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Lizards of Paraguay: an integrative approach to solve taxonomic problems in central South America
(2018)
Paraguay is located in the center of South America with drier and warmer climatic conditions in the western part of the country, and more temperate and humid in the eastern region. Biogeographically, Paraguay is a key spot in South America, where several ecoregions converge. In my study, I sampled most of the ecoregions of Paraguay. The main objective of my work is to solve taxonomic problems, identified through genetic barcoding analyses, in the central region of South America. To achieve this objective, I used selected taxa of the Paraguayan Squamata as models taking into consideration the crucial geographic position of the country, plus the scarce available genetic data of Paraguayan reptiles.
The collecting activities were performed in the framework of a barcoding inventory project of the Paraguayan herpetofauna and carried out mostly in rural areas searching for animals in different types of habitats using active search as the sampling technique.
For genetics, the extraction of DNA was performed with DNeasy® Blood & Tissue Kit of Qiagen® for sets of few samples, and the fiber glass plate protocol for sets of 96 samples. I assessed the quality of sequences after amplification in agarose gel electrophoresis. The first marker sequenced was 16S mtDNA, used for barcoding analysis. A DNA barcode is a genetic identifier for a species. Once a taxonomic problem was detected, I generate more gene sequences to target the issue.
All the analyses to test phylogenetic hypotheses (based on single genes or concatenated datasets) were performed under Maximum Likelihood and Bayesian approaches. To root the phylogenetic trees, I chose the available taxon (or taxa) most closely related to the respective studied group as outgroups. For the general tree of Paraguayan Squamata, based on barcodes of 16S, I chose Sphenodon punctatus.
I generated a total of 142 sequences of 64 species of Squamata from Paraguay (Appendix I). The final alignment of 615 bp comprised 249 samples. The best substitution model for the Barcoding dataset based on the gene 16S was GTR+G, according to the BIC.
To complement molecular evidence generated with the ML grouping of 16S barcodes, I took a morphological approach based on voucher specimens collected during fieldwork (usually the same specimens that I used for genetic analysis), supplemented by the revision of museum collections.
Summarizing my results, samples of Colobosaura exhibit large genetic distances, and accordingly I revalidated Colobosaura kraepelini (Appendix II). Tropidurus of the spinulosus group show two clades and among them there is little genetic and morphological variation, I synonymized T. tarara and T. teyumirim with T. lagunablanca, and T. guarani with T. spinulosus (Appendix III). I detected the presence of candidate species of Homonota, and I restricted the name H. horrida for Argentina, and described two new species of Homonota (Appendices IV and V), and a new species of Phyllopezus also in the Family Phyllodactylidae (Appendix VI).
In this work I present the most comprehensive analysis of genetic samples of Squamata from Paraguay. The results obtained here will be useful to help to clarify further taxonomic issues regarding the squamate fauna from the central region of South America. Moreover, the data generated for this study will have a positive impact in a larger geographic context, beyond Paraguayan borders.
Regarding the conservation of the Paraguayan reptiles, and considering the taxonomic changes accomplished here, it is important to note that many species lack legal protection. In Paraguay, the major problem for conservation is habitat loss due to extensive crop farming. Thus, currently, the protected areas are the best strategy for conservation of biodiversity in the country. However, many such areas face legal problems (e.g., lack of official measurements, management plans, forest guards, infrastructure, etc.) so that the maintenance of their biodiversity over time is not guaranteed.
In conclusion, in this study I present contributions on the taxonomy of mostly lizards from Paraguay. Due to lack of samples, I was not able to deal with a deep taxonomic revision of the country's snakes. Based on my results, I can argue that analyses of Xenodontini and Pseudoboini are currently a pressing research issue. This barcoding project may continue since some colleagues in Paraguay are interested in collaboration. Given that the sequenced specimens are yet a small portion of the actual diversity of Paraguay, it will be of utmost importance to continue and expand these studies that will further improve our taxonomic knowledge. Furthermore, it is desirable to have Paraguayan scientists not only involved, but to see them taking the lead of high quality taxonomic research.
Precise regulation of gene expression networks is required to develop and maintain a healthy organism before and after birth and throughout adulthood. Such networks are mostly comprised of regulatory proteins, but meanwhile many long non-coding transcripts (lncRNAs) are shown to participate in these regulatory processes. The functions and mechanisms of these lncRNAs vary greatly, however they are often associated with transcriptional regulation. Three lncRNAs, namely Sweetheart RNA (Swhtr), Fetal-lethal noncoding developmental regulatory RNA / Foxf1 adjacent non-Coding developmental regulatory RNA (Fendrr) and lncFsd2, were studied in this work to demonstrate the variety of cellular and biological processes that require lncRNA-mediated fine-tuning, in regard to the cardiopulmonary system.
Swhtr was found to be expressed exclusively in cardiomyocytes and became critical for regeneration after myocardial injury. Mice lacking Swhtr did not show issues under normal conditions, but failed to undergo compensatory hypertrophic remodeling after injury, leading to increased mortality. This effect was rescued by re-expressing Swhtr, demonstrating importance of the RNA. Genes dependent on Swhtr during cardiac stress were found to likely be regulated by NKX2-5 through physical interaction with Swhtr. Fendrr was found to be expressed in lung and interacted with target promoters through its RNA:dsDNA binding domain, the FendrrBox, which was partially required for Fendrr function. Fendrr, together with activated WNT signaling, regulated fibrosis related target genes via the FendrrBox in fibroblasts. LncFsd2, an ubiquitously expressed lncRNA, showed possible interaction with the striated muscle specific Fsd2, but its exact function and regulatory role remain unclear in muscle physiology. Immunoprecipitation and subcellular fractionation experiments suggest that lncFsd2 might be involved in nuclear retention of Fsd2 mRNA, thus fine-tuning FSD2 protein expression. These investigations have shed light on the roles of these lncRNAs in stress responses, fibrosis-related gene regulation, and localization processes, advancing our understanding of cardiovascular and pulmonary maintenance, reaction to injury, and diseases. The diverse and intricate roles of these three lncRNAs highlight how they influence various cellular processes and disease states, offering avenues for exploring lncRNA functions in different biological contexts.
In the interest of understanding the development of a multicellular organism, subcellular events must be seen in the context of the entire three-dimensional tissue. In addition, events that occur within a short period of time can be of great importance for the relatively long developmental process of the organ. Thus, it is required to capture subcellular events in a larger spatio-temporal scale context, which has been up to now a technical challenge. In developmental biology, light microscopy has always been an important tool. The dilemma of light microscopy, in particular fluorescence microscopy, is that molecules receive high light intensities that might change the conformation of molecules, which can have signaling or toxic effects. In Light Sheet-based Fluorescence Microscopy (LSFM), the energy required for a single recording is reduced by several orders of magnitude compared to other fluorescence microscopy techniques. During the last ten years, LSFM has emerged as a preferred tool to capture all cells during embryogenesis of the zebrafish Danio rerio, the fruit fly Drosophila melanogaster or recently the red flour beetle Tribolium castaneum for a period of several days. The motivation of this work was to gain new insights in developmental related processes of plant organs. The aim of this work was to establish a protocol for imaging plant growth over a long period of time using LSFM and perform comprehensive analyses at the cellular level. Plants have to cope with a variety of environmental conditions, therefore the conditions inside the microscope chamber had to be brought under control. The sample preparation methods and the standardized conditions at a physiological level allowed the study of gravity response, day-night rhythms, organ shape development as well as the intracellular dynamic events of the cytoskeleton and endosomal compartments in an unprecedented manner. Several of these projects were successfully published in collaborations with Prof. Jozef Šamaj (Palacký University Olomouc, Czech Republic), Prof. Niko Geldner (University of Lausanne, Switzerland), Prof. Malcom Bennett (University of Nottingham, UK) and Dr. Jürgen Kleine-Vehn (University of Natural Resources and Life Sciences, Austria). The main part of my work focused on the formation of lateral roots in Arabidopsis thaliana and was conducted in close collaboration with Dr. Alexis Maizel (University of Heidelberg, Germany). Previously, most experiments that describe lateral root formation have been performed on a small number of cells and for short periods of time. Capturing the complete process of lateral roots is an ambitious goal, because first, the primordium of a lateral root is located deep inside the primary root and imaging quality is impaired due to scattering of the overlaying tissue. Second, the process takes about 48 h, i.e. the plant has to be kept healthy for the whole period. Third, the amount of excitation light required for the spatio-temporal might have phototoxic effects that lead to a stop of growth at least in conventional microscopic techniques. In Arabidopsis embryogenesis, the sequence of cell divisions is relatively invariant. However, whether lateral root organogenesis follows particular cell division patterns has been unknown. The complete process of lateral root formation was captured from the first cell division until after the emergence from the main root. Images of a nuclei marker and a plasmamembrane marker were recorded every 5 min for a time period of up to 64 h. The positions and cell divisions of all cells were tracked manually. In collaboration with Alexander Schmitz (Goethe University Frankfurt am Main, Germany) and Dr. Jens Fangerau (University of Heidelberg, Germany), comprehensive analyses of the data were performed. A lateral root forms from initially 8-15 founder cells, arranged in a patch of 5-8 parallel files. The occurrence of new cell layers by periclinal divisions, as well as the sequence of layer generation was conserved and resembles the sequence suggested by Malamy and Benfey in 1997. Besides this stereotyped occurrence of periclinal divisions, radial divisions were found to appear stochastically, following no particular pattern. A large variability was also found in the contribution of founder cells and cell files to the final lateral root. In summary, the results suggest that a stereotyped pattern of cell divisions at particular developmental stages and a dynamically adapted control of cell divisions exist in parallel. Both properties allow a controlled but flexible development of the organ according to variations in cell topology and mechanical properties of the surrounding tissue. This work shows that LSFM, the sample preparation methods and controlled environmental conditions allow to capture and analyse the development of plants over several days at high resolution in an unprecedented manner.
Die Differenzierung zwischen Teilpopulationen hin zu unterschiedlichen Arten kann nur erfolgen, wenn zwischen diesen Teilpopulationen reproduktive Isolation besteht. Wie die unterschiedlichen Arten von reproduktiver Isolation zusammenwirken und welche Voraussetzungen bestehen müssen, um neue Arten zu bilden, muss in jedem Studiensystem untersucht werden. Ein idealer Ansatzpunkt sind Arten, die sich mehrfach an anspruchsvolle Habitate angepasst haben, deren Artbildung also von ökologischen Habitatparametern bestimmt wird. Dieser Vorgang wird als Ökologische Artbildung bezeichnet. Im Artkomplex Poecilia spec., der im Süden Mexikos mehrere schwefelangepasste Ökotypen ausgebildet hat, wurden erste Hinweise auf eine Korrelation zwischen der Selektionsstärke von natürlicher und sexueller Selektion gefunden, deren Einfluss zusammen die bestehenden reproduktiven Barrieren zwischen Klarwasser- und Schwefelökotyp formen. Wie diese Reproduktionsbarrieren beschaffen sind und wie die Umweltvariable Schwefel auf die Morphologie und das Verhalten der Poeciliiden Einfluss nimmt, wurde in der vorliegenden Arbeit anhand von fünf Fragestellungen untersucht. (1) Die Körperfärbung kann ein aussagekräftiges Signal für die Qualität des potentiellen Partners bei der Fortpflanzung sein. Wie beeinflusst die extreme Umweltvariable Schwefel die Ausbildung von Färbung? (2) Sind die gefundenen Anpassungen der Färbung erblich oder werden sie plastisch entsprechend des Nahrungsangebots ausgebildet? (3) In einem der untersuchten Flusssysteme konnte unvollständige reproduktive Isolation zwischen der Klarwasser- und Schwefelpopulation nachgewiesen werden. Sind in den Mischzonen zwischen diesen beiden Habitaten Hybriden genetisch nachweisbar und bilden diese die Färbungsanpassungen der Klarwasser-, der Schwefelpopulation oder eine intermediäre Form aus? (4) Die Gelbfärbung der Flossen bei Männchen scheint ein geeignetes Merkmal für die Anzeige der Qualität zu sein, da es möglicherweise unabhängig vom Nahrungsangebot ausgebildet wird. Besteht eine weibliche Präferenz für dieses Merkmal? (5) Auch die weibliche Partnerwahlpräferenz wird vom Habitat und dem eigenen Zustand beeinflusst. Wie verändert sich die Präferenz für Männchen mit gutem Ernährungszustand bei Weibchen, die hungrig sind?
