen, sollten sowohl shrew-1 als auch der potenzielle Interaktionspartner mittels RNAi ausgeschaltet werden. Mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems war es möglich, die Interaktion zwischen shrew-1 und caveolin-1 zu bestätigen und zu zeigen, dass diese durch die zytoplasmatische Domäne von shrew-1 vermittelt wird. Weiterhin konnte CD147 als neuer Interaktionpartner identifiziert werden. Eine Interaktion beider Proteine konnte ferner mit Hilfe des Bimolekularen-Fluoreszens-Komplementations-Systems (BIFC), des Fluoreszens-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) und Coimmunoprezipitationen bestätigt werden. Die Interaktion von shrew-1 und CD147 scheint allerdings abhängig vom zellulären Kontext zu sein, wie die FRET-Analysen vermuten lassen. So konnte nämlich mit diesen Analysen eine starke Interaktion in MCF7-Zellen gezeigt werden, wohingegen die Interaktion in MDCK-Zellen schwächer war. Einer der auffälligsten Unterschiede dieser beiden Zelllinien im Bezug auf diese Interaktion könnte sein, dass MCF7-Zellen im Gegensatz zu MDCK-Zellen kein Caveolin-1 exprimieren. Caveolin-1 konnte seinerseits als Interaktionspartner von shrew-1 mit Hilfe des Hefe-Split-Ubiquitin-Systems bestätigt werden und andererseits wurde von einer anderen Arbeitsgruppe eine Interaktion von CD147 mit Caveolin-1 publiziert. Um dies näher zu untersuchen, wurde Caveolin-1 in MCF7-Zellen exprimiert und die FRET-Analysen in diesen wiederholt. Wie vermutet kam es zu einer Reduktion der Interaktion in Caveolin-1 exprimierenden MCF7-Zellen. CD147 ist neben vielen anderen Funktionen auch maßgeblich an der Regulation von Matrix-Metalloproteinasen beteiligt und kann somit die Invasivität von Zellen beeinflussen. Um einen Einfluß von shrew-1 und CD147 auf die Invasivität zu untersuchen, wurden beide Proteine mittels RNAi in HeLa-Zellen ausgeschaltet. Nachdem ein negativer Einfluss dieses Ansatzes auf das Proliferationsverhalten der Zellen ausgeschlossen werden konnte, wurde ein möglicher Effekt auf die Invasivität der Zellen untersucht. Durch die Analyse in Matrigel-Invasionsassays konnte gezeigt werden, dass das unabhängige Ausschalten beider Proteine die Invasivität der Zellen auf 35-55% im Vergleich zu Kontrollzellen reduziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern die Annahme, dass shrew-1 eine Rolle bei invasiven Vorgängen spielt und weisen darauf hin, dass dies möglicherweise durch eine Interaktion mit CD147 geschieht. Die Interaktion mit CD147 und damit eine mögliche Funktion von shrew-1 bei invasiven Vorgängen scheinen dabei abhängig vom zellulären Kontext zu sein.
Die halophilen Archaea Haloferax volcanii und Halobacterium salinarum haben sich aufgrund ihrer metabolischen Vielseitigkeit und der Verfügbarkeit vieler molekulargenetischer und biochemischer Techniken zu archaealen Modellorganismen für die Untersuchung zellulärer Prozesse entwickelt. In den vergangenen Jahren wurden eine Vielzahl prokaryaler Genome sequenziert, es zeigte sich jedoch, dass ca. 30% aller Gene keine Funktion zugeordnet werden kann. Die funktionelle Genomforschung zielt darauf, durch parallele genomweite Untersuchung der Genexpression die Funktion der Transkripte bzw. der Proteine aufzuklären. In der vorliegenden Arbeit wurden für beide halophilen Archaea genomweite Genexpressionsanalysen unter Verwendung der DNA-Mikroarray- Technologie etabliert. Aufgrund der derzeit nicht vorhandenen Genomsequenz wurde für die Untersuchung der Genexpression von H. volcanii der erste und bisher einzig beschriebene genomweite shotgun-DNA-Mikroarray konstruiert. Dazu wurde zunächst eine Genombibliothek mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 1,5 kb hergestellt. Die Genombibliothek wurde anschließend in eine PCR-Produkt-Bibliothek umgewandelt, die dazu genutzt wurde, in einem hochdichten Raster zwei DNA-Mikroarrays herzustellen, einen 960-Sonden DNA-Mikroarray zur Etablierung und Optimierung der Methode und einen 2880-Sonden DNA-Mikroarray, der einer einfachen Genomabdeckung entspricht. Für den Vergleich der Genexpression nach einer Änderung der Kohlenstoffquelle wurden Zellen von H. volcanii einem Wechsel von Wachstum mit Aminosäuren zu Wachstum mit Glukose als alleiniger Kohlenstoff-Quelle unterzogen. Die Transkriptomänderungen vom Wechsel der Kohlenstoff-Quelle bis zum erneuten Beginn des exponentiellen Wachstums wurden zu fünf Zeitpunkten mit dem 2880-Sonden DNA-Mikroarray analysiert. Es wurden fünf verschiedene Klassen kinetisch gleichregulierter Gene gefunden, die entweder induziert, reprimiert oder transient induziert waren. Insgesamt wurden ca. 10% aller Gene zu mindestens einem Zeitpunkt mehr als 2,5 fach reguliert. Für Gene aller fünf Klassen wurden die Ergebnisse durch Northern-Analysen verifiziert. Die Identität der regulierten Gene wurde durch Sequenzierung der PCR-Produkte von beiden Enden ermittelt. Es wurde ein breites Spektrum an Genen identifiziert, deren Genprodukte für unterschiedliche funktionelle Kategorien wie Stoffwechselenzyme, ABC-Transporter, regulatorische Proteine und hypothetische Proteine usw. kodieren. Viele gleichregulierte Gene kodieren für Proteine gemeinsamer Funktion. Erwartete wie auch unerwartete Ergebnisse erlaubten Vorhersagen über den zentralen Metabolismus, die Transportkapazität und der zellulären Organisation bei Wachstum von H. volcanii auf Aminosäuren bzw. Glukose. Die Mikroarray-Analysen stehen im Einklang mit der Wachstumsrate und dem Ribosomengehalt von H. volcanii bei Wachstum auf den alternativen Kohlenstoffquellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein shotgun-DNA-Mikroarray mit einfacher Genomabdeckung die Charakterisierung der Regulation metabolischer Prozesse sowie die funktionelle Charakterisierung von Proteinen bzw. Proteinkomplexen erlaubt. Für Halobacterium salinarum, dessen Genomsequenz bekannt ist, wurde ein genomweiter genspezifischer DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurde jeder ORF des Genoms unter Verwendung von ORF-spezifischen Oligonukleotiden mittels PCR amplifiziert. Zur Etablierung dieses Systems wurden zunächst mit einem 200-Sonden DNA-Mikroarray exemplarisch Genexpressionsanalysen für zwei verschiedene Wachstumsbedingungen durchgeführt. Bei anaeroben Wachstum von H. salinarum durch fermentativen Argininabbau wurden im Vergleich zu aeroben Wachstum die für die Argininfermentation essentiellen Gene induziert. Dagegen wurden charakteristische Gene des aeroben Stoffwechsels reprimiert. Zur Untersuchung des Zellzyklusses von H. salinarum wurde der genomweite genspezifische DNAMikroarray verwendet. Um erstmals genomweit die zellzyklusspezifische Genexpression eines Archaeons zu analysieren, wurden Zellen von H. salinarum durch eine reversible Zellzyklusblockade mit Aphidicolin, einem DNA-Polymerase Inhibitor, synchronisiert. Vorläufige Transkriptomstudien mit einer synchron wachsenden H. salinarum-Kultur deuten an, dass die Transkription der Mehrzahl der Gene im Verlauf des Zellzyklusses nicht reguliert wird. Die Untersuchungen dieser Arbeit bilden die Grundlage für genomweite funktionelle Charakterisierungen haloarchaealer Genexpression und Regulationsprozesse.
Optischer Raumsinn
(1913)
On the molecular basis of novel anti-inflammatory compounds and functional leukocyte responses
(2006)
Inflammation is a complex pathophysiological event that can be triggered by activation of a number of distinct activation pathways eventually leading to the release of pro-inflammatory molecules and enzymes. Among all cells involved in inflammatory processes, neutrophils, monocytes and platelets are of major relevance. Activation of leukocytes occurs via binding of agonists to distinct GPCRs leading to activation of G proteins and proximate signaling cascades. In short, GPCR activation by pro-inflammatory agonists such as fMLP, PAF or LTB4 leads to activation of G proteins that are associated with the receptor at the cytosolic side of the plasma membrane. G proteins consist of a Gα- and a Gβγ-subunit which are associated in the inactive state. In this state, G proteins bind GDP. Upon activation, GDP is replaced by GTP that results in the dissociation of the Gα- from the Gβγ-subunit. Both subunits are capable of activating distinct PLC-β isoenzymes that catalyze the turnover of PtdIns(4,5)P2 into the second messengers Ins(1,4,5)P3 and DAG. Every GPCR holds a distinct pattern of associated G proteins which preferentially activate distinct PLC-β isoenzymes. Ca2+ channels within the SR/ER-membrane function as specific receptors for Ins(1,4,5)P3. Ligation of Ins(1,4,5)P3 to this receptor causes a release of Ca2+ from intracellular stores into the cytosol that is subsequently followed by the influx of Ca2+ e through channels in the plasma membrane. Ca2+ represents an important signaling molecule, involved in the regulation of cellular processes and enzymes that mediate inflammatory events such as ROS formation and the release of degradative enzymes. 5-LO and COXs are involved in the biosynthesis of pro-inflammatory eicosanoids and catalyze the turnover of AA into LTs and PGs, respectively. Both enzymes play pivotal roles in the initiation and maintenance of allergic diseases and inflammatory processes. LTB4 is regarded as a potent chemotactic and chemokinetic substance, whereas the cysteinyl-LTs cause smooth muscle contraction and increased vascular permeability. Therefore, 5-LO inhibitors are assumed to possess therapeutic potential for the treatment of diseases related to inflammation. Besides the intervention with 5-LO activity, inhibition of COX-activity is an effective way to suppress inflammatory reactions. The two COX isoenzymes, namely COX-1 and COX-2 show different patterns in terms of tissue expression and sensitivity towards inhibitors. COX-1 is supposed to be constantly expressed whereas COX-2 expression is upregulated at sites of inflammation. The extract of H. perforatum is commonly used for the treatment of mild to moderate depressive disorders, accompanied by a moderate profile of side effects. The extract´s efficacy as an antidepressant can be traced back to the content of the phloroglucinol hyperforin which represents the most abundant lipophilic constituent. However, in folk medicine hypericum extracts are additionally used for the treatment of inflammatory disorders such as rheumatoid arthritis or inflammatory skin diseases. In fact, it was shown that hypericum extracts and hyperforin possess anti-inflammatory potential. Hyperforin was described as a dual inhibitor of 5-LO and COX-1. The phloroglucinols MC and S-MC from M. communis significantly differ from the molecular structure of hyperforin. Hyperforin represents a monomeric prenylated derivative whereas MS and S-MC are non-prenylated oligomeric compounds. To date, the anti-inflammatory potential of SM and S-MC has not been investigated in detail. So far, solely antioxidant activity was attributed to MC and S-MC that indeed might qualify them as anti-inflammatory drugs. The phloroglucinols MC, S-MC and hyperforin are potent inhibitors of ROS formation and HLE release. However, any inhibitory potential of these compounds was only observed when cells were activated by GPCR agonists such as fMLP or PAF. In contrast, when cells were stimulated under circumvention of G protein-associated signaling cascades, the abovementioned inhibitors were not effective at all. In leukocytes, [Ca2+]i plays a pivotal role in signal transduction and regulation of the indicated pro-inflammatory cellular functions. We were able to show that MC, S-MC and hyperforin inhibited GPCR-mediated Ca2+ mobilization with approximately the same potency as the above-mentioned leukocyte responses. However, all of the indicated phloroglucinols were ineffective when cells were stimulated with ionomycin. Since ionomycin as well as GPCR agonists exert their effects by mobilizing Ca2+ i, it seems conceivable that MC, S-MC and hyperforin somehow interfere with G protein-associated signaling pathways. In order to investigate PLC as a potential target of hyperforin, the effects of hyperforin were compared to those of the broad spectrum PLC inhibitor U-73122. We found that both inhibitors acted in a comparable manner in terms of agonist-induced Ca2+ mobilization and in regard of the manipulation of basal Ca2+ levels in unstimulated cells. In this respect, significant differences between hyperforin and U-73122 were obvious for inhibition of total PLC activity in vitro. Thus, U-73122 blocked PLC activity whereas hyperforin was ineffective in this respect. This might indicate that only certain PLC isoenzymes are affected by hyperforin. Alternatively, other components within G protein-associated signaling pathways such as G proteins itself or the Ins(1,4,5)P3 receptor must be taken into account as putative targets of hyperforin. We were able to introduce MC and S-MC as novel dual inhibitors of 5-LO and COX-1. Interestingly, such a pattern was also described for hyperforin. MC and S-MC turned out to be direct inhibitors of 5-LO, based on the fact that they inhibit 5-LO not only in intact cells but also as purified enzyme in vitro. For MC and S-MC, great discrepancies were observed between the IC50 values concerning 5-LO inhibition and the concentrations that exert the antioxidative effects. It seems probable that 5-LO inhibition is not related to reduction of the active site iron as a result of the antioxidant activity of MC and S-MC but rather to direct interference with the 5-LO enzyme. The capability of MC and S-MC to suppress COX-1 activity seems not to be a unique effect of these phloroglucinols because for COX-1, the IBPC, present in both MC and S-MC, turned out to be the most active compound. ....
