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Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.
The heat stress response is characterized by the presence of heat stress transcription factors (Hsfs) which mediate transcription of heat stress genes. In tomato (Lycopersicon peruvianum) cell cultures the simultaneous expression of four Hsfs, which are either constitutively (HsfA1 and HsfA3) or heat-stress inducible (HsfA2 and HsfB1) expressed, results in a complex network with dynamically changing cellular levels, intracellular localization and functional interactions. In order to examine the relevance of their multiplicity as well as to get more insights into the complexity of the plant heat stress response, the individual tomato Hsfs were investigated with respect to their protein interactions in vitro and in vivo. To this aim, I used pull-down assays as well as yeast assays to study the following aspects: 1. Oligomeric state of Hsfs: the results show that all class A Hsfs (HsfA1, HsfA2 and HsfA3) are trimeric proteins and interact with each other via the oligomerization (HR-A/B) domain. The similarity of their HRA/B regions allows formation of homo- and heterooligomeric complexes between all class A Hsfs. This special property was investigated by mutational studies with HsfA2 indicating that the linker and the HR-B regions are the minimal part required for Hsf/Hsf interactions. The conserved hydrophobic amino acid residues of the HR-B region are most important whereas the amino acid residues of the linker may provide higher flexibility to the HR-B region. Another investigated factor was HsfB1. HsfB1 is a member of class B Hsfs, which are characterized by an oligomerization domain without the 21 amino acid residues linker inserted between the HR-A and HR-B regions. It has a low activator potential and exists exclusively as dimer. HsfB1 can not physically interact with class A Hsfs. However, HsfB1 and HsfA1, binding to adjacent HSE sites, are assumed to cause strong synergistic effects in gene activation. 2. Potential HsfB1 interacting proteins: we searched for HsfB1 interacting proteins by using recombinant His-tagged proteins with HsfB1 as baits in pull-down assays. Histones H2A, H2B and H4 were identified by means of Peptide Mass Finger Printing and N-terminal sequencing analyses. The three histones represent the major proteins in tomato whole cell extracts retrieved by HsfB1. 3. HsfA2/small heat stress proteins (sHsps) interaction: pull-down and yeast two-hybrid assays were used to study the specific interaction of HsfA2 with tomato class II sHsp. This interaction occurs via the oligomerization domain of HsfA2. Other members of the plant Hsp20 family, including class I sHsp, do not interact with HsfA2. Heterooligomers of HsfA2 with class II sHsp may represent precursor forms of the plant higher molecular weight cytoplasmic complexes of heat stress granules, which form during heat stress. The findings presented in this thesis are a contribution to support the concept of a Hsfs network via protein-protein interactions. These data, together with information obtained from other studies, are used to propose a tentative model of the complex Hsfs network controlling the plant heat stress response.
Ein transgenes Mausmodell zur Untersuchung der Zink-vermittelten Modulation des Glyzinrezeptors
(2002)
Zink (Zn2+) ist ein im Zentralnervensystem der Säuger weitverbreitetes Metallion, das in kleinen synaptischen Vesikeln hoch angereichert wird. Zink-reiche Vesikel sind besonders gut dokumentiert in exzitatorischen Synapsen, z.B. im Hippocampus, sie werden jedoch auch in inhibitorischen Synapsen von Neuronen des Rückenmarks oder der Retina gefunden. Nach exozytotischer Freisetzung dieser Vesikel in den synaptischen Spalt können Zink-Konzentrationen von bis zu zehn mikromolar erreicht werden. In vitro hat Zink modulatorische Effekte auf eine Vielzahl von Neurotransmitter-Rezeptoren, so u.a. auf Glutamat-Rezeptoren vom AMPA-, NMDA-, oder Kainat-Typ, aber auch auf GABAA- und Glyzinrezeptoren (GlyR). Zink wurde daher als endogener Neuromodulator vorgeschlagen. Der modulatorische Effekt von Zink auf den GlyR ist biphasisch: Niedrige mikromolare Konzentrationen bewirken eine Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme, höhere mikromolare Konzentrationen dagegen deren Inhibition. Dieser potenzierende Effekt von Zn2+ kann in transfizierten HEK 293 Zellen oder cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten durch eine Punktmutation im N-terminalen Bereich des α1-Polypeptids aufgehoben werden (D80A (Lynch et al., 1998), oder D80G (Laube et al., 2000)). Ein revers-genetischer Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit benutzt, um Rückschlüsse auf die physiologische Relevanz der Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme durch Zn2+ zu gewinnen: In einem „Knock-In“ Mausmodell wurde durch homologe Rekombination in ES-Zellen eine Mutation in der kodierenden Sequenz des GlyRα1-Genlocus eingeführt, die den o.g. AS Austausch (D80A) in der adulten ligandenbinden Untereinheit des GlyR bewirkt. Um die Veränderung des Genlocus zu minimieren war die als Selektionsmarker bei der Einführung der Mutation benötigte Neor-Kassette von zwei loxP-Sequenzen flankiert, und konnte so nach dem Nachweis des homologen Rekombinationsereignisses durch Wirkung der Cre-Rekombinase wieder entfernen werden. Nach Blastozysteninjektion homolog rekombinierter ES-Zellen zur Herstellung chimaerer Tiere und Keimbahntransmission der Mutation in einem Teil dieser Chimaeren konnten so Mauslinien mit zwei verschiedenen mutierten Allelen generiert werden: In zwei Linien wurde das intronisch miteingeführte Neor-Element bereits in ES-Zellen in vitro deletiert, wonach lediglich eine der loxP-Sequenzen verbleibt; in einer dritten Linie wurde der Selektionsmarker als intronische Insertion belassen. Während heterozygote Tiere aller drei Linien keinerlei offensichtliche Auffälligkeiten zeigen, findet sich bei homozygot-mutanten Tieren aller Linien ein mit der zweiten postnatalen Woche eintretender Phänotyp, dessen auffälligste Symptome eine verstärkte akustisch oder taktil induzierbare Schreckreaktion, ein erhöhter Muskeltonus, taktil induzierbarer Tremor und generalisierter Myoklonus sowie ein verlangsamtes Wiederaufrichten sind. Dieser Symtomkomplex ähnelt stark dem der spontanen Mutationen des GlyRs spasmodic, spastic oder oscillator und weist auf einen Verlust glyzinerger Inhibition als Ursache hin. Die verschiedenen Allele verursachen unterschiedlich starke Phänotypen: Das mutierte Allel, in welchem die Neor–Kassette deletiert ist, bewirkt einen schwachen Phänotyp, wohingegen das Verbleiben des intronischen Neor-Elements einen schwerwiegenderen Phänotyp zur Folge hat, und homozygote Tiere bis auf wenige Ausnahmen bis zur achten Lebenswoche sterben. Die Immunoblot-Analyse zeigt, daß bei homozygot mutanten Tieren dieser stärker betroffenen Linie ein partieller Verlust der Proteinexpression der GlyRα -Untereinheit auftritt. Dagegen ist in Tieren, in denen die Neor-Kassette deletiert ist, keine Verringerung der GlyRα-Expression durch Immunoblot nachweisbar. Der milde Phänotyp ist demnach am einfachsten durch den spezifischen pharmakologischen Effekt der Mutation, d. h. den Verlust der Zn2+-induzierten Potenzierung des GlyR, erklärbar. Hiermit wurde erstmals ein Hinweis daraufhin gewonnen, daß niedrige mikromolare Konzentrationen von Zn2+ für die physiologische Funktion des adulten GlyR notwendig sind. Darüberhinaus unterstreichen die Ergebnisse das Potential des GlyR als Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Muskel-relaxierender oder sedativer Substanzen, die - ähnlich der Wirkung von Zn2+ - einen potenzierenden Effekt auf die glyzinerge Inhibition haben.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
Die Chemoresistenz von Tumoren ist ein schwerwiegendes Problem in der Krebstherapie. Insbesondere das maligne Melanom gilt aufgrund seiner ausgeprägten Therapieresistenz als nahezu unheilbar. Ein erster Schritt zur Verbesserung der Chemotherapie von Tumoren ist das Verständnis von Mechanismen, die der Resistenz zugrunde liegen. Für die Aufklärung der Mechanismen ist die Molekularbiologie des chemoresistenten Phänotyps von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen im Transkriptionsmuster analysiert, die mit dem Erwerb von Chemoresistenz in Melanomzellinien einhergehen. Die Melanomzellinie MeWo wurde mit Abkömmlingen, die erworbene Resistenz gegen die DNA-schädigenden Agenzien Etoposid (MeWoEto1), Cisplatin (MeWoCis1) und Fotemustin (MeWoFote40) aufweisen, bezüglich ihres Transkriptionsmusters verglichen. Um zunächst eine möglichst große Anzahl von Genen in die Analyse einzubeziehen, wurden initiale Genexpressionsanalysen unter Verwendung des RZPD UniGene 1 Arrays durchgeführt. Dieses Array repräsentiert ca. 31.500 cDNA Sequenzen, die bei einer geschätzten Redundanz von 1,44 einer Anzahl von 21.875 verschiedenen Transkripten entsprechen. Geht man davon aus, dass der Mensch insgesamt über ca. 30.000 Gene verfügt, wurde durch die Verwendung dieses Arrays ein großer Teil aller humanen Gene untersucht. Unter definierten Selektionskriterien wurden 126 Gene ausgewählt, die als im chemoresistenten Phänotyp differentiell exprimiert angesehen wurden. Diese 126 Gene wurden mit 1.143 weiteren tumorassoziierten Genen für die Zusammenstellung und Produktion eines chemoresistenzspezifischen Kandidatengen-Arrays ausgewählt. In verifizierenden Analysen unter Verwendung des Kandidatengen-Arrays wurde eine differentielle Expression für 57 der initial selektierten Gene sowie für weitere 209 tumorassoziierte Gene festgestellt. Die in diesen Analysen angewandten Kriterien für die Definition differentieller Genexpression wurden in exemplarischen Northernblot-Analysen geprüft. Hier zeigte sich eine qualitative Übereinstimmung der Ergebnisse beider Methoden von 81,4%. Da zur Zeit noch keine Hochdurchsatz-Methoden für funktionelle Analysen zur Verfügung stehen, wurde versucht, den Kreis vielversprechender Kandidaten durch eine Integration von Ergebnissen anderer Experimente einzuengen. In Clusteranalysen zur Untersuchung von Verwandtschaftsgraden zwischen den resistenten Zellpopulationen zeigte die MeWoEto1-Zellinie eine vergleichsweise hohe Stabilität in ihrem Genexpressionsmuster über einen Zeitraum von ca. 2,5 Jahren, während MeWoCis1 und MeWoFote40 hier beträchtliche Schwankungen aufwiesen. Die Expressionsmuster der letzteren resistenten Linien zeigten zum spätesten analysierten Zeitpunkt Konvergenz, nachdem sie zunächst deutlich voneinander abwichen. Da die Wirkung sowohl von Cisplatin als auch von Fotemustin zur Bildung von DNA-Addukten führt, kann die Konvergenz als Ergebnis einer fortschreitenden Optimierung der Resistenz in beiden Linien gedeutet werden. Einzelne Gene wie z.B. PEPP2 und CRYAB, die konvergierend differentielle Expression zeigten, können demnach als vielversprechende Kandidaten für eine funktionelle Relevanz in der Resistenz gegen Cisplatin und Fotemustin betrachtet werden. Neben der Clusteranalyse wurden Ergebnisse von vergleichenden genomischen Hybridisierungen (CGH), der Untersuchung einer Deregulation von Kandidatengenen in mehreren der resistenten Linien oder nach Kurzzeitbehandlung von MeWo-Zellen mit den Zytostatika sowie Literaturdaten verwendet, um die Relevanz der differentiellen Expression für einzelne Gene zu validieren. Danach wurden unter anderen die apoptoserelevanten Gene CRYAB und STK17A sowie MPP1, AHCYL1, CYR61 und STMN3 als vielversprechende Kandidaten eingestuft. Ein weiteres bis dahin unbekanntes Gen aus der C2H2-Zinkfinger-Genfamilie, für das in initialen Analysen sowie in Northernblot und RT-PCR-Experimenten eine Überexpression in MeWoCis1 und MeWoEto1 nachgewiesen werden konnte, wurde bezüglich seiner mRNA-Sequenz vervollständigt und im Detail analysiert. Für dieses Gen konnte phänotyp- bzw. gewebespezifisches differentielles Spleissen sowie differentielle Polyadenylierung nachgewiesen werden. Das alternative Spleissen von Exon 3, dem aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zu bereits charakterisierten KRAB A Domänen die Funktion der transkriptionalen Repression zugewiesen werden kann, könnte für ein phänotypspezifisches Transkriptionsprogramm verantwortlich sein. Ausgehend von insgesamt 267 differentiell exprimierten Genen konnte der Kreis vielversprechender Kandidaten durch die Integration von Daten aus anderen Experimenten auf ca. 20 Gene eingeengt werden. Unmittelbar im Anschluss and die Dissertation werden diese Gene in funktionellen Analysen bezüglich ihrer Relevanz für den chemoresistenten Phänotyp analysiert.