Um diese Fragen zu beantworten, wurden in mehreren Jahren Männchen und Weibchen der Arten Poecilia mexicana und Poecilia sulphuraria aus sieben Populationen im Studiengebiet in Südmexiko gefangen und auf ihre Färbung untersucht sowie Laborpopulationen getestet. Es konnten generelle Anpassungen der Färbung an die Umweltvariable Schwefel nachgewiesen werden. Dazu gehören die Aufhellung der Körperregionen, die durch Tarnung (konkret: countershading und background matching) vor Entdeckung durch Prädatoren schützen, und die Reduktion von Gelb- und Rottönen. Diese Anpassung ist vermutlich auf das geringe Angebot an Karotinoiden in den schwefelbelasteten Extremhabitaten zurückzuführen. Außerdem konnten zahlreiche flusssystem¬spezifische Anpassungen beschrieben werden, deren Ursachen in den Unterschieden zwischen den Schwefelhabitaten untereinander begründet sind. Das Flusssystem des Río Tacotalpa stellt hier eine Besonderheit dar, da Männchen eine besonders starke Gelbfärbung der Flossen aufweisen. Wildgefangene und laborgeborene Männchen dieses Flusssystems wurden verglichen, um einen Hinweis auf den Einfluss des Nahrungsangebots auf dieses Merkmal zu untersuchen. Tatsächlich ist die Ausprägung dieses Merkmals, die Gelbfärbung der Flossen, unabhängig vom Angebot an Karotinoiden. Während die hier verwendeten genetischen Analysen nicht geeignet waren, Hybriden aus den Mischzonen zwischen Schwefel- und Klarwasserhabitat nachzuweisen, ergaben die Untersuchungen von Individuen aus den Mischzonen keine eindeutigen Ergebnisse über eine etwaige intermediäre Ausbildung der Färbung. Die Präsentation von Männchen, deren Gelbintensität an den Flossenspitzen künstlich verändert wurde, konnte bei Weibchen keine eindeutige Präferenz für stärker gefärbte Männchen aufzeigen. Vielmehr weist dieses Ergebnis auf eine starke Korrelation zwischen mehreren Merkmalen (z. B. weitere morphologische Merkmale, Verhalten) hin, die für die Beurteilung der männlichen Qualität herangezogen werden. Die weibliche Präferenz für konditionsabhängige Merkmale wird bei schwefelangepassten Weibchen leicht verstärkt, wenn diese hungrig sind. Eine solche flexible Präferenz sollte gerade in Habitaten mit starken Fluktuationen im Nährstoffangebot existieren. Dabei waren Weibchen, denen Videoaufnahmen präsentiert wurden, eher in der Lage, das qualitativ hochwertigere Männchen zu identifizieren, als Weibchen, denen animierte Bilder präsentiert wurden. Auch hier wird davon ausgegangen, dass die Reduktion auf eines oder wenige Merkmale, die für die Partnerwahl zur Verfügung stehen, keine ausreichend starke Reaktion auslösen können. Vielmehr ist der Zugriff auf alle Aspekte der männlichen Erscheinung wichtig, um die Qualität des potentiellen Partners zu beurteilen.
Färbung ist also generell geeignet, den Ökotyp eines Individuums zu bestimmen und ein solches Merkmal kann der Artbestimmung im ersten Schritt der Partnerwahl dienen. Dasjenige männliche Färbungsmerkmal, das über mehrere Generationen gleichbleibend ausgeprägt wurde – die Gelbfärbung der Flossen – reicht jedoch nicht aus, um bei der weiblichen Partnerwahl eine Reaktion auszulösen. Vielmehr deuten die Ergebnisse auf eine enge Korrelation der Färbung mit weiteren Merkmalen in Morphologie und Verhalten eines Individuums hin, die vom wählenden Weibchen stets gemeinsam entsprechend der Multiple-message-Theorie betrachtet werden. Auch der Vergleich zwischen Videoaufnahmen und animierten Fotografien als Stimuli bei der Partnerwahl ergab, dass der Aspekt Verhalten (nur verfügbar mit Videoaufnahmen) für eine Partnerwahlentscheidung von Bedeutung ist.
Meine Arbeit konnte den bestehenden Wissensschatz um die bestehenden reproduktiven Barrieren im Studiensystem um den Aspekt der Färbung erweitern. Meine Ergebnisse zeigen weitere spannende Fragestellungen auf. Je größer das Verständnis der vorliegenden Selektionskräfte und Mechanismen reproduktiver Isolation ist, desto besser kann die Wissenschaft verstehen, welche Umgebungsvariablen welchen Einfluss auf den Prozess der Artbildung haben.
The oleochemical and petrochemical industries provide diverse chemicals used in personal care products, food and pharmaceutical industries or as fuels, oils, polymers and others. However, fossil resources are dwindling and concerns about these conventional production methods have risen due to their strong negative impact on the environment and contribution to climate change.
Therefore, alternative, sustainable and environmentally friendly production methods for oleochemical compounds such as fatty acids, fatty alcohols, hydroxy fatty acids and dicarboxylic acids are desired. The biotechnological production by engineered microorganism could fulfill these requirements. The concept of metabolic engineering, which is the modification of metabolic pathways of a host organism for increased production of a target compound, is a widely used strategy in biotechnology to generate cell factories or chassis strains for robust, efficient and high production. In this work, the versatile model and industrial yeast Saccharomyces cerevisiae was manipulated by metabolic engineering strategies for increased production of the medium-chain fatty acid octanoic acid and de novo production the derived 8-hydroxyoctanoic acid.
Octanoic acid production was enabled by the fatty acid biosynthesis pathway by use of a mutated fatty acid synthase (FASRK) in a wild type FAS deficient strain. The yeast fatty acid synthase (FAS) consists of two polypeptides, α and β, which assemble to a α6β6 complex in a co-translational manner by interaction of the subunits. Because this step might be subject to cellular regulation, the α- and β- subunits of fatty acid synthase were fused to form a single-chain construct (fusFASRK), which displayed superior octanoic acid production compared with split FASRK. Thus, FASRK expression was identified as a limiting step of octanoic acid production. But the strains that produce octanoic acid have a severe growth defect that is undesirable for biotechnological applications and could lead to lower production titers. One reason is the strong
inhibitory effect of octanoic acid. Another possibility is that the mutant FAS no longer produces enough essential long-chain fatty acids. To compensate for this, the mutated split and fused FAS variants were co-expressed individually in a strain harboring genomic wild type FAS alleles. In
addition, mutant and wild type variants of fused and split FAS were co-expressed together in a FAS deficient strain. However, both cases resulted in decreased octanoic acid titers potentially by physical and/or metabolic crosstalk of the FAS variants.
The fatty acid biosynthesis relies on cytosolic acetyl-CoA for initiation and derived malonyl-CoA for elongation and requires NADPH for reductive power. To increase production of octanoic acid, engineering strategies for increased acetyl-CoA and NADHP supply were investigated. First, the flux through the native cytosolic acetyl-CoA and NADPH providing pyruvate dehydrogenase bypass was enhanced by overexpression of the target genes ADH2, ALD6 and ACSL461P from Salmonella enterica in combination or individually. Next, the acety-CoA forming heterologous phosphoketolase/phosphotransacetylase pathway was expressed and NADPH formation was increased by redirecting the flux of glucose-6-phosphate into the NADPH producing oxidative branch of the pentose phosphate pathway. In particular, the flux through glycolysis and pyruvate dehydrogenase bypass was reduced by downregulating the expression of the phosphoglucose isomerase PGI1 and deleting the acetaldehyde dehydrogenase ALD6. Glucose-6-phosphate was guided into the pentose phosphate pathway by overexpressing the glucose-6-phosphate dehydrogenase ZWF1. The first approach did not influence octanoic acid production but the latter increased yields in the glucose consumption phase by 65 %. However,
combining the superior fusFASRK with acetyl-CoA and NADPH supply engineering strategies did not result in additive production effects, indicating that other limitations hinder high octanoic acid accumulation. Limitations could be caused in particular by the strong inhibitory effects of octanoic acid or by intrinsic limitations of the FASRK mutant. To enlarge the octanoic acid production platform towards other derived valuable oleochemical compounds the de novo production of 8-hydroxyoctanoic acid was targeted. Since short- and medium-chain fatty acids have a strong inhibitory effect on Saccharomyces cerevisiae, the inhibitory effect of hydroxy fatty acid and dicarboxylic with eight or ten carbon atoms were compared and revealed only little or no growth impairment. Subsequently, the formation of 8-hydroxyoctanoic acid was targeted by a terminal hydroxylation of externally supplied octanoic acid in a bioconversion. For that, three heterologous genes, encoding for cytochromes P450 enzymes and their cognate cytochrome P450 reductases were expressed and 8-hydroxyoctanoic acid production was compared. In addition, the use of different carbon sources was compared.
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For thousands of years, S. cerevisiae has been employed by humans in brewing and baking. Nowadays, this budding yeast is more than that: it is a well investigated model organism and an established workhorse in biotechnology. S. cerevisiae serves as a production host for various applications such as i) bioethanol production ii) the biosynthesis of hormones including insulin or iii) cannabinoid biosynthesis. Hereby, the robustness of S. cerevisiae and its high tolerances regarding pH and salt concentrations qualifies it for a wide range of industrial applications. Moreover, products of S. cerevisiae are generally recognised as safe (GRAS), enabling diverse biotechnological applications. Various mechanisms for genetic engineering of S. cerevisiae are applicable and the engineering process itself is straightforward since methods are established and widely known. Due to the wide range of industrial applications of S. cerevisiae, this organism is an ideal candidate for applied research and implementation of the recombinant biosynthesis of tocochromanols in this study.
Tocochromanols encompass tocotrienols and tocopherols, which are lipid-soluble compounds that are commonly associated with vitamin E activity. Hereby, α-tocopherol is the most prevalent form, as it is an essential nutrient in the diet of humans and animals. Naturally, tocochromanols are almost exclusively synthesised by photoautotrophic organisms such as plants or cyanobacteria. They consist of an aromatic head group and a polyprenyl side chain which is saturated in tocopherols and 3-fold unsaturated in tocotrienols. The methylation status of the chromanol ring distinguishes α-, β-, γ- and δ-tocochromanol. All forms of tocochromanols represent a group of powerful antioxidants, scavenging reactive oxygen species (ROS) and preventing the propagation of lipid oxidation in lipophilic environments. Recently, attention has been drawn to tocotrienols, due to their benefits in neuroprotection as well as cholesterol-lowering and anti-cancer properties. Consequently, tocochromanols are valuable additives in the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries.
The metabolic engineering strategy of S. cerevisiae to enable tocochromanol biosynthesis was started in a preceding master thesis with the provision of the aromatic moiety, homogentisic acid (HGA), from the aromatic amino acid biosynthesis. Hereby, the upregulation and redirection of the native pathway was essential. Therefore, a strain with an engineered aromatic amino acid pathway for improved 4 hydroxyphenylpyruvate (HPP) production (MRY33) was utilised from Reifenrath and Boles (2018). Furthermore, a heterologous hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) was required to convert HPP into HGA. Thus, several heterologous HPPDs were expressed and characterised regarding their HGA production within the previous study. The best variant originated from Yarrowia lipolytica, YlHPPD, and was integrated into the genome of MRY33. The resulting strain JBY2, produced 435 mg/L HGA in a shake flask fermentation.