ATP ist ein weit verbreitetes Signalmolekül im ZNS. Seine Hauptfunktionen betreffen die präsynaptische Modulation der Transmitterfreisetzung und die schnelle exzitatorische Transmission. Die Aktivierung ionotroper P2X-Rezeptoren durch ATP beinhaltet den Einstrom von Kalzium in die Zelle. Unter pathologischen Bedingungen, wie bei Epilepsie oder Ischämie, ist die ATP-Freisetzung erhöht und könnte einen neuronalen Zelltod induzieren. Eine anhaltender Aktivierung von NMDA-Rezeptoren und der dadurch erhöhte Einstrom von Kalzium in die Zelle stellt dabei den primären Effektor der Neurotoxizität dar. Dieses, als Exzitotoxizität bezeichnete Phänomen, ist an vielen neurologischen Krankheiten beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von ATP und anderen Purin- und Pyrimidin-Nukleotiden und von Adenosin auf die Überlebensrate von Neuronen bei induzierter Toxizität in hippokampalen Primärkulturen untersucht. Neurotoxizität wurde durch die Applikation der Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA (30 μM) oder Kainat (300 μM) und durch Applikation von KCl (30 mM) induziert. Purin- und Pyrimidin-Nukleotide wurden in verschiedenen Konzentrationen von 10 μM – 1000 μM koappliziert. Nach 24 Stunden wurde die Überlebensrate der Neurone mit der Methode des Neuronen-spezifischen zellulären ELISA quantifiziert. Applikation von NMDA reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 56 ± 3%. Der NMDARezeptor-Antagonist MK-801 verhinderte die NMDA-induzierte Toxizität. Die Koapplikation von ATP (0,01-1 mM) schwächte die zytotoxischen Wirkung von NMDA konzentrationsabhängig ab. Die Purine ITP und GTP zeigten ebenfalls eine protektive Wirkung und reduzierten die NMDA-induzierte Toxizität, wohingegen die Pyrimidin-Nukleotide UTP und CTP keinen protektive Wirkung zeigten. Weitere getestete P2-Rezeptor-Agonisten, wie ADP, AMP, Adenosin, α,β-meATP, 2MeSATP, das Dinukleotid Ap4A, α,β-meADP und BenzoylATP waren unwirksam. Der P2-Rezeptor-Antagonist Reactive Blue 2 (100 μM) inhibierte die Wirkung von ATP. Suramin und PPADS (100 μM) verhinderten die protektive Wirkung von ATP nicht. Applikation von Kainat reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 37 ± 0,3%. Der Antagonist CNQX (100 μM) verhinderte die Kainat-induzierte Toxizität. Weder ATP noch GTP zeigten eine protektive Wirkung nach Kainat-induzierter Toxizität. Dies steht im Gegensatz zu ihrer protektiven Wirkung nach NMDA-vermittelter Toxizität. Applikation von KCl reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 61 ± 4%. Die Purin- und Pyrimidin-Nukleotide (1 mM) zeigten bei K+-Depolarisation ein völlig anderes Wirkungsspektrum als bei Applikation von NMDA: GTP > ITP > ATP > ADP > CTP > α,β-meATP > UTP > AMP. 2MeSATP, α,β-meADP, Ap4A, BenzoylATP und Adenosin veränderten die Überlebensrate der Zellen nach KCl-induzierter Toxizität nicht. Weder Suramin noch PPADS (100 μM) inhibierten die protektive Wirkung von ATP. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die protektive Wirkung von ATP, GTP und ITP weder P2- noch Adenosin-Rezeptor-vermittelt war. Zudem schienen sie spezifisch für eine NMDARezeptor-vermittelte Toxizität, da ATP und GTP nach Kainat-Applikation keine Wirkung erzielten und die alleinige Applikation der verwendeten P2-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten (Kontrollen) keine Wirkung auf das Überleben von Neuronen hatte. Deshalb wurde eine direkte Inhibition des NMDA-Rezeptors durch ATP postuliert. In einer Kooperationsarbeit führte Dr. Bodo Laube vom Max-Planck-Institut für Hirnforschung in Frankfurt am Main elektrophysiologische Messungen an Oozyten und hippokampalen Neuronen zur Bestätigung dieser Hypothese durch. ATP inhibierte in Oozyten NMDA-induzierte Einwärtsströme kompetitiv durch Bindung an die NR2B-Rezeptor-Untereinheit. ITP, GTP, AMP waren an dieser rekombinanten NR1/NR2BRezeptorkombination ebenso effektiv, wohingegen UTP, CTP, ADP und Adenosin nur schwache inhibitorische Wirkungen zeigten. In kultivierten hippokampalen Neuronen inhibierte ATP auch NMDA-induzierte Ströme, nicht jedoch Kainat-induzierte Ströme. Die Expression der beiden NMDA-Rezeptor-Untereinheiten NR1 und NR2B wurde durch immunzytochemische Untersuchungen in den hippokampalen Neuronen bestätigt. Die Resultate zeigten, daß ATP direkt NMDA-Rezeptoren mit einer bestimmten Untereinheitenzusammensetzung inhibierten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, daß ATP und andere Purinund Pyrimidin-Nukleotide durch Inhibition des NMDA-Rezeptors neuroprotektive Wirkungen vermitteln können. Dies ist eine neue Funktion von ATP zu der bereits beschriebenen direkten Aktivierung von postsynaptischen P2X-Rezeptoren und zu seiner Rolle als eine extrazelluläre Quelle des synaptischen Modulators Adenosin an glutamatergen Synapsen.
Das Y-Chromosom war, mit Ausnahme der Pseudoautosomalen Regionen, während der Genomevolution einer enormen Veränderung unterworfen, die zu einem weitesgehenden Verlust oder der Inaktivierung von Genen führte, die nicht in den Prozess der Geschlechtsdetermination bzw. –differenzierung, oder Spermatogenese involviert sind. Gleichzeitig kam es durch Amplifikation von funktionellen Kopien der Spermatogenesespezifischen Genen zu sog. amplifikonischen Genfamilien, die fast ausschliesslich im Testis exprimiert werden. TSPY (Testis Specific Protein Y-encoded) ist nach bisherigen Untersuchungen mit 35 Kopien, bestehend aus funktionellen Kopien und inaktiven Pseudogenen, die grösste und homogenste Protein-kodierende amplikonische Genfamilie auf dem Y-Chromosom und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer analysiert. Es wird unter normalen Bedingungen in den Spermatogonien des Testis exprimiert, aber es ist auch eine aberrante Expression in malignen Geweben, wie Gonadoblastom, Carcinoma in situ (CIS) des Testis oder in einer Fraktion von Prostatakarzinomen detektierbar. Aufgrund der Expression und der korrelierten Kopplungsanalyse wurde postuliert, dass es sich bei TSPY um ein Kandidatengen für den sog. Gonadoblastom-Locus auf dem Y-Chromosom (GBY) handelt. TSPY gehört ausserdem aufgrund einer evolutionär konservierten Domäne zur Familie der SET/NAP-Proteine. Andere Mitglieder dieser Familie sind z.B. in Proliferation, Zell-Zyklus-Regulation, Chromatin-Umbau und Kerntransport involviert. Durch die Analyse der TSPY-Transkription konnte anhand des LNCaP-Zellkultursystems die postulierte Androgen-abhängige TSPY-Transkription widerlegt werden. Zusätzlich wurden zwei TSPY-Transkripte unterschiedlicher Grösse und Transkriptionsraten detektiert, wobei das grössere Transkript TSPY-S stärker exprimiert wird als das kleinere Transkript TSPY-L. Ursache hierfür ist alternatives Splicing in Intron 4 des TSPY-Gens, das zur Expression der beiden Protein-Varianten mit unterschiedlichen C-Termini führt. Die durchgeführte Haplotyp-Analyse zur Identifizierung transkribierter TSPY-Gene konnte aufzeigen, dass das einzige funktionelle Gen des sog. TSPY minor Clusters (mit dem Haplotyp G-G-18) als einziges nicht alternativ gespliced wird und andererseits das häufigste TSPY-S Transkript (44 %) darstellt. Hierfür wird die Möglichkeit einer „locus-control-region“ diskutiert. Um Interaktionspartner von TSPY-S zu identifizieren und dadurch möglicherweise Hinweise auf die Funktion von TSPY zu erhalten, wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System eingesetzt. Vorversuche lokalisierten eine mögliche Transkriptions-Aktivierungsdomäne im N-Terminus von TSPY, weshalb eine N-terminale Deletion von TSPY-S, die einen grossen Teil der NAP Domäne und den C-Terminus enthält, als Köder eingesetzt wurde, um eine Testis-cDNABibliothek nach interagierenden Proteinen zu durchsuchen. Die Interaktion von TSPY mit den drei interessantesten Kandidaten hTid-1, dem menschlichen Homolog eines Tumor-Suppressor-Gens aus Drosophila, einem Mitglied der Ubiquitin-like-Proteinfamilie Ubiquilin 3 (UBQLN3), das aufgrund der Protein-Struktur eine Funktion bei der Regulation des Zellzyklus haben könnte und Isopetidase T (USP5), einer Ubiquitin-spezifische Protease, die an der proteasomalen Protein-Degradation beteiligt ist wurde durch Co-Transformation verifiziert und genauer analysiert. Immunhistochemische Experimente bestätigten die ausschliessliche zelluläre Lokalisation von TSPY in den Spermatogonien. Es konnten jedoch leichte entwicklungsspezifische Unterschiede gezeigt werden. In post-pubertärem und adulten Testis-Gewebe wird TSPY im Kern und Cytoplasma der mitotischen Spermatogonien exprimiert, aber in einem sehr grossen Anteil der ruhenden Spermatogonien im früh-kindlichen Testis (6 Monate) fehlt ein Kernsignal. Expression der EGFP (enhanced green fluorescent protein) -markierten Wildtyp cDNAs von TSPY-S und –L in HEK-293 Zellen bestätigte eine Protein-Lokalisation in Cytoplasma und Kern. Gezielte Deletion des C-Terminus der EGFP-TSPY-Fusionsproteine führte zur Degradation der Proteine, was die Bedeutung des variablen C-Terminus hervorhebt. Selektive Mutation einer mit den Computer vorhergesagten und durch einen Phosphorylierungs-Assay experimentell bestätigten CK2-Phosphorylierungs-Stelle im C-Terminus von TSPY-S verhinderte die Kern-Lokalisation, was darauf hindeutete, dass die C-terminale Phosphorylierung für die Lokalisation im Zellkern notwendig ist. Für TSPY-L konnte dieses Muster nicht bestätigt werden, da Mutationen im direkten C-Terminus von TSPY-L zur Protein-Degradation führten. Aufgrund der Datenlage wurde die Arbeitshypothese aufgestellt, dass TSPY im Cytoplasma durch CK2 phosphoryliert und in den Zellkern transportiert wird. Nach Androgen-Stimulus und Signal-Transduktion kommt es zur Kern-Lokalisation von CK2 und dadurch zur verstärkten Phosphorylierung von TSPY im Kern. Dort führt die Interaktion von TSPY mit den einzelnen identifizierten Proteinen zur Regulation des Zellzyklus und der mitotischen Proliferation der Spermatogonien, aber auch zur pathologischen Funktion von TSPY bei der Entstehung von Keimzelltumoren. Diese Arbeitshypothese müsste überprüft und verbessert werden, um die Funktion von TSPY bei der Proliferation der Spermatogonien und der Krebsentstehung aufzuklären.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.
The heat stress response is characterized by the presence of heat stress transcription factors (Hsfs) which mediate transcription of heat stress genes. In tomato (Lycopersicon peruvianum) cell cultures the simultaneous expression of four Hsfs, which are either constitutively (HsfA1 and HsfA3) or heat-stress inducible (HsfA2 and HsfB1) expressed, results in a complex network with dynamically changing cellular levels, intracellular localization and functional interactions. In order to examine the relevance of their multiplicity as well as to get more insights into the complexity of the plant heat stress response, the individual tomato Hsfs were investigated with respect to their protein interactions in vitro and in vivo. To this aim, I used pull-down assays as well as yeast assays to study the following aspects: 1. Oligomeric state of Hsfs: the results show that all class A Hsfs (HsfA1, HsfA2 and HsfA3) are trimeric proteins and interact with each other via the oligomerization (HR-A/B) domain. The similarity of their HRA/B regions allows formation of homo- and heterooligomeric complexes between all class A Hsfs. This special property was investigated by mutational studies with HsfA2 indicating that the linker and the HR-B regions are the minimal part required for Hsf/Hsf interactions. The conserved hydrophobic amino acid residues of the HR-B region are most important whereas the amino acid residues of the linker may provide higher flexibility to the HR-B region. Another investigated factor was HsfB1. HsfB1 is a member of class B Hsfs, which are characterized by an oligomerization domain without the 21 amino acid residues linker inserted between the HR-A and HR-B regions. It has a low activator potential and exists exclusively as dimer. HsfB1 can not physically interact with class A Hsfs. However, HsfB1 and HsfA1, binding to adjacent HSE sites, are assumed to cause strong synergistic effects in gene activation. 2. Potential HsfB1 interacting proteins: we searched for HsfB1 interacting proteins by using recombinant His-tagged proteins with HsfB1 as baits in pull-down assays. Histones H2A, H2B and H4 were identified by means of Peptide Mass Finger Printing and N-terminal sequencing analyses. The three histones represent the major proteins in tomato whole cell extracts retrieved by HsfB1. 3. HsfA2/small heat stress proteins (sHsps) interaction: pull-down and yeast two-hybrid assays were used to study the specific interaction of HsfA2 with tomato class II sHsp. This interaction occurs via the oligomerization domain of HsfA2. Other members of the plant Hsp20 family, including class I sHsp, do not interact with HsfA2. Heterooligomers of HsfA2 with class II sHsp may represent precursor forms of the plant higher molecular weight cytoplasmic complexes of heat stress granules, which form during heat stress. The findings presented in this thesis are a contribution to support the concept of a Hsfs network via protein-protein interactions. These data, together with information obtained from other studies, are used to propose a tentative model of the complex Hsfs network controlling the plant heat stress response.
Ein transgenes Mausmodell zur Untersuchung der Zink-vermittelten Modulation des Glyzinrezeptors
(2002)
Zink (Zn2+) ist ein im Zentralnervensystem der Säuger weitverbreitetes Metallion, das in kleinen synaptischen Vesikeln hoch angereichert wird. Zink-reiche Vesikel sind besonders gut dokumentiert in exzitatorischen Synapsen, z.B. im Hippocampus, sie werden jedoch auch in inhibitorischen Synapsen von Neuronen des Rückenmarks oder der Retina gefunden. Nach exozytotischer Freisetzung dieser Vesikel in den synaptischen Spalt können Zink-Konzentrationen von bis zu zehn mikromolar erreicht werden. In vitro hat Zink modulatorische Effekte auf eine Vielzahl von Neurotransmitter-Rezeptoren, so u.a. auf Glutamat-Rezeptoren vom AMPA-, NMDA-, oder Kainat-Typ, aber auch auf GABAA- und Glyzinrezeptoren (GlyR). Zink wurde daher als endogener Neuromodulator vorgeschlagen. Der modulatorische Effekt von Zink auf den GlyR ist biphasisch: Niedrige mikromolare Konzentrationen bewirken eine Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme, höhere mikromolare Konzentrationen dagegen deren Inhibition. Dieser potenzierende Effekt von Zn2+ kann in transfizierten HEK 293 Zellen oder cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten durch eine Punktmutation im N-terminalen Bereich des α1-Polypeptids aufgehoben werden (D80A (Lynch et al., 1998), oder D80G (Laube et al., 2000)). Ein revers-genetischer Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit benutzt, um Rückschlüsse auf die physiologische Relevanz der Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme durch Zn2+ zu gewinnen: In einem „Knock-In“ Mausmodell wurde durch homologe Rekombination in ES-Zellen eine Mutation in der kodierenden Sequenz des GlyRα1-Genlocus eingeführt, die den o.g. AS Austausch (D80A) in der adulten ligandenbinden Untereinheit des GlyR bewirkt. Um die Veränderung des Genlocus zu minimieren war die als Selektionsmarker bei der Einführung der Mutation benötigte Neor-Kassette von zwei loxP-Sequenzen flankiert, und konnte so nach dem Nachweis des homologen Rekombinationsereignisses durch Wirkung der Cre-Rekombinase wieder entfernen werden. Nach Blastozysteninjektion homolog rekombinierter ES-Zellen zur Herstellung chimaerer Tiere und Keimbahntransmission der Mutation in einem Teil dieser Chimaeren konnten so Mauslinien mit zwei verschiedenen mutierten Allelen generiert werden: In zwei Linien wurde das intronisch miteingeführte Neor-Element bereits in ES-Zellen in vitro deletiert, wonach lediglich eine der loxP-Sequenzen verbleibt; in einer dritten Linie wurde der Selektionsmarker als intronische Insertion belassen. Während heterozygote Tiere aller drei Linien keinerlei offensichtliche Auffälligkeiten zeigen, findet sich bei homozygot-mutanten Tieren aller Linien ein mit der zweiten postnatalen Woche eintretender Phänotyp, dessen auffälligste Symptome eine verstärkte akustisch oder taktil induzierbare Schreckreaktion, ein erhöhter Muskeltonus, taktil induzierbarer Tremor und generalisierter Myoklonus sowie ein verlangsamtes Wiederaufrichten sind. Dieser Symtomkomplex ähnelt stark dem der spontanen Mutationen des GlyRs spasmodic, spastic oder oscillator und weist auf einen Verlust glyzinerger Inhibition als Ursache hin. Die verschiedenen Allele verursachen unterschiedlich starke Phänotypen: Das mutierte Allel, in welchem die Neor–Kassette deletiert ist, bewirkt einen schwachen Phänotyp, wohingegen das Verbleiben des intronischen Neor-Elements einen schwerwiegenderen Phänotyp zur Folge hat, und homozygote Tiere bis auf wenige Ausnahmen bis zur achten Lebenswoche sterben. Die Immunoblot-Analyse zeigt, daß bei homozygot mutanten Tieren dieser stärker betroffenen Linie ein partieller Verlust der Proteinexpression der GlyRα -Untereinheit auftritt. Dagegen ist in Tieren, in denen die Neor-Kassette deletiert ist, keine Verringerung der GlyRα-Expression durch Immunoblot nachweisbar. Der milde Phänotyp ist demnach am einfachsten durch den spezifischen pharmakologischen Effekt der Mutation, d. h. den Verlust der Zn2+-induzierten Potenzierung des GlyR, erklärbar. Hiermit wurde erstmals ein Hinweis daraufhin gewonnen, daß niedrige mikromolare Konzentrationen von Zn2+ für die physiologische Funktion des adulten GlyR notwendig sind. Darüberhinaus unterstreichen die Ergebnisse das Potential des GlyR als Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Muskel-relaxierender oder sedativer Substanzen, die - ähnlich der Wirkung von Zn2+ - einen potenzierenden Effekt auf die glyzinerge Inhibition haben.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