Studies in particular of the last decade showed that active neurogenesis continuously takes place in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles of the adult rodent brain. Neurogenesis in the SVZ leads to migration of neuroblasts within the rostral migratory stream (RMS) and mature neuron formation mainly in the olfactory bulb (OB). According to present understanding, glial cells with astrocytic properties represent the actual adult neural stem cells. The cell types representing the various cellular transition states leading to the formation of mature neurons as well as the mechanisms controlling adult neurogenesis and neuroblast migration are poorly understood. A previous study from this laboratory demonstrated that the ATP-hydrolyzing enzyme nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2) is associated with type B cells, the presumptive neural stem cells. NTPDase2 is a protein of the plasma membrane with its catalytic site facing the extracellular space. It hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates to their respective nucleoside diphosphates. This raises the possibility that the signaling pathway via extracellular nucleotides is involved in the control of adult neurogenesis. Neurons as well as glial cells express several subtypes of receptors (P2 receptors) that are responsive to the nucleotides ATP, ADP, UTP, or UDP. P2X receptors are ATP-gated Na+, K+ and Ca2+ permeable ion channels, P2Y receptors are coupled to trimeric G-proteins. In order to probe for a functional role of nucleotides in adult neurogenesis, the present study referred to an in vitro system (neurospheres). Neurospheres produced from isolates of the mouse SVZ and cultured in the presence of EGF and bFGF expressed the neural stem cell marker nestin and also GFAP, S100β, NTPDase2 and tissue non-specific alkaline phosphatase. Neurospheres generated from the cells of the subventricular zone were multipotenital. This was revealed by immunostaining of differentiated cells with markers for astrocytes, neurons and oligodendrocytes. The presence of ecto-nucleotidase was verified by analyzing the free phosphate released from nucleotides. The tissue non-specific form of alkaline phosphatase was the predominant enzyme. Both NTPDase2 and TNAP could be identified by immunocytochemistry and Western blotting. Hydrolysis was not observed for p-nitrophenyl thymidine monophosphate, a substrate of members of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family (NPP1 to NPP3). Since ecto-nucleotidases control the availability of extracellular nucleotide agonists, neurospheres were studied for the potential expression and functional role of nucleotide receptors. Neurospheres responded to extracellular nucleotides with a transient rise in Ca2+ (ATP = ADP > UTP). The rise in Ca2+ was due to P2Y receptors. The Ca2+ response was unaltered in the absence of extracellular Ca2+ and strongly reduced by thapsigargin, a blocker of internal Ca2+ stores. The P2Y1 antagonist MRS2179 strongly reduced the ATP- or ADP-induced increase in Ca2+, suggesting the involvement of a P2Y1 receptor. In addition, suramin and PPADS, non-selective antagonists for P2 receptors, inhibited most of the Ca2+ response. The agonistic activity of UTP and the lack of response to UDP implied the additional presence of a P2Y2 and/or a P2Y4 receptors and the absence of a functional P2Y6 receptor. RT-PCR experiments demonstrated that neurospheres expressed P2Y1 and P2Y2 receptors but not P2Y4 receptor. That the majority of the Ca2+ response to ATP was mediated via P2Y1 receptors was also confirmed by analysis of P2Y1 knockout mice and by application of the P2Y1 receptor-specific antagonist MRS2179. In addition, agonists of P2Y1 and P2Y2 receptors and low concentrations of adenosine augmented cell proliferation inspite of the presence of mitogenic growth factors. Neurosphere cell proliferation was attenuated after application of MRS2179 and in neurospheres from P2Y1 receptor knockout mice. These results infer a nucleotide receptor-mediated synergism that augments growth factor-mediated cell proliferation. Taken together these results suggest that P2Y-mediated nucleotidergic signalling is involved in neurosphere function and possibly also in adult neurogenesis in situ.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation beleuchten neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort. Die Ergebnisse der experimentellen Arbeiten können erheblich die Planung und Durchführung zukünftiger Untersuchungen erleichtern, sowie das Verständnis der Regulation von Hitzestresstranskriptionsfaktoren als terminale Komponenten der zellulären Stressantwort verbessern. Zum ersten Mal wurde die Interaktion zwischen einem Hitzestresstranskriptionsfaktor und einem cytoplasmatischen Hitzestressprotein der Hsp20 Familie nachgewiesen. Die Aktivität des LpHsfA2 hängt von zahlreichen Faktoren ab, die den zellulären Zustand während und nach der Stressperiode widerspiegeln. Der bisher am besten verstandene Regulationsmechanismus, das Verhältnis des Kernimports im Vergleich zum Kernexport, welches stark durch die Heteroligomerisierung mit HsfA1 beeinflusst wird, wird durch den Einfluss von Hsp17.4-CII auf den Aggregationszustand und die Aktivität von HsfA2 erweitert. Nach massiver Akkumulierung von HsfA2 unter Hitzestressbedingungen führt die spezifische Interaktion mit Hsp17.4-CII zu einer reversiblen Inaktivierung des Transkriptionsfaktors und zu einer Bindung in hochmolekularen Komplexen. Die Interaktion ist hochspezifisch. Die nur durch wenige AS-Austausche charakterisierte Isoform Hsp17.3-CII bindet LpHsfA2 nicht. Im Gegensatz dazu ist der solubilisierende Einfluss der Hitzestressproteine der Klasse CI klassen-, nicht aber speziesspezifisch. Das Wechselspiel aus Inaktivierung durch Bindung an Hsp17.4-CII und anschliessende Resolubilisierung durch Hsp17-CI, sowie Kernimport nach erfolger Heterooligomerisierung mit HsfA1, führt zu einer fein abgestimmten Regulation der zellulären Lokalisation von HsfA2 und somit auch zur Modulation seiner Funktion als Transkriptionsaktivator. Die in der Arbeit gewählten experimentellen Bedingungen bewirken eine Aggregation von HsfA2 auch unter Kontrollbedingungen und ähneln der Situation in einer Pflanzenzelle während der Erholungsphase nur teilweise. In vivo wird der massiven Aggregation von HsfA2 und Hsp17.4-CII durch den Einfluss von HsfA1 und Hsp17-CI entgegengewirkt. Die gefundene in vitro Situation bietet somit ein wertvolles experimentelles Artefakt, um die Wechselwirkungen der Proteine während der Erholungsphase der Pflanze zu untersuchen und verstehen zu lernen. Aufgrund verschiedener experimenteller Hinweise kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei der gezeigten spezifischen Interaktion nicht um ein auf die Gattung Lycopersicon beschränktes Phänomen handelt. In ersten Experimenten konnten Hinweise auf einen ähnlichen Regulationsmechanismus in A. thaliana gefunden werden (spezifische Interaktion zwischen AtHsfA2 und AtHsp17.7-CII). Allerdings zeigen die Ergebnisse der Experimente, in denen Proteine aus A. thaliana untersucht wurden, Abweichungen zu dem für die Tomatenproteine erarbeiteten Bild. Weitere Untersuchungen an Arabidopsis müssen hierzu durchgeführt werden, um Klarheit über den grundlegenden Regulationsmechanismus sowie speziesspezifische Besonderheiten zu bringen. Das aus den experimentellen Befunden resultierende Bild zeigt thermotolerante Tomatenzellen, in denen LpHsfA2 in einer transkriptionel inaktiven Form durch Bindung mit löslichem Hsp17.4- CII in Gegenwart von Hsp17-CI stabilisiert wird. Der Transkriptionsfaktor ist in diesem Zustand bereit für eine rasche Reaktivierung bei einem wiederkehrenden Hitzestress. Auch wenn mittlerweile die vier wichtigsten Regulatoren dieses Netzwerkes identifiziert werden konnten (LpHsfA1, LpHsfA2, LpHsp17.4-CII und LpHsp17-CI), kann nicht ausgeschlossen werden, dass weitere Faktoren beteiligt sind. Die Identifizierung solcher Faktoren, sowie weiterführende Arbeiten an Tomatenzellen, zum Beispiel durch Ausschalten einzelner Faktoren mit Hilfe von RNAi Konstrukten, wird in Zukunft helfen, noch mehr Details dieses interessanten Phänomens zu klären. Trotz der sehr guten Kenntnis der molekularen Eigenschaften der 21 AtHsf in Bezug auf ihre funktionellen Domänen wird erst das Verständnis der Art und Weise, wie diese Moleküle miteinander oder mit Co-Regulatoren interagieren und wie sie in die zellulären Regulationsnetzwerke eingebunden sind, zu einem Gesamtbild der Funktion der Hitzestresstranskriptionsfaktoren führen. Insbesondere gilt dies, seit die Analyse der Transkritionsprofile der AtHsf mit Hilfe von Micro-Array Analysen gezeigt haben, dass die Aufgaben der Hsf weit über die Regulation der Hitzestressantwort hinausgehen könnten. So könnten einige Vertreter der Hsf eine Rolle in der Pathogenabwehr spielen, bzw. im Laufe der Evolution ausschließlich entwicklungsspezifische Funktionen übernommen haben. Um die geschilderte Fragestellung effektiv zu bearbeiten, wurde in dieser Arbeit das Hefe-Zwei-Hybridsystem zur Charakterisierung der Interaktionseigenschaften der 21 AtHsf eingesetzt. Die zeitsparende Bearbeitung vieler Proben war hierbei ein Kernziel, das erfolgreich bearbeitet werden konnte: Die etablierte Hochdurchsatzmethode kann zukünftige Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen stark beschleunigen. Die standardisierte Verwendung von Mikrotiterplatten und Mehrkanalpipetten in Kombination mit den etablierten Tranformations-, Analyse und PCR-Verfahren macht eine Bearbeitung großer Probenmengen möglich. Die Synthese dieser Technik mit der Kenntniss des gesamten Genoms von A. thaliana sowie der Fülle an Transkriptionsdaten einzelner Gene unter verschiedenen Umgebungsbedingungen stellt zukünftigen Untersuchungen ein potentes Instrumentarium ganz allgemeiner Art zur Verfügung. Im vorliegenden Fall wurde die etablierte YTH Methode dazu verwendet, Erkenntnisse über das Interaktionsverhalten der AtHsf untereinander zu gewinnen. Die Zusammenfassung aller auftretenden Interaktionen liefert für einige Gruppen von Hsf interessante Einsichten. In vielen Fällen (z.B. AtHsfA4/A5; AtHsfA1/A9) konnte für Vertreter eine Interaktion gezeigt werden, für die bereits physiologische Zusammenhänge bekannt sind. Das erstellte Interaktom kann dazu dienen, bereits bekannte Hsf-Hsf Interaktionen durch einen weiteren experimentellen Befund zu belegen, sowie bisher unbekannte Verbindungen aufzudecken. Zur Identifizierung unbekannter Interaktionspartner mussten zunächst geeignete Bibliotheken hergestellt werden. Mit Hilfe dieser Bibliotheken konnten zahlreiche putative Interaktionspartner identifiziert und durch das Interaktom bereits bekannte Interaktionspartner für fast alle Köder in den Bibliotheken gefunden werden. Dies bestätigt sowohl die gute Abdeckung der mRNA Population der Zellen, aus denen die Bibliotheken gewonnen wurden, als auch die Reproduzierbarkeit und Funktionalität des YTH Screenings. Die Tatsache, dass in der Population der putativen Interaktionspartner für AtHsf gehäuft Transkriptionsfaktoren auftreten, lässt auf die Art der Vernetzung der AtHsf in den Proteinnetzwerken schließen: Die Regulation der Zielgene erfolgt möglicherweise bevorzugt durch eine direkte Wechselwirkung von Transkriptionsfaktoren verschiedener Familien. Neben der Etablierung der Methoden zur beschleunigten Untersuchung zahlreicher Proben stellte auch die Standardisierung der experimentellen Folgeschritte einen wichtigen Aspekt dar, um eine reproduzierbare Aussage über die Relevanz einer Interaktion treffen zu können. Interessante Ansatzpunkte, sowie Vorschläge für weiterführende experimentelle Arbeiten sollen im Folgenden für die wichtigsten Klone thesenartig dargestellt werden: Ein möglicher Co-Regulator für AtHsfA5 Das mit Hilfe der AtHsfA5-CTD identifizierte unbekannte Protein, codiert durch den Lokus At5g01370, bietet einen Ansatzpunkt für eine gezielte Untersuchung der Rolle und Regulation des AtHsfA5. Die spezifische Interaktion zwischen HsfA5 und HsfA4, die sowohl in A. thaliana als auch in Tomate existiert, sowie das auffällige Fehlen einer hemmenden Aktivität von AtHsfA5 auf HsfA4 an den bisher untersuchten Reporterkonstrukten in Pflanzenzellen, zeichnen diesen TF als einen besonders interessanten Vertreter der AtHsf aus. Es muss wegen der Pflanzenspezifität des Hemmeffektes über die Existenz eines HsfA5 spezifischen Co-Repressors nachgedacht werden. In diesem Zusammenhang kann die Analyse des identifizierten Proteins helfen, einen solchen Regulator zu charakterisieren. Die im Rahmen dieser Arbeit dokumentierten Ergebnisse legen nahe, dass das von At5g01370 codierte Protein mit der NLS-Region von AtHsfA5 interagiert. Da die entscheidenden Experimente bisher nur in Hefe durchgeführt wurden, steht eine Reproduktion in einem pflanzlichen Expressionssystem für weiterführende Arbeiten im Vordergrund. Die Versuche, die Transkriptionseigenschaften von AtHsfA5 durch Co-Expression des unbekannten Proteins oder Co-Transformation eines RNAi induzierenden Plasmides zu beeinflussen, sind bisher mangels Kenntnis der Zielgene von AtHsfA5 fehlgeschlagen. Weitere Schritte bei der Bearbeitung dieser Fragestellung müssen demnach die Suche nach einem geeigneten Testsystem, sowie die experimentelle Bestätigung einer Interaktion beider Proteine in planta sein. Im Rahmen der Promotion wurde der Lokus des identifizierten Gens auf das Vorhandensein einer T-DNA Insertion hin überprüft. Eine entsprechende Linie existiert nicht, so dass transgene Pflanzen durch Transformation von Überexpressions- oder RNAi-Kassetten hergestellt werden müssten. Es ist nicht auszuschließen, dass schon die Deletion einer der beiden chromosomalen Kopien des Gens zu einem lethalen Phänotyp führt und daher keine T-DNA Insertionslinien existieren. In diesem Fall kann möglicherweise der Phänotyp einer Überexpressionspflanze Aufschlüsse über einen Zusammenhang der Funktion des unbekannten Proteins und der Rolle des AtHsfA5 liefern. AtHsfB2a interagiert mit AtDLC8 (At3g15930) Die Interaktion des Dynein Leichte Kette 8 Proteins (DLC8) mit AtHsfB2a bietet ebenfalls Ansätze für weitere Untersuchungen. Durch die mit Hilfe des Interaktoms identifizierte spezifische Interaktion zwischen AtHsfB2a und HsfB2b hebt sich diese Subgruppe der Klasse B der AtHsf von den übrigen Vertretern ab. Die im Ergebnisteil beschriebenen Befunde, vornehmlich aus Experimenten mit Säugersystemen, deuten eine regulatorische Rolle für DLC Proteine allgemein an (zum Beispiel beschrieben für die Interaktion zwischen dem TF Bim aus der Bcl2 Familie und DLC8 (Day et al., 2004)). Eine detaillierte Charakterisierung der im YTH gefundenen Interaktion zwischen DLC8 und AtHsfB2a könnte eine pflanzenspezifische, regulatorische Funktion der DLC Proteine zeigen, die losgelöst von den Transportfunktionen des Dynein Komplexes existiert. Das Fehlen geeigneter Reportersysteme für AHsfB2a stellt in diesem Zusammenhang ein großes Problem dar. Auch für den Lokus At3g15930 existieren keine TDNA Linien, obwohl der gesamte umgebende chromosomale Kontext zahlreiche Insertionen aufweist. Die Herstellung und Kultivierung von Überexpressions- oder „knock down“ Pflanzen für das DLC8 Protein muss zeigen, ob dieses in Verbindung mit HsfB2a essentielle Aufgaben während der Entwicklung bzw. bei der Stressabwehr von A. thaliana übernimmt. Interaktion von AtHsfA9 mit AtDr1 (At5g23090) Der mit Hilfe von AtHsfA9 identifizierte Klon AtDr1 stellt möglicherweise eine Verbindung zwischen den AtHsf und einem sehr allgemeinen Regulationsmechanismus in Pflanzen dar, über den bisher nur sehr wenig bekannt ist. Die meisten Repressoren, die aus nicht-pflanzlichen Systemen beschrieben wurden, üben ihre Funktion genspezifisch aus, d.h. sie binden entweder Promoter-spezifisch an die entsprechenden Zielgene oder an spezifische Bindungspartner. Einer der wenigen Repressoren, die eine generelle Funktion ausüben, ist Dr1. In Säugerzellen zum Beispiel verringert Dr1 die generelle Effektivität der RNA-Polymerase II. Da kürzlich die Existenz und Funktionalität der pflanzlichen Homologe von Dr1 in Reis bewiesen wurde, bietet die nun gefundene Verbindung mit der Gruppe der AtHsf einen viel versprechenden Ansatzpunkt. Allerdings war es im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, mit Hilfe geeigneter Reportersysteme eine Repression von Promotoren durch Dr1 zu zeigen. Die Etablierung eines solchen Systems (auch endogener chromosomaler Reportersysteme) steht daher im Vordergrund weiterer Untersuchungen. Im Rahmen der Arbeit konnten transgene T-DNA Insertionslinien des Lokus At5g23090 charakterisiert werden, sie liegen für weitere Untersuchungen bereit. Allen voran steht die Analyse des Transkriptionsniveaus verschiedener Zielgene in Wildtyppflanzen sowie in den beschriebenen Mutanten. Weitere Schritte sind die Herstellung und Analyse transgener Pflanzen, die veränderte Mengen an Dr1 und AtHsfA9 aufweisen. Neben der Identifizierung der Vernetzungen der AtHsf mit Dr1 als einem generellen Regulator der Genexpression kann eventuell auch die molekulare Wirkungsweise des Dr1 Repressors in Pflanzen mit Hilfe solcher Experimente entschlüsselt werden. AtHsfB1 interagiert mit AtbZip44 (At1g75390) Die aus den durchgeführten YTH Screenings resultierende wahrscheinlich wichtigste Vernetzung der AtHsf mit bisher unbekannten Co-Regulatoren stellt das Zusammenspiel der Hsf mit den bZip Transkriptionsfaktoren da. Die Kombination des inaktiven HsfB1 mit AtbZip44 führt zu einer verstärkten Aktivierung von Zielgenen, zu denen auch die Gene von HsfA3 und HsfC1 gehören. Obwohl eine direkte Interaktion beider Transkriptionsfaktoren für die synergistische Aktivierung nicht stattfindet, deutet die am Promoter von AtHsfC1 und AtHsfA3 gefundene Konstellation eine bisher unbekannte Rolle für AtHsfB1 an, die von der kürzlich beschriebenen Rolle von LpHsfB1 in Tomatenzellen abweicht. Die gefundenen experimentellen Ergebnisse lassen folgende Hypothese zu: AtHsfB1, der sowohl in Wurzel- als auch in Sprossgewebe unter zahlreichen Stressbedingungen induziert wird, bindet an Promotoren und besetzt dort spezifische Bindestellen, die klassischen HSE. Aufgrund fehlender Aktivatormotive führt diese Bindung zu keiner Aktivierung der Zielgene. Die Promotoren befinden sich jedoch nun in einem Zustand, in dem die Bindung weiterer Aktivatoren, im beschriebenen Fall AtbZip44, zu einer raschen und starken Aktivierung des Gens führt. Durch das Zusammenwirken von zwei unabhängig voneinander bindenden Transkriptionsfaktoren könnte ein erhöhtes Maß an Flexibilität und Sensitivität der Genregulation erreicht werden. Auch eine generelle induzierte Toleranz gegenüber Stress könnte durch die differentielle Expression von AtHsfB1 und weiteren Faktoren erklärt werden. In diesem Fall würde HsfB1 auch nach Beendigung eines Stresszustandes noch an den Promotoren wichtiger Zielgene gebunden bleiben, ohne diese unnötig zu aktivieren. Bei Wiederkehren der Stresssituation wäre eine rasche Reaktivierung durch Synergismen mit kurzlebigen, potenten Aktivatoren, wie zum Beispiel AtbZip44, möglich. Durch die Wechselwirkung von AtHsfB1 mit Vertretern verschiedener Familien von Transkriptionsfaktoren, möglicherweise auch Repressoren, kann so eine Vielzahl von Zielgenen reguliert werden. Die weitere Untersuchung des AtbZip44 erscheint aus zwei Gründen besonders lohnend: (1) AtbZip44 beeinflusst die Synthese der AS Prolin. Prolin stellt ein weit verbreitetes Osmolyt dar, welches als Hydroxyl-Radikal-Fänger fungiert, Plasmamembranen unter Stressbedingungen schützt sowie die Toleranz von Pflanzen gegenüber Frost und Hochsalzbedingungen erhöht. (2) Für AtHsfA5 wurde eine direkte Interaktion mit AtbZip44 in vitro gezeigt. Ob ein Komplex zwischen AtHsfA5 und AtbZip44 eine Transkription an geeigneten Reportern bewirkt, ist allerdings noch offen, und muss durch geeignete Experimente gezeigt werden. Neben umfangreichen Screeningarbeiten, der basalen Charakterisierung aller interessanten Klone und der Detailcharakterisierung der Interaktion zwischen AtHsfB1 und AtbZip44 konnten zusätzlich erste Vorarbeiten mit transgenen Pflanzen für die interessantesten Kandidaten durchgeführt werden. Als Ergebnis der Arbeit stehen somit einige vielversprechende Ansatzpunkte für weitere Studien zur Verfügung, ebenso die standardisierte Technik und die notwendigen konservierten Bibliotheken, um in kurzer Zeit Screenings mit weiteren Köderproteinen durchzuführen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen dazu bei, zukünftige Experimente besser zu planen, sowie die Rolle der Hsf als terminale Komponenten der pflanzlichen Stressantwort weiter zu entschlüsseln und zu verstehen. Die Entschlüsselung der Funktion aller Proteine eines Gesamtorganismus, deren posttranslationale Modifizierungen, die Möglichkeit stabiler sowie transienter Interaktionen mit anderen Proteinen und somit die Vernetzung aller Proteine zu einem Gesamtnetzwerk stellt die große Herausforderung des Zeitalters der „proteomics“ dar. Verliefen während der Entschlüsselung der Genome von Organismen die Informationen auf Nukleinsäureebene noch linear, so dass mit Hilfe eines hohen Automatisierungsgrades ein rascher Fortschritt erzielt werden konnte, so erfordert die so genannte „post-genomics“ Ära hohe finanzielle und personelle Investitionen. Die Nicht-Linearität der Proteinfunktionen, die durch Modifikationen und Wechslwirkungen beeinflusst werden, hat rasch gezeigt, dass ein komplexer Organismus nicht lediglich durch die Kenntnis der Summe seiner Gene verstanden werden kann. Das Zeitalter der „proteomics“ erfordert trotz potenter Hochdurchsatzmethoden und weit fortgeschrittener Computeranalysen mehr denn je ausgefeilte Testmethoden und eine individuelle Untersuchung einzelner Proteine und deren Wechselwirkungen, um schließlich die Kernfrage der Biologie, wie Leben funktioniert, beantworten zu können.