This work was started with the genetically highly modified strain JBY2, whose genome already contained a large number of genes artificially expressed behind strong promoters. For further strain development, it was advantageous to maintain a high degree of sequence variability in order to prevent genomic instabilities due to sequence homologies. Thus, 17 artificial promoters (AP1-AP17) were characterised regarding their strength of expression by the yellow fluorescent protein (YFP). These sequences were also part of a patent that was filed during this work (WO2023094429A1).
The key point of this study was the development of a metabolic engineering strategy for the strain JBY2. First, the sufficient supply of the second precursor, the polyprenyl side chain, was investigated. Natively, S. cerevisiae produces the precursor, geranylgeranyl diphosphate (GGPP), from the isopentenyl diphosphate pathway. However, without further engineering, GGPP was barely detectable in JBY2 (< 0.1 mg/L). Thus, engineering of the isopentenyl diphosphate biosynthesis was necessary. The limiting enzyme of the mevalonate pathway was the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR), which is encoded by HMG1. Therefore, a truncation for feedback-resistance and its overexpression by a promoter exchange was performed. Furthermore, the promoter of the gene for the squalene synthase (pERG9) was exchanged by the ergosterol sensitive promoter pERG1 to limit the metabolic flux of the mevalonate pathway into the ergosterol pathway. The native GGPP synthase (BTS1) was another limitation that was observed throughout this study. To overcome this bottleneck, plasmid-based and integrative overexpression of the native BTS1 and a codon optimised BTS1 were investigated. Other strategies to improve GGPP production were the deletion of the gene for the diacylglycerol pyrophosphate phosphatase (DPP1) to prevent excessive dephosphorylation of GGPP to geranylgeraniol (GGOH), and the overexpression of the farnesyl pyrophosphate synthetase, encoded by ERG20. However, the best improvements of the GGPP biosynthesis, inferred through GGOH measurements, were achieved from the screening of several heterologous GGPP synthases in S. cerevisiae. The best performing strain was JBY61 (JBY2, hmg1Δ::pTDH3-HMG1tr[1573–3165], pERG9Δ::pERG1, ChrIV-49293-49345Δ::pTDH3-XdcrtE-tSSA1_LEU2), bearing the heterologous GGPP synthase crtE of Xanthophyllomyces dendrorhous and produced 64.23 mg/L GGOH. Consequently, this engineering strategy improved the GGOH production by a factor of 642 compared to the parent strain JBY2.
In Europe, the sugar refinery is largely based on sugar beets. This route for obtaining household sugar results in a large amount of biomass waste, consisting mainly of the insoluble beet resi-dues, e.g., cell wall fragments. To a vast moiety this debris consists of the polymer pectin (up to 20% in the dry total solids). The structure of pectin is based on a backbone of D-galacturonic acid units (GalA), but also contains various other sugar monomers, predominantly L-arabinose, D-galactose, L-rhamnose and D-xylose. The amount of GalA adds up to a moiety of up to 70% with-in this sugar cocktail. So far, this debris is only fed to cattle or simply burnt. In nature, pectin is a common substrate for various organisms. The degradation of pectin-rich biomass is often per-formed by filamentous fungi like Hypocrea jecorina (also known as Trichoderma reesei) and As-pergillus niger, which evolved pectinases to degrade the pectin backbone and pathways to con-sume the monomer GalA as a sole carbon source. The fungal catabolism of pectin residues starts with the reduction of GalA to L-galactonate (GalOA) by a GalA-reductase. Even though filamen-tous fungi are native hosts of the GalA-catabolism and certain engineering approaches have al-ready been demonstrated, this class of organisms remains challenging with regard to bioreactor cultivation and tedious genetic accessibility. In contrast, the yeast S. cerevisiae is well known in fermentation processes and easily modified by a versatile set of genetic tools. So far, first ap-proaches have already been conducted to transfer the GalA utilization pathways into S. cerevisiae, but these approaches indicated limitations regarding GalA-uptake and redox cofac-tor replenishment due to the relatively high oxidative state of GalA compared to other sugars like glucose and galactose. Furthermore, the generally strongly increased demand for redox co-factors must be met by GalA reduction by finding new cofactor sources or redirecting reactions of the core metabolism.
This work aimed at the production of GalOA, which is the first intermediate of the fungal GalA catabolism. This compound shows an interesting range of potential applications, for instance as a food and cosmetic additive. To overcome the oxidized character of GalA, the presence of a more reduced co-substrate as a redox donor and as a carbon and energy source was required. To further enhance the reduction of GalA, modulation of the redox-cofactor supply and enzyme engineering were performed.
Xylose, an abundant sugar fraction of lignocellulosic biomass, is a five-carbon skeleton molecule. Since decades, utilization of this sugar has gained much attention and has been in particular focus as a substrate for production of biofuels like ethanol by microbial hosts, including Saccharomyces cerevisiae. In this yeast, xylose is naturally not used as a carbon source, but its utilization could be achieved by metabolic engineering either via the oxidoreductive route or through the isomerase pathway. Both pathways share xylulose as a common intermediate that must be phosphorylated before entering the endogenous metabolism via the non-oxidative pentose phosphate pathway (noxPPP). Besides this, in some bacteria a non-phosphorylating oxidative pathway for xylose degradation exists, known as Weimberg pathway, where a molecule of xylose is converted by a series of enzymes - xylose dehydrogenase (XylB), xylonate dehydratase (XylD), 3-keto-2-deoxy-xylonate dehydratase (XylX) and α-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase (KsaD) - to form α-ketoglutarate (AKG). Besides having several useful properties as a product, AKG could also be used for cell growth as an intermediate of the tricarboxylic acid (TCA) cycle. One target of the present study is to establish a functional Weimberg pathway in S. cerevisiae. Previous studies have shown that this task is not trivial, for instance due to the toxicity of xylonate (the first metabolite of the pathway) and the involvement of an iron-sulfur cluster dependent enzyme, the D-xylonate dehydratase. The assembly of iron-sulfur clusters on a heterologous protein in yeast is known to be challenging.
To establish the Weimberg pathway in yeast, the genes xylB, xylD, and xylX were obtained from Caulobacter cresentus and ksaD was from Corynebacterium glutamicum. In a variant, the dehydratase xylD was replaced with orf41 from Arthrobacter nicotinovorans, which is believed to be independent of iron-sulfur clusters. Growth of yeast cells on xylose as a sole carbon source was expected as an indicator of a functional Weimberg pathway. However, the heterologous expression of the codon optimized genes was not sufficient to reach this goal. Due to the complexity of the interactions of the heterologous pathway with the endogenous cellular processes, it was assumed that potential limitations could be overcome by adaptive laboratory evolution, using xylose as a sole source of carbon. Increasing selection pressure was applied on a strain with Weimberg pathway genes integrated into the genome over several generations. As a variant of the evolutionary engineering approach, mutator strains were generated. For this, RAD27 and MSH2 genes were deleted, which are involved in nucleotide excision and mismatch repair mechanisms, respectively. Some of the resulting strains PRY24, PRY25, PRY27 and PRY28 were able grow in xylose as a sole carbon source after evolutionary engineering. As a control, a non-mutator strain PRY19 was also included. Strikingly, only the mutator strains were able to consume xylose as a sole carbon source, which shows the feasibility of the approach.
In addition to the mutator strain strategy, a further approach employed in the present study was the simultaneous expression of the Weimberg pathway in the cytosol and mitochondria. This was based on the reasoning that the iron-sulfur cluster biogenesis on XylD may be improved in the organelle and that the AKG is an intermediate of the TCA cycle. In the strain AHY02, all enzymes of the pathway were tagged with mitochondrial targeting signals in addition to a full cytosolically localized pathway. The localization of the mitochondrial variants was confirmed by fluorescence microscopy. Together with AHY02, CEN.PK2-1C wild type strain was also included as a control for evolution. When a selection pressure on xylose was applied, both strains - AHY02 and CEN.PK2-1C - were able to grow in the course of evolution. Deletion of the xylulokinase (XKS1) gene was found to be detrimental for both evolved strains in xylose-containing media. This suggests that the evolution of the endogenous oxidoreductive and noxPPP genes is responsible for growth of the evolved cells. For the evolved strain AHY02, it could also be possible that the Weimberg pathway genes supported to growth in addition to the oxidoreductive route. To elucidate the underlying molecular mechanisms, genome sequencing and reverse engineering approaches would be necessary in future.
In addition to screening for growth on xylose as a sole carbon source, a less stringent screening system was created to examine even a minor flux of xylose towards AKG. For this, all genes necessary for conversion of isocitrate to AKG where deleted, yielding a glutamate auxotrophic strain. In this system, the cells can grow on other carbon sources, whereas xylose is only provided as a source of AKG for the synthesis of glutamate...
Die Substitution von klassischen, mit der Nahrungsmittelproduktion in Konkurrenz stehenden, Substraten wie Glukose durch alternative Kohlenstoffquellen in der Biotechnologie ist sowohl aus ethischer, als auch aus ökonomischer Sicht erstrebenswert. Diese Arbeit beschreibt die Synthese von Bulkchemikalien in Form zweier Dicarboxylsäuren und einer Feinchemikalie in Form eines Sesquiterpens aus dem alternativen Substrat Methanol mit Hilfe genetisch veränderter Stämme des methylotrophen α-Proteobakteriums Methylobacterium extorquens.
Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure sind Dicarboxylsäurederivate der CoA-Ester Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA, die als Intermediate im Ethylmalonyl-CoA- Weg (EMCP) vorkommen. M. extorquens nutzt den EMCP für die Regeneration von Glyoxylat, das für das Wachstum auf C1-Substraten wie Methanol obligatorisch ist. In dieser Arbeit konnte erstmals Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure de novo durch die Expression einer für die Vorstufen Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA aktiven Thioesterase produziert werden. Ein kobaltlimitiertes Wachstum von M. extorquens führte aufgrund mangelnder Cofaktorversorgung zweier Vitamin-B12-abhäniger Mutasen im EMCP zu einer Akkumulation der beiden CoA-Ester-Vorstufen, womit eine Produktion von 0.65 g/l Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure erreicht wurde. Weitergehende Untersuchungen belegten außerdem einen positiven Effekt eines ausgeschalteten PHB-Zyklusses auf die Produktion der beiden EMCP- Dicarboxylsäurederivate.
Diese Arbeit beinhaltet zusätzlich grundlagenwissenschaftliche Untersuchungen zur Substitution der EMCP-katalysierten Glyoxylatregeneration durch einen heterologen Glyoxylatzyklus in EMCP-negativen M. extorquens-Stämmen. Dabei konnte erstmals ein methanolverwertendes, methylotrophes Bakterium identifiziert werden, das einen Serin-Zyklus in Kombination mit dem Glyoxylat-Zyklus zur Kohlenstoffassimilation verwendet, ohne dabei zusätzliche Stoffwechselwege zur CO2-Fixierung wie den EMCP, RuMP oder CBB-Zyklus zu verwenden.
Die Präsenz einer nativen C30-Carotinoidbiosynthese, ausgehend von der Vorstufe Farnesylpyrophosphat (FPP), empfiehlt M. extorquens als Produktionsorganismus für (Sesqui-)Terpene. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe einer induzierbar gesteuerten Expression einer Terpensynthase in Form einer α-Humulen-Synthase, einer FPP-Synthase und eines prokaryontischen Mevalonatweges, erstmals die de novo Synthese eines Terpens aus Methanol am Beispiel des α-Humulens etabliert. Durch optimierte Expressionen der Terpensynthase, FPPS und einzelner MVA-Gene mit Hilfe angepasster Translationsinitiationsraten der jeweiligen ribosomalen Bindestellen und der Verwendung eines in der nativen Carotinoidbiosynthese inhibierten M. extorquens-Stammes wurden finale Produkttiter von bis zu 1.65 g/l α-Humulen in Fed-Batch-Fermentationen erreicht.
Diese kumulative Dissertation beinhaltet außerdem einen Reviewartikel, in dem der verwendete Mikroorganismus M. extorquens in mikrobiologischer, genetischer, biochemischer und auch biotechnologischer Hinsicht ausführlich beschrieben wird. Zudem gibt ein Buchkapitel eine Übersicht über die Verwendung von Methanol in der Biotechnologie.