Die Chemoresistenz von Tumoren ist ein schwerwiegendes Problem in der Krebstherapie. Insbesondere das maligne Melanom gilt aufgrund seiner ausgeprägten Therapieresistenz als nahezu unheilbar. Ein erster Schritt zur Verbesserung der Chemotherapie von Tumoren ist das Verständnis von Mechanismen, die der Resistenz zugrunde liegen. Für die Aufklärung der Mechanismen ist die Molekularbiologie des chemoresistenten Phänotyps von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen im Transkriptionsmuster analysiert, die mit dem Erwerb von Chemoresistenz in Melanomzellinien einhergehen. Die Melanomzellinie MeWo wurde mit Abkömmlingen, die erworbene Resistenz gegen die DNA-schädigenden Agenzien Etoposid (MeWoEto1), Cisplatin (MeWoCis1) und Fotemustin (MeWoFote40) aufweisen, bezüglich ihres Transkriptionsmusters verglichen. Um zunächst eine möglichst große Anzahl von Genen in die Analyse einzubeziehen, wurden initiale Genexpressionsanalysen unter Verwendung des RZPD UniGene 1 Arrays durchgeführt. Dieses Array repräsentiert ca. 31.500 cDNA Sequenzen, die bei einer geschätzten Redundanz von 1,44 einer Anzahl von 21.875 verschiedenen Transkripten entsprechen. Geht man davon aus, dass der Mensch insgesamt über ca. 30.000 Gene verfügt, wurde durch die Verwendung dieses Arrays ein großer Teil aller humanen Gene untersucht. Unter definierten Selektionskriterien wurden 126 Gene ausgewählt, die als im chemoresistenten Phänotyp differentiell exprimiert angesehen wurden. Diese 126 Gene wurden mit 1.143 weiteren tumorassoziierten Genen für die Zusammenstellung und Produktion eines chemoresistenzspezifischen Kandidatengen-Arrays ausgewählt. In verifizierenden Analysen unter Verwendung des Kandidatengen-Arrays wurde eine differentielle Expression für 57 der initial selektierten Gene sowie für weitere 209 tumorassoziierte Gene festgestellt. Die in diesen Analysen angewandten Kriterien für die Definition differentieller Genexpression wurden in exemplarischen Northernblot-Analysen geprüft. Hier zeigte sich eine qualitative Übereinstimmung der Ergebnisse beider Methoden von 81,4%. Da zur Zeit noch keine Hochdurchsatz-Methoden für funktionelle Analysen zur Verfügung stehen, wurde versucht, den Kreis vielversprechender Kandidaten durch eine Integration von Ergebnissen anderer Experimente einzuengen. In Clusteranalysen zur Untersuchung von Verwandtschaftsgraden zwischen den resistenten Zellpopulationen zeigte die MeWoEto1-Zellinie eine vergleichsweise hohe Stabilität in ihrem Genexpressionsmuster über einen Zeitraum von ca. 2,5 Jahren, während MeWoCis1 und MeWoFote40 hier beträchtliche Schwankungen aufwiesen. Die Expressionsmuster der letzteren resistenten Linien zeigten zum spätesten analysierten Zeitpunkt Konvergenz, nachdem sie zunächst deutlich voneinander abwichen. Da die Wirkung sowohl von Cisplatin als auch von Fotemustin zur Bildung von DNA-Addukten führt, kann die Konvergenz als Ergebnis einer fortschreitenden Optimierung der Resistenz in beiden Linien gedeutet werden. Einzelne Gene wie z.B. PEPP2 und CRYAB, die konvergierend differentielle Expression zeigten, können demnach als vielversprechende Kandidaten für eine funktionelle Relevanz in der Resistenz gegen Cisplatin und Fotemustin betrachtet werden. Neben der Clusteranalyse wurden Ergebnisse von vergleichenden genomischen Hybridisierungen (CGH), der Untersuchung einer Deregulation von Kandidatengenen in mehreren der resistenten Linien oder nach Kurzzeitbehandlung von MeWo-Zellen mit den Zytostatika sowie Literaturdaten verwendet, um die Relevanz der differentiellen Expression für einzelne Gene zu validieren. Danach wurden unter anderen die apoptoserelevanten Gene CRYAB und STK17A sowie MPP1, AHCYL1, CYR61 und STMN3 als vielversprechende Kandidaten eingestuft. Ein weiteres bis dahin unbekanntes Gen aus der C2H2-Zinkfinger-Genfamilie, für das in initialen Analysen sowie in Northernblot und RT-PCR-Experimenten eine Überexpression in MeWoCis1 und MeWoEto1 nachgewiesen werden konnte, wurde bezüglich seiner mRNA-Sequenz vervollständigt und im Detail analysiert. Für dieses Gen konnte phänotyp- bzw. gewebespezifisches differentielles Spleissen sowie differentielle Polyadenylierung nachgewiesen werden. Das alternative Spleissen von Exon 3, dem aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zu bereits charakterisierten KRAB A Domänen die Funktion der transkriptionalen Repression zugewiesen werden kann, könnte für ein phänotypspezifisches Transkriptionsprogramm verantwortlich sein. Ausgehend von insgesamt 267 differentiell exprimierten Genen konnte der Kreis vielversprechender Kandidaten durch die Integration von Daten aus anderen Experimenten auf ca. 20 Gene eingeengt werden. Unmittelbar im Anschluss and die Dissertation werden diese Gene in funktionellen Analysen bezüglich ihrer Relevanz für den chemoresistenten Phänotyp analysiert.
Studies in particular of the last decade showed that active neurogenesis continuously takes place in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles of the adult rodent brain. Neurogenesis in the SVZ leads to migration of neuroblasts within the rostral migratory stream (RMS) and mature neuron formation mainly in the olfactory bulb (OB). According to present understanding, glial cells with astrocytic properties represent the actual adult neural stem cells. The cell types representing the various cellular transition states leading to the formation of mature neurons as well as the mechanisms controlling adult neurogenesis and neuroblast migration are poorly understood. A previous study from this laboratory demonstrated that the ATP-hydrolyzing enzyme nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2) is associated with type B cells, the presumptive neural stem cells. NTPDase2 is a protein of the plasma membrane with its catalytic site facing the extracellular space. It hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates to their respective nucleoside diphosphates. This raises the possibility that the signaling pathway via extracellular nucleotides is involved in the control of adult neurogenesis. Neurons as well as glial cells express several subtypes of receptors (P2 receptors) that are responsive to the nucleotides ATP, ADP, UTP, or UDP. P2X receptors are ATP-gated Na+, K+ and Ca2+ permeable ion channels, P2Y receptors are coupled to trimeric G-proteins. In order to probe for a functional role of nucleotides in adult neurogenesis, the present study referred to an in vitro system (neurospheres). Neurospheres produced from isolates of the mouse SVZ and cultured in the presence of EGF and bFGF expressed the neural stem cell marker nestin and also GFAP, S100β, NTPDase2 and tissue non-specific alkaline phosphatase. Neurospheres generated from the cells of the subventricular zone were multipotenital. This was revealed by immunostaining of differentiated cells with markers for astrocytes, neurons and oligodendrocytes. The presence of ecto-nucleotidase was verified by analyzing the free phosphate released from nucleotides. The tissue non-specific form of alkaline phosphatase was the predominant enzyme. Both NTPDase2 and TNAP could be identified by immunocytochemistry and Western blotting. Hydrolysis was not observed for p-nitrophenyl thymidine monophosphate, a substrate of members of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family (NPP1 to NPP3). Since ecto-nucleotidases control the availability of extracellular nucleotide agonists, neurospheres were studied for the potential expression and functional role of nucleotide receptors. Neurospheres responded to extracellular nucleotides with a transient rise in Ca2+ (ATP = ADP > UTP). The rise in Ca2+ was due to P2Y receptors. The Ca2+ response was unaltered in the absence of extracellular Ca2+ and strongly reduced by thapsigargin, a blocker of internal Ca2+ stores. The P2Y1 antagonist MRS2179 strongly reduced the ATP- or ADP-induced increase in Ca2+, suggesting the involvement of a P2Y1 receptor. In addition, suramin and PPADS, non-selective antagonists for P2 receptors, inhibited most of the Ca2+ response. The agonistic activity of UTP and the lack of response to UDP implied the additional presence of a P2Y2 and/or a P2Y4 receptors and the absence of a functional P2Y6 receptor. RT-PCR experiments demonstrated that neurospheres expressed P2Y1 and P2Y2 receptors but not P2Y4 receptor. That the majority of the Ca2+ response to ATP was mediated via P2Y1 receptors was also confirmed by analysis of P2Y1 knockout mice and by application of the P2Y1 receptor-specific antagonist MRS2179. In addition, agonists of P2Y1 and P2Y2 receptors and low concentrations of adenosine augmented cell proliferation inspite of the presence of mitogenic growth factors. Neurosphere cell proliferation was attenuated after application of MRS2179 and in neurospheres from P2Y1 receptor knockout mice. These results infer a nucleotide receptor-mediated synergism that augments growth factor-mediated cell proliferation. Taken together these results suggest that P2Y-mediated nucleotidergic signalling is involved in neurosphere function and possibly also in adult neurogenesis in situ.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation beleuchten neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort. Die Ergebnisse der experimentellen Arbeiten können erheblich die Planung und Durchführung zukünftiger Untersuchungen erleichtern, sowie das Verständnis der Regulation von Hitzestresstranskriptionsfaktoren als terminale Komponenten der zellulären Stressantwort verbessern. Zum ersten Mal wurde die Interaktion zwischen einem Hitzestresstranskriptionsfaktor und einem cytoplasmatischen Hitzestressprotein der Hsp20 Familie nachgewiesen. Die Aktivität des LpHsfA2 hängt von zahlreichen Faktoren ab, die den zellulären Zustand während und nach der Stressperiode widerspiegeln. Der bisher am besten verstandene Regulationsmechanismus, das Verhältnis des Kernimports im Vergleich zum Kernexport, welches stark durch die Heteroligomerisierung mit HsfA1 beeinflusst wird, wird durch den Einfluss von Hsp17.4-CII auf den Aggregationszustand und die Aktivität von HsfA2 erweitert. Nach massiver Akkumulierung von HsfA2 unter Hitzestressbedingungen führt die spezifische Interaktion mit Hsp17.4-CII zu einer reversiblen Inaktivierung des Transkriptionsfaktors und zu einer Bindung in hochmolekularen Komplexen. Die Interaktion ist hochspezifisch. Die nur durch wenige AS-Austausche charakterisierte Isoform Hsp17.3-CII bindet LpHsfA2 nicht. Im Gegensatz dazu ist der solubilisierende Einfluss der Hitzestressproteine der Klasse CI klassen-, nicht aber speziesspezifisch. Das Wechselspiel aus Inaktivierung durch Bindung an Hsp17.4-CII und anschliessende Resolubilisierung durch Hsp17-CI, sowie Kernimport nach erfolger Heterooligomerisierung mit HsfA1, führt zu einer fein abgestimmten Regulation der zellulären Lokalisation von HsfA2 und somit auch zur Modulation seiner Funktion als Transkriptionsaktivator. Die in der Arbeit gewählten experimentellen Bedingungen bewirken eine Aggregation von HsfA2 auch unter Kontrollbedingungen und ähneln der Situation in einer Pflanzenzelle während der Erholungsphase nur teilweise. In vivo wird der massiven Aggregation von HsfA2 und Hsp17.4-CII durch den Einfluss von HsfA1 und Hsp17-CI entgegengewirkt. Die gefundene in vitro Situation bietet somit ein wertvolles experimentelles Artefakt, um die Wechselwirkungen der Proteine während der Erholungsphase der Pflanze zu untersuchen und verstehen zu lernen. Aufgrund verschiedener experimenteller Hinweise kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei der gezeigten spezifischen Interaktion nicht um ein auf die Gattung Lycopersicon beschränktes Phänomen handelt. In ersten Experimenten konnten Hinweise auf einen ähnlichen Regulationsmechanismus in A. thaliana gefunden werden (spezifische Interaktion zwischen AtHsfA2 und AtHsp17.7-CII). Allerdings zeigen die Ergebnisse der Experimente, in denen Proteine aus A. thaliana untersucht wurden, Abweichungen zu dem für die Tomatenproteine erarbeiteten Bild. Weitere Untersuchungen an Arabidopsis müssen hierzu durchgeführt werden, um Klarheit über den grundlegenden Regulationsmechanismus sowie speziesspezifische Besonderheiten zu bringen. Das aus den experimentellen Befunden resultierende Bild zeigt thermotolerante Tomatenzellen, in denen LpHsfA2 in einer transkriptionel inaktiven Form durch Bindung mit löslichem Hsp17.4- CII in Gegenwart von Hsp17-CI stabilisiert wird. Der Transkriptionsfaktor ist in diesem Zustand bereit für eine rasche Reaktivierung bei einem wiederkehrenden Hitzestress. Auch wenn mittlerweile die vier wichtigsten Regulatoren dieses Netzwerkes identifiziert werden konnten (LpHsfA1, LpHsfA2, LpHsp17.4-CII und LpHsp17-CI), kann nicht ausgeschlossen werden, dass weitere Faktoren beteiligt sind. Die Identifizierung solcher Faktoren, sowie weiterführende Arbeiten an Tomatenzellen, zum Beispiel durch Ausschalten einzelner Faktoren mit Hilfe von RNAi Konstrukten, wird in Zukunft helfen, noch mehr Details dieses interessanten Phänomens zu klären. Trotz der sehr guten Kenntnis der molekularen Eigenschaften der 21 AtHsf in Bezug auf ihre funktionellen Domänen wird erst das Verständnis der Art und Weise, wie diese Moleküle miteinander oder mit Co-Regulatoren interagieren und wie sie in die zellulären Regulationsnetzwerke eingebunden sind, zu einem Gesamtbild der Funktion der Hitzestresstranskriptionsfaktoren führen. Insbesondere gilt dies, seit die Analyse der Transkritionsprofile der AtHsf mit Hilfe von Micro-Array Analysen gezeigt haben, dass die Aufgaben der Hsf weit über die Regulation der Hitzestressantwort hinausgehen könnten. So könnten einige Vertreter der Hsf eine Rolle in der Pathogenabwehr spielen, bzw. im Laufe der Evolution ausschließlich entwicklungsspezifische Funktionen übernommen haben. Um die geschilderte Fragestellung effektiv zu bearbeiten, wurde in dieser Arbeit das Hefe-Zwei-Hybridsystem zur Charakterisierung der Interaktionseigenschaften der 21 AtHsf eingesetzt. Die zeitsparende Bearbeitung vieler Proben war hierbei ein Kernziel, das erfolgreich bearbeitet werden konnte: Die etablierte Hochdurchsatzmethode kann zukünftige Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen stark beschleunigen. Die standardisierte Verwendung von Mikrotiterplatten und Mehrkanalpipetten in Kombination mit den etablierten Tranformations-, Analyse und PCR-Verfahren macht eine Bearbeitung