Active neurogenesis continuously takes place in the dentate gyrus of the adult mammalian brain. The dentate gyrus of the adult rodent hippocampus contains an astrocytelike cell population that is regarded as residual radial glia. These cells reside with their cell bodies in the subgranular layer (SGL). Radial processes traverse the granule cell layer (GCL) and form bushy ramifications in the inner molecular layer (IML). The residual radial glial cells apparently represent neuronal progenitor cells that can give rise to functionally integrated granule cells. To date the cellular and molecular events driving a subpopulation of these cells into neurogenesis as well as the cellular transition states are poorly understood. The present study shows, that in the mouse dentate gyrus, this cell type selectively expresses surfacelocated ATPhydrolyzing activity and is immunopositive for nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2). NTPDase2 is an ectoenzyme and hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates such as ATP or UTP to their respective nucleoside diphosphates. The enzyme becomes expressed in the hippocampus during late embryogenesis from E17 onwards, and is thus not involved in early brain development. Its embryonicpattern of expression mirrors dentate migration of neuroblasts and the formation of the primary and finally the tertiary dentate matrix. NTPDase2 is also expressed by a transient population of cortical radial glia from late embryonic development until postnatal day 5. NTPDase2 can be employed as a novel markerfor defining cellular transition states along the neurogenic pathway. It is associated with subpopulations of GFAP and nestinpositive cells. These intermediate filaments are typically expressed by the progenitor cells of the dentate gyrus. In addition there is a considerable overlap with doublecortinand PSANCAM positive cells. The expression of the microtubuleassociated protein doublecortin and of PSANCAM which are expressed by migrating neuroblasts is indicative of a transition of progenitors to a neural phenotype or an immature form of granule cell. NTPDase2 is no longer associated with young neurons and with maturegranule cells, as indicated by the lack of doubleimmunostaining for III tubulin and NeuN, respectively. Furthermore, β S100positive astrocytes do not express NTPDase2 validating that NTPDase2 is also not associated with later stages of gliogenesis. Experiments with the Sphase marker bromodeoxyuridine (BrdU) demonstrate that NTPDase2positive cell proliferate. Postmitotic BrdU-labeled cells preferentially acquire an NTPDase2positive phenotype. Many of these cells were also positive for GFAP. The contribution of BrdUlabeled cells positive for NTPDase2 increased with time from 2 h to 72 h, validating a strong association of NTPDase2 with proliferating cells of the dentate gyrus. The colocalization studies with various markers and the results of the experiments suggestthat NTPDase2 is associated with cell types of varying maturation states but not with mature neurons or astrocytes. Studies on the formation of neurospheres from the dentate gyrus validate previous data suggesting that the hippocampal progenitors have little capacity for self renewal in vitro. In situ hybridization results indicate the presence of one of the metabotropic purinergic receptor subtypes (the P2Y1 receptor) within the adult neurogenic regions, the dentate gyrus and the lateral walls of the lateral ventricles. A patchclamp analysis demonstrates the presence of functional ionotropic nucleotide receptor (P2X receptors) in progenitor cells expressing nestin promotordriven GFP. They suggest that the signaling pathway via extracellular nucleotides and nucleotide receptors may play a role in the control of adult hippocampal neurogenesis.
Das humane MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) ist in chromosomale Translokationen mit mehr als 50 verschiedenen Partnergenen involviert. Alle diese Rearrangements sind mit akuter lymphatischer oder akuter myeloischer Leukämie assoziiert. Die reziproke Translokation t(4;11) ist ursächlich für die Entstehung einer akuten lymphatischen Leukämie, die gehäuft bei Kleinkindern auftritt. Die Prognose dieser aggressiven Leukämie ist sehr schlecht, da die leukämischen Blasten nahezu Therapie-resistent sind. Für einige MLL-Rearrangements konnte in Transduktions/Transplantations-Experimenten gezeigt werden, dass das MLL-Fusionsgen akute myeloische Leukämien in Mäusen induzieren kann. Aus diesem Grund steht immer noch das jeweilige MLL-Fusionsprotein im Mittelpunkt der Suche nach einem zugrunde liegenden Pathomechanismus. Die Versuche, ein Tiermodell mit dem MLL/AF4- Fusionsprodukt zu etablieren, blieben lange Zeit erfolglos. Erst Anfang dieses Jahres gelang es, durch eine knock-in Strategie, transgene Mäuse zu generieren, die das MLL/AF4 Translokationsprodukt tragen. Diese Mäuse entwickeln nach einer sehr langen Latenzzeit von bis zu 540 Tagen diffuse B-Zell-Lymphome. An der t(4;11) sind die Gene MLL auf Chromosom 11q23 und AF4 auf Chromosom 4q21 beteiligt. Die reziproke Translokation führt zur Entstehung von zwei Fusionsgenen (MLL/AF4 und AF4/MLL) mit intaktem Leserahmen. Wir nehmen an, dass beide Fusionsgene notwendig sind, um die Entartung der Zellen zu bewirken. Zum Einen ist der beschriebene Phänotyp der transgenen MLL/AF4 positiven Mäuse mit dem aggressiven Verlauf der t(4;11) Leukämie nicht vergleichbar, und zum Anderen findet man bei der Mehrzahl der Patienten mit einer t(4;11) beide Fusionstranskripte in den leukämischen Blasten. Um die Eigenschaften der Fusionsproteine AF4/MLL und MLL/AF4 zu untersuchen, wurden stabil transfizierte murine embryonale Fibroblasten-Linien etabliert, die entweder eines oder beide Fusionsgene regulierbar exprimierten. Mit Hilfe dieses in vitro Modells konnte man erstmals die Auswirkungen der gleichzeitigen Expression beider Fusionsgene auf das Verhalten der Zellen analysieren. Die Untersuchungen der Proliferation und der Apoptoseraten der verschiedenen transfizierten Zelllinien ergab, dass das AF4/MLL Fusionsprotein in den Zellen zu Wachstumstransformation führt, aber gleichzeitig die Zellen für den Zelltod durch bislang unbekannte Apoptosemechanismen sensitiviert. Das MLL/AF4 Translokationsprodukt war nicht in der Lage, eine Wachstumstransformation auszulösen. Vielmehr wurde deutlich, dass die Expression von MLL/AF4 die Proliferation der Zellen hemmt. Die Untersuchung der spezifischen Apoptoserate in den MLL/AF4 positiven Zellen ergab, dass die Zellen sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stress-Konditionen Apoptose-resistent waren. Damit besitzen beide Fusionsproteine onkogene Eigenschaften. Da nur die mit AF4/MLL und MLL/AF4 transfizierten Zellen eine stark erhöhte Proliferation aufwiesen, im Wachstum transformiert waren und eine erhöhte Apoptoseresistenz zeigten, wurde deutlich, dass die Eigenschaften beider Fusionsproteine notwendig sind, um den vollständig transformierten Phänotyp auszulösen. Um die Veränderungen in den Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde mittels quantitativer PCR die Expression verschiedener Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Expression Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene in allen drei Zellen verändert war. Genexpressionsprofil-Studien der Zellen ergaben schließlich, dass der Transkriptionsfaktor Nanog in den doppelt-transfizierten Zellen verstärkt exprimiert wurde. Nanog ist in die Aufrechterhaltung der Pluripotenz und des Selbsterneuerungspotenzials von embryonalen Stammzellen involviert. In dieser Arbeit konnte erstmals der Phänotyp einer Zelllinie beschrieben werden, die beide Fusionskonstrukte, AF4/MLL und MLL/AF4, stabil exprimierte. Dabei wurde deutlich, dass nur durch die Expression beider Fusionsgene ein Phänotyp erzeugt wird, der den Leukämoblasten sehr ähnlich ist. Die Expression von Nanog in diesen Zellen erklärt den Stammzell-Charakter der leukämischen Zellen.
Molekulare Regulation der UDP-Zucker-Biosynthese Untersuchungen anhand der myo-Inositoxygenase
(2006)
Der Nukleotidzucker UDP-Glucuronsäure ist die prinzipielle Zuckervorstufe für UDP-Galacturonsäure, -Xylose, -Arabinose und –Apiose, welche alle in die Zellwandpolymere der pflanzlichen Zellwand einfließen. UDP-Glucuronsäure kann in Arabidopsis über zwei alternative, funktionelle Synthesewege gebildet werden, wobei entweder die UDP-Glucose-Dehydrogenase oder die myo-Inositoxygenase als Schlüsselenzym, welche den Kohlehydratfluss in Richtung Zellwandbiosynthese katalysiert, involviert ist. In dieser Arbeit wurden die Gene für die Enzymisoformen der Inositoxygenase (MIOX) aus Arabidopsis thaliana analysiert. Sie repräsentieren eine kleine Genfamilie bestehend aus vier Isoformen. Studien mittels Promotor::GUS-Konstrukten und RT-PCR zeigten, dass die Transkription der MIOX-Gene eine sehr transiente und organspezifische Genexpression ist. Die Isoformen MIOX1 und MIOX2 ließen sich in nahezu allen Geweben nachweisen wogegen die Isoformen MIOX4/5 nur in den generativen Geweben aufzufinden waren. Es konnte eine deutliche Präsenz aller vier MIOX-Isoformen in den generativen Geweben nachgewiesen werden und die Nukleotidzucker, die während der Samenentwicklung benötigt werden, scheinen überwiegend über die MIOX zur Verfügung gestellt zu werden. So zeigen T-DNA-Insertionslinien von ΔMIOX1 & 2 eine reduzierte Schleimhülle um die Samen und eine erhöhte Ausfallrate bei der Samenentwicklung auf. Ansonsten zeigen die untersuchten T-DNA-Insertionslinien einen ähnlichen Wuchs wie der Wildtyp auf. Auch konnten keine Unterschiede über die durchgeführten Zellwandanalysen, mittels GC-MS, MALDI und Dionex-HPLC verifiziert werden, was durch die Redundanz der MIOX- und UGD-Isoformen erklärt werden könnte. Nichtsdestotrotz konnte bei den Isoformen ΔMIOX1 & 2 eine dramatische Reduktion beim Einbau von 3H-Inosit in Zellwandpolymere von Keimlingen verzeichnet werden, was einen klaren Beweis für eine funktionelle MIOX liefert, da in diesem Gewebe diese beiden Isoformen die einzig aktiven sind. Außerdem konnten über Promotor-Deletions-Analysen potentielle cis-Elemente für die Promotoren von MIOX2 und MIOX4 aufgedeckt werden.
An den Folgen von AIDS sind bisher fast 20 Millionen Menschen gestorben. Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte erstmals die Viruslast bei gleichzeitiger Erhöhung der CD4-Lymphozytenzahl effizient erniedrigt werden. Dadurch konnte zwar eine Kontrolle der Virusreplikation und damit verbunden eine längere Überlebenszeit erreicht werden, jedoch ist eine vollständige Eradikation des Virus bisher nicht möglich. Hohe Behandlungskosten, Nebenwirkungen der antiviralen Substanzen, ihre unzureichende Wirkung in manchen Körperkompartimenten und die rasche Verbreitung resistenter Viren schränken die Effektivität von HAART ein. Alternative Therapieformen zielen in den letzten Jahren verstärkt auf die HIV-Eintrittshemmung durch Inhibition der Membranfusion von Virus und Wirtszelle („Fusionsinhibitoren“). Peptide, die sich aus der „heptad repeat“ Region 2, HR2, des gp41 ableiten (C-Peptide), sind äußerst wirksame antivirale Substanzen. 2003 wurde T-20, ein 36 Aminosäure langes C-Peptid, als erster Fusionsinhibitor zugelassen. Sein breiter Einsatz ist jedoch aufgrund rascher Resistenzbildung, mangelnder oraler Verfügbarkeit, einer äußerst kurzen Serumhalbwertszeit sowie daraus resultierender hoher Therapiekosten limitiert. Aufgrund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit mit der Entwicklung von RNA-Aptameren als HIV-Fusionsinhibitoren ein neuer therapeutischer Ansatz etabliert werden. Zur Isolierung dieser RNA-Aptamere wurden zwei hoch komplexe RNA-Bibliotheken in manuellen sowie automatisierten Selektionen gegen verschiedene Zielstrukturen auf dem HIV-1 gp41 mit Hilfe der SELEX-Technologie selektiert. Der Wirkmechanismus der isolierten RNA-Aptamere sollte analog zu den gp41 HR-abgeleiteten Peptiden auf der Hemmung der Ausbildung des Sechs-Helix-Bündels als fusionaktive Struktur beruhen. So sollten die RNA-Aptamere die Ausbildung der zentralen N coiled-coil Struktur verhindern (Selektion gegen HR1-Peptide) oder die Anlagerung der HR-2 Domänen an die konservierten hydrophoben Furchen des zentralen N coiled-coils inhibieren (Selektion gegen HR2-Peptide). Die gewählten Zielstrukturen wurden entweder als freie synthetische Peptide oder membrangebunden auf der Oberfläche von humanen T-Zellen präsentiert. Um die Selektion von serumstabilen Aptameren zu gewährleisten, wurden die RNA-Aptamere unter Einsatz von 2’-F- oder 2’-NH2-modifizierten Pyrimidinen transkribiert. Nach initialen Selektionsrunden wurden die isolierten Aptamerfraktionen in einer „single-round infection“ unter Einsatz von HIV-Pseudotypvektoren auf spezifische Inhibition des Eintritts von HIV in die Zielzellen analysiert. Die isolierten RNA-Aptamere waren in der Lage, den HIV-Eintritt zu inhibieren, ihre Wirksamkeit war allerdings im Vergelich zu der naiven Bibliothek gering. Nach Durchführung von verschiedenen Reifungsstrategien, um die Affinität der vorselektieren RNA-Fraktionen zum jeweiligen Zielepitop zu erhöhen, konnte die inhibitorische Wirkung der gereiften RNA-Fraktionen auf das 10Fache im Vergleich zu der Urspungsbibliothek verbessert werden. Die wirksamste RNA-Fraktion, 435UU, wurde aus einer Selektion einer aminomodifizierten N30 RNA-Bibliothek gegen das membranverankerte Fusionsprotein M435, bestehend aus gp41 C46 und dem membranproximalen HIV-Linker, und anschließender Kompetiton mit dem 2F5 Antikörper gewonnen. Die 435UU RNA-Fraktion konnte den Eintritt von HIV mit einer IC50 ≈ 200 nM spezifisch hemmen. Weiterhin konnte die spezifische Fusionsinhibition der 435UU Aptamerfraktion in einem Zell-Zellfusionsassay unter Einsatz von HIV env exprimierenden Zellen und einer humanen T-Zelllinie demonstriert werden. Die Affinität der 435UU-Fraktion wurde in einem Gelmobilitätsversuch bestimmt. Die moderate HIV-Eintrittshemmung beruhte auf einer schwachen Bindung (Kd ≈ 750 nM) an das Zielepitop auf dem gp41. Die Analyse von Einzelaptameren aus der 435UU RNA-Population ergab keine signifikanten Unterschiede in ihrem HIV-Neutralisationspotential. Des Weiteren konnten nur wenig gemeinsame Primärstrukturmotive bestimmt werden. Der Gehalt an inkorporierten Pyrimidinen in den 435UU-Einzelaptameren war allerdings mit ca. 70% vergleichsweise hoch. Unter Einsatz von randomisierten RNA-Transkripte mit definiertem Pyrimidingehalt konnte festgestellt werden, dass tendenziell ein höherer Gehalt an NH2-Pyrimidinen die HIV-Neutralisation fördert. Allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Bindung an das C46-HIVLinker Fusionskonstrukt und dem Pyrimidingehalt der Transkripte ermittelt werden. Die Sekundärstukturvorhersage ergab keine strukturelle Verwandtschaft unter den 435UU-Einzelaptameren noch konnten klar definierte Sekundärstrukturmotive gefunden werden. Die Selektion der 435UU-Aptamerfraktion erfolgte deshalb nich allein aufgrund ihres hohen Pyrimidingehaltes. Ein direkter Vergleich der 435UU Aptamerfraktion mit dem bisher einzigen RNA-Eintrittsinhibitor, einem anti-gp120 RNA-Aptamer, ergab zwar eine geringfügig schwächere HIV-Inhibition, jedoch ein wesentlich breiteres Wirkspektrum der isolierten anti-gp41 RNA-Aptamere wahrscheinlich durch ihren hoch konservierten Wirkmechanismus. Schlussendlich könnte die Wahl der Präsentation der Zielstrukturen sowie der Selektionsdurchführung die Gewinnung von RNA-Aptameren mit moderater Affinität fördern und gleichzeitig zum Verlust von hoch affinen RNA-Strukturen führen. In nachfolgenden Selektionen sollte deshalb die Selektionsstringenz erhöht sowie gegen membrangebundene Zielstrukturen selektiert werden, die die tatsächliche native gp41 Konformation darstellen.