In recent years, several neuronal differentiation protocols were published that circumvent the requirement of embryoid body (EB) formation under serum-deprivation and simplified medium conditions. But a neuronal default model to establish an approach that works efficiently for all pluripotent cells and neuronal precursors is still lacking. Whether such a default neural mechanism exist and how this is implemented across a broad spectrum of cell source, is addressed in several studies and still controversially discussed. It was proposed that the default neuronal fate is initiated in the absence of extrinsic signals and is achieved by eliminating extracellular inhibitors of neuroectodermal fate and suppressing cell-cell signalling through limited cell density. Previous studies reported that ESC and ECC grown at low density and in absence of exogenous factors or feeder layers die within 24 h but acquire a neural identity as indicated by expression of the neural marker Nestin. Thus, this application is not suitable for generating neural cultures. Furthermore, it was reported that P19 cells survive and express neuroectodermal marker genes in serum-free DMEM/F12 medium containing transferrin, insulin, and selenite, although no neurites were identified.
Based on this background, in this study, a novel approach to induce neuronal differentiation in vitro was developed that implements a nutrient-poor environment, which, in contrast to previous studies, ensures the survival of neuronally differentiated cells over a long period of time and allows normal formation of neurites. Neither the formation of free-floating aggregates nor supplementation of growth factors or known inducers was required to establish a reliable neuronal differentiation protocol. A simple medium, consisting of DMEM/F12+N2 that was highly diluted in salt solution, was sufficient to drive a fast neuronal differentiation in monolayer cultures. Serum deprivation and strong dilution of DMEM/F12+N2 medium cause a nutrient-poor environment in which the influence of growth factors and inducers is minimized. This medium creates a metabolically defined environment that is presumably free of extrinsic signals that prevent the decision of neuronal fate. Analysis of the medium components discovered no actual inducer. Hence, it was suggested that the metabolic composition of the medium exclusively covers specific cell requirements of neurons, therefore ensures their survival, and drives the switch from pluripotent cells to neurons. The self-developed method was established by usage of the murine embryonal carcinoma cell line P19 and could be transferred to murine ESC. Consequently, the method could provide a feasible protocol for a generally valid neuronal default model.
The established protocol provides several advantages such as the possibility to generate stable pure neuronal cultures by a fast, simple, and highly reproducible one-step induction under defined medium conditions with a minimum of exogen effectors. The method is characterised by clear and steady medium conditions that makes the investigation of specific cell requirements during differentiation accessible. It is therefore expected to be a useful tool to investigate the molecular basis of neuronal differentiation as well as for high throughput screenings. The phenotype of mature postmitotic neurons was arising within one week and cultures were shown to stay stable at least for three weeks. The neuronal identity was confirmed by expression of neuronal markers through immunofluorescence staining and mass spectrometry analysis. Furthermore, increased levels of axon markers were detected in early neuronal differentiation and functionality of the synapses of the P19-derived neurons was ascertained by detection of calcium activity. Axonal laser ablation, immediately followed by fast regrowth of connections in the neuronal network, revealed a strong regeneration potential under the given conditions. Furthermore, the generated neurons showed a morphologically distinct phenotype and the formation of neural rosettes. Immunofluorescence staining demonstrated the generation of pure and homogeneous neuronal cultures, free of glial cells.
Retinoic acid (RA) plays an essential role in cell signalling during embryogenesis and efficiently induces neuronal differentiation in vitro in a concentration dependent manner. Neither retinol nor retinoic acid was included in any of the components of the self-prepared medium in this work. However, I observed, dependence on RARβ- and/or RARγ-regulated RA signalling in serum-free monolayer cultures. Nevertheless, neuronal differentiation in serum-free monolayer cultures was assumed to be RARα-independent because (i) RARα was slightly downregulated after neuronal induction, (ii) the truncated RARα of the RAC65 mutant had no effect on induction efficiency, and (iii) a pan-RAR inhibitor suppressed neuronal differentiation. In contrast to serum-free monolayer cultures, the truncated RARα prevented neuronal differentiation by application of the conventional protocol where cells are grown in free floating cell aggregates in serum-containing medium. Proteome analysis of P19 cells, treated by the self-developed differentiation protocol over five days showed increased levels of cellular RA binding proteins that mediate the cellular RA transport and are involved in canonical as well as non-canonical RA signalling.
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Terrestrische Säugetiere werden von unterschiedlichen Parasiten als Wirte genutzt. Dabei kann ihre Parasitenfauna je nach Art, Lebensweise, Verbreitung, Gesundheitszustand und Reproduktionsstatus des Wirts abweichen. Ein weiterer bestimmender Faktor, ist der Einfluss des Menschen in Form von Regulierungsmaßnahmen und Schaffung urbaner Lebensräume. Domestizierte Haustiere bzw. Nutztiere weisen daher in der Regel andere Parasiten auf als ihre wildlebenden Artgenossen. Gleichzeitig können sich sowohl Wildtiere als auch domestizierte Tiere und Menschen gegenseitig Parasitenarten teilen und wechselseitig aufeinander übertragen. Daraus resultierende Krankheiten werden als Zoonosen bezeichnet.
Insbesondere Fledermäuse (Unterordnung Microchiroptera) zeigen weltweit eine enorme Parasitendiversität, die noch weitgehend unerforscht ist. Ebenfalls Forschungsbedarf besteht für die Sandfloh-Gattung Tunga in Süd- und Mittelamerika in Hinblick auf ihr Wirtsspektrum, welches auch Menschen einschließt. Die Art Tunga penetrans und zahlreiche weitere Parasitenarten, parasitieren gleichzeitig auch bei Hunden. Daher stellen diese Wirte eine direkte Gesundheitsgefahr für Menschen in ihrer unmittelbaren Umgebung dar.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form zusammengefasst und beinhaltet drei Einzelpublikationen sowie einen Reviewartikel.
Ziel war es, die Parasitendiversität von Hunden aus urbanen tropischen Gebieten und die Parasitendiversität des Großen Ameisenbären (Myrmecophaga tridactyla) mit Hilfe morphologischer und molekularbiologischer Methoden zu analysieren. Die jeweiligen Parasitenfaunen wurden in Hinblick auf die soziale bzw. solitäre Lebensweise der beiden Wirtsarten verglichen und ihr zoonotisches Potenzial bewertet.
Ein weiteres Ziel war die Zusammenfassung der Ektoparasitennachweise süd- und mittelamerikanischer Microchiroptera und für die europäischen Arten der Fledermaus-Gattung Myotis (hier Endo- und Ektoparasiten) auf Basis der verfügbaren Literatur. Des Weiteren sollten eigene Parasitennachweise aus Bolivien bzw. Deutschland erfolgen. Für die Nachweise aus Deutschland wurden M. myotis untersucht, deren Artzugehörigkeit vorher bestimmt wurde. Zusätzlich wurden diese Individuen auf humanpathogene Lyssaviren untersucht.
Die Nachweise erfolgten über molekularbiologische und morphologische Methoden.
Das Vorkommen von Kunststoffmaterialien <5 mm, sogenanntem Mikroplastik
(MP), in marinen Ökosystemen wurde bereits eingehend untersucht. Im Gegensatz dazu existieren erhebliche Wissenslücken hinsichtlich der Abundanz und der Auswirkung von MP in limnischen Ökosystemen. Vor diesem Hintergrund steht das Umweltvorkommen, mögliche Eintragspfade und die Auswirkungen von MP auf aquatische Invertebraten im Fokus dieser Arbeit. Zur Bestimmung der MP-Abundanz in Fließgewässern sind Sedimente der Elbe untersucht worden. Hierfür wurde zunächst eine Methode zur Extraktion und Identifizierung von MP aus Umweltproben entwickelt, optimiert und validiert. In der anschließenden Analyse konnten in elf Probenahmestellen 55–17400 MP kg-1 in den Sedimenten nachgewiesen werden. Der Einfluss der Gezeitenströmung wurde anhand der abnehmenden MP-Abundanz in der Tideelbe deutlich. Insgesamt weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Sedimente von Fließgewässern eine Senke für MP darstellen. Für die Evaluation von Eintragspfaden von MP in Oberflächengewässer wurden die
Einleiter von fünf Kläranlagen beprobt und 240–897 MP m-3 in den Einleitern detektiert. Die Detailuntersuchung einer Kläranlage zeigte, dass >99% der MP-Fracht im Verlauf der Abwasseraufbereitung entfernt wird. Hierbei erfolgte die Hauptentfernung
bereits in der Vorklärung. Somit stellen Kläranlagen effektive Barrieren für den Eintrag von MP dar.
Insgesamt wird ersichtlich, dass die getesteten Arten C. riparius und G. pulex relativ insensitiv gegenüber einer MP-Exposition sind. So konnten bei G. pulex keine und bei C. riparius erst bei sehr hohen MP-Konzentrationen adverse Effekte detektiert werden. Hierbei ist die Autökologie der Spezies eine mögliche Erklärung für die Toleranz gegenüber partikulären Stressoren. Auf Basis dieser Daten sowie der ermittelten MPAbundanz kann das Umweltrisiko von MP in limnischen Ökosystemen vorläufig als
gering eingeschätzt werden. Hierbei gilt es jedoch zu beachten, dass eine abschließende
Bewertung aufgrund der nach wie vor existierenden Unsicherheiten nicht möglich ist. Diese Unsicherheiten betreffen die Umweltkonzentration von MP <80 μm, das Verhaltensowie das Wirkpotential dieser heterogenen und dynamischen Stressorenklasse
in umweltrelevanten Szenarien.
Seit den 1950er Jahren hat sich Plastik als unverzichtbare Ressource im menschlichen Alltag etabliert. Als negative Folge dieses Booms wird seit einigen Jahrzehnten jedoch eine zunehmende Belastung aquatischer Ökosysteme mit Plastikmüll bzw. dessen Degradationsprodukten, sogenanntes „Mikroplastik“ (MP, < 5 mm) bzw. „Nanoplastik“ (NP, < 1 µm), beobachtet. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des aktuellen Vorkommens von MP in limnischen Gewässern, die Analyse der Interaktion zwischen MP und limnischen Wirbellosenarten und der daraus resultierenden Toxizität sowie eine erste Risikoabschätzung.
Das Vorkommen von Mikroplastik in limnischen Gewässern wurde exemplarisch anhand der Elbe als großes Fließgewässer in Deutschland untersucht. Durch die Auswertung von elf Probestellen entlang des Verlaufs der Mittel- und Unterelbe konnte gezeigt werden, dass die MP-Konzentrationen im Sediment (2,26x10^4 – 2,27x10^7 P m^-3) im Mittel fast 150.000-fach höher sind als in der Wasserphase (0,88–13,24 P m^-3). Sedimente sind somit eine Senke für MP. Die Zusammensetzung der Polymerarten sowie MP-Formen deuten zudem an, dass die Partikel sowohl aus diffusen wie auch aus Punktquellen (z.B. Industrieabwässer) stammen. Im globalen Vergleich können die MP-Konzentrationen in deutschen Fließgewässern z. Z. als durchschnittlich betrachtet werden. Allerdings muss insgesamt davon ausgegangen werden, dass die bisher bestimmten MP-Umweltkonzentrationen die realen Konzentrationen möglicherweise unterschätzen. So zeigte die Elbestudie, dass die Sedimentfeinfraktion < 100 µm einen bedeutenden Polymeranteil enthielt. Die meisten bisher durchgeführten Studien zur Bestimmung von MP-Partikeln in Flüssen haben Partikel < 100 µm jedoch nicht in ihrer Analyse berücksichtigt.