großer Probenmengen möglich. Die Synthese dieser Technik mit der Kenntniss des gesamten Genoms von A. thaliana sowie der Fülle an Transkriptionsdaten einzelner Gene unter verschiedenen Umgebungsbedingungen stellt zukünftigen Untersuchungen ein potentes Instrumentarium ganz allgemeiner Art zur Verfügung. Im vorliegenden Fall wurde die etablierte YTH Methode dazu verwendet, Erkenntnisse über das Interaktionsverhalten der AtHsf untereinander zu gewinnen. Die Zusammenfassung aller auftretenden Interaktionen liefert für einige Gruppen von Hsf interessante Einsichten. In vielen Fällen (z.B. AtHsfA4/A5; AtHsfA1/A9) konnte für Vertreter eine Interaktion gezeigt werden, für die bereits physiologische Zusammenhänge bekannt sind. Das erstellte Interaktom kann dazu dienen, bereits bekannte Hsf-Hsf Interaktionen durch einen weiteren experimentellen Befund zu belegen, sowie bisher unbekannte Verbindungen aufzudecken. Zur Identifizierung unbekannter Interaktionspartner mussten zunächst geeignete Bibliotheken hergestellt werden. Mit Hilfe dieser Bibliotheken konnten zahlreiche putative Interaktionspartner identifiziert und durch das Interaktom bereits bekannte Interaktionspartner für fast alle Köder in den Bibliotheken gefunden werden. Dies bestätigt sowohl die gute Abdeckung der mRNA Population der Zellen, aus denen die Bibliotheken gewonnen wurden, als auch die Reproduzierbarkeit und Funktionalität des YTH Screenings. Die Tatsache, dass in der Population der putativen Interaktionspartner für AtHsf gehäuft Transkriptionsfaktoren auftreten, lässt auf die Art der Vernetzung der AtHsf in den Proteinnetzwerken schließen: Die Regulation der Zielgene erfolgt möglicherweise bevorzugt durch eine direkte Wechselwirkung von Transkriptionsfaktoren verschiedener Familien. Neben der Etablierung der Methoden zur beschleunigten Untersuchung zahlreicher Proben stellte auch die Standardisierung der experimentellen Folgeschritte einen wichtigen Aspekt dar, um eine reproduzierbare Aussage über die Relevanz einer Interaktion treffen zu können. Interessante Ansatzpunkte, sowie Vorschläge für weiterführende experimentelle Arbeiten sollen im Folgenden für die wichtigsten Klone thesenartig dargestellt werden: Ein möglicher Co-Regulator für AtHsfA5 Das mit Hilfe der AtHsfA5-CTD identifizierte unbekannte Protein, codiert durch den Lokus At5g01370, bietet einen Ansatzpunkt für eine gezielte Untersuchung der Rolle und Regulation des AtHsfA5. Die spezifische Interaktion zwischen HsfA5 und HsfA4, die sowohl in A. thaliana als auch in Tomate existiert, sowie das auffällige Fehlen einer hemmenden Aktivität von AtHsfA5 auf HsfA4 an den bisher untersuchten Reporterkonstrukten in Pflanzenzellen, zeichnen diesen TF als einen besonders interessanten Vertreter der AtHsf aus. Es muss wegen der Pflanzenspezifität des Hemmeffektes über die Existenz eines HsfA5 spezifischen Co-Repressors nachgedacht werden. In diesem Zusammenhang kann die Analyse des identifizierten Proteins helfen, einen solchen Regulator zu charakterisieren. Die im Rahmen dieser Arbeit dokumentierten Ergebnisse legen nahe, dass das von At5g01370 codierte Protein mit der NLS-Region von AtHsfA5 interagiert. Da die entscheidenden Experimente bisher nur in Hefe durchgeführt wurden, steht eine Reproduktion in einem pflanzlichen Expressionssystem für weiterführende Arbeiten im Vordergrund. Die Versuche, die Transkriptionseigenschaften von AtHsfA5 durch Co-Expression des unbekannten Proteins oder Co-Transformation eines RNAi induzierenden Plasmides zu beeinflussen, sind bisher mangels Kenntnis der Zielgene von AtHsfA5 fehlgeschlagen. Weitere Schritte bei der Bearbeitung dieser Fragestellung müssen demnach die Suche nach einem geeigneten Testsystem, sowie die experimentelle Bestätigung einer Interaktion beider Proteine in planta sein. Im Rahmen der Promotion wurde der Lokus des identifizierten Gens auf das Vorhandensein einer T-DNA Insertion hin überprüft. Eine entsprechende Linie existiert nicht, so dass transgene Pflanzen durch Transformation von Überexpressions- oder RNAi-Kassetten hergestellt werden müssten. Es ist nicht auszuschließen, dass schon die Deletion einer der beiden chromosomalen Kopien des Gens zu einem lethalen Phänotyp führt und daher keine T-DNA Insertionslinien existieren. In diesem Fall kann möglicherweise der Phänotyp einer Überexpressionspflanze Aufschlüsse über einen Zusammenhang der Funktion des unbekannten Proteins und der Rolle des AtHsfA5 liefern. AtHsfB2a interagiert mit AtDLC8 (At3g15930) Die Interaktion des Dynein Leichte Kette 8 Proteins (DLC8) mit AtHsfB2a bietet ebenfalls Ansätze für weitere Untersuchungen. Durch die mit Hilfe des Interaktoms identifizierte spezifische Interaktion zwischen AtHsfB2a und HsfB2b hebt sich diese Subgruppe der Klasse B der AtHsf von den übrigen Vertretern ab. Die im Ergebnisteil beschriebenen Befunde, vornehmlich aus Experimenten mit Säugersystemen, deuten eine regulatorische Rolle für DLC Proteine allgemein an (zum Beispiel beschrieben für die Interaktion zwischen dem TF Bim aus der Bcl2 Familie und DLC8 (Day et al., 2004)). Eine detaillierte Charakterisierung der im YTH gefundenen Interaktion zwischen DLC8 und AtHsfB2a könnte eine pflanzenspezifische, regulatorische Funktion der DLC Proteine zeigen, die losgelöst von den Transportfunktionen des Dynein Komplexes existiert. Das Fehlen geeigneter Reportersysteme für AHsfB2a stellt in diesem Zusammenhang ein großes Problem dar. Auch für den Lokus At3g15930 existieren keine TDNA Linien, obwohl der gesamte umgebende chromosomale Kontext zahlreiche Insertionen aufweist. Die Herstellung und Kultivierung von Überexpressions- oder „knock down“ Pflanzen für das DLC8 Protein muss zeigen, ob dieses in Verbindung mit HsfB2a essentielle Aufgaben während der Entwicklung bzw. bei der Stressabwehr von A. thaliana übernimmt. Interaktion von AtHsfA9 mit AtDr1 (At5g23090) Der mit Hilfe von AtHsfA9 identifizierte Klon AtDr1 stellt möglicherweise eine Verbindung zwischen den AtHsf und einem sehr allgemeinen Regulationsmechanismus in Pflanzen dar, über den bisher nur sehr wenig bekannt ist. Die meisten Repressoren, die aus nicht-pflanzlichen Systemen beschrieben wurden, üben ihre Funktion genspezifisch aus, d.h. sie binden entweder Promoter-spezifisch an die entsprechenden Zielgene oder an spezifische Bindungspartner. Einer der wenigen Repressoren, die eine generelle Funktion ausüben, ist Dr1. In Säugerzellen zum Beispiel verringert Dr1 die generelle Effektivität der RNA-Polymerase II. Da kürzlich die Existenz und Funktionalität der pflanzlichen Homologe von Dr1 in Reis bewiesen wurde, bietet die nun gefundene Verbindung mit der Gruppe der AtHsf einen viel versprechenden Ansatzpunkt. Allerdings war es im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, mit Hilfe geeigneter Reportersysteme eine Repression von Promotoren durch Dr1 zu zeigen. Die Etablierung eines solchen Systems (auch endogener chromosomaler Reportersysteme) steht daher im Vordergrund weiterer Untersuchungen. Im Rahmen der Arbeit konnten transgene T-DNA Insertionslinien des Lokus At5g23090 charakterisiert werden, sie liegen für weitere Untersuchungen bereit. Allen voran steht die Analyse des Transkriptionsniveaus verschiedener Zielgene in Wildtyppflanzen sowie in den beschriebenen Mutanten. Weitere Schritte sind die Herstellung und Analyse transgener Pflanzen, die veränderte Mengen an Dr1 und AtHsfA9 aufweisen. Neben der Identifizierung der Vernetzungen der AtHsf mit Dr1 als einem generellen Regulator der Genexpression kann eventuell auch die molekulare Wirkungsweise des Dr1 Repressors in Pflanzen mit Hilfe solcher Experimente entschlüsselt werden. AtHsfB1 interagiert mit AtbZip44 (At1g75390) Die aus den durchgeführten YTH Screenings resultierende wahrscheinlich wichtigste Vernetzung der AtHsf mit bisher unbekannten Co-Regulatoren stellt das Zusammenspiel der Hsf mit den bZip Transkriptionsfaktoren da. Die Kombination des inaktiven HsfB1 mit AtbZip44 führt zu einer verstärkten Aktivierung von Zielgenen, zu denen auch die Gene von HsfA3 und HsfC1 gehören. Obwohl eine direkte Interaktion beider Transkriptionsfaktoren für die synergistische Aktivierung nicht stattfindet, deutet die am Promoter von AtHsfC1 und AtHsfA3 gefundene Konstellation eine bisher unbekannte Rolle für AtHsfB1 an, die von der kürzlich beschriebenen Rolle von LpHsfB1 in Tomatenzellen abweicht. Die gefundenen experimentellen Ergebnisse lassen folgende Hypothese zu: AtHsfB1, der sowohl in Wurzel- als auch in Sprossgewebe unter zahlreichen Stressbedingungen induziert wird, bindet an Promotoren und besetzt dort spezifische Bindestellen, die klassischen HSE. Aufgrund fehlender Aktivatormotive führt diese Bindung zu keiner Aktivierung der Zielgene. Die Promotoren befinden sich jedoch nun in einem Zustand, in dem die Bindung weiterer Aktivatoren, im beschriebenen Fall AtbZip44, zu einer raschen und starken Aktivierung des Gens führt. Durch das Zusammenwirken von zwei unabhängig voneinander bindenden Transkriptionsfaktoren könnte ein erhöhtes Maß an Flexibilität und Sensitivität der Genregulation erreicht werden. Auch eine generelle induzierte Toleranz gegenüber Stress könnte durch die differentielle Expression von AtHsfB1 und weiteren Faktoren erklärt werden. In diesem Fall würde HsfB1 auch nach Beendigung eines Stresszustandes noch an den Promotoren wichtiger Zielgene gebunden bleiben, ohne diese unnötig zu aktivieren. Bei Wiederkehren der Stresssituation wäre eine rasche Reaktivierung durch Synergismen mit kurzlebigen, potenten Aktivatoren, wie zum Beispiel AtbZip44, möglich. Durch die Wechselwirkung von AtHsfB1 mit Vertretern verschiedener Familien von Transkriptionsfaktoren, möglicherweise auch Repressoren, kann so eine Vielzahl von Zielgenen reguliert werden. Die weitere Untersuchung des AtbZip44 erscheint aus zwei Gründen besonders lohnend: (1) AtbZip44 beeinflusst die Synthese der AS Prolin. Prolin stellt ein weit verbreitetes Osmolyt dar, welches als Hydroxyl-Radikal-Fänger fungiert, Plasmamembranen unter Stressbedingungen schützt sowie die Toleranz von Pflanzen gegenüber Frost und Hochsalzbedingungen erhöht. (2) Für AtHsfA5 wurde eine direkte Interaktion mit AtbZip44 in vitro gezeigt. Ob ein Komplex zwischen AtHsfA5 und AtbZip44 eine Transkription an geeigneten Reportern bewirkt, ist allerdings noch offen, und muss durch geeignete Experimente gezeigt werden. Neben umfangreichen Screeningarbeiten, der basalen Charakterisierung aller interessanten Klone und der Detailcharakterisierung der Interaktion zwischen AtHsfB1 und AtbZip44 konnten zusätzlich erste Vorarbeiten mit transgenen Pflanzen für die interessantesten Kandidaten durchgeführt werden. Als Ergebnis der Arbeit stehen somit einige vielversprechende Ansatzpunkte für weitere Studien zur Verfügung, ebenso die standardisierte Technik und die notwendigen konservierten Bibliotheken, um in kurzer Zeit Screenings mit weiteren Köderproteinen durchzuführen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen dazu bei, zukünftige Experimente besser zu planen, sowie die Rolle der Hsf als terminale Komponenten der pflanzlichen Stressantwort weiter zu entschlüsseln und zu verstehen. Die Entschlüsselung der Funktion aller Proteine eines Gesamtorganismus, deren posttranslationale Modifizierungen, die Möglichkeit stabiler sowie transienter Interaktionen mit anderen Proteinen und somit die Vernetzung aller Proteine zu einem Gesamtnetzwerk stellt die große Herausforderung des Zeitalters der „proteomics“ dar. Verliefen während der Entschlüsselung der Genome von Organismen die Informationen auf Nukleinsäureebene noch linear, so dass mit Hilfe eines hohen Automatisierungsgrades ein rascher Fortschritt erzielt werden konnte, so erfordert die so genannte „post-genomics“ Ära hohe finanzielle und personelle Investitionen. Die Nicht-Linearität der Proteinfunktionen, die durch Modifikationen und Wechslwirkungen beeinflusst werden, hat rasch gezeigt, dass ein komplexer Organismus nicht lediglich durch die Kenntnis der Summe seiner Gene verstanden werden kann. Das Zeitalter der „proteomics“ erfordert trotz potenter Hochdurchsatzmethoden und weit fortgeschrittener Computeranalysen mehr denn je ausgefeilte Testmethoden und eine individuelle Untersuchung einzelner Proteine und deren Wechselwirkungen, um schließlich die Kernfrage der Biologie, wie Leben funktioniert, beantworten zu können.
Active neurogenesis continuously takes place in the dentate gyrus of the adult mammalian brain. The dentate gyrus of the adult rodent hippocampus contains an astrocytelike cell population that is regarded as residual radial glia. These cells reside with their cell bodies in the subgranular layer (SGL). Radial processes traverse the granule cell layer (GCL) and form bushy ramifications in the inner molecular layer (IML). The residual radial glial cells apparently represent neuronal progenitor cells that can give rise to functionally integrated granule cells. To date the cellular and molecular events driving a subpopulation of these cells into neurogenesis as well as the cellular transition states are poorly understood. The present study shows, that in the mouse dentate gyrus, this cell type selectively expresses surfacelocated ATPhydrolyzing activity and is immunopositive for nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2). NTPDase2 is an ectoenzyme and hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates such as ATP or UTP to their respective nucleoside diphosphates. The enzyme becomes expressed in the hippocampus during late embryogenesis from E17 onwards, and is thus not involved in early brain development. Its embryonicpattern of expression mirrors dentate migration of neuroblasts and the formation of the primary and finally the tertiary dentate matrix. NTPDase2 is also expressed by a transient population of cortical radial glia from late embryonic development until postnatal day 5. NTPDase2 can be employed as a novel markerfor defining cellular transition states along the neurogenic pathway. It is associated with subpopulations of GFAP and nestinpositive cells. These intermediate filaments are typically expressed by the progenitor cells of the dentate gyrus. In addition there is a considerable overlap with doublecortinand PSANCAM positive cells. The expression of the microtubuleassociated protein doublecortin and of PSANCAM which are expressed by migrating neuroblasts is indicative of a transition of progenitors to a neural phenotype or an immature form of granule cell. NTPDase2 is no longer associated with young neurons and with maturegranule cells, as indicated by the lack of doubleimmunostaining for III tubulin and NeuN, respectively. Furthermore, β S100positive astrocytes do not express NTPDase2 validating that NTPDase2 is also not associated with later stages of gliogenesis. Experiments with the Sphase marker bromodeoxyuridine (BrdU) demonstrate that NTPDase2positive cell proliferate. Postmitotic BrdU-labeled cells preferentially acquire an NTPDase2positive phenotype. Many of these cells were also positive for GFAP. The contribution of BrdUlabeled cells positive for NTPDase2 increased with time from 2 h to 72 h, validating a strong association of NTPDase2 with proliferating cells of the dentate gyrus. The colocalization studies with various markers and the results of the experiments suggestthat NTPDase2 is associated with cell types of varying maturation states but not with mature neurons or astrocytes. Studies on the formation of neurospheres from the dentate gyrus validate previous data suggesting that the hippocampal progenitors have little capacity for self renewal in vitro. In situ hybridization results indicate the presence of one of the metabotropic purinergic receptor subtypes (the P2Y1 receptor) within the adult neurogenic regions, the dentate gyrus and the lateral walls of the lateral ventricles. A patchclamp analysis demonstrates the presence of functional ionotropic nucleotide receptor (P2X receptors) in progenitor cells expressing nestin promotordriven GFP. They suggest that the signaling pathway via extracellular nucleotides and nucleotide receptors may play a role in the control of adult hippocampal neurogenesis.