Apoptose ist für grundlegende Prozesse des Lebens wie die Embryonalentwicklung und die Infektabwehr unentbehrlich. Defekte im Apoptoseprozess haben ernste Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Folge. Ein charakteristisches Kennzeichen von Krebszellen ist deren Apoptoseresistenz, die verhindert, dass Krebszellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Die Tumorzellen reagieren im allgemeine nicht mehr auf Zelltod-Signale, die z. B. bei Nähr- und Sauerstoffmangel oder einem Angriff durch Effektorzellen des Immnunsystems empfangen werden. Ein wesentlicher Grund dafür sind Mutationen im Signalweg der Apoptose. Häufig wird in Tumoren die Überaktivierung von antiapoptotischen Proteinen beobachtet. Die Aufklärung der Apoptose-Signalwege und die Charakterisierung der ihnen zu Grunde liegenden molekularen Interaktionsmechanismen sind wichtig für die Erklärung der Pathogenesse vieler Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, neue anti-apoptotische Proteine zu identifizieren, die als Targets zur Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien benutzt werden können. Ein wichtiger Bestandteil des Apoptoseweges ist das Mitochondrium. Ausgangspunkt für den mitochondrialen oder intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweg ist die Freisetzung von Cytochrom c (Cyt c) und anderen apoptogenen Faktoren aus dem Mitochondrien. Zytoplasmatisches Cytochrom c bindet zusammen mit ATP oder dATP an das Adaptorprotein Apaf-1 und induziert daraufhin eine Konformationsänderung sowie die Oligomerisation von Apaf-1. Die Selbstassoziation von Apaf-1 führt zur zusätzlichen Rekrutierung von Caspase-9, die in diesem des sogenannten Apoptosomskomplexes durch die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration autokatalytisch aktiviert wird. Aktive Caspase-9 wiederum spaltet und aktiviert Effektorcaspasen wie Caspase-3, die zelluläre Targetproteine spalten und damit den Zelltod verursachen. Viele apoptotische Stimuli aktivieren den mitochondrialen Apoptoseweg. Defekte im intrinsischen Signalweg finden sich häufig im Tumoren und sind oft mit Resistenzen gegen apoptoseauslösende Krebstherapien assoziert. Anti-apoptotische Proteine, die mit dem apoptotischen Programm an dieser Stelle interferieren und in Tumoren überexprimiert werden, stellen attraktive Targets für Tumortherapien dar. In der Arbeitsgruppe von Dr. Martin Zörnig am Georg-Speyer-Haus wurde ein S. pombe Hefesystem etabliert, um in einem funktionellen „Survival-Screen“ neue anti-apoptotische Säugergene aus Tumor-cDNA-Banken zu identifizieren. Hefen können durch die Expression bestimmter pro-apoptotischer Säugerproteine abgetötet werden. Dieser Hefezelltod weist äusserliche Gemeinsamkeiten mit apoptotischen Zellen multizelluläre Organismen auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe dieses Screens tatsächlich anti-apoptosische Säugerproteine zu identifizieren, die den induzierten Hefezelltod inhibieren können. In einem Screen, bei dem das Apaf-1 Homolog in C.elegans, CED-4, als Killerprotein verwendet wurde, konnte unter anderem das Gen Aven isoliert werden, das nicht nur CED-4-induzierten Zelltod in Hefe, sondern auch Apaf-1/Casp-9-vermittelte Apoptose in Säugerzellen inhibiert. Dabei wurde ein unvollständiges ΔAven-cDNA-Plasmid isoliert, dem das 5´-Ende fehlte. Diese Verkürzung ist vermutlich auf ein vorzeitiges Abbrechen der cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase zurückzuführen. Die vollständige humane Aven cDNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. J. M. Hardwick (J. Hopkins University, Baltimore USA) bereitgestellt, zusammen mit zwei polyklonalen anti-Aven Antiseren. Die Antisera erkennen die N-terminalen Aminosäuren 98-112 (anti-Aven A) sowie am C-terminus aa 256-268 (anti-Aven B). In der AG Zörnig wurde ein zusätzliches Antiserum (anti-Aven C) gegen ein Peptid generiert, das die letzten 17 Aminosäuren des humanen und des Maus-Aven-Proteins erkennt. Aven wurde in der Gruppe von M. Hardwick als anti-apoptotisches Protein beschrieben, das an das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xL und Apaf-1 bindet (Chau et al., 2000). Aven wurde mit Hilfe eines „Hefe-2-Hybrid Screens“ mit Bcl-xL als Köder („bait“) isoliert. Es wurde publiziert, dass Aven die Apaf-1 Selbstassoziation (und damit Caspase-9-Aktivierung) verhindert. Das humane Aven Gen kodiert für insgesamt 362 Aminosäuren. Die Sequenz ist in zahlreichen Spezies hoch konserviert. Aven mRNA Expression wurde in vielen Geweben (Herz, Nieren, Pankreas, Testis und Skelet-Muskulatur) und in mehreren Zelllinien gefunden. Dies deutet auf eine ubiquitäre Expression hin. In der Zelle ist Aven hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Immunfluoreszenzanalysen der Arbeitsgruppe Hardwick zeigten zusätzlich eine schwache Expression des Proteins im Nukleus. In der Arbeitsgruppe Zörnig konnte gezeigt werden, dass die isolierte Deletionsmutante ΔAven (aa 180-362) CED-4-induzierten Zelltod in Hefen inhibiert (Doktorarbeit M.L. Brezniceanu, unpublizierte Daten). Eine anti-apoptotische Wirkung konnte für ΔAven zusätzlich im Säugersystem verifiziert werden. Durch Überexpressionsstudien eines ΔAven- GFP-Fusionskonstruktes wurde Apaf-1/Caspase-9-induzierte Apoptose in der humanen Kolonkarzinomzelllinie RKO inhibiert. Weitere Experimente zeigten, dass sich in Tumoren des Kolons, der Niere und der Schilddrüse erhöhte Aven mRNA-Mengen nachweisen lassen und dass Aven auf mRNA-Ebene während der Entwicklung der Brustdrüse reguliert wird (unpublizierte Daten). Im Rahmen dieser Arbeit wurde Aven biochemisch und genetisch näher charakterisiert. Dabei wurden sowohl das volle-Länge-Aven sowie die artifizielle ΔAven Deletionsmutante untersucht. Zunächst wurde ein Teil der publizierten Daten verifiziert. Beschrieben ist eine Bindung zwischen Aven und Bcl-xL, die durch die N-terminale Domäne von Aven (Aminosäure 74-108) vermittelt wird. ΔAven, das den N-Terminus nicht enthält, sollte daher nicht an Bcl-xL binden können. In einem Immunpräzipitations-Experiment mit dem anti-Aven B Antiserum wurde entsprechend einer Interaktion mit Bcl-xL nur für das volle-Länge-Aven-Protein, nicht aber für ΔAven nachgewiesen. Den Publizierten Daten zufolge bindet Aven mit den Aminosäuren 180 bis 300 an Apaf-1, und diese Interaktion konnte in einem weiteren Ko-Immunpräzipitations-Experiment bestätigt werden. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluß von Aven auf die Bildung des Apoptosoms zu untersuchen. Dafür wurden Apoptosom-Immunpräzipitations-Experimente mit 293T Zelllysaten etabliert, in denen man endogene Apaf-1/Caspase-9-Komplexe nachweisen konnte. Durch Zugabe von Cytochrom c und dATP direkt zu den Zelllysaten wurde die Bildung des Apoptosoms induziert, das anschließend mit einem monoklonalen anti-Caspase-9 Antiköper immunpräzipitiert werden konnte. Bei gleichzeitiger Überexpression von ΔAven wurde weniger Apaf-1 mit Caspase-9 ko-immunpräzipitiert, ein Hinweis darauf, dass die Apoptosombildung unterdrückt wurde. Das Ergebnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass Caspase-9-Spaltung und -Aktivierung durch ΔAven vermindert wurde. Interessanterweise konnte eine Überexpression des volle-Längen Aven-Proteins die Bildung des Apoptosoms nicht verhindert. Apaf-1 wurde wie bei den Lysaten nichttransfizierter Zellen mit Caspase-9 Ko-immunopräzipitiert, und die Caspase-9 Spaltprodukte p35 und p37, die bei Aktivierung des Apoptosoms entstehen, wurden unverändert detektiert. Bei den beschriebenen Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch eine Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 (und nicht nur an Apaf-1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der C-Terminus von Aven für die Bindung an Caspase-9 wichtig ist. Interessanterweise nahm die Bindung von ΔAven an Caspase-9 nach Apoptosominduktion ab, während kein Unterschied in der Bindung des vollständigen Aven-Proteins an Caspase-9 vor oder nach Apoptosominduktion beobachtet werden konnte. Wegen der Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 konnte mit diesen Experimenten nicht festgestellt werden, ob Aven bzw. ΔAven Teil des gebildeten Apoptosomkomplexes sind, d. h. ob sie auch nach Apoptosombildung an Apaf-1 binden. Eine Hemmung der Apoptosomsbildung führt zur Inhibierung der Caspase-Aktivierungskaskade und damit zu verringerter Caspase-3 Aktivität. Entsprechend wurde die Caspase-3-Aktivität nach in vitro Apoptosominduktion bei Überexpression von ΔAven inhibiert, während das volle-Länge Aven keinen Einfluß auf die Caspase-3-Aktivität hatte. In weiteren Verlauf des Projektes wurden funktionelle Apoptoseexperimente mit transfizierten RKO-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Protektion durch Aven und ΔAven nach Staurosporin- und UV- Behandlungen. Dabei zeigte ΔAven einen stärkeren anti-apoptotischen Effekt als das volle-Länge-Aven in vivo. Die Tatsache, dass ΔAven ein höheres anti-apoptotisches Potential als das volle-Länge-Aven-Protein aufweist, deutet auf eine mögliche Spaltung oder Konformationsänderung von Aven in vivo hin, die zur Entstehung eines aktiven anti-apoptotischen C-terminalen Proteins führt. Um dies nachzuweisen, wurden einzel- und doppel-getaggte Fusionskonstrukte kloniert. Western Blot Analysen mit dem anti-Aven B Antiserum zeigten zusätzlich zu der volle-Längen-Aven- Bande (50 kDa) eine kleinere immunreaktive Bande mit einer Größe von ca. 35 kDa. Nach Apoptoseinduktion nahm die relative Menge dieser kleineren Bande zu. Das 35 kDa Aven-Spaltprodukt wurde nicht nur nach Überexpression, sondern auch auf endogener Proteinebene detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Spaltung Caspasen-abhängig ist. Eine Behandlung der Aven-überexprimierenden Zellen vor Apoptoseinduktion mit dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk blockierte die Spaltung von Aven vollständig. Gleiche Ergebnisse konnten mit dem endogenen Protein gezeigt werden. Obwohl die Aven-Sequenz keine in silico vorausgesagten Spaltstellen für Caspasen enthält, zeigten in vitro Experimente mit rekombinanter Caspase-3, dass Aven von Caspase-3 direkt prozessiert wird. In vivo Experimente mit Wildtyp-MCF-7-Zellen, die keine endogene Caspase-3 exprimieren, sowie mit transfizierten MCF-7-Zellen, die Caspase-3 stabil exprimieren, bestätigten dies. Aven wurde nur in den mit Caspase-3 transfizierten MCF-7-Zellen nach Staurosporin-Behandlung in das 35 kDa Fragment gespalten. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die das N-terminale Ende von Aven erkennen (anti-Flag oder anti-Aven A) zeigten eine zusätzliche kleinere Bande. Dieses Spaltprodukt ist ungefähr 30 kDa groß, und im Vergleich mit dem 35 kDa Aven-Peptid veränderte sich seine Expression kaum unter apoptotischen Bedingungen. Dieses Aven-Fragment ist jedoch nicht das Ergebnis einer Caspase-Spaltung, weil seine Entstehung nicht durch z-VAD-fmk inhibiert wurde. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch Serin-Proteasen nicht für diese Spaltung verantwortlich sind. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus von Aven gerichtet sind, zeigten erstaunlicherweise kein zusätzlichen Aven-Spaltprodukte, sondern nur das volle Länge-Aven-Protein. Offensichtlich ist das entstehende C-terminale Fragment nach Spaltung durch Caspase-3 instabil und kann nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche, nicht näher identifizierte 40 und 45 kDa große Aven Spaltprodukte wurden in MCF7-Zellen detektiert, die jedoch nicht in RKO-, HeLa-, oder 293T-Zellen beobachtet wurden. Mit Hilfe einer frei verfügbaren Software (GrabCas; ein Programm, das auch Granzyme Bund Caspase-Spaltstellen voraussagt, die sich von den Konsensusspaltsequenzen unterscheiden) sowie mit Western Blot Analysen von verschiedenen Aven-Deletionsmutante sollten potenzielle Schnittstellen näher charakterisiert werden. Dabei wurde die Spaltung durch Caspase-3 bei D293 (oder D287) bestätigt. Außerdem wurden zusätzliche mögliche Spaltstellen bei aa 240 oder zwischen aa 142-175 in Aven gefunden. Eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 142 und 175 würde zu einem ähnlichen C-terminalen Aven-Peptid führen wie das artifizielle ΔAven und sollte von daher potente anti-apoptotische Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Spaltstelle wurde ungefähr bei aa 100 kartiert. Die Isolierung von Aven Spaltprodukten aus eindimensionalen SDS-PA Gelen für eine nachfolgende massenspektrometische Analyse war aus technischen Gründe leider nicht erfolgreich. Die vorausgesagte Aven-Prozessierungsstellen sowie die in Western Blot Analysen beobachteten Aven-Fragmente lassen die Schlussfolgerung zu, dass Aven nach proteolytischer Aktivierung (d. h. nach Abspaltung inhibierender N-terminaler Sequenzen) anti-apoptotische Eigenschaften annimmt. Das generierte C-terminale Peptid wird dann möglicherweise durch Caspase-3-Spaltung bei D293 inaktiviert, wenn ein starker apoptotischer Stimulus auftritt. Zu Aufklärung der physiologischen Funktion von Aven in Normalgewebe und um zu untersuchen, ob Aven bei der Tumorentstehung eine Rolle spielt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Dazu wurde die humane Aven-cDNA zum einen unter der Kontrolle eines Hühner-ß-Aktin-Promotors und eines CMV-Enhancers kloniert. Diese Kombination regulatorischer Elemente sollte zu einer hohen und ubiquitären Expression des Transgens führen. Zusätzlich wurde die humane Aven-cDNA in den Vektor p1017 unter die Kontrolle des proximalen lck-Promotors kloniert, der eine Expression in unreifen T Zellen erlaubt. Die Etablierung der Mauslinien wurde in Kollaboration mit dem GSF-Institut für Experimentelle Genetik (AG Prof. M. Hrabé de Angelis) in München durchgeführt. Bei einer Untersuchung der Organe zeigte sich, dass in der ß-Aktin Aven-transgenen Maus eine starke Überexpression von Aven nur im Herz nachgewiesen wurde. Diese transgenen Mäuse werden zurzeit in Kollaboration mit Dr. S. Barrère-Lemaire (Institut of Functional Genomics, Montpellier, Frankreich) analysiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine lck Aven-Maus Linie untersucht. Western Blot Analyse zeigten eine starke Proteinexpression des Transgens im Thymus und auch in reifen T-Zellen (Milz). Mit Hilfe des anti-Aven C Antiserums konnte im Western Blot ein weiteres, vorher nicht beobachtetes Aven-Spaltprodukt in Thymozyten und aufgereinigten periphären T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Überexpression von Aven in Thymozyten und gereinigten T-Zellen hatte jedoch keine messbare Inhibition von Apoptose zur Folge. Dagegen wurde eine Inhibition der aktivierungsinduzierten Proliferation von T-Zellen in transgenen Aven-Mäuse beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten die transgenen Aven-Mäuse keine spontane Tumorentwicklung obwohl eine Korrelation zwischen Aven-Expression und einer schlechten Prognose in Kinderleukämien publiziert worden ist. Um zu untersuchen, ob Aven in Kombination mit anderen Onkogenen in Tumorentstehung oder Progression kooperieren kann, sollen transgene Aven-Mäuse mit anderen transonkogenen Mausstämmen (z.B. p53-/- Mäusen) gekreuzt werden.
Gehirne von an Scrapie erkrankten Tieren sind histopathologisch durch Vakuolisierung, Astrogliose, Neurodegeneration und charakteristische PrPSc-Ablagerungen gekennzeichnet. Die pathologischen Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, sind noch weitgehend unverstanden. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression in Scrapie-infizierten Mausgeweben kann zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen dieser Erkrankung auf molekularer Ebene beitragen. Auch könnten einige der differentiell exprimierten Gene zur Entwicklung eines auf Surrogatmarkern basierenden Testsystems beitragen oder für die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Intervention nützlich sein. Um im Verlauf der Scrapieerkrankung in Mäusen hoch- oder herunterregulierte Gene zu identifizieren, wurden RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) und suppression subtractive hybridisation (SSH) an Hirn- und Milzproben Scrapie-infizierter Mäuse und gesunder Kontrolltiere durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anhand eines differentiellen Screening-Schrittes, Sequenzanalysen und Northernblots bestätigt. Durch einen Datenbankabgleich der erhaltenen Sequenzen wurden mehrere Kandidaten identifiziert. Einige davon, wie GFAP, Apolipoprotein D, Vimentin, Mx-Protein, MHC I und II wurden bereits als in Scrapie-infizierten Gehirnen hochreguliert von anderen Arbeitsgruppen publiziert. Eine differentielle Regulation weniger weiterer Kandidaten, wie Cytochromoxidase, Ubiqitinierungsfaktor E4a und das herunterregulierte Stathmin wurden bisher noch nicht beschrieben. Auch eine bisher unbekannte differentiell exprimierte Sequenz wurde gefunden. Ergänzend zu den Untersuchungen auf Nukleinsäureebene wurde die 2DElektrophorese für Gehirngewebe zur Untersuchung der differentiellen Expresssion auf Proteinebene unter Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen etabliert. Protokolle für die Vorbereitung von Mäusegehirnproben, die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung und der 2. Dimension, sowie Färbeprotokolle für qualitative und quantitative Analysen der Gele unter Berücksichtigung der Erfordernisse nachfolgender MALDI-Analysen wurden erarbeitet.