Die Interaktion von MP mit limnischer Biota wurde anhand der Artgruppen der Muscheln (Bivalvia), Schnecken (Gastropoda) sowie Krebstiere (Crustacea) näher untersucht. Die Intensität der Interaktion ist maßgeblich von der Aufnahme von MP durch die verschiedenen Arten abhängig. Anhand von zahlreichen Aufnahmestudien mit verschiedenen limnischen Arten, darunter den Muschelarten Dreissena polymorpha, Sinanodonta woodiana und Anodonta anatina, der Lungenschnecke Lymnaea stagnalis sowie der Amphipodenart Gammarus pulex, wurde nachgewiesen, dass die MP-Aufnahme von den Eigenschaften der exponierten Arten bzw. Individuen, den MP-Charakteristika sowie den Expositionsbedingungen abhängt. Die Experimente mit Muscheln verdeutlichten die rasche Aufnahme, aber auch Exkretion von MP-Partikeln innerhalb weniger Stunden. In allen drei Artgruppen war die Aufnahme konzentrationsabhängig mit zunehmender Aufnahme bei steigenden MP-Konzentrationen. Die Muschelexperimente zeigten jedoch auch, dass eine gleichzeitige Exposition mit anderen Partikeln (z.B. Nahrung) zu einer reduzierten Aufnahme führt. Auch die Größe der Testorganismen beeinflusste die Aufnahme: So nahmen im Fall der Muscheln und Krebse kleinere Individuen (bzw. im Fall der Muscheln auch Arten) relativ pro Körpermasse mehr MP-Partikel auf als größere Individuen bzw. Arten. Für alle untersuchten Arten wurde darüber hinaus gezeigt, dass die MP-Größe relevanten Einfluss auf die Menge an aufgenommenen Partikeln hat.
Ein Vergleich zwischen den Artgruppen zeigte, dass Muscheln als filtrierende Organismen in den Laboruntersuchungen bei gleicher Expositionskonzentration mehr MP aufnahmen als Krebse (Zerkleinerer) und Schnecken (Weidegänger). Im Gegensatz zu Muscheln nutzen Krebstiere und Schnecken allerdings die Grenzschicht zwischen Wasser- und Sedimentphase als Suchraum für ihre Nahrung und sind in der Umwelt (auf Grund des höheren MP-Vorkommens in Sedimenten) somit möglicherweise gegenüber höheren MP-Konzentrationen exponiert als Muscheln. Die Extrapolation der gewonnenen Labordaten sowie der Vergleich mit publizierten Umweltdaten legen allerdings nahe, dass das MP-Vorkommen in Individuen aller drei Artgruppen bisher auf einige wenige MP-Partikel begrenzt ist. Ausgeprägte Unterschiede zwischen den Artgruppen sind bisher nicht erkennbar.
MP-Toxizitätsstudien mit G. pulex, L. stagnalis sowie D. polymorpha konnten trotz der Berücksichtigung einer Vielzahl an Endpunkten (Mortalität, Reproduktion, Nahrungsaufnahme, oxidativer Stress, Energiereserven, Immunzellaktivität) und trotz des Einsatzes zum Teil sehr hoher MP-Konzentrationen weit oberhalb aktueller Umweltkonzentrationen nur sehr wenige MP-induzierte Effekte nachweisen, darunter eine Steigerung der Filtrationsaktivität (D. polymorpha) bzw. Veränderung der Immunfunktion von Hämolymphzellen (L. stagnalis).
Zur weiteren Risikoabschätzung wurden diese Studienergebnisse mit publizierten Daten für marine und limnische Muschel- und Krebsarten in Artenempfindlichkeitsverteilungen (Species Sensitivity Distributions, SSD) zusammengeführt und jeweils eine SSD für Muscheln und Krebstiere erstellt. Die Erstellung einer SSD nur für limnische Arten ist zum jetzigen Zeitpunkt auf Grund der geringen Datenlage noch nicht möglich.
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Morbus Parkinson (abgekürzt als PD vom Englischen Parkinson’s disease) ist nach Alzheimer die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Die Hauptmerkmale sind Rigidität und Bradykinesie, sowie Tremor und posturale Instabilität. Im Gehirn lässt sich bei Parkinsonpatienten post mortem ein Verlust an Neuronen in der Substantia nigra feststellen, was zu den ersten beiden Anzeichen führt. Zudem gibt es intrazelluläre Einschlüsse in den betroffenen Nervenzellen – Lewy-Körperchen genannt – die aus Alpha-Synuklein und anderen Proteinen wie Ubiquitin zusammengesetzt sind. Außerdem ist der Eisenmetabolismus in Gehirnen von Parkinsonpatienten gestört und man findet Eisen-Ablagerungen, vor allem im Mittelhirn. Die Ursachen für PD sind bislang nicht abschließend geklärt. Der Großteil der Fälle ist sporadischer Natur mit unbekannter Ursache und nur bei einem geringen Anteil liegt eine Mutation in einem einzelnen Gen zugrunde. Die häufigsten Mutationen tritt in den Genen für Alpha-Synuklein (SNCA), PINK1 und PARKIN auf.
Die Serin-Threonin-Kinase PINK1 und die E3-Ubiquitin-Protein-Ligase PARKIN sind zwei Proteine, die in Stresssituationen an der Mitochondrien-Außenmembran am Abbau von alten oder nicht richtig funktionierenden Mitochondrien beteiligt sind. Dieser Vorgang nennt sich Mitophagie.
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Publikationen gehen den Zusammenhängen zwischen mitochondrialen Fehlfunktionen und der Pathogenese von PD nach. Da die Krankheit meist erst im hohen Alter auftritt, davon größtenteils ohne direkte Ursache, liegt der Schluss nahe, dass neben genetischen Ursachen auch Umweltfaktoren eine größere Rolle spielen könnten. Um dies näher zu analysieren, wurden experimentell verschiedene Stressoren eingesetzt.
Insgesamt wurden folgende Aspekte untersucht:
I. Welche Auswirkungen hat das Fehlen von PINK1 auf die Zelle? Gibt es einen Biomarker, der mit höherem Alter immer stärker verändert ist?
II. Welchen Einfluss haben Umweltfaktoren wie veränderte Eisen-Exposition auf die Zelle und was verändert sich beim Fehlen von PINK1?
III. Wie können mitochondriale Fehlfunktionen präferentiell das Nervensystem betreffen, wenn es nicht um respiratorische Insuffizienz geht?
Die einzelnen Studien zeigten folgende Ergebnisse:
Torres-Odio/Key et al. 2017 widmete sich der Suche nach molekularen Biomarkern, wodurch PD präsymptomatisch erkannt und die Progression der Erkrankung eingeschätzt werden kann. Die Transkriptom-Analyse der Kleinhirne von Mäusen mit Pink1-/--Mutation in drei verschiedenen Altersstufen zeigte eindrücklich, dass nicht ein einzelner Faktor immer stärker verändert war, sondern, dass immer mehr Faktoren und daher auch eine steigende Zahl an
Signalwegen mit höherem Alter beteiligt waren. Diese Veränderungen betrafen inflammatorische Signalwege, insbesondere Faktoren, die mit der Erkennung und Verarbeitung von zellfremden Nukleinsäuren assoziiert sind. Aufgrund der evolutionären Herkunft von Mitochondrien als frühere Protobakterien haben mitochondriale Nukleinsäuren und Proteine zum Teil bakterielle Ähnlichkeiten, und könnten bei Fehlfunktionen ins Zytosol gelangen. Vor diesem Hintergrund lassen die Ergebnisse der Studie den Schluss zu, dass das angeborene Immunsystem in Neuronen durch eine PINK1-assoziierte mitochondriale Störung aktiviert wird.
In der Publikation Key et al. 2020 wurde Eisen als ein im täglichen Leben vorkommender Stressor eingesetzt und es wurden systematisch Faktoren des Eisenstoffwechsels bei hohen und niedrigen Eisenspiegeln im Zusammenhang mit Parkinson-Mutationen untersucht. Da Eisen für die Gesundheit von Mitochondrien eine große Rolle spielt und Eisen-Chelatoren als Therapie bei PD Patienten bereits diskutiert werden, haben die molekularen Befunde große Relevanz. Die Ergebnisse zeigen, dass unter niedrigen Eisenspiegeln Proteine reduziert waren, die am Nukleotid-Stoffwechsel beteiligt sind, sowie Faktoren, die Eisen-Schwefel-Cluster als Cofaktoren haben und wichtig für die Nukleotid-Qualitätskontrolle sind. Das Fehlen von Eisen führte zu einer Induktion von Pink1 und Prkn, was auf verstärkte Mitophagie hindeutet. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die mitochondriale Eisen-Schwefel-Cluster Biogenese und die post-transkriptionelle Eisenregulation entscheidend für die Pathogenese von PD, bzw. das gesunde Fortbestehen einer Zelle und letztlich auch eines Organismus sind.
In Key et al. 2019 wurde erstmalig das Gesamt-Ubiquitylom aus Gehirnen von gealterten Parkin-knockout (KO) Mäusen erhoben und analysiert, um Ubiquitylierungs-Substrate von PARKIN zu identifizieren. Hierbei zeigte sich eine veränderte Ubiquitylierung von mehreren Faktoren, die an der zellulären Calcium-Homöostase beteiligt sind. Weitere elektrophysiologische Experimente in Gehirnen von gealterten Parkin-/--KO Mäusen ergaben, dass in Nervenzellen im Locus coeruleus die Geschwindigkeit der spontanen Taktgeber erhöht, dass die langsame Nachhyperpolarisation reduziert und, dass die Dauer der Aktionspotentiale erniedrigt war, ohne Veränderung der Kaliumkanal-Ströme.
Insgesamt geht aus den drei Studien hervor, dass mitochondriale Fehlfunktionen bei dauerhaftem Bestehen weitreichende Folgen für die Gesundheit des Nervensystems haben können, denn auch kleine Veränderungen, seien es durch Mutationen oder Umweltfaktoren wie Eisen, können in einer so großen Lebensspanne wie der des Menschen über Krankheit oder Gesundheit entscheiden!
Modellierung der klimatischen Habitateignung verschiedener krankheitsübertragender Vektorarten
(2018)
Der Klimawandel hat einen starken Einfluss auf die Verbreitungsgebiete von Arten. Infolgedessen kann sich das Verbreitungsgebiet von Arten verschieben, einschränken oder ausweiten. Bei thermophilen Arten wird vermutet, dass sie von den klimatischen Änderungen profitieren und sie sich wahrscheinlich ausbreiten werden. Eine solche Ausbreitung, wozu auch die Einwanderung von gebietsfremden Arten zählt, hätte nicht nur zahlreiche Konsequenzen für diese Ökosysteme, sondern könnte sich auch zu einem ernsten Gesundheitsrisiko entwickeln, wenn es sich bei den einwandernden Neobiota um Vektorarten handelt.
Stechmücken und Sandmücken, als blutsaugende Insekten, zählen zu den bekanntesten Vektorarten. Sie sind in der Lage, eine Vielzahl von Infektionskrankheiten wie das Denguefieber oder das Gelbfieber, aber auch protozoische Parasiten wie "Leishmania"-Arten zu übertragen. Als thermophile Arten sind viele dieser Vektoren aktuell in ihrer Verbreitung weitgehend auf tropische und subtropische Gebiete beschränkt. Eine Einwanderung in gemäßigtere Gebiete kann zu einer Einschleppung der durch sie übertragenden Erreger führen und damit zum Ausbruch von Infektionskrankheiten. Aufgrund der medizinischen Relevanz dieser Arten ist es essentiell, die räumliche Verbreitung, sowie die abiotischen Ansprüche der Vektorarten zu kennen, um deren mögliche Ausbreitung nachzuvollziehen.