Das humane MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) ist in chromosomale Translokationen mit mehr als 50 verschiedenen Partnergenen involviert. Alle diese Rearrangements sind mit akuter lymphatischer oder akuter myeloischer Leukämie assoziiert. Die reziproke Translokation t(4;11) ist ursächlich für die Entstehung einer akuten lymphatischen Leukämie, die gehäuft bei Kleinkindern auftritt. Die Prognose dieser aggressiven Leukämie ist sehr schlecht, da die leukämischen Blasten nahezu Therapie-resistent sind. Für einige MLL-Rearrangements konnte in Transduktions/Transplantations-Experimenten gezeigt werden, dass das MLL-Fusionsgen akute myeloische Leukämien in Mäusen induzieren kann. Aus diesem Grund steht immer noch das jeweilige MLL-Fusionsprotein im Mittelpunkt der Suche nach einem zugrunde liegenden Pathomechanismus. Die Versuche, ein Tiermodell mit dem MLL/AF4- Fusionsprodukt zu etablieren, blieben lange Zeit erfolglos. Erst Anfang dieses Jahres gelang es, durch eine knock-in Strategie, transgene Mäuse zu generieren, die das MLL/AF4 Translokationsprodukt tragen. Diese Mäuse entwickeln nach einer sehr langen Latenzzeit von bis zu 540 Tagen diffuse B-Zell-Lymphome. An der t(4;11) sind die Gene MLL auf Chromosom 11q23 und AF4 auf Chromosom 4q21 beteiligt. Die reziproke Translokation führt zur Entstehung von zwei Fusionsgenen (MLL/AF4 und AF4/MLL) mit intaktem Leserahmen. Wir nehmen an, dass beide Fusionsgene notwendig sind, um die Entartung der Zellen zu bewirken. Zum Einen ist der beschriebene Phänotyp der transgenen MLL/AF4 positiven Mäuse mit dem aggressiven Verlauf der t(4;11) Leukämie nicht vergleichbar, und zum Anderen findet man bei der Mehrzahl der Patienten mit einer t(4;11) beide Fusionstranskripte in den leukämischen Blasten. Um die Eigenschaften der Fusionsproteine AF4/MLL und MLL/AF4 zu untersuchen, wurden stabil transfizierte murine embryonale Fibroblasten-Linien etabliert, die entweder eines oder beide Fusionsgene regulierbar exprimierten. Mit Hilfe dieses in vitro Modells konnte man erstmals die Auswirkungen der gleichzeitigen Expression beider Fusionsgene auf das Verhalten der Zellen analysieren. Die Untersuchungen der Proliferation und der Apoptoseraten der verschiedenen transfizierten Zelllinien ergab, dass das AF4/MLL Fusionsprotein in den Zellen zu Wachstumstransformation führt, aber gleichzeitig die Zellen für den Zelltod durch bislang unbekannte Apoptosemechanismen sensitiviert. Das MLL/AF4 Translokationsprodukt war nicht in der Lage, eine Wachstumstransformation auszulösen. Vielmehr wurde deutlich, dass die Expression von MLL/AF4 die Proliferation der Zellen hemmt. Die Untersuchung der spezifischen Apoptoserate in den MLL/AF4 positiven Zellen ergab, dass die Zellen sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stress-Konditionen Apoptose-resistent waren. Damit besitzen beide Fusionsproteine onkogene Eigenschaften. Da nur die mit AF4/MLL und MLL/AF4 transfizierten Zellen eine stark erhöhte Proliferation aufwiesen, im Wachstum transformiert waren und eine erhöhte Apoptoseresistenz zeigten, wurde deutlich, dass die Eigenschaften beider Fusionsproteine notwendig sind, um den vollständig transformierten Phänotyp auszulösen. Um die Veränderungen in den Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde mittels quantitativer PCR die Expression verschiedener Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Expression Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene in allen drei Zellen verändert war. Genexpressionsprofil-Studien der Zellen ergaben schließlich, dass der Transkriptionsfaktor Nanog in den doppelt-transfizierten Zellen verstärkt exprimiert wurde. Nanog ist in die Aufrechterhaltung der Pluripotenz und des Selbsterneuerungspotenzials von embryonalen Stammzellen involviert. In dieser Arbeit konnte erstmals der Phänotyp einer Zelllinie beschrieben werden, die beide Fusionskonstrukte, AF4/MLL und MLL/AF4, stabil exprimierte. Dabei wurde deutlich, dass nur durch die Expression beider Fusionsgene ein Phänotyp erzeugt wird, der den Leukämoblasten sehr ähnlich ist. Die Expression von Nanog in diesen Zellen erklärt den Stammzell-Charakter der leukämischen Zellen.
Molekulare Regulation der UDP-Zucker-Biosynthese Untersuchungen anhand der myo-Inositoxygenase
(2006)
Der Nukleotidzucker UDP-Glucuronsäure ist die prinzipielle Zuckervorstufe für UDP-Galacturonsäure, -Xylose, -Arabinose und –Apiose, welche alle in die Zellwandpolymere der pflanzlichen Zellwand einfließen. UDP-Glucuronsäure kann in Arabidopsis über zwei alternative, funktionelle Synthesewege gebildet werden, wobei entweder die UDP-Glucose-Dehydrogenase oder die myo-Inositoxygenase als Schlüsselenzym, welche den Kohlehydratfluss in Richtung Zellwandbiosynthese katalysiert, involviert ist. In dieser Arbeit wurden die Gene für die Enzymisoformen der Inositoxygenase (MIOX) aus Arabidopsis thaliana analysiert. Sie repräsentieren eine kleine Genfamilie bestehend aus vier Isoformen. Studien mittels Promotor::GUS-Konstrukten und RT-PCR zeigten, dass die Transkription der MIOX-Gene eine sehr transiente und organspezifische Genexpression ist. Die Isoformen MIOX1 und MIOX2 ließen sich in nahezu allen Geweben nachweisen wogegen die Isoformen MIOX4/5 nur in den generativen Geweben aufzufinden waren. Es konnte eine deutliche Präsenz aller vier MIOX-Isoformen in den generativen Geweben nachgewiesen werden und die Nukleotidzucker, die während der Samenentwicklung benötigt werden, scheinen überwiegend über die MIOX zur Verfügung gestellt zu werden. So zeigen T-DNA-Insertionslinien von ΔMIOX1 & 2 eine reduzierte Schleimhülle um die Samen und eine erhöhte Ausfallrate bei der Samenentwicklung auf. Ansonsten zeigen die untersuchten T-DNA-Insertionslinien einen ähnlichen Wuchs wie der Wildtyp auf. Auch konnten keine Unterschiede über die durchgeführten Zellwandanalysen, mittels GC-MS, MALDI und Dionex-HPLC verifiziert werden, was durch die Redundanz der MIOX- und UGD-Isoformen erklärt werden könnte. Nichtsdestotrotz konnte bei den Isoformen ΔMIOX1 & 2 eine dramatische Reduktion beim Einbau von 3H-Inosit in Zellwandpolymere von Keimlingen verzeichnet werden, was einen klaren Beweis für eine funktionelle MIOX liefert, da in diesem Gewebe diese beiden Isoformen die einzig aktiven sind. Außerdem konnten über Promotor-Deletions-Analysen potentielle cis-Elemente für die Promotoren von MIOX2 und MIOX4 aufgedeckt werden.
An den Folgen von AIDS sind bisher fast 20 Millionen Menschen gestorben. Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte erstmals die Viruslast bei gleichzeitiger Erhöhung der CD4-Lymphozytenzahl effizient erniedrigt werden. Dadurch konnte zwar eine Kontrolle der Virusreplikation und damit verbunden eine längere Überlebenszeit erreicht werden, jedoch ist eine vollständige Eradikation des Virus bisher nicht möglich. Hohe Behandlungskosten, Nebenwirkungen der antiviralen Substanzen, ihre unzureichende Wirkung in manchen Körperkompartimenten und die rasche Verbreitung resistenter Viren schränken die Effektivität von HAART ein. Alternative Therapieformen zielen in den letzten Jahren verstärkt auf die HIV-Eintrittshemmung durch Inhibition der Membranfusion von Virus und Wirtszelle („Fusionsinhibitoren“). Peptide, die sich aus der „heptad repeat“ Region 2, HR2, des gp41 ableiten (C-Peptide), sind äußerst wirksame antivirale Substanzen. 2003 wurde T-20, ein 36 Aminosäure langes C-Peptid, als erster Fusionsinhibitor zugelassen. Sein breiter Einsatz ist jedoch aufgrund rascher Resistenzbildung, mangelnder oraler Verfügbarkeit, einer äußerst kurzen Serumhalbwertszeit sowie daraus resultierender hoher Therapiekosten limitiert. Aufgrund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit mit der Entwicklung von RNA-Aptameren als HIV-Fusionsinhibitoren ein neuer therapeutischer Ansatz etabliert werden. Zur Isolierung dieser RNA-Aptamere wurden zwei hoch komplexe RNA-Bibliotheken in manuellen sowie automatisierten Selektionen gegen verschiedene Zielstrukturen auf dem HIV-1 gp41 mit Hilfe der SELEX-Technologie selektiert. Der Wirkmechanismus der isolierten RNA-Aptamere sollte analog zu den gp41 HR-abgeleiteten Peptiden auf der Hemmung der Ausbildung des Sechs-Helix-Bündels als fusionaktive Struktur beruhen. So sollten die RNA-Aptamere die Ausbildung der zentralen N coiled-coil Struktur verhindern (Selektion gegen HR1-Peptide) oder die Anlagerung der HR-2 Domänen an die konservierten hydrophoben Furchen des zentralen N coiled-coils inhibieren (Selektion gegen HR2-Peptide). Die gewählten Zielstrukturen wurden entweder als freie synthetische Peptide oder membrangebunden auf der Oberfläche von humanen T-Zellen präsentiert. Um die Selektion von serumstabilen Aptameren zu gewährleisten, wurden die RNA-Aptamere unter Einsatz von 2’-F- oder 2’-NH2-modifizierten Pyrimidinen transkribiert. Nach initialen Selektionsrunden wurden die isolierten Aptamerfraktionen in einer „single-round infection“ unter Einsatz von HIV-Pseudotypvektoren auf spezifische Inhibition des Eintritts von HIV in die Zielzellen analysiert. Die isolierten RNA-Aptamere waren in der Lage, den HIV-Eintritt zu inhibieren, ihre Wirksamkeit war allerdings im Vergelich zu der naiven Bibliothek gering. Nach Durchführung von verschiedenen Reifungsstrategien, um die Affinität der vorselektieren RNA-Fraktionen zum jeweiligen Zielepitop zu erhöhen, konnte die inhibitorische Wirkung der gereiften RNA-Fraktionen auf das 10Fache im Vergleich zu der Urspungsbibliothek verbessert werden. Die wirksamste RNA-Fraktion, 435UU, wurde aus einer Selektion einer aminomodifizierten N30 RNA-Bibliothek gegen das membranverankerte Fusionsprotein M435, bestehend aus gp41 C46 und dem membranproximalen HIV-Linker, und anschließender Kompetiton mit dem 2F5 Antikörper gewonnen. Die 435UU RNA-Fraktion konnte den Eintritt von HIV mit einer IC50 ≈ 200 nM spezifisch hemmen. Weiterhin konnte die spezifische Fusionsinhibition der 435UU Aptamerfraktion in einem Zell-Zellfusionsassay unter Einsatz von HIV env exprimierenden Zellen und einer humanen T-Zelllinie demonstriert werden. Die Affinität der 435UU-Fraktion wurde in einem Gelmobilitätsversuch bestimmt. Die moderate HIV-Eintrittshemmung beruhte auf einer schwachen Bindung (Kd ≈ 750 nM) an das Zielepitop auf dem gp41. Die Analyse von Einzelaptameren aus der 435UU RNA-Population ergab keine signifikanten Unterschiede in ihrem HIV-Neutralisationspotential. Des Weiteren konnten nur wenig gemeinsame Primärstrukturmotive bestimmt werden. Der Gehalt an inkorporierten Pyrimidinen in den 435UU-Einzelaptameren war allerdings mit ca. 70% vergleichsweise hoch. Unter Einsatz von randomisierten RNA-Transkripte mit definiertem Pyrimidingehalt konnte festgestellt werden, dass tendenziell ein höherer Gehalt an NH2-Pyrimidinen die HIV-Neutralisation fördert. Allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Bindung an das C46-HIVLinker Fusionskonstrukt und dem Pyrimidingehalt der Transkripte ermittelt werden. Die Sekundärstukturvorhersage ergab keine strukturelle Verwandtschaft unter den 435UU-Einzelaptameren noch konnten klar definierte Sekundärstrukturmotive gefunden werden. Die Selektion der 435UU-Aptamerfraktion erfolgte deshalb nich allein aufgrund ihres hohen Pyrimidingehaltes. Ein direkter Vergleich der 435UU Aptamerfraktion mit dem bisher einzigen RNA-Eintrittsinhibitor, einem anti-gp120 RNA-Aptamer, ergab zwar eine geringfügig schwächere HIV-Inhibition, jedoch ein wesentlich breiteres Wirkspektrum der isolierten anti-gp41 RNA-Aptamere wahrscheinlich durch ihren hoch konservierten Wirkmechanismus. Schlussendlich könnte die Wahl der Präsentation der Zielstrukturen sowie der Selektionsdurchführung die Gewinnung von RNA-Aptameren mit moderater Affinität fördern und gleichzeitig zum Verlust von hoch affinen RNA-Strukturen führen. In nachfolgenden Selektionen sollte deshalb die Selektionsstringenz erhöht sowie gegen membrangebundene Zielstrukturen selektiert werden, die die tatsächliche native gp41 Konformation darstellen.