Der Einfluss von Stress auf einen Organismus führt zur Expression molekularer Chaperone unterschiedlichster Hitzestressprotein-(Hsp)-Familien, die die Zellen vor stressbedingten Schäden schützen. Mitglieder der Hsp2O-Familie (kurz small Hsps, sHsps) besitzen ein Molekulargewicht von 12-43 kDa und sind durch einen zentralen, evolutiv konservierten Bereich, der als alpha-Crystallin-Domäne (ACD) bezeichnet wird, gekennzeichnet. Diese besteht größtenteils aus beta-Strängen, während die flankierenden Bereiche hingegen variabel in Länge, Sequenz sowie Sekundärstrukturen sind. sHsps bilden mit Hilfe der Sekundärstrukturen oligomere Komplexe aus. Darüber hinaus besitzen sie eine ATP-unabhängige Chaperonaktivität und spielen beim Schutz thermosensitiver Proteine eine wichtige Rolle. In Pflanzenzellen führt ein anhaltender Hitzestress zur Ansammlung von sHsps zu so genannten Hitzestressgranula (HSGs), die sich wiederum zu größeren HSG-Komplexen (HSCs) organisieren. Eine mögliche Funktion von HSCs ist der Schutz zellulärer denaturierter Proteine vor einer irreversiblen Aggregation. Durch deren Bindung mittels sHsps und Eingliederung in den HSC-Verband werden die denaturierten Proteine in einem faltungskompetenten Zustand gehalten. Schließlich können die mit den HSCs assoziierten ATP-abhängigen Hsp-Maschinen (z.B. Hsp70/40, Hsp100) die sHsp-gebundenen Substrate renaturieren. Wie in der vorliegenden Arbeit dargestellt, weisen Pflanzen die höchste soweit bekannte Anzahl von sHsp-Genen auf. Die korrespondierenden Proteine werden anhand ihrer Primärsequenz und subzellulären Lokalisation in verschiedene Klassen eingeteilt: sHsps der Klassen CI und CI1 befinden sich im nucleo-cytoplasmatische Raum, sHsps der Klasse M in Mitochondrien, der Klasse P in den Plastiden und der Klasse ER im endoplasmatischen Reticulum sowie im Golgi-Apparat. Da das Genom von Arabidopsis thaliana das erste komplett sequenzierte pflanzliche Genom ist, eignete sich dieser Modelorganismus zur Identifikation aller sHsp kodierenden Gene. Der Einsatz von Protein- und Nukleotidsequenzen bereits bekannter pflanzlicher sHsps als Suchkriterium in der NCBI-Datenbank (BLASTP und BLASTN), ergab die ldentifikation 19 putativer sHsp kodierender Gene, von denen erstaunlicheweise 13 bislang noch nicht bekannt waren. Proteinsequenzvergleiche ergaben, dass 7 der neu entdeckten sHsps nicht den typischen Klassen zugehörig sind. Dies bildete den Ausgangspunkt für deren nähere Analyse und Charakterisierung im Rahmen des ,,Functional Genomics": (1) Lokalisationsstudien I: Myc-Epitop markierte sHsp-Konstrukte wurden transient in Tabak-Mesophyllprotoplasten transformiert. Über Lokalisationsstudien per lmmunfluoreszenz konnten diese Proteine in tatsächlich 7 neu definierte sHsp Klassen eingeteilt werden. Interessanteweise werden die Vertreter dieser neuen Klassen von jeweils nur einem Gen kodiert. Die Vertreter der Klassen CI11 bis CVII lokalisieren im nucleo-cytoplasmatischen Kompartiment. Ferner bewiesen die Kodetektionen von organellären Markerproteinen, dass Klasse MII sHsps in die Mitochondrien und Mitglieder der Klasse Po in die Peroxisomen transportiert werden. Dies stimmte überein mit der Vorhersage von organellären Signalsequenzen. (2) Lokalisationsstudien II: Frühere Studien zeigten, dass sHsps der Klassen CI und CII unter Hitzestressbedingungen HSCs ausbilden. Wahrscheinlich fungieren Klasse CII sHsps als Grundgerüst für die HSC-Bildung und rekrutieren sHsps der Klasse CI in diese Multichaperonkomplexe. Die Proteine (Myc-markiert) Hsp17.4-CIII, Hsp15.4-CIV, Hsp18.5-CVI und Hsp14.7-CVII wurden unter Hitzestressbedingungen in endogene HSCs von Tabak-Mesophyllprotoplasten eingegliedert. Dieses Phänomen bleibt auf die genannten sHsp Klassen beschränkt, da weder Hsp21.7-CV, noch die organellären Proteine Hsp26.5-MI1 sowie Hsp15.7-Po in HSCs detektiert wurden. (3) Das sHsp-lnteraktom: Im Gegensatz zu früheren Studien, konnte in der vorliegenden Arbeit eine lnteraktion zwischen sHsps verschiedener Klassen zum ersten Mal im Hefe-Zwei-Hybrid-System sowie über Pull-down und nativer SDS-Gelelektrophorese detektiert werden. Am Beispiel eines Klasse CIII sHsps wurde gezeigt, dass die lnteraktion mit sHsps anderer Klassen zu einer Heterooligomerisierung führt. Dies wiederum hat eine nachhaltige Beeinflussung der intrazellulären Lokalisation der sHsps zur Folge. (4) Darüber hinaus ist für sHsps der Klasse CIII typisch, dass sie aufgrund einer Kernlokalisationssequenz innerhalb der ACD in den Nukleus transportiert werden. Im Vergleich zu sHsps der Klassen CI und CII, die Oligomere Strukturen von 220-230 kDa ausbilden, assemblieren sHsp-Monomere der Klasse CIII zu hochmolekularen Komplexen im Bereich von 1 MDa. (5) Das sHsp-Transkriptom: Durch RT-PCR-Analysen und Auswertung der öffentlich zugänglichen Microarray-Daten des AtGenExpress Konsortiums, konnte die Expression aller sHsps kodierenden Gene im Arabidopsis Genom auf transkriptioneller Ebene analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben Hitzestress auch der Einfluss anderer abiotischer Stressoren, wie U. a. oxidativer stress und UV-B Bestrahlung, zu einer Akkumulation von sHsp-Transkripten führt. Ferner werden einige sHsps in bestimmten Entwicklungsstufen bzw. Organen, wie z.B. Blüten, Blättern und Samen, unabhängig von Stresseinflüssen exprimiert. (6) Funktionelle Analysen: Ein seminatives in vitro Chaperontestsystem, in dem Luciferase als thermosensitives Modelsubstrat eingesetzt wird, wurde herangezogen, um ausgesuchte sHsps bezüglich ihrer möglichen Chaperonfunktion zu testen. In Abhängigkeit der rekombinant hergestellten Proteine Hsp18.5-CVI, Hsp26.5-MII und Hsp15.7-Po konnte eine verminderte Aggregation der Luciferase unter Hitzestresseinwirkung und eine darauf folgende erhöhte Renaturierung durch ATP-abhängige Chaperonmaschinen während einer Erholungsphase beobachtet werden. (7) Peroxisomale sHsps: Da nie zuvor über peroxisomale sHsps berichtet wurde, nahm Hsp15.7-Po eine besondere Rolle bei den Untersuchungen ein. Dieses Protein besitzt eine putative peroxisomale Lokalisationssequenz (PTS) am C-Terminus, bestehend aus der Abfolge der Aminosäurereste SKL (PTS1). Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Studien und lmmunfluoreszenzanalysen (in Tabak-Mesophyllprotoplasten und Säugerzellen) sowie den Einsatz von Mutanten wurde demonstriert, dass die PTS1 tatsächlich für die lnteraktion von Hsp15.7-Po mit den TPR-Domänen des peroxisomalen Importrezeptors Pex5 und für die peroxisomale Lokalisation des sHsps verantwortlich ist. Ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening nach möglichen lnteraktionspartnern von Hsp15.7-Po lieferte den ersten Anhaltspunkt für die lnteraktion mit cytoplasmatischen sHsps (Hspl7.7-CII). Dies ließ sich durch Pull-down-Analysen bestätigten und auf Hsp17.6-CII erweitern. Diese Interaktionen beeinflussten jedoch nicht die subzelluläre Lokalisation der jeweiligen Proteine bei Koexpression in Tabak-Mesophyllprotoplasten. All die hier dargestellten Ergebnisse weisen auf diverse Funktionen der einzelnen neu identifizierten sHsps der unterschiedlichen Klassen hin und bilden die Grundlage für zukünftige, detaillierte in planta Untersuchungen, die hierdurch erleichtert werden können.
Zwei der wichtigsten Leistungen eines sich entwickelnden Embryos sind der Aufbau des Blutkreislauf- und des Nervensystems. Beide Systeme sind hierarchisch organisierte Strukturen, deren Verzweigungen nahezu alle Teile des Körpers erreichen. Es gibt eine zunehmende Zahl von Hinweisen darauf, dass ihre Entwicklung eng miteinander verknüpft ist, nach ähnlichen Prinzipien verläuft und verwandte molekulare Mechanismen verwendet. Die Entstehung eines funktionellen vaskulären Netzwerks erfordert Signale, die Prozesse wie die Lenkung und die Verzweigung von Gefäßen in den Zielgeweben kontrollieren. Ähnliche Anforderungen werden an wachsende Axone bei der Knüpfung der Verbindungen des Nervensystems während der Embryonalentwicklung gestellt. Einige der Faktoren, die die Lenkung der Axone kontrollieren, spielen auch eine ähnliche Rolle in der vaskulären Entwicklung. Lenkungsmoleküle, die eine Richtungsinformation vermitteln, sind für die Wegfindung der Axone besonders wichtig. Die größte Familie solcher Lenkungsmoleküle wird durch die Semaphorine gebildet. Semaphorine können in acht Klassen unterteilt werden, deren gemeinsames Merkmal eine konservierte Semaphorin-Domäne ist und die unterschieden werden anhand ihrer Klassen-spezifischen carboxyterminalen Domänen. Die Semaphorin-Familie umfasst sowohl sekretierte als auch membrangebundene Proteine. Die am besten charakterisierten hiervon sind die sekretierten Klasse 3 Semaphorine. Eine Kombination von in vitro und in vivo Ansätzen zeigte, dass die Klasse 3 Semaphorine an der Steuerung der Axon- und Dendritenlenkung, der Bildung von Axonbündeln und der neuronalen Migration während der Entwicklung des Nervensystems beteiligt sind. Sie agieren hauptsächlich als repulsiv wirkende Signale, die Axone aus Regionen ausschließen, von den Geweben weg, in denen sie exprimiert sind. Diese Wirkung wird über die Semaphorin-Domäne vermittelt. Verschiedene Hinweise deuten auf eine Beteiligung von Semaphorinen an der Entwicklung des vaskulären Systems. Sowohl homozygote Sema3a- als auch Sema3c-Mausnullmutanten sterben nach der Geburt aufgrund kardiovaskulärer Defekte. Darüber hinaus binden die Rezeptoren für die Klasse 3 Semaphorine, Neuropilin-1 (Nrp-1) und –2 (Nrp-2), einige Isoformen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Neuropilin-1 und Neuropilin-2-defiziente Mäuse und Neuropilin-1/-2-Doppelmutanten weisen Defekte des Gefäßsystems auf, wie z.B. eine Rückbildung der neuralen Vaskularisierung und Abweichungen in der Entwicklung des Herzens und der großen Gefäße. Die membrangebundenen Semaphorine sind bisher nur wenig untersucht, da zuverlässige in vitro Assays fehlen. Somit ist ein genetischer Ansatz der beste Weg, die physiologische Funktion dieser Proteine zu untersuchen. Aus diesen Gründen war die Zielsetzung dieser Arbeit, durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen eine Mauslinie herzustellen, die ein Nullallel des membrangebundenen Sema5a-Gens trägt. Für diesen Ansatz wurde ein Mitglied der Klasse 5 Semaphorine gewählt, da es nur zwei Mitglieder dieser Klasse im Mausgenom gibt, die weitgehend komplementäre Expressionsmuster aufweisen. Damit unterscheiden sie sich von den anderen Klassen der Semaphorine, deren Mitglieder stark überlappende Expressionsmuster zeigen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer gegenseitigen funktionellen Kompensation nach Mutation eines Gens. Die Klasse 5 Semaphorine sind auch deshalb besonders interessant, da sie die einzigen sind, die sowohl in Vertebraten als auch in Invertebraten vertreten sind. Sie sind gekennzeichnet durch sieben carboxyterminale Typ 1-Thrombospondinmodule (TSP) in ihrer extrazellulären Domäne. TSPs wurden ursprünglich in den Proteinen Thrombospondin 1 und 2 gefunden, in denen sie das Auswachsen von Neuriten verschiedener Nervenzelltypen fördern. Dies lässt vermuten, dass Klasse 5 Semaphorine sowohl inhibierende als auch stimulierende Effekte haben könnten, in dem sie unterschiedliche Rezeptoren mit der Semaphorin-Domäne oder der TSPs aktivieren. Das Expressionsmuster von Sema5A und die bekannte Funktion von Semaphorinen in der Ausbildung neuronaler Verbindungen lassen es sinnvoll erscheinen, bei der Untersuchung der mutanten Tiere den Schwerpunkt auf die Entwicklung des Nerven- und des Gefäßsystems zu legen. Aufgrund technischer Schwierigkeiten konnte innerhalb der Bearbeitungszeit dieser Doktorarbeit nur der Phänotyp des vaskulären Systems untersucht werden. Die Inaktivierung des Sema5a-Gens wurde durch die Verwendung eines ‚Targeting’-Vektors erreicht, welcher die Exone 4 und 5 des Sema5a-Gens durch eine Neomycin-Selektionskassette ersetzte. Aus 144 untersuchten ES-Zellklonen wurden drei ES-Zellinien mit einem rekombinierten Sema5a-Locus identifiziert. Zwei der positiven Klone wurden zur Herstellung einer chimären Maus durch die Morula-Aggregationsmethode verwendet. Mit einem der Klone konnte eine männliche Chimäre erzeugt werden, die nach Kreuzung mit NMRI-Wildtyptieren die Mutation an die Nachkommen weitergab. Der Verlust der Proteinexpression in homozygoten Sema5a-Mutanten wurde durch Westernblot-Analyse von Zellmembranpräparationen homozygoter Embryonen unter Verwendung eines Antikörpers gegen das zytoplasmatische Ende von Sema5A bestätigt. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Deletion des vierten und fünften Exons des Sema5a-Gens ein Nullallel hervorbringt. Nach Verpaarungen heterozygoter Mutanten konnten keine Neugeborenen identifiziert werden, die homozygot für das mutierte Allel waren. Homozygte Mutanten starben zwischen E11,5 und E12,5 der Embryonalentwicklung, der Verlust von Sema5A ist also embryonal letal. Die Morphologie der homozygoten Tiere zeigte keinen offensichtlichen Unterschied zu den heterozygoten Embryonen oder zu Wildtyp-Geschwistern auf. Frühe embryonale Musterbildungsprozesse in Sema5a-Nullmutanten sind also nicht gestört. Ein Tod bei dieser Entwicklungsstufe deutet auf einen Defekt in der Entwicklung des Blutgefäßsystems hin, da die Embryonalstadien zwischen E9 und E13 besonders wichtig für die Ausbildung dieser Gefäße sind und viele Mutationen, die Herz und Blutgefäßen beeinträchtigen, den Tod der Embryonen in diesem Stadium bewirken. Das embryonale Blutgefäßsystem in E10,5 und E11,5 Embryonen wurde durch immunhistochemische Färbungen ganzer Embryonen unter Verwendung eines spezifischen gegen das Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule (PECAM) gerichteten Antikörpers dargestellt, welches in vaskulären Endothelzellen exprimiert ist. Die allgemeine Architektur des Gefäßsystems war in homo- und heterozygoten Mutanten ähnlich und wies weder an E10,5 noch an E11,5 besondere Abweichungen auf. Es wurden bei der Lage und der Anzahl intersomitischer Gefäße, der Entwicklung der dorsalen Aorta oder der Vaskularisierung der Extremitätenanlagen keine Abweichungen festgestellt. Morphologische Defekte konnten jedoch bei E10,5 in den Verästelungen der Blutgefäße detektiert werden, die von den Hauptvenen der Cranialregion abzweigen. Die Verzweigungen waren geringer ausgeprägt als in heterozygoten oder Wildtyp-Vergleichstieren. Insbesondere zeigte sich eine Verringerung der Anzahl sekundärer und tertiärer Verzweigungen. In dem sich entwickelnden Embryo führt die wiederholte Verzweigung von Ästen der Hauptvenen zu einem hierarchisch gegliederten Netzwerk großer Gefäße in der Region des medialen Kopfes. Während die Ausbildung dieses Netzwerkes in den Sema5a-/--Tieren beeinträchtigt ist, erscheint die Organisation der kleinen Gefäße in den mehr dorsal und peripher gelegenen Regionen des Kopfes normal. In heterozygoten und homozygoten Mutanten bilden die kleineren Gefäße ein dicht verzweigtes Netzwerk. Die Verminderung der Komplexität der größeren Gefäße konnte in allen untersuchten Nullmutanten beobachtet werden. Es variierte jedoch die Penetranz des Phänotyps. In allen Fällen war die Anzahl primärer Verzweigungen unverändert, während die Anzahl der sekundären und der tertiären Verzweigungen zu unterschiedlichen Graden reduziert war. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Verzweigungsmuster von heterozygoten Mutanten und beim Wildtyp nur eine geringe Variabilität zwischen individuellen Embryonen. Dies belegt, dass die Verminderung des Verzweigungsgrades größerer Gefäße nicht innerhalb der normalen Variabilität liegt, sondern durch die Inaktivierung des Sema5a-Gens verursacht wird. Dieser Phänotyp ist in späteren Stadien sogar deutlicher ausgeprägt. In E11,5 Embryonen waren die Stämme der großen Blutgefäße in den Nullmutanten weniger komplex und in einigen Fällen trat sogar eine Reduzierung der Anzahl primärer Verzweigungen auf. Diese spätere Verminderung der Anzahl bereits ausgebildeter primärer Verzweigungen legt nahe, dass der Phänotyp durch eine Rückbildung von Verzweigungen aufgrund möglicher Defizite in deren Reifung und/oder Stabilisierung erfolgt. Die interessanteste Besonderheit der vaskulären Defekte in den Nullmutanten liegt in ihrer regionalen Spezifität. Bis hier ist das Netzwerk großer Gefäße, welches der anterioren Hauptvene entspringt, das einzige Gefäßsystem, in dem Abweichungen entdeckt wurden. Dieses Netzwerk wird durch die strukturelle Umbildung des primären kapillaren Plexuses gebildet. Zwischen E9,5 und E12 sprießen Zweige rostral aus der Hauptvene, um ein hierarchisch organisiertes Netzwerk von Gefäßen zu bilden. Die Umbildung des primären kapillaren Plexus in den mehr rostral und ventral gelegenen Kopfregionen führt zu der Bildung eines hochverzweigten vaskulären Netzwerkes, welches jedoch bei E10,5 noch nicht hierarchisch organisiert erscheint. Die Signale, die für diesen unterschiedlichen Ablauf der Musterbildung während der Entwicklung des Gefäßsystems des Kopfes verantwortlich sind, sind noch unbekannt. Die besonderen Defekte in der stereotypischen Organisation der cranialen Gefäße in Sema5a-Mutanten legt nahe, dass Sema5A eines dieser Signale sein könnte. Es könnte Teil eines Rezeptor/Ligandenkomplexes sein, welcher positionelle Signale für das Verzweigen und das Wachstum großer Gefäße in rostraler Richtung liefert. Sema5A könnte die Bildung von Verzweigungen durch die Regulierung der Wanderung endothelialer Zellen, ihrer Proliferation oder ihrer Interaktion mit unterstützenden Zellen oder der extrazellulären Matrix kontrollieren. Sema5A könnte Teil eines neuen Signalweges sein oder als Teil eines der bekannten Signalwegs wirken, welcher die Entwicklung des Gefäßsystems reguliert. Einer der Signalwege, die essentiell für die Gefäßbildung sind, wird durch VEGF und Angiopoietin (Ang-1) reguliert. Sowohl in VEGF-, als auch in Ang-1-Mutanten ist die Gefäßumbildung im Kopf beeinträchtigt. Insbesondere erscheint das Netzwerk kleiner Gefäße in den Ang-1 Nullmutanten als nur nur teilweise restrukturiert und die großen Gefäße als weniger komplex. Das Verzweigungsmuster der großen Gefäße in den Ang-1- Nullmutanten ähnelt auffallend dem der Sema5a-Nullmutanten. Eine zweite Ähnlichkeit in den Phänotypen von Ang-1- und Sema5a-Mutanten zeigt sich in der Reduzierung der primären Verzweigungen, welche in den Sema5a-Nullmutanten bei E11,5 beobachtet wird. Hier könnte die Verminderung aus einer Rückbildung von Gefäßen resultieren, wie sie auch typischerweise in Mutanten für Ang-1 oder dessen Rezeptor auftritt. Diese Beobachtung legt nahe, dass Sema5A ein neuer Teilnehmer innerhalb des Ang-1-Signalweges ist, welcher die Auswirkung von Ang-1 auf die endothelialen Zellen der großen Gefäße entweder vermittelt oder moduliert und dadurch das spezifische Muster der Blutgefäße des Kopfes beeinflußt. Mit dieser Doktorarbeit wird zum ersten Mal eine funktionelle Untersuchung des Klasse 5 Semaphorins Sema5A vorgestellt. Die phänotypische Untersuchung von Mäusen, die Nullallele für Sema5a-Gens tragen ergab, dass dieses membrangebundene Protein essentiell für die embryonale Entwicklung ist. Es ist an der Musterbildung des Gefäßsystems beteiligt. Seine Aufgabe besteht möglicherweise darin, die Bereitstellung positioneller Signale für die Ausbildung von Gefäßverzweigungen zu gewährleisten. Einige grundlegende Fragen werden durch diesen Phänotyp aufgeworfen. Sowohl die Ursache für die embryonale Sterblichkeit als auch die zellulären Prozesse, welche in den Sema5a-Nullmutanten beeinträchtigt sind, müssen noch beschrieben werden. Unbekannt ist ebenfalls, ob zusätzlich zu der hier beschriebenen Rolle von Sema5A in der Gefäßbildung dieses an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist. Die ersten Daten über die physiologische Rolle von Sema5A, welche mit dieser Arbeit vorgelegt werden, öffnen den Weg für weitergehende Untersuchungen über die Funktion des Proteins während der Embrionalentwicklung. Das hier erstmals vorgestellte Modellsystem ermöglicht es, Sema5A regulierte zelluläre Mechanismen zu untersuchen. Zusätzlich stellt es ein Werkzeug zur Verfügung, um die funktionelle Beziehung zwischen der Entwicklung des kardiovaskulären Systems und des Nervensystems zu untersuchen. Damit können die Aufgaben der Semaphorin-Proteinfamilie, die an diesen beiden wichtigen Prozessen beteiligt sind, näher charakterisiert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene proteomanalytische Methoden untersucht und evaluiert, die, basierend auf der Verwendung 2D-gelelektrophoretischer, 2D-chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken, die differentielle, quantitative Proteinanalyse zweier unterschiedlicher muriner Fibroblasten-Zelllinien ermöglichen. Hierfür wurden zunächst unterschiedliche Methoden für die 2D-elektrophoretische Proteinauftrennung analysiert. Im Hinblick auf eine größtmögliche Auflösung und Gel-zu- Gel-Reproduzierbarkeit wurden innerhalb der ersten Dimension (IEF) die Lademethode, die Fokussierungszeiten und der Reduktionsschritt (DTT oder HED) optimiert. Desweiteren wurde eine auf isoelektrischer Fokussierung basierende Vorfraktionierungsmethode auf ihre Anwendbarkeit bei einer quantitativen Proteomanalyse getestet. Für die Proteingelfärbung wurde unter anderem ein selbst synthetisierter Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, der hinsichtlich Färbesensitivität und MS-Kompatibilität mit etablierten Protokollen verglichen wurde. Eine Doppelfärbungs-Methode von Proteingelen (Silberfärbung nach Fluoreszenzfärbung) wurde auf ihre MS-Kompatibilität nach tryptischen Verdau untersucht. Desweiteren wurden manuelle und automatisierte Verdauprotokolle für eine möglichst hohe Peptide Recovery optimiert. Die zunächst durch die Anwendung von klassischen Färbe- und Quantifizierungsmethoden nach 2DE gewonnenen Ergebnisse wurden mit neueren Labelling-Methoden zur relativen Proteinquantifizierung verglichen. Dabei kamen zwei unterschiedliche Multiplexing-Verfahren zum Einsatz, die sich in der Proteinquantifizierung grundlegend unterscheiden (DIGE: gelbasierte Proteinquantifizierung; iTRAQ: LC-MS/MS basierte Peptidquantifizierung). Die für diese beiden Methoden bestehenden Protokolle wurden für die Anwendbarkeit auf die Fibroblasten-Proteinextrakte angepasst. Es konnte gezeigt werden, daß diese beiden Labelling-Methoden in Bezug auf Reproduzierbarkeit und quantitativer Aussagekraft dem klassischen 2DE-Experiment (Proteinfärbung nach der Auftrennung auf einzelnen Gelen) überlegen sind. Die statistische Absicherung der analysierten relativen Quantitätsunterschiede verbesserte sich durch die zusätzliche Anwendung der beiden neuen Labelling-Methoden erheblich. Dabei stützt sich die Signifikanz der quantitativen Bestimmung sowohl auf die große statistische Sicherheit, die innerhalb dieser beiden Multiplexing-Methoden erreicht wird, als auch auf die Wiederholbarkeit in unterschiedlichen Experimenten (21 Proteine wurden in unterschiedlichen Ansätzen bestätigt). Die beiden Labelling-Methoden DIGE und iTRAQ unterscheiden sich außer in der Quantifizierungsstrategie auch grundsätzlich in dem Ansatz der Auftrennung (DIGE: Proteine, 2DElektrophorese; iTRAQ: Peptide, 2D-Flüssigchromatographie). Damit besitzen sie unterschiedliche Limitierungen in Bezug auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Peptide/Proteine, die mit der jeweiligen Methode aufgetrennt werden können. Der daraus resultierende komplementäre Charakter beider Methoden konnte anhand mehrerer Proteine verdeutlicht werden. Durch die relative Quantifizierung konnten insgesamt 30 Proteine identifiziert werden, die aufgrund der An- oder Abwesenheit des MLL-Proteins in den beiden murinen Zelllinien differentiell reguliert sind. Die alleine schon durch die unterschiedliche Morphologie der untersuchten murinen Fibroblasten vermutete Deregulation von Struktur- und Stressproteinen (Actin, HSP27, HSP70) konnte bestätigt werden. Weitere Expressionsunterschiede zwischen Mll-/-- und Mll+/+-Fibroblasten zeigten sich vor allem bei Proteinen, die funktionell der Gruppe RNA-prozessierender Proteine (Polyadenylate Binding Protein, PTB-associated Splicing Factor, hnRNPs) zugeordnet werden können. Ein Vergleich der quantitativen Proteomdaten dieser Arbeit mit den mRNA-Expressionsprofilen der gleichen Zellen zeigt nur eine sehr geringe Korrelation bezüglich der Regulationen einzelner Gene/Proteine. Die meisten der bisherigen Studien, die eine Untersuchung des mRNA/Protein-Verhältnisses zum Gegenstand haben, bestätigen das Fehlen einer Korrelation. Diese Tatsache unterstreicht die Wichtigkeit der Kombination genomischer und proteinanalytischer Daten zur Aufklärung zellulärer molekularer Prozesse.
Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können.
Retrovirale Gen-Therapie-Vektoren haben die ethisch problematische Eigenschaft, ungerichtet in das Genom der therapierten Zellen zu integrieren und somit die Zelle gegebenenfalls durch Insertions-Mutagenese zu schädigen. Diese Problematik könnte gelöst werden, indem das zugrunde liegende Prinzip spezifisch integrierender, mobiler genetischer Elemente (Transposons) aufgeklärt und in die Retrovirus-basierten Gen-Therapie-Vektoren mit einbezogen werden könnte. Das Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum enthält eine Reihe von Non-LTR-Retrotransposons, die ausnahmslos Positions- und Orientierungs-spezifisch in die genetisch unproblematischen Regionen vor oder hinter tRNAGene integrieren (tRNA-Gen-assoziierte Retroelemente oder kurz TRE). Zur Untersuchung des Mechanismusses der Positions- und Orientierungs-spezifischen Integration von TRE-Retrotransposons wurde in D. discoideum ein in vivo Retrotranspositions-Testsystem etabliert, mit welchem de novo auftretende Retrotranspositions-Ereignisse endogener TRE-Retrotransposons auf methodisch einfache Weise festgestellt und analysiert werden konnten. Das in vivo Testsystem beruht auf der positiven Selektion derjenigen Zellen eines D. discoideum-Reporterstammes, in denen eines der selten auftretenden Retrotranspositions-Ereignisse stattgefunden hat. Die Herstellung des D. discoideum- Reporterstammes erfolgte durch die Veränderung des UMP-Synthase-Gens (pyr5-6), in welches artifiziell ein Intron (cbfAint) inklusive eines „Köder“-tRNA-Gens (valUAC) integriert wurde. Aufgrund der Integration eines TRE-Retrotransposons in die Nähe des „Köder“-tRNA-Gens kann das Intron nicht mehr korrekt aus der UMP-Synthase-Vorläufer-mRNA gespleißt werden, die Zellen konvertieren dadurch bedingt vom ura+- zum ura--Phänotyp und können deshalb mit dem für ura+-Zellen toxischen Zytostatikum 5-Fluoro-orotat (5-FO) positiv selektiert werden. Durch die detaillierte Analyse zahlreicher 5-FO-resistenter Klone konnte gezeigt werden, daß in modernen D. discoideum-Stämmen ausschließlich die oberhalb von tRNA-Genen integrierenden TRE5-Retrotransposons vom Subtyp A.1 und A.2 gleichermaßen aktiv sind und daß ein beliebiges „Köder“-tRNA-Gen in einer artifiziellen genomischen Umgebung als Integrations-Ziel für TRE5-A-Retrotransposons dienen kann. Die TRE5-A-Retrotransposons zeigten entsprechend den genomischen Kopien eine Positions-Spezifität von ca. 48 (±3) bp oberhalb des tRNA-Gens und Ziel-Sequenz-Verdopplungen von 12 – 15 bp. Alle de novo integrierten TRE5- A.1-Retrotransposons waren 5’-verkürzt, während 64% der TRE5-A.2-Retrotransposons ein intaktes 5’-Ende aufwiesen. Das nukleäre D. discoideum-Protein CMBF (C-Modul-bindender Faktor) bindet Sequenzspezifisch an das C-Modul von TRE5-A-Retrotransposons und könnte deshalb an der Regulation der Transkription und/oder Mobilisierung der TRE5-A-Retrotransposons beteiligt sein. Zur Untersuchung des Einflusses von CMBF auf die TRE5-A-Retrotranspositions-Frequenz wurde das in vivo Retrotranspositions-Testsystem im D. discoideum-Stamm JH.D2 etabliert, welcher mit ca. 5% des Wildtyp-Niveaus CMBF stark unterexprimiert. Die Herstellung von JH.D2 erfolgte durch Einführung eines amber-Translationsstop-Codons in das cbfA-Gen des Wildtyp-Stamms AX2 sowie Expression einer amber-Suppressor-tRNA. Durch die Herstellung eines murinen monoklonalen Anti-CMBF-Antikörpers konnte bewiesen werden, daß die CMBF-Unterexpression auf eine partielle Suppression des cbfA(amber)-Stop-Codons zurückzuführen ist. Die Unterexpression von CMBF führte zu einer Erniedrigung der zellulären Menge an Sense- und Antisense-Transkripten der TRE5-A-Retrotransposons und im in vivo Testsystem zu einer maßgeblichen Reduktion der Retrotranspositions-Frequenz. Das Protein CMBF zeigt in der JumonjiC-Domäne (JmjC) Homologie zu einer Vielzahl von Proteinen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen und könnte daher neben der Regulation der TRE5-A-Retrotransposition noch weitere biologische Funktionen in D. discoideum erfüllen. Die eingehende Untersuchung des Phänotyps der CMBFunterexprimierenden Mutante JH.D2 zeigte ein verlangsamtes Wachstum sowie einen um ca. 24 Stunden verzögerter Beginn der Entwicklung aufgrund der Inhibition des cAMP-Signalsystems. Durch die homologe Expression von CMBF und N-terminal verkürzter CMBF-Derivate konnte der Entwicklungs-Phänotyp von JH.D2 revertiert und somit der zelluläre CMBF-Mangel als alleinige Ursache für die phänotypische Veränderung von JH.D2 verantwortlich gemacht werden. Aufgrund von Zweifeln an der Richtigkeit des bislang angenommenen CMBF-kodierenden Gens (cbfA-Gen) wurde der Transkriptionsstart des cbfA-Locus mittels der 5’-RACE-Methode bestimmt und somit der Beginn des cbfA-Gens korrekt definiert. Das cbfA-Gen umfaßt demnach 3412 bp inklusive eines Introns von 409 bp und kodiert somit für ein 1000 Aminosäuren langes Protein mit einem rechnerischen Molekulargewicht von 114 198 kDa. Durch die Etablierung des in vivo Retrotranspositions-Testsystems in Dictyostelium discoideum sind die Voraussetzung für eine detaillierte Untersuchung der spezifischen Retrotransposition der TRE5-Retrotransposons gegeben. Die Herstellung der CMBF-unterexprimierenden D. discoideum-Mutante JH.D2 bietet die Möglichkeit einer eingehenden Funktions-Analyse der charakteristischen Domänen von CMBF.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.