Vor diesem Hintergrund beschäftigte sich die vorliegende kumulative Dissertation mit den klimawandelinduzierten Änderungen der Habitateignung verschiedener medizinisch relevanter Vektorarten. Dabei wurden die zwei invasiven Stechmückenarten "Aedes albopictus" (I-III) und "Aedes japonicus" (III), sowie zehn in Europa bereits vorkommende Sandmückenarten der Gattung "Phlebotomus" (IV), untersucht. Die Arbeit basiert auf vier (ISI-) Publikationen. Unter Verwendung ökologischer Nischenmodellierung wurden geeignete Gebiete unter aktuellen und zukünftigen Klimabedingungen bestimmt. Um dabei sowohl räumliche als auch zeitliche Aspekte zu berücksichtigen, wurden mehrere räumliche Skalen (Deutschland und Europa), sowie Zeitperioden (2030, 2050 und 2070) betrachtet. Des Weiteren wurden verschiedene Ansätze (einzelne Algorithmen und Ensemble-Modelle) zur Modellierung der Habitateignung verwendet.
Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen eine zukünftige klimawandelbedingte Ausweitung der geeigneten Gebiete für viele der betrachteten Vektorarten. So konnte gezeigt werden, dass die Habitateignung für "Aedes albopictus" in Deutschland (I) und in Europa (III) zukünftig deutlich zunimmt. Auch für die Sandmückenarten "Phlebotomus alexandri", "Phlebotomus neglectus", "Phlebotomus papatasi", "Phlebotomus perfiliewi" und "Phlebotomus tobbi" konnte eine deutliche Zunahme der klimatisch geeigneten Gebieten projiziert werden (IV).
Lediglich Arten, wie die Asiatische Buschmücke "Aedes japonicus" (III) und auch kältetolerantere Sandmücken, wie "Phlebotomus ariasi" und "Phlebotomus mascittii" (IV) scheinen weniger von diesen klimatischen Veränderungen zu profitieren und könnten in Zukunft sogar aktuell geeignete Gebiete verlieren (klimawandelinduzierte Arealverkleinerung). Bei "Aedes japonicus" konnte dies auf eine engeren Nische mit einem Optimum bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen zurückgeführt werden (III).
Am Beispiel von "Aedes albopictus" wurden ferner Umweltfaktoren identifiziert, die die Verbreitung der Art limitieren (II). Als wärmeliebende Art spielen bei "Aedes albopictus" in Mitteleuropa insbesondere die niedrigen Temperaturen eine Rolle, während in Zukunft die Sommertrockenheit in Südeuropa zunehmend eine Rolle spielen könnte.
Nischenmodellierung stellt trotz ihrer vereinfachenden Annahmen und Unsicherheiten, eine hilfreiche Methode zur Untersuchung klimawandelinduzierter Arealverschiebungen dar. Mit Hilfe der Modellierungsergebnisse konnten Gebiete mit einem hohen Etablierungsrisiko für die Vektorarten identifiziert werden, welche daher im Fokus künftiger Überwachungsprogramme stehen sollten. In Zukunft könnten mehr Vektorarten geeignete Bedingungen in Mitteleuropa finden, wodurch die Vektordiversität zunehmen wird. Dadurch könnte auch das Risiko für einen Ausbruch der durch die Vektoren übertragenen Krankheiten steigen.
Auch wenn das Vorhandensein eines kompetenten Vektors eine unerlässliche Voraussetzung für den Ausbruch einer Infektionskrankheit darstellt, gibt es noch weitere Faktoren, wie das Vorhandensein des Erregers. In Bezug auf die Risikoabschätzung vektorassoziierter Krankheiten sollten neben der Verbreitung des Vektors und des Erregers auch die abiotischen Bedingungen für die Entwicklung des Erregers berücksichtigt werden. Neben neu eingewanderten Arten sollten zudem auch die heimischen Arten in Bezug auf ihre Vektorkompetenz untersucht werden, da diese ebenfalls als potentielle Vektoren dienen und somit das Gesundheitsrisiko weiter erhöhen könnten.
Eine überlebenswichtige Eigenschaft von Mensch und Tier ist es, sich bei Gefahr durch eine Schreckreaktion in Sicherheit zu bringen. Doch woran erkennt ein Organismus, in welcher Situation es „sinnvoll“ wäre, sich zu erschrecken und welche Eigenschaften sensorischer Stimuli tragen zu dem Gefahreneindruck bei? Bei plötzlich eintretenden, lauten auditorischen Reizen kann es zur Auslösung der akustischen Schreckreaktion kommen. Dies führt bei Menschen, aber auch bei kleineren Säugetieren zu einer reflexartigen Kontraktion der Nacken-, Gesichts- und Skelettmuskulatur. Die Erforschung der akustisch evozierten Schreckreaktion (ASR) dient dem besseren Verständnis der neurobiologischen Grundlagen sensorischer Verarbeitung. Modulationen der ASR mithilfe von Präpulsen (Präpulsinhibition) ermöglichen Einblicke in die Funktion der Kochlea, des Hörnervs, der Hirnstammstrukturen und anderer beteiligter Gehirnregionen.
In dieser Arbeit wurden kurzzeitige Änderungen von Frequenz oder Intensität des akustischen Hintergrundes als neuartige Präpulse untersucht. Die Bedeutung verschiedener Reizparameter dieser Präpulse wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal systematisch erforscht. Um zu prüfen, welche Präpulsstimulationen eine Inhibition der ASR auslösen können, wurde eine Reihe von Parametern umfassend getestet. In einem weiteren Schritt wurde analysiert, ob es mithilfe von gezielten Änderungen von Frequenz oder Intensität möglich sein könnte, Unterscheidungsschwellen, oder gar Hörschwellen von Versuchstieren zu bestimmen.
Die Experimente zur Modulation der ASR wurden mit weiblichen Sprague Dawley-Ratten durchgeführt. Dabei wurde eine Vielzahl von Verhaltensparadigmen untersucht. Dazu zählten Präpulse mit unterschiedlichem Frequenzgehalt und variabler Dauer. Zusätzlich wurden neuartige Paradigmen etabliert, um die Fähigkeit zur Frequenz- und Intensitätsdiskriminierung zu untersuchen. Hierbei wurde der Frequenzgehalt oder die Intensität einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation verändert, um eine Präpulswirkung zu erzeugen. Um die Möglichkeiten der Bestimmung von Hörschwellen mittels der Präpulsinhibition (PPI) zu ergründen, wurde die Intensität von Präpulsen systematisch verändert. Die so generierten Schwellenwerte wurden durch die Messung früher akustisch evozierter Hirnstammpotenziale verifiziert. Schließlich sollten, unter Zuhilfenahme der Signaldetektionstheorie, aus den erhobenen Daten diverse Schwellen bestimmt werden: Für die Intensitätsänderungen der Präpulse in Stille wurden Hörschwellen bestimmt, während bei Änderungen der Frequenz und Intensität Unterscheidungsschwellen bestimmt werden sollten.
Mit steigender Größe eines Frequenzsprungs in einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation war eine stärkere Inhibition der ASR feststellbar; ein Effekt, der stark von der Hintergrundfrequenz abhängig war. Bei einer Stimulation mit 8 kHz konnten signifikant höhere Inhibitionswerte erzielt werden als mit 16 kHz. Bei der Untersuchung des Zeitablaufs der Stimulation ergab sich, dass eine abgesetzte Stimulation mit einer Abweichung von 80 ms Dauer bis 50 ms vor dem Schreckreiz für die höchsten Inhibitionen sorgte.
Die durch eine Intensitätsänderung einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation ausgelöste PPI hing primär von der Größe und Richtung des Intensitätssprungs ab. Mit zunehmender Sprunggröße stiegen die Inhibitionswerte an. Eine Erhöhung der Hintergrundintensität um 10 dB hatte einen signifikanten Einfluss auf die Inhibitionswerte. Auch hier zeigte sich eine höhere Sensitivität in Form von höheren Inhibitionen für Stimuli mit einer Hintergrundfrequenz von 8 kHz als für alle anderen getesteten Hintergrundfrequenzen.
Die Bestimmung von Hörschwellen mittels intensitätsabhängiger PPI wies im Vergleich mit den elektrophysiologisch bestimmten Hörschwellen ein heterogenes Bild mit starken individuellen Schwankungen auf: Bei etwa der Hälfte der Tiere waren die Hörschwellen beider Messungen sehr vergleichbar, bei den übrigen Tieren konnten mittels PPI für eine oder mehrere Frequenzen keine aussagekräftigen Hörschwellen erzielt werden. Die elektrophysiologisch bestimmten Hörschwellen waren am sensitivsten, während PPI-Stimulationen signifikant höher waren. Außerdem bewirkten PPI-Stimulationen mit Reintönen signifikant sensitivere Hörschwellen im Vergleich zu einem Schmalbandrauschen.
Für die Bestimmung der Unterscheidungsschwellen von Frequenzänderungen konnte beobachtet werden, dass die Tiere auf Frequenzsprünge hin zu niedrigeren Frequenzen signifikant sensibler reagierten, als hin zu Aufwärtssprüngen (-1.2 bzw. +4.5%). Bei der Intensitätsunterscheidung hingegen konnte beobachtet werden, dass die Tiere signifikant sensitiver auf Intensitätserhöhungen als auf Erniedrigungen reagierten (-5.9 bzw. +2.7 dB).
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden, dass die PPI zur Bestimmung von absoluten Hörschwellen starken Schwankungen unterlag, sodass diese Methode nur eingeschränkt als Alternative zu operanter Konditionierung oder elektrophysiologischen Ableitungen in Frage kommt. Des Weiteren erzeugten bereits kleine Änderungen des Frequenzgehalts oder der Intensität einer Hintergrundstimulation eine robuste PPI. Somit können reflexbasierte Messungen mit überschwelligen Stimuli genutzt werden, um Unterscheidungsschwellen in Versuchstieren zu bestimmen. Diese Herangehensweise stellt also eine vielversprechende Methode dar, um Hörstörungen zu untersuchen, die nach einem Schalltrauma auftreten können. In einem nächsten Schritt könnte sie zur weiteren Charakterisierung von verstecktem Hörverlust beitragen.
In times of a growing world population and the associated demand for high crop yield, the understanding and improvement of plant reproduction is of central importance. One key step of plant reproduction is the development of the male gametophyte, which is better known as pollen. In addition, the development of pollen was shown to be very sensitive to abiotic stresses, such as heat, which can cause crop damage and yield loss. To obtain new insights in the development and heat stress response of pollen, a combined transcriptome and proteome analysis was performed for three pollen developmental stages of non- and heat-stressed tomato plants.
The analysis of the transcriptomes of non-stressed pollen developmental stages enabled the determination of mRNAs accumulated in certain developmental stages. The functional analysis of these mRNAs led to the identification of protein families and functional processes that are important at different times of pollen development. A subsequent comparison of the transcriptomes of non- and heat-stressed pollen revealed a core set of 49 mRNAs, which are upregulated in all three developmental stages. The encoded proteins include among other things different heat stress transcription factors and heat shock proteins, which are known key players of the plant heat stress response.
Furthermore, 793 potential miRNAs could be identified in the transcriptome of non- and heat-stressed pollen. Interestingly, 38 out of the 793 miRNAs have already been identified in plants. For more than half of these miRNAs potential target mRNAs were identified and the interactions between miRNAs and mRNAs linked to the development and heat stress response of pollen. In total, 207 developmentally relevant interactions could be determined, out of which 34 have an effect on transcriptional-networks. In addition, 24 of the interactions contribute the heat stress response of pollen, whereby this mainly affects post-meiotic pollen.
An initial correlation of the proteome and transcriptome of the developmental stages revealed that transcriptome analyses are not sufficient to draw exact conclusions about the state of the proteome. A closer look on the relationship of the transcriptome and proteome during pollen development revealed two translational modes that are active during the development of pollen. One mode leads to a direct translation of mRNAs, while the second mode leads a delayed translation at a later point in time. Regarding the delayed translation, it could be shown that this is likely due to a short-term storage of mRNAs in so-called EPPs. The comparison of the proteome and transcriptome response to heat stress revealed that the proteome reacts much stronger and that the reaction is mainly independent from the transcriptome. Finally, the comparison of the proteome of non- and heat-stressed pollen provided first indications for changes in the ribosome composition in response to heat stress, as 57 ribosomal proteins are differentially regulated in at least one developmental stage.