Apoptose ist für grundlegende Prozesse des Lebens wie die Embryonalentwicklung und die Infektabwehr unentbehrlich. Defekte im Apoptoseprozess haben ernste Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Folge. Ein charakteristisches Kennzeichen von Krebszellen ist deren Apoptoseresistenz, die verhindert, dass Krebszellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Die Tumorzellen reagieren im allgemeine nicht mehr auf Zelltod-Signale, die z. B. bei Nähr- und Sauerstoffmangel oder einem Angriff durch Effektorzellen des Immnunsystems empfangen werden. Ein wesentlicher Grund dafür sind Mutationen im Signalweg der Apoptose. Häufig wird in Tumoren die Überaktivierung von antiapoptotischen Proteinen beobachtet. Die Aufklärung der Apoptose-Signalwege und die Charakterisierung der ihnen zu Grunde liegenden molekularen Interaktionsmechanismen sind wichtig für die Erklärung der Pathogenesse vieler Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, neue anti-apoptotische Proteine zu identifizieren, die als Targets zur Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien benutzt werden können. Ein wichtiger Bestandteil des Apoptoseweges ist das Mitochondrium. Ausgangspunkt für den mitochondrialen oder intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweg ist die Freisetzung von Cytochrom c (Cyt c) und anderen apoptogenen Faktoren aus dem Mitochondrien. Zytoplasmatisches Cytochrom c bindet zusammen mit ATP oder dATP an das Adaptorprotein Apaf-1 und induziert daraufhin eine Konformationsänderung sowie die Oligomerisation von Apaf-1. Die Selbstassoziation von Apaf-1 führt zur zusätzlichen Rekrutierung von Caspase-9, die in diesem des sogenannten Apoptosomskomplexes durch die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration autokatalytisch aktiviert wird. Aktive Caspase-9 wiederum spaltet und aktiviert Effektorcaspasen wie Caspase-3, die zelluläre Targetproteine spalten und damit den Zelltod verursachen. Viele apoptotische Stimuli aktivieren den mitochondrialen Apoptoseweg. Defekte im intrinsischen Signalweg finden sich häufig im Tumoren und sind oft mit Resistenzen gegen apoptoseauslösende Krebstherapien assoziert. Anti-apoptotische Proteine, die mit dem apoptotischen Programm an dieser Stelle interferieren und in Tumoren überexprimiert werden, stellen attraktive Targets für Tumortherapien dar. In der Arbeitsgruppe von Dr. Martin Zörnig am Georg-Speyer-Haus wurde ein S. pombe Hefesystem etabliert, um in einem funktionellen „Survival-Screen“ neue anti-apoptotische Säugergene aus Tumor-cDNA-Banken zu identifizieren. Hefen können durch die Expression bestimmter pro-apoptotischer Säugerproteine abgetötet werden. Dieser Hefezelltod weist äusserliche Gemeinsamkeiten mit apoptotischen Zellen multizelluläre Organismen auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe dieses Screens tatsächlich anti-apoptosische Säugerproteine zu identifizieren, die den induzierten Hefezelltod inhibieren können. In einem Screen, bei dem das Apaf-1 Homolog in C.elegans, CED-4, als Killerprotein verwendet wurde, konnte unter anderem das Gen Aven isoliert werden, das nicht nur CED-4-induzierten Zelltod in Hefe, sondern auch Apaf-1/Casp-9-vermittelte Apoptose in Säugerzellen inhibiert. Dabei wurde ein unvollständiges ΔAven-cDNA-Plasmid isoliert, dem das 5´-Ende fehlte. Diese Verkürzung ist vermutlich auf ein vorzeitiges Abbrechen der cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase zurückzuführen. Die vollständige humane Aven cDNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. J. M. Hardwick (J. Hopkins University, Baltimore USA) bereitgestellt, zusammen mit zwei polyklonalen anti-Aven Antiseren. Die Antisera erkennen die N-terminalen Aminosäuren 98-112 (anti-Aven A) sowie am C-terminus aa 256-268 (anti-Aven B). In der AG Zörnig wurde ein zusätzliches Antiserum (anti-Aven C) gegen ein Peptid generiert, das die letzten 17 Aminosäuren des humanen und des Maus-Aven-Proteins erkennt. Aven wurde in der Gruppe von M. Hardwick als anti-apoptotisches Protein beschrieben, das an das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xL und Apaf-1 bindet (Chau et al., 2000). Aven wurde mit Hilfe eines „Hefe-2-Hybrid Screens“ mit Bcl-xL als Köder („bait“) isoliert. Es wurde publiziert, dass Aven die Apaf-1 Selbstassoziation (und damit Caspase-9-Aktivierung) verhindert. Das humane Aven Gen kodiert für insgesamt 362 Aminosäuren. Die Sequenz ist in zahlreichen Spezies hoch konserviert. Aven mRNA Expression wurde in vielen Geweben (Herz, Nieren, Pankreas, Testis und Skelet-Muskulatur) und in mehreren Zelllinien gefunden. Dies deutet auf eine ubiquitäre Expression hin. In der Zelle ist Aven hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Immunfluoreszenzanalysen der Arbeitsgruppe Hardwick zeigten zusätzlich eine schwache Expression des Proteins im Nukleus. In der Arbeitsgruppe Zörnig konnte gezeigt werden, dass die isolierte Deletionsmutante ΔAven (aa 180-362) CED-4-induzierten Zelltod in Hefen inhibiert (Doktorarbeit M.L. Brezniceanu, unpublizierte Daten). Eine anti-apoptotische Wirkung konnte für ΔAven zusätzlich im Säugersystem verifiziert werden. Durch Überexpressionsstudien eines ΔAven- GFP-Fusionskonstruktes wurde Apaf-1/Caspase-9-induzierte Apoptose in der humanen Kolonkarzinomzelllinie RKO inhibiert. Weitere Experimente zeigten, dass sich in Tumoren des Kolons, der Niere und der Schilddrüse erhöhte Aven mRNA-Mengen nachweisen lassen und dass Aven auf mRNA-Ebene während der Entwicklung der Brustdrüse reguliert wird (unpublizierte Daten). Im Rahmen dieser Arbeit wurde Aven biochemisch und genetisch näher charakterisiert. Dabei wurden sowohl das volle-Länge-Aven sowie die artifizielle ΔAven Deletionsmutante untersucht. Zunächst wurde ein Teil der publizierten Daten verifiziert. Beschrieben ist eine Bindung zwischen Aven und Bcl-xL, die durch die N-terminale Domäne von Aven (Aminosäure 74-108) vermittelt wird. ΔAven, das den N-Terminus nicht enthält, sollte daher nicht an Bcl-xL binden können. In einem Immunpräzipitations-Experiment mit dem anti-Aven B Antiserum wurde entsprechend einer Interaktion mit Bcl-xL nur für das volle-Länge-Aven-Protein, nicht aber für ΔAven nachgewiesen. Den Publizierten Daten zufolge bindet Aven mit den Aminosäuren 180 bis 300 an Apaf-1, und diese Interaktion konnte in einem weiteren Ko-Immunpräzipitations-Experiment bestätigt werden. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluß von Aven auf die Bildung des Apoptosoms zu untersuchen. Dafür wurden Apoptosom-Immunpräzipitations-Experimente mit 293T Zelllysaten etabliert, in denen man endogene Apaf-1/Caspase-9-Komplexe nachweisen konnte. Durch Zugabe von Cytochrom c und dATP direkt zu den Zelllysaten wurde die Bildung des Apoptosoms induziert, das anschließend mit einem monoklonalen anti-Caspase-9 Antiköper immunpräzipitiert werden konnte. Bei gleichzeitiger Überexpression von ΔAven wurde weniger Apaf-1 mit Caspase-9 ko-immunpräzipitiert, ein Hinweis darauf, dass die Apoptosombildung unterdrückt wurde. Das Ergebnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass Caspase-9-Spaltung und -Aktivierung durch ΔAven vermindert wurde. Interessanterweise konnte eine Überexpression des volle-Längen Aven-Proteins die Bildung des Apoptosoms nicht verhindert. Apaf-1 wurde wie bei den Lysaten nichttransfizierter Zellen mit Caspase-9 Ko-immunopräzipitiert, und die Caspase-9 Spaltprodukte p35 und p37, die bei Aktivierung des Apoptosoms entstehen, wurden unverändert detektiert. Bei den beschriebenen Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch eine Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 (und nicht nur an Apaf-1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der C-Terminus von Aven für die Bindung an Caspase-9 wichtig ist. Interessanterweise nahm die Bindung von ΔAven an Caspase-9 nach Apoptosominduktion ab, während kein Unterschied in der Bindung des vollständigen Aven-Proteins an Caspase-9 vor oder nach Apoptosominduktion beobachtet werden konnte. Wegen der Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 konnte mit diesen Experimenten nicht festgestellt werden, ob Aven bzw. ΔAven Teil des gebildeten Apoptosomkomplexes sind, d. h. ob sie auch nach Apoptosombildung an Apaf-1 binden. Eine Hemmung der Apoptosomsbildung führt zur Inhibierung der Caspase-Aktivierungskaskade und damit zu verringerter Caspase-3 Aktivität. Entsprechend wurde die Caspase-3-Aktivität nach in vitro Apoptosominduktion bei Überexpression von ΔAven inhibiert, während das volle-Länge Aven keinen Einfluß auf die Caspase-3-Aktivität hatte. In weiteren Verlauf des Projektes wurden funktionelle Apoptoseexperimente mit transfizierten RKO-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Protektion durch Aven und ΔAven nach Staurosporin- und UV- Behandlungen. Dabei zeigte ΔAven einen stärkeren anti-apoptotischen Effekt als das volle-Länge-Aven in vivo. Die Tatsache, dass ΔAven ein höheres anti-apoptotisches Potential als das volle-Länge-Aven-Protein aufweist, deutet auf eine mögliche Spaltung oder Konformationsänderung von Aven in vivo hin, die zur Entstehung eines aktiven anti-apoptotischen C-terminalen Proteins führt. Um dies nachzuweisen, wurden einzel- und doppel-getaggte Fusionskonstrukte kloniert. Western Blot Analysen mit dem anti-Aven B Antiserum zeigten zusätzlich zu der volle-Längen-Aven- Bande (50 kDa) eine kleinere immunreaktive Bande mit einer Größe von ca. 35 kDa. Nach Apoptoseinduktion nahm die relative Menge dieser kleineren Bande zu. Das 35 kDa Aven-Spaltprodukt wurde nicht nur nach Überexpression, sondern auch auf endogener Proteinebene detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Spaltung Caspasen-abhängig ist. Eine Behandlung der Aven-überexprimierenden Zellen vor Apoptoseinduktion mit dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk blockierte die Spaltung von Aven vollständig. Gleiche Ergebnisse konnten mit dem endogenen Protein gezeigt werden. Obwohl die Aven-Sequenz keine in silico vorausgesagten Spaltstellen für Caspasen enthält, zeigten in vitro Experimente mit rekombinanter Caspase-3, dass Aven von Caspase-3 direkt prozessiert wird. In vivo Experimente mit Wildtyp-MCF-7-Zellen, die keine endogene Caspase-3 exprimieren, sowie mit transfizierten MCF-7-Zellen, die Caspase-3 stabil exprimieren, bestätigten dies. Aven wurde nur in den mit Caspase-3 transfizierten MCF-7-Zellen nach Staurosporin-Behandlung in das 35 kDa Fragment gespalten. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die das N-terminale Ende von Aven erkennen (anti-Flag oder anti-Aven A) zeigten eine zusätzliche kleinere Bande. Dieses Spaltprodukt ist ungefähr 30 kDa groß, und im Vergleich mit dem 35 kDa Aven-Peptid veränderte sich seine Expression kaum unter apoptotischen Bedingungen. Dieses Aven-Fragment ist jedoch nicht das Ergebnis einer Caspase-Spaltung, weil seine Entstehung nicht durch z-VAD-fmk inhibiert wurde. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch Serin-Proteasen nicht für diese Spaltung verantwortlich sind. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus von Aven gerichtet sind, zeigten erstaunlicherweise kein zusätzlichen Aven-Spaltprodukte, sondern nur das volle Länge-Aven-Protein. Offensichtlich ist das entstehende C-terminale Fragment nach Spaltung durch Caspase-3 instabil und kann nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche, nicht näher identifizierte 40 und 45 kDa große Aven Spaltprodukte wurden in MCF7-Zellen detektiert, die jedoch nicht in RKO-, HeLa-, oder 293T-Zellen beobachtet wurden. Mit Hilfe einer frei verfügbaren Software (GrabCas; ein Programm, das auch Granzyme Bund Caspase-Spaltstellen voraussagt, die sich von den Konsensusspaltsequenzen unterscheiden) sowie mit Western Blot Analysen von verschiedenen Aven-Deletionsmutante sollten potenzielle Schnittstellen näher charakterisiert werden. Dabei wurde die Spaltung durch Caspase-3 bei D293 (oder D287) bestätigt. Außerdem wurden zusätzliche mögliche Spaltstellen bei aa 240 oder zwischen aa 142-175 in Aven gefunden. Eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 142 und 175 würde zu einem ähnlichen C-terminalen Aven-Peptid führen wie das artifizielle ΔAven und sollte von daher potente anti-apoptotische Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Spaltstelle wurde ungefähr bei aa 100 kartiert. Die Isolierung von Aven Spaltprodukten aus eindimensionalen SDS-PA Gelen für eine nachfolgende massenspektrometische Analyse war aus technischen Gründe leider nicht erfolgreich. Die vorausgesagte Aven-Prozessierungsstellen sowie die in Western Blot Analysen beobachteten Aven-Fragmente lassen die Schlussfolgerung zu, dass Aven nach proteolytischer Aktivierung (d. h. nach Abspaltung inhibierender N-terminaler Sequenzen) anti-apoptotische Eigenschaften annimmt. Das generierte C-terminale Peptid wird dann möglicherweise durch Caspase-3-Spaltung bei D293 inaktiviert, wenn ein starker apoptotischer Stimulus auftritt. Zu Aufklärung der physiologischen Funktion von Aven in Normalgewebe und um zu untersuchen, ob Aven bei der Tumorentstehung eine Rolle spielt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Dazu wurde die humane Aven-cDNA zum einen unter der Kontrolle eines Hühner-ß-Aktin-Promotors und eines CMV-Enhancers kloniert. Diese Kombination regulatorischer Elemente sollte zu einer hohen und ubiquitären Expression des Transgens führen. Zusätzlich wurde die humane Aven-cDNA in den Vektor p1017 unter die Kontrolle des proximalen lck-Promotors kloniert, der eine Expression in unreifen T Zellen erlaubt. Die Etablierung der Mauslinien wurde in Kollaboration mit dem GSF-Institut für Experimentelle Genetik (AG Prof. M. Hrabé de Angelis) in München durchgeführt. Bei einer Untersuchung der Organe zeigte sich, dass in der ß-Aktin Aven-transgenen Maus eine starke Überexpression von Aven nur im Herz nachgewiesen wurde. Diese transgenen Mäuse werden zurzeit in Kollaboration mit Dr. S. Barrère-Lemaire (Institut of Functional Genomics, Montpellier, Frankreich) analysiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine lck Aven-Maus Linie untersucht. Western Blot Analyse zeigten eine starke Proteinexpression des Transgens im Thymus und auch in reifen T-Zellen (Milz). Mit Hilfe des anti-Aven C Antiserums konnte im Western Blot ein weiteres, vorher nicht beobachtetes Aven-Spaltprodukt in Thymozyten und aufgereinigten periphären T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Überexpression von Aven in Thymozyten und gereinigten T-Zellen hatte jedoch keine messbare Inhibition von Apoptose zur Folge. Dagegen wurde eine Inhibition der aktivierungsinduzierten Proliferation von T-Zellen in transgenen Aven-Mäuse beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten die transgenen Aven-Mäuse keine spontane Tumorentwicklung obwohl eine Korrelation zwischen Aven-Expression und einer schlechten Prognose in Kinderleukämien publiziert worden ist. Um zu untersuchen, ob Aven in Kombination mit anderen Onkogenen in Tumorentstehung oder Progression kooperieren kann, sollen transgene Aven-Mäuse mit anderen transonkogenen Mausstämmen (z.B. p53-/- Mäusen) gekreuzt werden.
Gehirne von an Scrapie erkrankten Tieren sind histopathologisch durch Vakuolisierung, Astrogliose, Neurodegeneration und charakteristische PrPSc-Ablagerungen gekennzeichnet. Die pathologischen Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, sind noch weitgehend unverstanden. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression in Scrapie-infizierten Mausgeweben kann zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen dieser Erkrankung auf molekularer Ebene beitragen. Auch könnten einige der differentiell exprimierten Gene zur Entwicklung eines auf Surrogatmarkern basierenden Testsystems beitragen oder für die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Intervention nützlich sein. Um im Verlauf der Scrapieerkrankung in Mäusen hoch- oder herunterregulierte Gene zu identifizieren, wurden RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) und suppression subtractive hybridisation (SSH) an Hirn- und Milzproben Scrapie-infizierter Mäuse und gesunder Kontrolltiere durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anhand eines differentiellen Screening-Schrittes, Sequenzanalysen und Northernblots bestätigt. Durch einen Datenbankabgleich der erhaltenen Sequenzen wurden mehrere Kandidaten identifiziert. Einige davon, wie GFAP, Apolipoprotein D, Vimentin, Mx-Protein, MHC I und II wurden bereits als in Scrapie-infizierten Gehirnen hochreguliert von anderen Arbeitsgruppen publiziert. Eine differentielle Regulation weniger weiterer Kandidaten, wie Cytochromoxidase, Ubiqitinierungsfaktor E4a und das herunterregulierte Stathmin wurden bisher noch nicht beschrieben. Auch eine bisher unbekannte differentiell exprimierte Sequenz wurde gefunden. Ergänzend zu den Untersuchungen auf Nukleinsäureebene wurde die 2DElektrophorese für Gehirngewebe zur Untersuchung der differentiellen Expresssion auf Proteinebene unter Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen etabliert. Protokolle für die Vorbereitung von Mäusegehirnproben, die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung und der 2. Dimension, sowie Färbeprotokolle für qualitative und quantitative Analysen der Gele unter Berücksichtigung der Erfordernisse nachfolgender MALDI-Analysen wurden erarbeitet.