The Na+/proline transporter of E. Coli (PutP) is responsible for the uptake of proline which is subsequently used not only as a carbon and nitrogen source and a constituent of proteins but also as a particularly effective osmoprotectant. However, for a long time there was little known about the single steps in the reaction cycle of this transporter and only few details about its structure-function relationship are available. Aim of the present work was to achieve a deeper understanding about the kinetic properties of the Na+/proline transporter and to get insights into the structure-function relationship of the substrate binding. To answer these questions different techniques were used. By using the novel SSM technique combining the preparation of PutP proteoliposomes it was possible to demonstrate for the first time the electrogenic substrate binding to PutP transporter. Due to rapid solution exchange measurements on the SSM it was additionally possible to obtain time resolved information about the kinetic details of the cytoplasmic substrate binding sites which were not available by previous steady state and equilibrium binding measurements. Pre-steady-state charge translocation was observed after rapid addition of one or both of the cosubstrates Na+ and/or proline to the PutP-WT proteoliposomes adsorbed on the SSM. Thereby it was possible to link the observed electrical signals with the binding activity of PutP. The observed Na+ and/or proline induced charge displacement were assigned to an electrogenic Na+ and/or proline binding process at the cytoplasmic face of the enzyme with a rate constant of k > 50 s-1 proceeding the rate limiting step of the reaction cycle. Furthermore, based on the kinetic analysis of the electrical signals obtained from the measurements of PutP on SSM, the following characteristics of the substrates binding in PutP were deduced: (1) both Na+ and proline can bind individually to the transporter. Under physiological conditions, an ordered binding mechanism prevails; while at sufficiently high concentrations, each substrate can bind in the absence of the other; (2) substrate binding is electrogenic not only for Na+, but also for the uncharged cosubstrate proline. The charge displacement associated with Na+ binding and proline binding is of comparable size and independent of the presence of the respective cosubstrate. In addition, it was concluded that Na+ accesses its binding site through a high-field access channel resulting in a charge translocation, whereas the binding of the electroneutral proline induces a conformation alteration involving the displacement of charged amino acid residue(s) of the protein; (3) Na+ and proline binding sites interact cooperatively with each other by increasing the affinity and/or the speed of binding of the respective cosubstrate; (4) proline binding proceeds in a two step process: low affinity (~ 0.9 mM) electroneutral substrate binding followed by a nearly irreversible electrogenic conformational transition; (5) membrane impermeable PCMBS inhibits both Na+ and proline binding to the inside-out orientated PutP transporter, indicating that rather than selectively blocking a specific binding site, PCMBS probably locks the enzyme in an inactive state. The possible targets for this SH-reagent are cysteines 281 and 344 located close to the cytoplasmic surface of the protein. Beyond it, transient electrical currents of PutP were also observed on the BLM after rapid addition of proline in the presence of Na+. This was possible by combining the conventional BLM technique with high-speed flash-photolysis of caged-proline. Indeed the signals on the BLM indicate the detection of a different underlying reaction process in comparison to the data achieved by the SSM technique. This has paved the way for supplemental information about the reaction cycle since it was possible to assign the flash-photolysis BLM signals to the proline binding step followed by the internalization of Na+ and proline into the liposome. Thereby it was found, that the presence of Na+ is indispensable and the time constant for the process is ~ 63 ms. Moreover, structure-function information about the Na+ and proline binding sites of PutP was obtained by investigating the functionally important amino acid residues Asp55, Gly63 and Asp187 with site-directed mutagenesis and the combined SSM technique. One finding is that the mutated proteins PutP-D55C and PutP-G63C showed no activity on the SSM. Therefore, it can be assumed that either both Asp55 and Gly63 are crucial for the structure of PutP protein, or they are located at or close to the Na+ and proline binding sites. Furthermore, the results obtained from PutP-D187N and PutP-D187C mutants on SSM suggest that Asp187 of PutP is likely to be involved in the Na+ binding at the cytoplasmic side of the backward running carrier. Taken together the results of the present work have substantially broadened the known picture of the Na+/proline transporter PutP thereby several steps of the reaction cycle were elucidated, and moreover, valuable insights into the structure-function relationship of the transporter have become available.
The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...
Sodium proton antiporters are ubiquitous membrane proteins found in the cytoplasmic and organelle membranes of cells of many different origins, including plants, animals and microorganisms. They are involved in cell energetics, and play primary roles in the homeostasis of intracellular pH, cellular Na+ content and cell volume. Adaptation to high salinity and/or extreme pH in plants and bacteria or in human heart muscles requires the action of such Na+/H+ antiporters. NhaA is the essential Na+/H+ antiporter for pH and Na+ homeostasis (at alkaline pH) in Escherichia coli and many other enterobacteria. NhaA is an electrogenic Na+/H+ antiporter that exchanges 2H+ for 1Na+ (or Li+). NhaA shares with many other prokaryotic and eukaryotic antiporters a very strong dependence on pH. In order to achieve three-dimensional structure of NhaA, the previously described NhaA protein preparation was modified: (i) the wild type bacterial strain (TA16) used for homologous over-expression of NhaA was replaced with a delta nhaA strain (RK20). As a result, the purity and homogeneity of the sample was significantly improved; (ii) the previously two-step purification procedure was shortened to a single step affinity chromatography purification; (iii) a wide-range screening of crystallisation conditions, more than 20,000, was performed; (iv) a Seleno-L-methionine (SeMet) NhaA derivative was produced in order to solve the phases during structure determination. In parallel, attempts of production and crystallisation of co-complexes composed of NhaA and antibody fragments have been made. Four different monoclonal antibodies were available against NhaA. Selected antibody fragments were produced and the stability of the complex analysed. Here, the crystal structure of the pH down-regulated secondary transporter NhaA of Escherichia coli is presented at 3.45 Å resolution. A negatively charged ion funnel opens to the cytoplasm and ends in the middle of the membrane at the putative ion-binding site. There, a unique assembly of two pairs of short helices connected by crossed, extended chains creates a balanced electrostatic environment. A possible mechanism is proposed: the binding of charged substrates causes electric imbalance inducing movements, which allow for a rapid alternating access mechanism. This ion exchange machinery is regulated by a conformational change elicited by a pH signal perceived at the cytoplasmic funnel entry. The structure represents a novel fold that provides two major insights: it reveals the structural basis for the mechanism of Na+/H+ exchange and its unique regulation by pH in NhaA and in many other similar antiporters. Furthermore, it is also important for the understanding of the architecture of membrane proteins in general. However, although many aspects of the ion-translocation mechanism and pH regulation are clarified by the NhaA structure, higher resolution structures with Li+ or Na+ bound are required for understanding the ligand binding and the translocation mechanism at the atomic level. The alkaline pH-induced conformation is essential to further understand the pH-control and proton access to the binding site.
Die chromosomale Translokation t(4;11) ist mit einer aggressiven pro-B ALL im Kleinkindesalter assoziiert und stellt eine der häufigsten genetischen Veränderungen des MLL Gens dar. Bei bis zu 40 % der untersuchten Translokationen des MLL Gens wurde das AF4 Gen als Translokationspartner identifiziert. Durch Arbeiten in unserer Arbeitsgruppe konnte in Focus Formation Experimenten das wachstumstrans-formierende Potenzial sowohl des Wildtyp AF4 Proteins, als auch des bei der Translokation entstehenden AF4•MLL Fusionsproteins, nachgewiesen werden. Es kann somit als gesichert angesehen werden, daß es sich bei dem Wildtyp-AF4 Protein um ein Proto-Onkoprotein und bei dem AF4•MLL Fusionsprotein um ein Onkoprotein handelt. Der für beide Proteine identische Bereich beschränkt sich auf die ersten 360 Aminosäuren des AF4 Proteins, was der Hypothese führte, daß der N-Terminale Bereich des AF4 Proteins (AF4•N) für das beobachtete onkogene Potential in murinen embryonalen Fibroblasten verantwortlich ist. Ein mit dem AF4•N Protein durchgeführter Hefe-2-Hybrid Screen identifizierte die beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 als Bindungspartner. Hierbei handelt es sich um Tumorsupressor- Proteine, die durch Ubiquitinylierung von Zielproteinen diese dem proteasomalen Abbau zuführen. Unter normalen physiologischen Bedingungen unterliegt das AF4 Protein einem raschen Abbau am Proteasom. Dies ist für das AF4•MLL Fusionsprotein nur noch eingeschränkt möglich, da es wie für das Wildtyp-MLL beobachetet proteolytisch gespalten wird, mit sich selbst dimerisiert und dann nicht mehr über das Proteasom abgebaut werden kann. Eine Bindung der beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte jedoch noch beobachtet werden, deshalb sollte die AF4 und SIAH Protein-Protein-Interaktion genauer untersucht werden. Hierzu wurden Hefe-2-Hybrid Experimente mit Deletionsmutanten durchgeführt, um die minimalen Kontakt-domänen zu identifiziert. Die Stärke der Interaktionen wurde durch ß-Galaktosidasetests ermittelt. Die identifizierte minimale AF4 Proteindomäne enthält das für die Erkennung durch die E3-Ligasen notwendige PxAxVxP Motiv und hat eine Länge von 25 Aminosäuren. Für die E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte der für die Interaktion notwendige Kontaktbereich innerhalb der sogenannten Substrat-Bindungs-Domäne (SBD) lokalisiert werden. Interessanterweise ist nicht die große Furche des Dimerisierungsinterfaces der beiden SIAH Monomere der Kontaktbereich, sondern der proximale Zink-Finger Bereich. Die experimentell ermittelten Proteindomänen wurden in geeignete bakterielle Expressionssysteme kloniert und ihre in vitro Interaktion durch Pulldown-Experimente bestätigt. Die strukturelle Aufklärung der Kontaktdomäne erfolgte dann mit Hilfe der NMR-Fast-Mapping Methode. Mit dieser kombinatorischen Methode wurden die an der AF4 Bindung beteiligten Aminosäuren des SIAH Proteins durch Änderung ihrer chemischen Verschiebung im [15N,1H] HSQC-Spektrum nach Titration mit steigenden AF4 Konzentrationen identifiziert. Aus den erhaltenen Daten und anhand der bekannten SIAH Röntgenstruktur konnte ein Modell für die Bindung des AF4 Proteins an die E3-Ligase SIAH1 erstellt werden. Über die Funktion des Proto-Onkoproteins AF4 ist bis dato wenig bekannt. Es gibt Hinweise, daß alle Vertreter der ALF Proteinfamilie über transkriptionsaktivierende Eigenschaften verfügen. Da posttranslationale Modifikationen von Proteinen, wie z.B. Sumoylierung, häufig zur Regulation von Transkriptionsfaktoren beobachtet werden, wurden Untersuchungen auf posttranslationale Modifikationen des AF4 Proteins durchgeführt. Hierzu wurde durch Mutation der E3-Ligase Erkennungssequenz PxAxVxP eine stabilisierte AF4 Mutante hergestellt. Durch Immunopräzipitations Experimente nach Transfektion in 293T Zellen konnte sowohl die Sumoylierung, als auch Tyrosin Phosphorylierungen des AF4 Proteins nachgewiesen werden.
Massenspektrometrische Untersuchungen von DNA, RNA und nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen
(2005)
Ziel dieser Dissertation war es, grundlegende Untersuchungen zum massenspektrometrischen Nachweis von DNA und RNA durchzuführen, sowie der spezifische Nachweis von nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen. Dabei lag der Schwerpunkt auf den folgenden drei Bereichen: - Allgemeiner Vergleich zwischen DNA und RNA sowie den Ionisierungsmethoden nano-ESI und MALDI - Quantitative Untersuchung des Einflusses des Salzgehaltes und der Aufreinigung der Probe auf das Spektrum - Grundlegende Vorraussetzungen zum spezifischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels Massenspektrometrie (MS) Dabei zeigte sich beim massenspektrometrischen Vergleich von DNA mit RNA, dass die RNA stets eine höhere Stabilität aufweist, wobei diese bei beiden Oligonukleotiden mit steigender Kettenlänge abnimmt. Gleichzeitig erhöht sich mit steigender Kettenlänge die Tendenz zur Kationenanlagerung im Spektrum. Um diese Anlagerungen zu unterdrücken, ist die Verwendung von ammoniumhaltigen Zusätzen ist bei der MS stets erforderlich. Bei MALDI haben die Matrices einen großen Einfluss auf das Fragmentierungsverhalten der Proben. Für die Oligonukleotide konnte daher folgende Einteilung der Matrices von „hart“ nach „weich“ getroffen werden: HCCA > DHB > THAP ungefähr gleich ATT > HPA. Bei der Untersuchung von Oligonukleotiden mittels nano-ESI konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Quarzkapillaren der Verwendung von Glaskapillaren vorzuziehen ist, da mit Quarz die Anlagerungen der Kationen im Spektrum deutlich unterdrückt werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Erhöhung des Drucks in der ersten Druckstufe zu einer schonenderen Desolvatisierung und damit zu einer deutlich verbesserten Nachweisgrenze führt. Bei der quantitativen Untersuchung des Salzeinflusses konnte eine maximale Salzkonzentration ermittelt werden, bei der eine massenspektrometrische Untersuchung von DNA und RNA noch möglich ist. Dabei hat sich gezeigt, dass bei direktem Vergleich nano-ESI 1000fach empfindlicher auf Salzverunreinigungen reagiert als MALDI. Generell lässt sich sagen, dass RNA eine höhere Tendenz zur Kationenanlagerung besitzt als DNA, wobei sich dieser Effekt mit steigender Kettenlänge verstärkt und bei nano-ESI deutlicher auftritt als bei MALDI. Das hat zur Folge, dass bei RNA ein höherer Aufreinigungsgrad notwendig ist, um im Vergleich zu DNA vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Dem entsprechend wurden neben der Aufreinigungsmethode mittels Ionenpaar-HPLC auch verschiedene Pipettenspitzen, die mit Chromatographiematerial gefüllt sind, zur Aufreinigung verwendet. Mit beiden Methoden konnte eine vergleichbare Reduktion der Kationenanlagerungen im Spektrum erreicht werden, wobei klar ist das die Verwendung von Pipettenspitzen die zeit- und kosteneffizientere Lösung darstellt. Durch ein neuartiges Aufreinigungsprotokoll für Pipettenspitzen konnte der Zeitaufwand noch einmal deutlich reduziert werden. Für die Untersuchung nichtkovalenter Oligonukleotid-Komplexe wurden „native“ Bedingungen gefunden, bei der die native Struktur des Komplexes soweit erhalten bleibt, dass ein spezifischer Nachweis mittels nano-ESI möglich ist. Diese Bedingungen stellen einen Kompromiss zwischen einerseits der Stabilität des Komplexes in Lösung und andererseits den optimalen Bedingungen für die Elektrospray-Ionisierung dar. Die erste untersuchte Komplexklasse waren Oligonukleotid-Dimere. Es wurden verschiedenste DNA-, RNA- sowie DNA-RNA-Hetero-Dimere mit Bindungsenergien zwischen 0 und -22,1 kcal/mol mittels nano-ESI vermessen. Es wurde eine klare Grenze ermittelt, bei der die Detektion nichtkovalenter Komplexe möglich ist. Spezifischen Dimere können im Spektrum nur dann detektiert werden, wenn deren Bindungsenergie mindestens -11,5 kcal/mol oder mehr beträgt. Als zweite Gruppe wurden Oligonukleotid-Dimere mit „Minor Groove Binding Ligands“ (MGBLs) mittels nano-ESI untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die MGBLs spezifisch und in der entsprechenden Bindungsstöchiometrie an DNA-Dimere binden. Für einen neusynthetisierten Ligand konnte erstmals die Bindungspräferenz an DNA-Dimere mit der Massenspektrometrie bestätigt werden. In allen Fällen wurde keine unspezifische Bindung an RNA-Dimere oder DNA-RNA-Hetero-Dimere beobachtet. Als letztes wurden RNA-Aminoglykosid-Komplexe mit nano-ESI untersucht. Hierbei konnten nur teilweise spezifischen Komplexe im Spektren nachgewiesen werden, da die Bindungsenergie einiger Komplexe deutlich unterhalb der Nachweisgrenze von -11,5 kcal/mol lag. Alle genannten nichtkovalenten Komplexe wurden auch mittels MALDI vermessen, allerdings konnten keine spezifischen Komplexe nachgewiesen werden. Durch direkten Vergleich von MALDI mit nano-ESI und entsprechende Kontrollexperimente konnte erstmals gezeigt werden, dass die nichtkovalenten Komplexe nicht wie vermutet während der MALDIKristallisation zerstört werden. Viel mehr werden die Komplexe im MALDI-Kristall unzerstört eingebaut und eine Zerstörung erfolgt erst während des Desorptions-/Ionisationsprozesses. Es besteht die berechtigte Vermutung, dass bei stärker bindenden Komplexen eine unzersetzte Ionisation mittels MALDI erfolgen kann. Daher sind weitere Untersuchungen in diese Richtung sinnvoll und es werden zur Zeit Komplexe, deren Bindungsenergie weit über -22,1 kcal/mol liegt, in der Arbeitsgruppe untersucht. Abschließend ist festzustellen, dass die Massenspektrometrie eine schnelle und effiziente Möglichkeit zur Analyse von DNA und RNA ist, die allerdings einen hohen Anspruch an die Sauberkeit und damit an die Aufreinigung der Probe stellt. Darüber hinaus ist die MS auch in der Lage nichtkovalente Oligonukleotid-Ligand-Komplexe zu untersuchen. Da in den letzten Jahren DNA und RNA als mögliches Zielmolekül für neue Therapieansätze mehr und mehr an Bedeutung gewonnen haben, bietet sich die Massenspektrometrie als eine Möglichkeit zur Analyse von Oligonukleotid-Wirkstoff- Komplexe an.
Mit der vorliegenden Arbeit wird für den südöstlichen Taunus und sein Vorland erstmals eine umfassende monographische Bearbeitung von Flora und Vegetation des Grünlands auf Basis umfangreicher Geländeerhebungen und Literaturrecherchen vorgelegt. Die wesentlichen Ziele der Untersuchung sind: • Darstellung der aktuellen und historischen Vorkommen und räumlichen Verbreitung von Pflanzenarten, Pflanzengesellschaften und Nutzungsintensitäten des Grünlands. • Darstellung der historischen Entwicklung des Grünlands und der sozioökonomischen Situation der Landwirtschaft. • Gefärdungseinstufung der Pflanzenarten und -gesellschaften (Rote Liste). • Kritische Bewertung des derzeitigen Stands der floristisch-vegetationskundlichen Landesforschung. • Bereitstellung von fachlichen Grundlagen für den praktischen Naturschutz, für Naturschutzbehörden, Planungsbüros, regionale Naturschutzforschung und die interessierte Öffentlichkeit. Das 1105 km2 große Untersuchungsgebiet liegt in nordwestlichen Rhein-Main-Gebiet und erstreckt sich von Wiesbaden im Südwesten und Bad Nauheim im Nordosten bzw. Schmitten im Nordwesten und Frankfurt im Südosten. Es umfasst mit dem Hebungsgebiet des Taunus (größte Höhe 878,5 m ü. NN) und dem Senkungsgebiet des Rhein-Main-Tieflands (tiefster Punkt 84 m ü. NN) zwei sehr unterschiedliche geowissenschaftliche Landschaftstypen, die im einzelnen 33 verschiedene naturräumliche Teileinheiten umfassen...