Autophagy, meaning “self-eating”, is an important cellular waste disposal mechanism. Thereby, damaged proteins, lipids and organelles are enclosed by autophagosomes and subsequently transported to the lysosomes for degradation into basic, cellular building blocks. Under basal conditions autophagy prevents the accumulation of defective and harmful material and generally promotes cell survival. However, several studies reported that hyperactivated autophagy, e.g. during developmental processes in lower eukaryotes, or during chemotherapeutic treatment of cancer cells, can also trigger cell death.
In recent years, autophagic cell death (ACD) has been considered as an alternative cell death pathway for tumor therapy, especially for solid tumors with high apoptosis resistance such as glioblastoma. Glioblastoma (GBM) is a very aggressive, malignant primary brain tumor with a median survival of ~ 15 months despite surgery and chemoradiotherapy. Accordingly, there is a great interest in improving GBM therapy through alternative cell death mechanisms. Interestingly, it has been shown that various substances, e.g. AT 101, cannabinoids and the combination of imipramine and ticlopidine (IM+TIC), induce ACD in GBM cells.
The aim of this project was to identify the underlying mechanisms of stress- and drug-induced ACD and its therapeutic potential for glioblastoma treatment. For detailed investigation of ACD, a CRISPR/Cas9-based approach was used to generate ATG5 and ATG7 knockouts as genetic models of autophagy deficiency. In a previous study of our lab it was demonstrated that administration of AT 101 triggers ACD in glioblastoma cells, which was associated with early mitochondrial fragmentation but no signs of apoptosis. Since mitochondrial fragmentation often precedes mitophagy, the first part of this thesis explored the potential role of mitophagy in AT 101-induced cell death.
ATG5-depleted cells confirmed that AT 101 induces ACD. In addition, treatment with AT 101 resulted in a pronounced mitochondrial depolarization, which was at least partly caused by the opening of the mitochondrial permeability pore. Global proteome analysis of AT 101-treated GBM cells revealed a robust decrease in mitochondrial protein clusters as well as a strong increase in the enzyme heme oxygenase-1 (HMOX1). Subsequent experiments for detailed investigation of mitophagy following AT 101 treatment (western blot, flow cytometric MTG and mt-mKeima, qRT-PCR of mitochondrial vs nuclear DNA) consistently indicated strong mitophagy induction by AT 101, which could be reduced by genetic or pharmacological inhibition of autophagy. Furthermore, siRNA-mediated knockdown experiments revealed that the selective mitophagy receptors BNIP3 and BNIP3L and the HMOX1 enzyme play an essential role in AT 101-induced mitophagy and subsequent cell death. Taken together, these data demonstrate that AT 101-induced mitochondrial dysfunction and HMOX1 induction synergize to promote excessive mitophagy with a lethal outcome in glioma cells.
The second part of this thesis focused on the identification of new substances that cause ACD and the investigation of the underlying cell death pathways. Using a cell death screen of the ENZO Screen-Well™ autophagy library in MZ-54 wild-type vs ATG5 and ATG7-depleted cells, loperamide, pimozide, and STF-62247 were identified as ACD-inducing agents. The increase of the autophagic flux and the induction of ACD by these substances was confirmed by using different ATG5 and ATG7 knockout cell lines and the already established positive control IM+TIC.
In contrast to AT 101, IM+TIC, STF-62247, loperamide and pimozide produced neither mitochondrial dysfunction nor mitophagy. Interestingly, it has been described that imipramine, loperamide and pimozide inhibit the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase, which is associated with impaired lipid transport. Global proteome analysis and cholesterol staining confirmed that all four substances, but especially loperamide and pimozide, inhibit cellular lipid transport, leading to massive lipid accumulation in the lysosomes. In the further course of the experiments, the connection between defective lipid transport and autophagy was investigated in more detail. On the one hand, the defective lipid transport contributed to the induction of autophagy, on the other hand the massive accumulation of lipids led to lysosomal membrane damage, inhibition of lysosomal degradation at later time points and finally to a lysosomal cell death. Remarkably, it has been shown that hyperactivated autophagy by IM+TIC, loperamide and pimozide massively promotes lysosomal membrane damage. This result highlights the difficulties of a clear distinction between autophagic and lysosomal cell death.
In summary, two new signaling pathways that induce autophagic cell death in GBM cells and may be relevant for glioblastoma therapy were investigated in this study.
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine idiopathische chronisch-entzündliche Systemerkrankung, mit primärer Gelenkmanifestation. Die fortschreitende Gelenkentzündung ist die Folge einer immunologischen Fehlerkennung von Gelenkstrukturen durch dysregulierte B- und T-Lymphozyten. So lassen sich in bis zu 70% der entzündeten Gelenke von RA-Patienten IgG-Autoantikörper gegen das knorpelspezifische Kollagen Typ II (CII) nachweisen.
In dieser Arbeit wurde die CII-Epitop-spezifische humorale Autoimmunantwort in der Pathogenese der RA auf molekularer Ebene analysiert. Im Mittelpunkt stehen hierbei bereits gut charakterisierte B-Zell-Epitope auf dem CII, die über die Speziesbarrieren hinweg evolutionär konserviert sind und sowohl in der humanen RA als auch in der murinen Experimentalerkrankung des CIA-Modell (Collagen-Induced-Arthritis) immundominante Strukturen der humoralen arthritogenen Autoimmunität darstellen.
Ein Teilaspekt der Arbeit war die Aufklärung des molekularen Mechanismus, der den katabolen Effekten des murinen arthritogenen CII-Autoantikörper (UL-1) auf den chondrozytären Matrixmetabolismus zugrunde liegt, gewidmet. Der gegen ein immundominantes Epitop (U1-Epitop) auf dem CII gerichtete monoklonale Antikörper kann unabhängig von seinen Fc-vermittelten inflammatorischen Effektorfunktionen, eine direkte Schädigung der Knorpelmatrix über eine Modulation des Chondrozytenmetabolismus im CIA-Modell bewirken. Basierend auf der Analyse von Sequenzhomologien des U1-Epitopes konnte eine immunologische Kreuzreaktivität mit dem LIF (Leukemia-Inhibitory-Factor)-Rezeptor auf Chondrozyten nachgewiesen werden. Weitergehende funktionelle Studien haben jedoch gezeigt, dass die Rezeptorbindung durch den Antikörper keine intrazellulären Signalwege aktiviert, die an der aus der Literatur bekannten Proteoglykan-depletierenden Wirkung des Zytokins LIF beteiligt sind. Während somit eine UL-1 abhängige Aktivierung des LIF-Rezeptors als Erklärungsmodell der katabolen Antikörperwirkung ausscheidet, konnten die funktionellen in vitro Studien eine spezifische UL-1 Antikörper abhängige Src-Kinaseaktivierung in den humanen Chondrozyten als Ansatzpunkt für zukünftige Studien nachweisen.
In der RA-Pathogenese wird die Bedeutung posttranslationaler Modifikationen, insbesondere der Deiminierung von Argininresten unter Bildung von Citrullin für die Neoepitopgenerierung diskutiert. Autoantikörper gegen citrullinierte Peptide (ACPA, anti-citrullinated-peptides-antibody) gelten als diagnostische und verlaufsprädiktive Marker der RA. Zielstrukturen für ACPAs sind nicht nur einige ubiquitär exprimierte Proteine, sondern auch das knorpelspezifische CII. In dieser Arbeit konnte erstmals die in vitro Bindung CII-spezifischer ACPAs an Knorpelgewebe von RA-Patienten, das als asserviertes Biomaterial aus Synovektomie- bzw. Gelenkersatzoperationen zur Verfügung stand, nachgewiesen werden. Darüber hinaus gelang der erstmalige Nachweis einer chondrozytären Expression der für die posttranslationale Modifikation verantwortlichen Peptidylarginin-Deiminasen (PAD) PAD2 und PAD4 im Knorpelgewebe und ihre Hochregulation in den Chondrozyten unter oxidativem und genotoxischem Stress. Diese Stressoren sind an degenerativen Knorpel-veränderungen in der Pathogenese der Osteoarthrose (OA) beteiligt, sodass die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese stützen, dass Degenerationsprozesse des alternden Knorpels zur Expression kollagenmodifiziernder PAD-Enzyme führen und damit die immunologische Selbsttoleranz des Knorpelgewebes durch Neoepitop-Generation in der Knorpelmatrix schwächen können.
Ein zentraler Aspekt der Arbeit galt der Analyse der CII-spezifischen humoralen Immunantwort im Blut und in der entzündlich veränderten Synovialmembran von RA-Patienten über die vergleichenden Analyse der rearrangierten Immunglobulingene in epitopspezifisch über biotinylierte CII-Peptide markierten B- und Plasmazellen. Die Isolation der markierten Zellen erfolgte mittels Laser-Mikrodissektion aus dem Gewebe und durchflusszytometrisch aus dem peripheren Blut. Die anschließende Sequenzanalyse der mittels semi-nested Einzelzell-PCR amplifizierten, für die variable Region der leichten und schweren Antikörperkette kodierenden V-Gene, ergab für die Erkennung des immundominanten CIIC1-Epitopes eine präferentielle V-Genverwendung. Darüber hinaus spricht der Nachweis höherer Mutationsraten in synovialen Plasmazellen im Vergleich zu CII-spezifischen B-Zellen im Blut für eine lokale synoviale Affinitätsreifung der Antikörperantwort. Die Klonierung der amplifizierten V-Gene in einen eukaryotischen Expressionsvektor ermöglicht die Expression rekombinanter Antikörper und deren Validierung im ELISA. Zukünftige Affinitätsbestimmungen und Kristallstrukturanalysen dienen dem verbesserten molekularen Verständnis der CII-Antikörpererkennung und murine Antikörper-transferexperimente der Evaluation der Arthritogenität der humanen CII-Antikörperantwort. Fernziel ist die Entwicklung einer auf der CII-Antigenspezifität beruhenden immunmodularischen Therapie der RA.