Der Einfluss von Stress auf einen Organismus führt zur Expression molekularer Chaperone unterschiedlichster Hitzestressprotein-(Hsp)-Familien, die die Zellen vor stressbedingten Schäden schützen. Mitglieder der Hsp2O-Familie (kurz small Hsps, sHsps) besitzen ein Molekulargewicht von 12-43 kDa und sind durch einen zentralen, evolutiv konservierten Bereich, der als alpha-Crystallin-Domäne (ACD) bezeichnet wird, gekennzeichnet. Diese besteht größtenteils aus beta-Strängen, während die flankierenden Bereiche hingegen variabel in Länge, Sequenz sowie Sekundärstrukturen sind. sHsps bilden mit Hilfe der Sekundärstrukturen oligomere Komplexe aus. Darüber hinaus besitzen sie eine ATP-unabhängige Chaperonaktivität und spielen beim Schutz thermosensitiver Proteine eine wichtige Rolle. In Pflanzenzellen führt ein anhaltender Hitzestress zur Ansammlung von sHsps zu so genannten Hitzestressgranula (HSGs), die sich wiederum zu größeren HSG-Komplexen (HSCs) organisieren. Eine mögliche Funktion von HSCs ist der Schutz zellulärer denaturierter Proteine vor einer irreversiblen Aggregation. Durch deren Bindung mittels sHsps und Eingliederung in den HSC-Verband werden die denaturierten Proteine in einem faltungskompetenten Zustand gehalten. Schließlich können die mit den HSCs assoziierten ATP-abhängigen Hsp-Maschinen (z.B. Hsp70/40, Hsp100) die sHsp-gebundenen Substrate renaturieren. Wie in der vorliegenden Arbeit dargestellt, weisen Pflanzen die höchste soweit bekannte Anzahl von sHsp-Genen auf. Die korrespondierenden Proteine werden anhand ihrer Primärsequenz und subzellulären Lokalisation in verschiedene Klassen eingeteilt: sHsps der Klassen CI und CI1 befinden sich im nucleo-cytoplasmatische Raum, sHsps der Klasse M in Mitochondrien, der Klasse P in den Plastiden und der Klasse ER im endoplasmatischen Reticulum sowie im Golgi-Apparat. Da das Genom von Arabidopsis thaliana das erste komplett sequenzierte pflanzliche Genom ist, eignete sich dieser Modelorganismus zur Identifikation aller sHsp kodierenden Gene. Der Einsatz von Protein- und Nukleotidsequenzen bereits bekannter pflanzlicher sHsps als Suchkriterium in der NCBI-Datenbank (BLASTP und BLASTN), ergab die ldentifikation 19 putativer sHsp kodierender Gene, von denen erstaunlicheweise 13 bislang noch nicht bekannt waren. Proteinsequenzvergleiche ergaben, dass 7 der neu entdeckten sHsps nicht den typischen Klassen zugehörig sind. Dies bildete den Ausgangspunkt für deren nähere Analyse und Charakterisierung im Rahmen des ,,Functional Genomics": (1) Lokalisationsstudien I: Myc-Epitop markierte sHsp-Konstrukte wurden transient in Tabak-Mesophyllprotoplasten transformiert. Über Lokalisationsstudien per lmmunfluoreszenz konnten diese Proteine in tatsächlich 7 neu definierte sHsp Klassen eingeteilt werden. Interessanteweise werden die Vertreter dieser neuen Klassen von jeweils nur einem Gen kodiert. Die Vertreter der Klassen CI11 bis CVII lokalisieren im nucleo-cytoplasmatischen Kompartiment. Ferner bewiesen die Kodetektionen von organellären Markerproteinen, dass Klasse MII sHsps in die Mitochondrien und Mitglieder der Klasse Po in die Peroxisomen transportiert werden. Dies stimmte überein mit der Vorhersage von organellären Signalsequenzen. (2) Lokalisationsstudien II: Frühere Studien zeigten, dass sHsps der Klassen CI und CII unter Hitzestressbedingungen HSCs ausbilden. Wahrscheinlich fungieren Klasse CII sHsps als Grundgerüst für die HSC-Bildung und rekrutieren sHsps der Klasse CI in diese Multichaperonkomplexe. Die Proteine (Myc-markiert) Hsp17.4-CIII, Hsp15.4-CIV, Hsp18.5-CVI und Hsp14.7-CVII wurden unter Hitzestressbedingungen in endogene HSCs von Tabak-Mesophyllprotoplasten eingegliedert. Dieses Phänomen bleibt auf die genannten sHsp Klassen beschränkt, da weder Hsp21.7-CV, noch die organellären Proteine Hsp26.5-MI1 sowie Hsp15.7-Po in HSCs detektiert wurden. (3) Das sHsp-lnteraktom: Im Gegensatz zu früheren Studien, konnte in der vorliegenden Arbeit eine lnteraktion zwischen sHsps verschiedener Klassen zum ersten Mal im Hefe-Zwei-Hybrid-System sowie über Pull-down und nativer SDS-Gelelektrophorese detektiert werden. Am Beispiel eines Klasse CIII sHsps wurde gezeigt, dass die lnteraktion mit sHsps anderer Klassen zu einer Heterooligomerisierung führt. Dies wiederum hat eine nachhaltige Beeinflussung der intrazellulären Lokalisation der sHsps zur Folge. (4) Darüber hinaus ist für sHsps der Klasse CIII typisch, dass sie aufgrund einer Kernlokalisationssequenz innerhalb der ACD in den Nukleus transportiert werden. Im Vergleich zu sHsps der Klassen CI und CII, die Oligomere Strukturen von 220-230 kDa ausbilden, assemblieren sHsp-Monomere der Klasse CIII zu hochmolekularen Komplexen im Bereich von 1 MDa. (5) Das sHsp-Transkriptom: Durch RT-PCR-Analysen und Auswertung der öffentlich zugänglichen Microarray-Daten des AtGenExpress Konsortiums, konnte die Expression aller sHsps kodierenden Gene im Arabidopsis Genom auf transkriptioneller Ebene analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben Hitzestress auch der Einfluss anderer abiotischer Stressoren, wie U. a. oxidativer stress und UV-B Bestrahlung, zu einer Akkumulation von sHsp-Transkripten führt. Ferner werden einige sHsps in bestimmten Entwicklungsstufen bzw. Organen, wie z.B. Blüten, Blättern und Samen, unabhängig von Stresseinflüssen exprimiert. (6) Funktionelle Analysen: Ein seminatives in vitro Chaperontestsystem, in dem Luciferase als thermosensitives Modelsubstrat eingesetzt wird, wurde herangezogen, um ausgesuchte sHsps bezüglich ihrer möglichen Chaperonfunktion zu testen. In Abhängigkeit der rekombinant hergestellten Proteine Hsp18.5-CVI, Hsp26.5-MII und Hsp15.7-Po konnte eine verminderte Aggregation der Luciferase unter Hitzestresseinwirkung und eine darauf folgende erhöhte Renaturierung durch ATP-abhängige Chaperonmaschinen während einer Erholungsphase beobachtet werden. (7) Peroxisomale sHsps: Da nie zuvor über peroxisomale sHsps berichtet wurde, nahm Hsp15.7-Po eine besondere Rolle bei den Untersuchungen ein. Dieses Protein besitzt eine putative peroxisomale Lokalisationssequenz (PTS) am C-Terminus, bestehend aus der Abfolge der Aminosäurereste SKL (PTS1). Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Studien und lmmunfluoreszenzanalysen (in Tabak-Mesophyllprotoplasten und Säugerzellen) sowie den Einsatz von Mutanten wurde demonstriert, dass die PTS1 tatsächlich für die lnteraktion von Hsp15.7-Po mit den TPR-Domänen des peroxisomalen Importrezeptors Pex5 und für die peroxisomale Lokalisation des sHsps verantwortlich ist. Ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening nach möglichen lnteraktionspartnern von Hsp15.7-Po lieferte den ersten Anhaltspunkt für die lnteraktion mit cytoplasmatischen sHsps (Hspl7.7-CII). Dies ließ sich durch Pull-down-Analysen bestätigten und auf Hsp17.6-CII erweitern. Diese Interaktionen beeinflussten jedoch nicht die subzelluläre Lokalisation der jeweiligen Proteine bei Koexpression in Tabak-Mesophyllprotoplasten. All die hier dargestellten Ergebnisse weisen auf diverse Funktionen der einzelnen neu identifizierten sHsps der unterschiedlichen Klassen hin und bilden die Grundlage für zukünftige, detaillierte in planta Untersuchungen, die hierdurch erleichtert werden können.
Zwei der wichtigsten Leistungen eines sich entwickelnden Embryos sind der Aufbau des Blutkreislauf- und des Nervensystems. Beide Systeme sind hierarchisch organisierte Strukturen, deren Verzweigungen nahezu alle Teile des Körpers erreichen. Es gibt eine zunehmende Zahl von Hinweisen darauf, dass ihre Entwicklung eng miteinander verknüpft ist, nach ähnlichen Prinzipien verläuft und verwandte molekulare Mechanismen verwendet. Die Entstehung eines funktionellen vaskulären Netzwerks erfordert Signale, die Prozesse wie die Lenkung und die Verzweigung von Gefäßen in den Zielgeweben kontrollieren. Ähnliche Anforderungen werden an wachsende Axone bei der Knüpfung der Verbindungen des Nervensystems während der Embryonalentwicklung gestellt. Einige der Faktoren, die die Lenkung der Axone kontrollieren, spielen auch eine ähnliche Rolle in der vaskulären Entwicklung. Lenkungsmoleküle, die eine Richtungsinformation vermitteln, sind für die Wegfindung der Axone besonders wichtig. Die größte Familie solcher Lenkungsmoleküle wird durch die Semaphorine gebildet. Semaphorine können in acht Klassen unterteilt werden, deren gemeinsames Merkmal eine konservierte Semaphorin-Domäne ist und die unterschieden werden anhand ihrer Klassen-spezifischen carboxyterminalen Domänen. Die Semaphorin-Familie umfasst sowohl sekretierte als auch membrangebundene Proteine. Die am besten charakterisierten hiervon sind die sekretierten Klasse 3 Semaphorine. Eine Kombination von in vitro und in vivo Ansätzen zeigte, dass die Klasse 3 Semaphorine an der Steuerung der Axon- und Dendritenlenkung, der Bildung von Axonbündeln und der neuronalen Migration während der Entwicklung des Nervensystems beteiligt sind. Sie agieren hauptsächlich als repulsiv wirkende Signale, die Axone aus Regionen ausschließen, von den Geweben weg, in denen sie exprimiert sind. Diese Wirkung wird über die Semaphorin-Domäne vermittelt. Verschiedene Hinweise deuten auf eine Beteiligung von Semaphorinen an der Entwicklung des vaskulären Systems. Sowohl homozygote Sema3a- als auch Sema3c-Mausnullmutanten sterben nach der Geburt aufgrund kardiovaskulärer Defekte. Darüber hinaus binden die Rezeptoren für die Klasse 3 Semaphorine, Neuropilin-1 (Nrp-1) und –2 (Nrp-2), einige Isoformen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Neuropilin-1 und Neuropilin-2-defiziente Mäuse und Neuropilin-1/-2-Doppelmutanten weisen Defekte des Gefäßsystems auf, wie z.B. eine Rückbildung der neuralen Vaskularisierung und Abweichungen in der Entwicklung des Herzens und der großen Gefäße. Die membrangebundenen Semaphorine sind bisher nur wenig untersucht, da zuverlässige in vitro Assays fehlen. Somit ist ein genetischer Ansatz der beste Weg, die physiologische Funktion dieser Proteine zu untersuchen. Aus diesen Gründen war die Zielsetzung dieser Arbeit, durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen eine Mauslinie herzustellen, die ein Nullallel des membrangebundenen Sema5a-Gens trägt. Für diesen Ansatz wurde ein Mitglied der Klasse 5 Semaphorine gewählt, da es nur zwei Mitglieder dieser Klasse im Mausgenom gibt, die weitgehend komplementäre Expressionsmuster aufweisen. Damit unterscheiden sie sich von den anderen Klassen der Semaphorine, deren Mitglieder stark überlappende Expressionsmuster zeigen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer gegenseitigen funktionellen Kompensation nach Mutation eines Gens. Die Klasse 5 Semaphorine sind auch deshalb besonders interessant, da sie die einzigen sind, die sowohl in Vertebraten als auch in Invertebraten vertreten sind. Sie sind gekennzeichnet durch sieben carboxyterminale Typ 1-Thrombospondinmodule (TSP) in ihrer extrazellulären Domäne. TSPs wurden ursprünglich in den Proteinen Thrombospondin 1 und 2 gefunden, in denen sie das Auswachsen von Neuriten verschiedener Nervenzelltypen fördern. Dies lässt vermuten, dass Klasse 5 Semaphorine sowohl inhibierende als auch stimulierende Effekte haben könnten, in dem sie unterschiedliche Rezeptoren mit der Semaphorin-Domäne oder der TSPs aktivieren. Das Expressionsmuster von Sema5A und die bekannte Funktion von Semaphorinen in der Ausbildung neuronaler Verbindungen lassen es sinnvoll erscheinen, bei der Untersuchung der mutanten Tiere den Schwerpunkt auf die Entwicklung des Nerven- und des Gefäßsystems zu legen. Aufgrund technischer Schwierigkeiten konnte innerhalb der Bearbeitungszeit dieser Doktorarbeit nur der Phänotyp des vaskulären Systems untersucht werden. Die Inaktivierung des Sema5a-Gens wurde durch die Verwendung eines ‚Targeting’-Vektors erreicht, welcher die Exone 4 und 5 des Sema5a-Gens durch eine Neomycin-Selektionskassette ersetzte. Aus 144 untersuchten ES-Zellklonen wurden drei ES-Zellinien mit einem rekombinierten Sema5a-Locus identifiziert. Zwei der positiven Klone wurden zur Herstellung einer chimären Maus durch die Morula-Aggregationsmethode verwendet. Mit einem der Klone konnte eine männliche Chimäre erzeugt werden, die nach Kreuzung mit NMRI-Wildtyptieren die Mutation an die Nachkommen weitergab. Der Verlust der Proteinexpression in homozygoten Sema5a-Mutanten wurde durch Westernblot-Analyse von Zellmembranpräparationen homozygoter Embryonen unter Verwendung eines Antikörpers gegen das zytoplasmatische Ende von Sema5A bestätigt. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Deletion des vierten und fünften Exons des Sema5a-Gens ein Nullallel hervorbringt. Nach Verpaarungen heterozygoter Mutanten konnten keine Neugeborenen identifiziert werden, die homozygot für das mutierte Allel waren. Homozygte Mutanten starben zwischen E11,5 und E12,5 der Embryonalentwicklung, der Verlust von Sema5A ist also embryonal letal. Die Morphologie der homozygoten Tiere zeigte keinen offensichtlichen Unterschied zu den heterozygoten Embryonen oder zu Wildtyp-Geschwistern auf. Frühe embryonale Musterbildungsprozesse in Sema5a-Nullmutanten sind also nicht gestört. Ein Tod bei dieser Entwicklungsstufe deutet auf einen Defekt in der Entwicklung des Blutgefäßsystems hin, da die Embryonalstadien zwischen E9 und E13 besonders wichtig für die Ausbildung dieser Gefäße sind und viele Mutationen, die Herz und Blutgefäßen beeinträchtigen, den Tod der Embryonen in diesem Stadium bewirken. Das embryonale Blutgefäßsystem in E10,5 und E11,5 Embryonen wurde durch immunhistochemische Färbungen ganzer Embryonen unter Verwendung eines spezifischen gegen das Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule (PECAM) gerichteten Antikörpers dargestellt, welches in vaskulären Endothelzellen exprimiert ist. Die allgemeine Architektur des Gefäßsystems war in homo- und heterozygoten Mutanten ähnlich und wies weder an E10,5 noch an E11,5 besondere Abweichungen auf. Es wurden bei der Lage und der Anzahl intersomitischer Gefäße, der Entwicklung der dorsalen Aorta oder der Vaskularisierung der Extremitätenanlagen keine Abweichungen festgestellt. Morphologische Defekte konnten jedoch bei E10,5 in den Verästelungen der Blutgefäße detektiert werden, die von den Hauptvenen der Cranialregion abzweigen. Die Verzweigungen waren geringer ausgeprägt als in heterozygoten oder Wildtyp-Vergleichstieren. Insbesondere zeigte sich eine Verringerung der Anzahl sekundärer und tertiärer Verzweigungen. In dem sich entwickelnden Embryo führt die wiederholte Verzweigung von Ästen der Hauptvenen zu einem hierarchisch gegliederten Netzwerk großer Gefäße in der Region des medialen Kopfes. Während die Ausbildung dieses Netzwerkes in den Sema5a-/--Tieren beeinträchtigt ist, erscheint die Organisation der kleinen Gefäße in den mehr dorsal und peripher gelegenen Regionen des Kopfes normal. In heterozygoten und homozygoten Mutanten bilden die kleineren Gefäße ein dicht verzweigtes Netzwerk. Die Verminderung der Komplexität der größeren Gefäße konnte in allen untersuchten Nullmutanten beobachtet werden. Es variierte jedoch die Penetranz des Phänotyps. In allen Fällen war die Anzahl primärer Verzweigungen unverändert, während die Anzahl der sekundären und der tertiären Verzweigungen zu unterschiedlichen Graden reduziert war. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Verzweigungsmuster von heterozygoten Mutanten und beim Wildtyp nur eine geringe Variabilität zwischen individuellen Embryonen. Dies belegt, dass die Verminderung des Verzweigungsgrades größerer Gefäße nicht innerhalb der normalen Variabilität liegt, sondern durch die Inaktivierung des Sema5a-Gens verursacht wird. Dieser Phänotyp ist in späteren Stadien sogar deutlicher ausgeprägt. In E11,5 Embryonen waren die Stämme der großen Blutgefäße in den Nullmutanten weniger komplex und in einigen Fällen trat sogar eine Reduzierung der Anzahl primärer Verzweigungen auf. Diese spätere Verminderung der Anzahl bereits ausgebildeter primärer Verzweigungen legt nahe, dass der Phänotyp durch eine Rückbildung von Verzweigungen aufgrund möglicher Defizite in deren Reifung und/oder Stabilisierung erfolgt. Die interessanteste Besonderheit der vaskulären Defekte in den Nullmutanten liegt in ihrer regionalen Spezifität. Bis hier ist das Netzwerk großer Gefäße, welches der anterioren Hauptvene entspringt, das einzige Gefäßsystem, in dem Abweichungen entdeckt wurden. Dieses Netzwerk wird durch die strukturelle Umbildung des primären kapillaren Plexuses gebildet. Zwischen E9,5 und E12 sprießen Zweige rostral aus der Hauptvene, um ein hierarchisch organisiertes Netzwerk von Gefäßen zu bilden. Die Umbildung des primären kapillaren Plexus in den mehr rostral und ventral gelegenen Kopfregionen führt zu der Bildung eines hochverzweigten vaskulären Netzwerkes, welches jedoch bei E10,5 noch nicht hierarchisch organisiert erscheint. Die Signale, die für diesen unterschiedlichen Ablauf der Musterbildung während der Entwicklung des Gefäßsystems des Kopfes verantwortlich sind, sind noch unbekannt. Die besonderen Defekte in der stereotypischen Organisation der cranialen Gefäße in Sema5a-Mutanten legt nahe, dass Sema5A eines dieser Signale sein könnte. Es könnte Teil eines Rezeptor/Ligandenkomplexes sein, welcher positionelle Signale für das Verzweigen und das Wachstum großer Gefäße in rostraler Richtung liefert. Sema5A könnte die Bildung von Verzweigungen durch die Regulierung der Wanderung endothelialer Zellen, ihrer Proliferation oder ihrer Interaktion mit unterstützenden Zellen oder der extrazellulären Matrix kontrollieren. Sema5A könnte Teil eines neuen Signalweges sein oder als Teil eines der bekannten Signalwegs wirken, welcher die Entwicklung des Gefäßsystems reguliert. Einer der Signalwege, die essentiell für die Gefäßbildung sind, wird durch VEGF und Angiopoietin (Ang-1) reguliert. Sowohl in VEGF-, als auch in Ang-1-Mutanten ist die Gefäßumbildung im Kopf beeinträchtigt. Insbesondere erscheint das Netzwerk kleiner Gefäße in den Ang-1 Nullmutanten als nur nur teilweise restrukturiert und die großen Gefäße als weniger komplex. Das Verzweigungsmuster der großen Gefäße in den Ang-1- Nullmutanten ähnelt auffallend dem der Sema5a-Nullmutanten. Eine zweite Ähnlichkeit in den Phänotypen von Ang-1- und Sema5a-Mutanten zeigt sich in der Reduzierung der primären Verzweigungen, welche in den Sema5a-Nullmutanten bei E11,5 beobachtet wird. Hier könnte die Verminderung aus einer Rückbildung von Gefäßen resultieren, wie sie auch typischerweise in Mutanten für Ang-1 oder dessen Rezeptor auftritt. Diese Beobachtung legt nahe, dass Sema5A ein neuer Teilnehmer innerhalb des Ang-1-Signalweges ist, welcher die Auswirkung von Ang-1 auf die endothelialen Zellen der großen Gefäße entweder vermittelt oder moduliert und dadurch das spezifische Muster der Blutgefäße des Kopfes beeinflußt. Mit dieser Doktorarbeit wird zum ersten Mal eine funktionelle Untersuchung des Klasse 5 Semaphorins Sema5A vorgestellt. Die phänotypische Untersuchung von Mäusen, die Nullallele für Sema5a-Gens tragen ergab, dass dieses membrangebundene Protein essentiell für die embryonale Entwicklung ist. Es ist an der Musterbildung des Gefäßsystems beteiligt. Seine Aufgabe besteht möglicherweise darin, die Bereitstellung positioneller Signale für die Ausbildung von Gefäßverzweigungen zu gewährleisten. Einige grundlegende Fragen werden durch diesen Phänotyp aufgeworfen. Sowohl die Ursache für die embryonale Sterblichkeit als auch die zellulären Prozesse, welche in den Sema5a-Nullmutanten beeinträchtigt sind, müssen noch beschrieben werden. Unbekannt ist ebenfalls, ob zusätzlich zu der hier beschriebenen Rolle von Sema5A in der Gefäßbildung dieses an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist. Die ersten Daten über die physiologische Rolle von Sema5A, welche mit dieser Arbeit vorgelegt werden, öffnen den Weg für weitergehende Untersuchungen über die Funktion des Proteins während der Embrionalentwicklung. Das hier erstmals vorgestellte Modellsystem ermöglicht es, Sema5A regulierte zelluläre Mechanismen zu untersuchen. Zusätzlich stellt es ein Werkzeug zur Verfügung, um die funktionelle Beziehung zwischen der Entwicklung des kardiovaskulären Systems und des Nervensystems zu untersuchen. Damit können die Aufgaben der Semaphorin-Proteinfamilie, die an diesen beiden wichtigen Prozessen beteiligt sind, näher charakterisiert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene proteomanalytische Methoden untersucht und evaluiert, die, basierend auf der Verwendung 2D-gelelektrophoretischer, 2D-chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken, die differentielle, quantitative Proteinanalyse zweier unterschiedlicher muriner Fibroblasten-Zelllinien ermöglichen. Hierfür wurden zunächst unterschiedliche Methoden für die 2D-elektrophoretische Proteinauftrennung analysiert. Im Hinblick auf eine größtmögliche Auflösung und Gel-zu- Gel-Reproduzierbarkeit wurden innerhalb der ersten Dimension (IEF) die Lademethode, die Fokussierungszeiten und der Reduktionsschritt (DTT oder HED) optimiert. Desweiteren wurde eine auf isoelektrischer Fokussierung basierende Vorfraktionierungsmethode auf ihre Anwendbarkeit bei einer quantitativen Proteomanalyse getestet. Für die Proteingelfärbung wurde unter anderem ein selbst synthetisierter Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, der hinsichtlich Färbesensitivität und MS-Kompatibilität mit etablierten Protokollen verglichen wurde. Eine Doppelfärbungs-Methode von Proteingelen (Silberfärbung nach Fluoreszenzfärbung) wurde auf ihre MS-Kompatibilität nach tryptischen Verdau untersucht. Desweiteren wurden manuelle und automatisierte Verdauprotokolle für eine möglichst hohe Peptide Recovery optimiert. Die zunächst durch die Anwendung von klassischen Färbe- und Quantifizierungsmethoden nach 2DE gewonnenen Ergebnisse wurden mit neueren Labelling-Methoden zur relativen Proteinquantifizierung verglichen. Dabei kamen zwei unterschiedliche Multiplexing-Verfahren zum Einsatz, die sich in der Proteinquantifizierung grundlegend unterscheiden (DIGE: gelbasierte Proteinquantifizierung; iTRAQ: LC-MS/MS basierte Peptidquantifizierung). Die für diese beiden Methoden bestehenden Protokolle wurden für die Anwendbarkeit auf die Fibroblasten-Proteinextrakte angepasst. Es konnte gezeigt werden, daß diese beiden Labelling-Methoden in Bezug auf Reproduzierbarkeit und quantitativer Aussagekraft dem klassischen 2DE-Experiment (Proteinfärbung nach der Auftrennung auf einzelnen Gelen) überlegen sind. Die statistische Absicherung der analysierten relativen Quantitätsunterschiede verbesserte sich durch die zusätzliche Anwendung der beiden neuen Labelling-Methoden erheblich. Dabei stützt sich die Signifikanz der quantitativen Bestimmung sowohl auf die große statistische Sicherheit, die innerhalb dieser beiden Multiplexing-Methoden erreicht wird, als auch auf die Wiederholbarkeit in unterschiedlichen Experimenten (21 Proteine wurden in unterschiedlichen Ansätzen bestätigt). Die beiden Labelling-Methoden DIGE und iTRAQ unterscheiden sich außer in der Quantifizierungsstrategie auch grundsätzlich in dem Ansatz der Auftrennung (DIGE: Proteine, 2DElektrophorese; iTRAQ: Peptide, 2D-Flüssigchromatographie). Damit besitzen sie unterschiedliche Limitierungen in Bezug auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Peptide/Proteine, die mit der jeweiligen Methode aufgetrennt werden können. Der daraus resultierende komplementäre Charakter beider Methoden konnte anhand mehrerer Proteine verdeutlicht werden. Durch die relative Quantifizierung konnten insgesamt 30 Proteine identifiziert werden, die aufgrund der An- oder Abwesenheit des MLL-Proteins in den beiden murinen Zelllinien differentiell reguliert sind. Die alleine schon durch die unterschiedliche Morphologie der untersuchten murinen Fibroblasten vermutete Deregulation von Struktur- und Stressproteinen (Actin, HSP27, HSP70) konnte bestätigt werden. Weitere Expressionsunterschiede zwischen Mll-/-- und Mll+/+-Fibroblasten zeigten sich vor allem bei Proteinen, die funktionell der Gruppe RNA-prozessierender Proteine (Polyadenylate Binding Protein, PTB-associated Splicing Factor, hnRNPs) zugeordnet werden können. Ein Vergleich der quantitativen Proteomdaten dieser Arbeit mit den mRNA-Expressionsprofilen der gleichen Zellen zeigt nur eine sehr geringe Korrelation bezüglich der Regulationen einzelner Gene/Proteine. Die meisten der bisherigen Studien, die eine Untersuchung des mRNA/Protein-Verhältnisses zum Gegenstand haben, bestätigen das Fehlen einer Korrelation. Diese Tatsache unterstreicht die Wichtigkeit der Kombination genomischer und proteinanalytischer Daten zur Aufklärung zellulärer molekularer Prozesse.
Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können.
Retrovirale Gen-Therapie-Vektoren haben die ethisch problematische Eigenschaft, ungerichtet in das Genom der therapierten Zellen zu integrieren und somit die Zelle gegebenenfalls durch Insertions-Mutagenese zu schädigen. Diese Problematik könnte gelöst werden, indem das zugrunde liegende Prinzip spezifisch integrierender, mobiler genetischer Elemente (Transposons) aufgeklärt und in die Retrovirus-basierten Gen-Therapie-Vektoren mit einbezogen werden könnte. Das Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum enthält eine Reihe von Non-LTR-Retrotransposons, die ausnahmslos Positions- und Orientierungs-spezifisch in die genetisch unproblematischen Regionen vor oder hinter tRNAGene integrieren (tRNA-Gen-assoziierte Retroelemente oder kurz TRE). Zur Untersuchung des Mechanismusses der Positions- und Orientierungs-spezifischen Integration von TRE-Retrotransposons wurde in D. discoideum ein in vivo Retrotranspositions-Testsystem etabliert, mit welchem de novo auftretende Retrotranspositions-Ereignisse endogener TRE-Retrotransposons auf methodisch einfache Weise festgestellt und analysiert werden konnten. Das in vivo Testsystem beruht auf der positiven Selektion derjenigen Zellen eines D. discoideum-Reporterstammes, in denen eines der selten auftretenden Retrotranspositions-Ereignisse stattgefunden hat. Die Herstellung des D. discoideum- Reporterstammes erfolgte durch die Veränderung des UMP-Synthase-Gens (pyr5-6), in welches artifiziell ein Intron (cbfAint) inklusive eines „Köder“-tRNA-Gens (valUAC) integriert wurde. Aufgrund der Integration eines TRE-Retrotransposons in die Nähe des „Köder“-tRNA-Gens kann das Intron nicht mehr korrekt aus der UMP-Synthase-Vorläufer-mRNA gespleißt werden, die Zellen konvertieren dadurch bedingt vom ura+- zum ura--Phänotyp und können deshalb mit dem für ura+-Zellen toxischen Zytostatikum 5-Fluoro-orotat (5-FO) positiv selektiert werden. Durch die detaillierte Analyse zahlreicher 5-FO-resistenter Klone konnte gezeigt werden, daß in modernen D. discoideum-Stämmen ausschließlich die oberhalb von tRNA-Genen integrierenden TRE5-Retrotransposons vom Subtyp A.1 und A.2 gleichermaßen aktiv sind und daß ein beliebiges „Köder“-tRNA-Gen in einer artifiziellen genomischen Umgebung als Integrations-Ziel für TRE5-A-Retrotransposons dienen kann. Die TRE5-A-Retrotransposons zeigten entsprechend den genomischen Kopien eine Positions-Spezifität von ca. 48 (±3) bp oberhalb des tRNA-Gens und Ziel-Sequenz-Verdopplungen von 12 – 15 bp. Alle de novo integrierten TRE5- A.1-Retrotransposons waren 5’-verkürzt, während 64% der TRE5-A.2-Retrotransposons ein intaktes 5’-Ende aufwiesen. Das nukleäre D. discoideum-Protein CMBF (C-Modul-bindender Faktor) bindet Sequenzspezifisch an das C-Modul von TRE5-A-Retrotransposons und könnte deshalb an der Regulation der Transkription und/oder Mobilisierung der TRE5-A-Retrotransposons beteiligt sein. Zur Untersuchung des Einflusses von CMBF auf die TRE5-A-Retrotranspositions-Frequenz wurde das in vivo Retrotranspositions-Testsystem im D. discoideum-Stamm JH.D2 etabliert, welcher mit ca. 5% des Wildtyp-Niveaus CMBF stark unterexprimiert. Die Herstellung von JH.D2 erfolgte durch Einführung eines amber-Translationsstop-Codons in das cbfA-Gen des Wildtyp-Stamms AX2 sowie Expression einer amber-Suppressor-tRNA. Durch die Herstellung eines murinen monoklonalen Anti-CMBF-Antikörpers konnte bewiesen werden, daß die CMBF-Unterexpression auf eine partielle Suppression des cbfA(amber)-Stop-Codons zurückzuführen ist. Die Unterexpression von CMBF führte zu einer Erniedrigung der zellulären Menge an Sense- und Antisense-Transkripten der TRE5-A-Retrotransposons und im in vivo Testsystem zu einer maßgeblichen Reduktion der Retrotranspositions-Frequenz. Das Protein CMBF zeigt in der JumonjiC-Domäne (JmjC) Homologie zu einer Vielzahl von Proteinen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen und könnte daher neben der Regulation der TRE5-A-Retrotransposition noch weitere biologische Funktionen in D. discoideum erfüllen. Die eingehende Untersuchung des Phänotyps der CMBFunterexprimierenden Mutante JH.D2 zeigte ein verlangsamtes Wachstum sowie einen um ca. 24 Stunden verzögerter Beginn der Entwicklung aufgrund der Inhibition des cAMP-Signalsystems. Durch die homologe Expression von CMBF und N-terminal verkürzter CMBF-Derivate konnte der Entwicklungs-Phänotyp von JH.D2 revertiert und somit der zelluläre CMBF-Mangel als alleinige Ursache für die phänotypische Veränderung von JH.D2 verantwortlich gemacht werden. Aufgrund von Zweifeln an der Richtigkeit des bislang angenommenen CMBF-kodierenden Gens (cbfA-Gen) wurde der Transkriptionsstart des cbfA-Locus mittels der 5’-RACE-Methode bestimmt und somit der Beginn des cbfA-Gens korrekt definiert. Das cbfA-Gen umfaßt demnach 3412 bp inklusive eines Introns von 409 bp und kodiert somit für ein 1000 Aminosäuren langes Protein mit einem rechnerischen Molekulargewicht von 114 198 kDa. Durch die Etablierung des in vivo Retrotranspositions-Testsystems in Dictyostelium discoideum sind die Voraussetzung für eine detaillierte Untersuchung der spezifischen Retrotransposition der TRE5-Retrotransposons gegeben. Die Herstellung der CMBF-unterexprimierenden D. discoideum-Mutante JH.D2 bietet die Möglichkeit einer eingehenden Funktions-Analyse der charakteristischen Domänen von CMBF.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.