Der Nucleus suprachiasmaticus (SCN) ist der übergeordnete circadiane Schrittmacher (die “Tageszeitenuhr“) der Säugetiere. Er generiert den circadianen Rhythmus und synchronisiert diesen mit den diurnalen Signalen (Zeitgebern) aus der physikalischen Umwelt. Die Generierung der circadianen Rhythmik findet innerhalb einzelner SCN-Neurone (“clock cells“), die einen Multi-Oszillatoren-Veband bilden, statt. Die asynchronen Individualrhythmen der “clock cells“ werden zu einem gemeinsamen Haupt-Rhythmus, den circadianen Rhythmus, synchronisiert. Die entscheidende Rolle bei der Synchronisation der Individual-Rhythmen wird dem inhibitorischen – in fast allen SCN-Neuronen vorkommenden – Neurotransmitter Gamma- Amino-Buttersäure (GABA) zugeschrieben. Der gemeinsame Haupt-Rhythmus wird weiterhin durch exogene Zeitgeber auf die 24-stündige Periodik der Umweltsignale getriggert. Der dafür wichtigste Zeitgeber ist das Licht. Die Licht-Informationen werden retinal perzipiert und chemisch durch den Neurotransmitter Glutamat an den SCN übermittelt. Der Schlaf – als prominente Komponente circadianer Rhythmen – scheint ebenso vom GABAergen System des SCN gesteuert zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das GABAerge System von Goldhamstern einschließlich seines glutamatergen Eingangssystems und der GABAergen Efferenzen analysiert. Diurnale Fluktuationen der untersuchten Komponenten des GABAergen Netzwerkes wurden auf ihre Beteiligung an Synchronisationsvorgängen im SCN beleuchtet. Die semiquantitative Analyse mit Hilfe von HPLC, Immuncytochemie und Immunoblot- Verfahren erbrachte eindeutige diurnale Fluktuationen aller untersuchten Komponenten des GABAergen Systems im Goldhamster-SCN. Während der Dunkelphase wurde das GABAerge-System aktiviert: die GABA-Synthese (GAD56/67), der Gesamt-GABA-Gehalt und die GABA-Wiederaufnahme (Entsorgung) aus dem synaptischen Spalt durch GABA-Transporter (GAT-1) zeigten eine nächtliche Reaktivitätssteigerung. Dies wurde durch die Erhöhung der nächtlichen GABA-Freisetzung aus SCN-Gewebekulturen (slice-Kulturen) ergänzt. In einer weiteren Untersuchung wurde die Zusammensetzung des GABAA-Rezeptors, der an den Synchronisationsvorgängen im SCN beteiligt ist, näher charakterisiert. Im SCN von Goldhamstern wurden die GABAA-Rezeptor- Untereinheiten alpha 2, alpha 3, beta 1 und beta 2/3 (schwach vertreten) nachgewiesen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das GABAerge System an der Schlafregulation beteiligt ist. Die Komponenten des GABAergen Systems (Gesamt-GABA, GAD56/67, GAT-1) im SCN von Goldhamstern wiesen während des Schlafs im Vergleich zum wachen Tier identischer photoperiodischer Phasenlage erhöhte Reaktivität auf. Die Komponenten des glutamatergen Systems, welchem die Lichtinformationsübermittlung an das GABAerge System im SCN obliegt, zeigten ebenfalls eine diurnale Fluktuation. Die Maxima der Immunreaktivität für die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten (GluR1, GluR2/3) am Tage deuten auf eine optimale Beteiligung dieser Komponenten an der Lichtvermittlung und auf einen Triggereffekt von Glutamat hin. Der Gesamt-Glutamat-Gehalt im SCN wies zwar erhöhte Werte während der Nacht auf, jedoch konnte keine Aussage über die Menge des funktionellen Neurotransmitters gemacht werden, da nur ein Bruchteil der Gesamt-Glutamat- Menge als Neurotransmitter wirkt. Die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten zeigten eine – im Vergleich zu wachen Tieren derselben photischen Phasenlage – erhöhte Reaktivität bei schlafenden Goldhamstern. Die Hochregulation der GABAergen Systems während der Nacht unterstützt die Hypothese, dass GABA-Pulse – verabreicht zu einem bestimmten Tageszeit – Rhythmen individueller SCN-Neurone (“clock cells“) synchronisieren können. Die Synchronisation der GABAAusschüttung zu bestimmten Tageszeiten aus allen SCN-Neuronen wird durch das glutamaterge System getrieben. Alle untersuchten Komponenten zeigten dabei konsensuelle Reaktivitätsmuster, die als erhebliche Kontrastverstärkung der Hell- und Dunkelphase gewertet werden müssen. Die Unterschiede in der Reaktivität des GABAergen und glutamatergen Systems zwischen schlafenden und phasengleich untersuchten wachen Tieren stellen deren große Bedeutung für die Schlafregulation heraus.
Einfluß von Rho-GTPasen und Aktin auf den cortikalen Membrantransport in Xenopus laevis-Oozyten
(2002)
Rho-Isoform-spezifische Änderungen der Zelloberfläche. Durch Bestimmung der Anzahl plasmamembranständiger Na,K-Pumpen bzw. der elektrischen Membrankapazität als Maße für die Zelloberfläche wurde der Einfluss verschiedener rekombinanter Rho-GTPasen auf den kortikalen Membranfluss an Xenopus-Oozyten untersucht. RhoA, RhoB, RhoC, RhoD und Cdc42 führten zu einer Abnahme der Zelloberfläche, wohingegen RhoE, RhoG und Rac1 eine Vergrößerung hervorriefen. Die Rho-GTPase TC10 hatte keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Die Veränderung der Zelloberfläche wurde durch elektronenmikroskopische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen verifiziert: Oozyten zeigten nach Überexprimierung von RhoA eine deutliche Reduktion der Mikrovilli, wohingegen die dominant-aktive Form von RhoG (V12-RhoG) zu einer Verlängerung der Mikrovilli führte. Für die Wirkstärke der Rho-GTPasen, die die Oberfläche in ihrer Wild-Typ Form reduzierten, konnte folgende Rangfolge ermittelt werden: RhoB > RhoA > RhoD > RhoC > Cdc42. In der Gruppe der Rho-Proteine, die eine Vergrößerung der Zelloberfläche bewirken, zeigte RhoE den größten Effekt, gefolgt von Xenopus-RhoG, humanem RhoG und Rac1. Aus den Untersuchungen ging ferner hervor, dass dominantaktive Formen der Rho-GTPasen nicht unbedingt stärker wirken als die Wildtypform. Auch einige dominant-negative Formen führten trotz des inhibierten GDP/GTP-Austausches zu unerwarteten Veränderungen der Zelloberfläche. GTPasen anderer Familien wie Arf1, Arf6 oder Rab5a, für die eine Rolle beim vesikulären Transport gut dokumentiert ist, hatten keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Für die Änderung der Zelloberfläche erwies sich das Vorhandensein eines Cterminalen Lipidankers als essentiell, da Rho-GTPase-Mutanten, die infolge des Fehlens eines kritischen Cysteinrestes nicht mehr isoprenyliert werden können, keine Änderung der Zelloberfläche bewirkten. Die Analyse von RhoB-RhoG-Chimären brachte keine eindeutigen Hinweise auf das Vorhandensein einer für die Zelloberflächenregulation entscheidenden weiterer Region. Sowohl N-terminal- als auch C-terminal-gelegene Sequenzabschnitte waren zur Ausbildung des vollen Effektes notwendig. Identifizierung möglicher RhoA-Effektoren. Die Untersuchung von RhoAEffektormutanten, bei denen die Interaktion mit spezifischen Effektormolekülen durch Mutation in der Effektorregion inhibiert war, ergab, dass die Abnahme der Zelloberfläche weder durch Rhophilin, mDia, Kinectin, Citronkinase oder ROK vermittelt wird. Auch der ROK-Inhibitors Y-27632 konnte den RhoA-Effekt nicht blockieren. Nach diesem Ausschlußverfahren konnte die Proteinkinase N (PKN, PRK) als einziger möglicher Effektor für den durch RhoA ausgelösten Internalisierungsprozeß ermittelt werden. Wechselwirkung zwischen Rho und Aktin. Rho-Proteine gelten als endscheidene Regulatorproteine des Aktinzytoskeletts. Als Reaktion auf bestimmte extrazelluläre Signale kontrollieren diese Proteine Aufbau und Zerfall des Aktins. Untersucht wurde hier der Einfluß der Aktinumstrukturierung auf den Rho-vermittelten Membrantransport. Die das Aktin-Zytoskelett gegensätzlich beeinflussenden Substanzen Cytochalasin B, Cytochalasin D und Phalloidin hatten keinen bzw. nur einen schwachen Effekt auf die Oozyten-Oberfläche. Die Rho-vermittelte Zelloberflächenänderungen wurden von diesen Substanzen nicht blockiert. Dagegen bewirkten die das Aktin-Zytoskelett depolymerisierenden Substanzen Latrunculin A und C2-Toxin eine starke Reduzierung der Zelloberfläche. Die Reduzierung unter Latrunculin A kam auch dann zustande, wenn zuvor RhoE überexprimiert wurde, welches selbst die Zelloberfläche stark vergrößert. Wurde zunächst C2-Toxin in Oozyten injiziert und anschließend RhoE überexprimiert, ergab sich keine Veränderung der Membrankapazität im Vergleich zu einer nicht injizierten Kontrolloozyte. Der Effekt von Latrunculin A wurde blockiert, wenn Rho-GTPasen durch Vorbehandlung der Oozyten mit Rho-spezifischen Toxinen (ToxB und C3- Toxin) inaktiviert wurden. Daraus folgt, dass der Effekt von Latrunculin A und C2-Toxin davon abhängt, dass aktivierbares Rho zur Verfügung steht. Jasplakinolid, eine Aktin stabilisierende Substanz, führt ebenfalls zu einer starken Verringerung der Zelloberfläche, die jedoch durch Toxin-Vorhandlung nicht blockierbar und damit RhoA-unabhängig war. Auswirkung der GAP-Wirkung von ExoS auf die Rho-Aktivität. Die Injektion von ExoS, einem Toxin, das gegenüber Rho GAP-Aktivität aufweist, führt zu einer Vergrößerung der Zelloberfläche. Die GAP-Wirkung von ExoS konnte durch das CNFToxin, daß aufgrund einer Aktivierung von Rho zu einer Verminderung der Zelloberfläche führt, nicht aufgehoben werden. Auch die dominant-aktiven Formen von RhoA (V14-RhoA, Q61-RhoA) konnten die GAP-Wirkung von ExoS nicht blockieren. ExoS kann im Gegensatz zu anderen GTPase-aktivierenden Proteinen eine Interaktion mit der deamidierten Form von Rho eingehen und somit den Aktivitätszustand durch GTPHydrolyse beenden. Wechselwirkung zwischen Bordetella Dermonekrose-Toxin (DNT) und Rho. Die biologische Wirkung von DNT resultiert aus einer Deamidierung und Transglutaminierung von Rho-GDP nach Freisetzung von GDI. Aufgrund dieser Modifikationen kommt es zum Verlust der GTP-Hydrolyse-Aktivität und somit zur Bildung einer konstitutiv-aktiven Form von Rho. In Zusammenarbeit mit Prof. Aktories (Pharmakologisches Institut, Freiburg), gelang es, die Aminosäure Lysin als ein weiteres Substrat neben Spermidin und Putrescin für den Transglutaminierunsprozeß des Toxins DNT zu identifizieren.
Hauptanliegen der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Waldvegetation des Rothaargebirges sowie andererseits der Vergleich mit historischen Bearbeitungen zur Ermittlung von Vegetationsveränderungen. Die aktuelle Vegetation wurde mit Hilfe pflanzensoziologischer Methoden erfaßt und klassifiziert. Ergänzend erfolgte eine Kartierung vieler Waldvegetationseinheiten, welche in Verbreitungskarten dargestellt ist. Von großer Bedeutung im Bereich der Waldgesellschaften ist das Luzulo-Fagetum, welches in einer Reihe unterschiedlicher Ausbildungen vorkommt und im gesamten Gebiet verbreitet ist. Weitere Buchenwälder sind dem Galio odorati-Fagetum und in geringem Umfang dem Hordelymo-Fagetum zuzuordnen. Als Ersatzgesellschaften der Buchenwälder sind die große Flächen einnehmenden Fichtenforste, die überwiegend aus der Haubergswirtschaft entstandenen Wälder des Betulo-Quercetum und die wenigen dem Carpinion zugehörigen Bestände einzustufen. An feuchtere Standorte gebunden sind die Schluchtwälder des Fraxino-Aceretum pseudoplatani sowie Auenwälder, die durch das Carici remotae-Fraxinetum und das Stellario nemorum-Alnetum repräsentiert sind. Weiterhin kommen Bruchwälder des Betuletum carpaticae und des Sphagno-Alnetum vor, welche auf nassen Standorten siedeln. Ebenfalls pflanzensoziologisch dokumentiert wurden Gesellschaften, die im räumlichen Verbund der Wälder auftreten oder mit diesen in einem syndynamischen Zusammenhang stehen. Hierzu gehören insbesondere krautige Formationen der Schlagfluren sowie deren strauchige Folgegesellschaften. Des weiteren wurden Gesellschaften der Heiden, der Quellfluren, der Bachröhrichte und der Felsen erfaßt. Für eine Gegenüberstellung des Luzulo-Fagetum mit seinen forstlichen Ersatzgesellschaften erfolgte eine Betrachtung struktureller Parameter, floristischer Unterschiede sowie von Zeigerwerten. Sowohl Fichtenforst als auch Betulo-Quercetum weisen im Vergleich zum Luzulo-Fagetum eine geringere Anzahl an Varianten auf und Arten der Ordnung Fagetalia treten zurück. Im Fichtenforst häufiger sind Säurezeiger sowie Arten der Schlag- und Ruderalfluren, im Betulo-Quercetum vor allem Säure- und Magerkeitszeiger. Bezogen auf mittlere Zeigerwerte äußern sich die Unterschiede beider Gesellschaften zum Luzulo-Fagetumin höheren Werten für den Faktor Licht, während in bezug auf die Faktoren Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff lediglich das Betulo-Quercetum deutlich vom Luzulo-Fagetum abweicht, wobei die Werte jeweils deutlich geringer ausfallen. Die Relevanz dieser beobachteten Unterschiede offenbart sich an einer exemplarisch durchgeführten Darstellung des Bestockungswandels der Markenwaldungen Winterberg. Hier wurde für das 20. Jahrhundert ein deutlicher Anstieg der mit Fichten bewachsenen Flächen registriert, der auf Kosten des Buchenanteils geht. Zur ergänzenden Beurteilung der Waldvegetation wurden Analysen geringeren Umfangs angestellt. Hierunter fällt zum einen die Darstellung der Waldgesellschaften in einem Ökogramm anhand der mittleren Zeigerwerte für Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff. Bei der Betrachtung der Naturverjüngung in den einzelnen Waldgesellschaften erwiesen sich insbesondere Fagus sylvatica, Picea abies, Acer pseudoplatanus und Sorbus aucuparia als die sich am häufigsten verjüngenden Baumarten. Zur Beurteilung des Faktors Wild wurde die Verbißhäufigkeit an Waldpflanzen registriert. Danach gehören Athyrium filix-femina, Epilobium angustifolium, Dryopteris dilatata und Polygonatum verticillatum zu den beliebtesten Äsungspflanzen. Weiterhin wurde exemplarisch die Vegetation auf den im Rothaargebirge häufig anzutreffenden Meilerflächen dokumentiert. Im Bereich dieser Plätze werden nicht selten Arten der Ordnung Fagetalia sowie andere nährstoffliebende Taxa gefördert. Eine Gegenüberstellung der Aufnahmen von Fagion-Gesellschaften, Luzulo-Fagetum, Fichtenforst und Betulo-Quercetum mit vergleichbaren Aufnahmen historischer Bearbeitungen ergab eine Reihe von Unterschieden. Deutlich zeichnet sich eine Zunahme an stickstoffliebenden Arten ab, die pflanzensoziologisch überwiegend den Klassen Epilobietea angustifolii und Artemisietea vulgaris zuzuordnen sind. In den Fichtenforsten ist dieser Wandel besonders auffällig und spiegelt sich in erhöhten mittleren Zeigerwerten für Stickstoff und Bodenreaktion wider. Für die Fagion-Gesellschaften wurde zudem eine Abnahme an Arten der Ordnung Fagetalia registriert, so daß die Veränderungen der mittleren Zeigerwerte nur gering ausfallen, da diese Arten ebenfalls als Stickstoffzeiger einzustufen sind. Für das Luzulo-Fagetum fällt der Zuwachs an den betreffenden Arten zwar geringer als im Fichtenforst aus, zeigt sich aber in einzelnen Aufnahmen mit dominantem Auftreten der stickstoffzeigenden Arten. Im Betulo-Quercetum ist die Zunahme an Stickstoffzeigern am geringsten ausgeprägt und der Anstieg des entsprechenden mittleren Zeigerwertes beruht primär auf einem Rückgang an Säure- und Magerkeitszeigern. Letztere verzeichnen auch in den anderen Waldgesellschaften unterschiedlich stark ausgeprägte Verluste. Als Ursache für die Veränderungen werden insbesondere stickstoffreiche Immissionen diskutiert, sowie Kompensationskalkungen und Bestandsauflichtungen. Ergänzend sind Nutzungsänderungen in Erwägung zu ziehen, die sich vor allem bei den ehemals als Hauberg bewirtschafteten Beständen des Betulo-Quercetum auswirken. Die ermittelten Ergebnisse fügen sich in eine Reihe ähnlicher Untersuchungen ein und bestätigen damit auch die angewendete Methode des pflanzensoziologischen Typenvergleichs zum Monitoring von Vegetationsveränderungen. Weiterhin wurde in vorliegender Arbeit ein Blick auf die Situation des Wald-Naturschutzes im Rothaargebirge geworfen und Empfehlungen für eine weitere Entwicklung kurz angerissen. Als Beispiel für das Vorkommen gefährdeter Arten und deren Abhängigkeit von der Waldvegetation wurden Verbreitungskarten von Bärlapp-Arten angeführt.
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.