Die nicht-konventionelle Hefe P. ciferrii produziert große Mengen der tetra-acetylierten Sphingoidbase Phytosphingosin (TAPS). Sphingoidbasen sind essentielle Komponenten des stratum corneums, der multilamellaren Barriere der menschlichen Haut, und daher in der Kosmetik-Industrie von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die biotechnologische Produktion der Sphingoidbasen Phytosphingosin, Sphinganin und Sphingosin auf molekularbiologischer Ebene in P. ciferrii charakterisiert und optimiert werden. Die Hefe P. ciferrii konnte durch Etablierung einer einfachen und hoch-effizienten Transformations-Methode auf genetischer Ebene leicht zugänglich gemacht werden. Durch Inaktivierung des für NHEJ essentiellen PcLIG4 Gens konnte die Effizienz zielgerichteter genomischer Integrationen von transformierten DNA-Konstrukten von 1 % auf 87 % erhöht werden. Die Etablierung des Cre-loxP Systems erlaubte das mehrfache Verwenden eines Selektions-Markers wodurch sukzessiv mehrere genomische Integrationen in einem Stamm ermöglicht wurden. Durch diese Errungenschaften konnte das Ziel „Optimierung der Sphingoidbasen-Produktion der nicht-konventionellen Hefe P. ciferrii“ im Folgenden erfolgreich verfolgt werden. Der initiale Schritt der Sphingoidbasen-Biosynthese ist die von der Serin-Palmitoyl-Transferase katalysierte Kondensation von L-Serin und Palmitoyl-CoA. Durch die Deletion von Genen, die am L-Serin-Katabolismus von P. ciferrii beteiligt sind (PcSHM1, PcSHM2und PcCHA1), konnte die de novo Sphingoidbasen-Biosynthese optimiert werden und führte in einem lig4? Stamm zu einer etwa dreifachen Erhöhung der TAPS-Produktion. Weitere Ansätze den (vermutlich durch L-Serin feed back regulierten) L-Serin-Biosyntheseweg bzw. die in vivo L-Serin-Verfügbarkeit zu optimieren, führten nicht zu einer gesteigerten TAPS-Produktion. Durch weitere Deletion und Überexpression von Genen des Sphingolipid-Stoffwechsels konnte die TAPS-Produktion jedoch um ein Vielfaches verbessert werden. So konnte ein Stamm konstruiert werden, der die Gene PcLCB1, PcLCB2 und PcSYR2 überexprimiert und Deletionen der Gene PcSHM1, PcSHM2, PcCHA1, PcLCB4 und PcORM12 trägt. Dieser Stamm (CSS.L4.O.L2.L1.S2) wies eine mehr als fünffach erhöhte maximale spezifische TAPS-Produktbildungsrate (q Pmax ) auf und produzierte mit 2 g * L rund siebenmal mehr TAPS als der lig4? Ausgangsstamm, weshalb ein Einsatz dieses Stammes für die industrielle TAPS-Produktion denkbar wäre. Ausgehend von einem für die TAPS- (und somit Sphingoidbasen-) Produktion optimierten Stamm sollten Stämme mit optimierter TriASa- oder TriASo-Produktion für industrielle Zwecke generiert werden. Es stellte sich allerding heraus, dass erhöhte Mengen dieser Sphingoidbasen wahrscheinlich wachstumshemmend für P. ciferrii sind, weshalb eine weitere Produktions-Optimierung nicht ohne Weiteres möglich ist. In einem Laborstamm gelang es jedoch, durch Konstruktion und anschließende Transformation eines optimierten integrativen Plasmids (trägt die Gene, die für die Produktion von Sphingosin bzw. TriASo nötig sind) eine TriASo-Produktion von bis zu 30 mg * g (BTM) zu erzielen, wobei gleichzeitig die Bildung des Nebenprodukts TriASa auf weniger als 4 mg * g (BTM)reduziert wurde. Weiterhin konnte durch Deletion von PcSCS7 in einem TriASo-Produktionsstamm die TriASa-Produktion mehr als vierfach reduziert werden. Die Bildung eines weiteren von P. ciferrii gebildeten Nebenproduktes [Tri-Acetyl-Sphingadienin (TriASd)] konnte durch Deletion des PcSLD1 Gens unterbunden werden. Nach Inaktivierung von PcSCH9 konnte eine fast 20 %ige Verbesserung der TriASo-Produktion erreicht werden. Es konnten zwei putative Acetyl-Transferasen identifiziert werden (PcAft2 und PcSli1), die an der Acetylierung von Phytosphingosin (zu TAPS), Sphinganin (zu TriASa) und Sphingosin (zu TriASo) beteiligt sind. Die Aufklärung und Optimierung dieser von PcAtf2 und PcSli1 katalysierten Schritte sind vielversprechende Ansatzpunkte die Sphingoidbasen-Produktion in P. ciferrii weiter zu optimieren.
Monoterpenes and their monoterpenoid derivatives form a subclass of terpene(oid)s. They are widely used in medicines/pharmaceuticals, as flavor and fragrance compounds, or in agriculture and are also considered as future biofuels. However, for many of these substances, the extraction from natural sources poses challenges such as occurring at low concentrations in their raw material or because the natural sources are diminishing. Furthermore, many of the structurally more complex terpenoids cannot be chemically synthesized in an economic way. Therefore, microbial production provides an attractive alternative, taking advantage of the often distinct regio- and stereoselectivity of enzymatic reactions. However, monoterpenes and monoterpenoids are challenging products for industrial biotechnology processes due to their pronounced cytotoxicity, which complicates the production in microorganisms compared to longer-chain terpenes (sesquiterpenes, diterpenes, etc.).
The aim of this thesis was to generate a biotechnological complement to fossil-resources-based chemical processes for industrial monoterpenoid production. Therefore, a starting point for the further development of a microbial cell factory based on the microbe Pseudomonas putida KT2440 was aimed to be created. This production organism should be able to conduct a whole- cell biocatalysis to selectively oxyfunctionalize monoterpene hydrocarbons using renewable industrial by-products and waste streams as raw material for monoterpenoid production (Figure 1). As a model substance, the production of (-)-menthol should be addressed due to its industrial significance. (-)-Menthol is one of the world’s most widely-used flavor and fragrance compounds by volume as well as a medical component, having an annual production volume of over 30,000 tons. An approach for (-)-menthol production from renewable resources could be a biotechnological(-chemical) two-step conversion (Figure 1), starting from (+)-limonene, a by-product of the citrus fruit processing industry.
The thesis project was divided into three parts. In the first part, enzymes (limonene-3- hydroxylases) were to be identified that can convert (+)-limonene into the precursor of (-)-menthol, (+)-trans-isopiperitenol. To counteract product toxicity, in the second part, the tolerance of the intended production organism P. putida KT2440 towards monoterpenes and their monoterpenoid derivatives should be increased. Finally, in the third part, the identified hydroxylase enzymes would be expressed in the improved P. putida KT2440 strain to create a whole-cell biocatalyst for the first reaction step of a two-step (-)-menthol production, starting from (+)-limonene.
To achieve these objectives, different genetic/molecular biology and analytical methods were applied. In this way, two cytochrome P450 monooxygenase enzymes from the fungi Aureobasidium pullulans and Hormonema carpetanum could be identified and functionally expressed in Pichia pastoris, which can catalyze the intended hydroxylation reaction on (+) limonene with high stereo- and regioselectivity. A further characterization of the enzyme from A. pullulans showed that apart from (+) limonene the protein can also hydroxylate ( ) limonene, - and -pinene, as well as 3-carene.
Furthermore, within this thesis, mechanisms of microbial monoterpenoid resistance of P. putida could be identified. It was shown that the different monoterpenes and monoterpenoids tested have very different toxicity levels and that mainly the Ttg efflux pumps of P. putida GS1 are responsible for the tolerance to many of these compounds. Based on these results, a P. putida KT2440 strain with increased resistance to various monoterpenoids, including isopiperitenol, could then be generated, which can be used as a host organism for the further development of monoterpenoid-producing cell factories.
While within the scope of this work the heterologous expression of the fungal gene in prokaryotic cells in a functional form could not be realized despite different approaches, the identified enzymes, the monoterpenoid-tolerant P. putida strain and a plasmid developed for heterologous gene expression in P. putida provide a starting point for the further design of a microbial cell factory for biotechnological monoterpenoid production.
Generally speaking, protein import into mitochondria and chloroplasts is a post-translational process during which the precursor proteins destined for mitochondria or chloroplasts are translated with cytosolic ribosomes and targeted. The previous results showed that the isolated chloroplasts can import in vitro synthesized proteins and the absence of ribosomes in the immediate area around chloroplasts in electron microscopy (EM) images. However, none of the EM images were recorded in the presence of a translation elongation inhibitor. Also, the observation showed that ribosomes stably bind to purified liver mitochondria in vitro, and the first indication of chloroplast localization of mRNAs encoding plastid proteins in Chlamydomonas rheinhardtii, which challenge the post-translational import and support the co-translational process. Therefore, in this study, the association of the ribosomes to the isolated chloroplasts were analyzed, a binding assay was established and showed that naked ribosomes are not considerably bound to chloroplasts. Additionally, mRNA localize in close vicinity to mitochondria also challenged post-translation protein import. Global analysis of transcripts bound to mitochondria in yeast or human revealed that around half of the transcripts of mitochondrial proteins displayed a high mitochondrial localization. The observed association of mRNAs with chloroplast fractions and the in vivo analysis of the distribution of mRNAs was used as base to formulate the hypothesis that mRNA can bind to chloroplast surface. Therefore, in this study, the mRNA binding assay was established and revealed that mRNAs coding for the mitochondrial cytochrome c oxidase copper chaperone COX17 showed unspecific binding to the chloroplasts. The mRNA coding for chloroplast outer envelope transport protein OEP24 and mRNA coding for the essential nuclear protein 1 (ENP1) showed specific binding, and OEP24 has a 3-fold higher affinity than ENP1 mRNA. Moreover, the BY2-L (Nicotiana tabacum non-green cell culture) could confer the highest enhancement of OEP24 mRNA binding efficiency than the COX17 and ENP1 mRNA and the preparation of the BY2-L was optimized. Afterwards, the feasibility to fix the interaction between mRNA and the proteins on the surface of chloroplasts was confirmed. OEP24 mRNA showed more efficiency in the UV-crosslinking. Following, the pull-down with antisense locked nucleic acid (LNA)/DNA oligonucleotides was established which could be used for the further investigation of the proteins involved in the mRNA binding to the chloroplasts.
Mutational analysis of ribosomal DNA and maturation-scheme analysis of ribosomal RNA in A. thaliana
(2022)
Ribosome biogenesis is a fundamental cellular process beginning with long precursor rRNA transcription from multi-copies of repetitive 45S ribosomal DNAs. At the subunit level, the primary pre-rRNA transcript encapsuled in 90S protein-RNA complex undergoes decisive splitting in two chief ways for further maturation into large (LSU) and small (SSU) ribosomal subunit. The usage of specific rDNA copies from defined chromosomes and their selective role during growth and development have been a topic of interest owing to its contribution to specialized ribosome theory which proposes non-monolithic functions for ribosomes and thereby their mRNA translation potential. Dual-guide CRISPR/Cas9 mediated disruption of rDNA regions resulted in stable disruption of up to 2.5% and 5% of all rDNA copies in hetero- and homozygous (ploop KD) conditions, respectively. At the RNA level, the mutation excised a critical structural element, P-loop on the LSU 25S rRNA. Mutation caused a dosage dependent defect with homozygosity leading to severe developmental defects through vegetative and reproductive growth phases which is manifested in their proteome by means of disregulation through both increase and decrease of several gene ontological categories of proteins in mutants. Interestingly, the mutation on chromosome 4 triggered dosage compensation through rRNA expression from chromosome 2 further compounded by ectopic rRNA biogenesis defects. The mutated copies however are not incorporated in the translating ribosomes and as a direct or indirect consequence led to elevated basal autophagic levels in the mutants.
The primary 35S transcript is known to undergo two modes of initial cleavages at the pre-rRNA level that aid in their subsequent maturation. Root cell culture (RCC) studies shows that these cells contain a novel ITS2-first cleaved precursor even under control growth conditions, P-C2 adding a third maturation means for the 35S pre-rRNA. This maturation path is further known to be triggered under elevated growth temperature forming a novel adaptive response in Arabidopsis and two other crop plants, tomato, and rice. Taken together, the pulse-chase labeling analysis of control and stressed tissues uncovers the fine-tuned pre-rRNA schematics with crossovers between multiple maturation paths.
Nematophilic bacteria as a source of novel macrocyclised antimicrobial non-ribosomal peptides
(2020)
A solution to ineffective clinical antimicrobials is the discovery of new ones from under-explored sources such as macrocyclic non-ribosomal peptides (NRP) from nematophilic bacteria. In this dissertation an antimicrobial discovery process –from soil sample to inhibitory peptide– is demonstrated through investigations on six nematophilic bacteria: Xenorhabdus griffiniae XN45, X. griffiniae VH1, Xenorhabdus sp. nov. BG5, Xenorhabdus sp. nov. BMMCB, X. ishibashii and Photorhabdus temperata. To demonstrate the first step of bacterium isolation and species delineation, endosymbionts were isolated from Steinernema sp. strains BG5 and VH1 that were isolated directly from soil samples in Western Kenya. After genome sequencing and assembly of novel Xenorhabdus isolates VH1 and BG5, species delineation was done via three overall genome relatedness indices. VH1 was identified as X. griffiniae VH1, BG5 as Xenorhabdus sp. nov. BG5 and X. griffiniae BMMCB was emended to Xenorhabdus sp. nov. BMMCB. The nematode host of X. griffiniae XN45, Steinernema sp. scarpo was highlighted as a putative novel species. To demonstrate the second step of genome mining and macrocyclic non-ribosomal peptide structure elucidation, chemosynthesis and biosynthesis, the non-ribosomal peptide whose production is encoded by the ishA-B genes in X. ishibashii was investigated. Through a combination of refactoring the ishA-B operon by a promoter exchange mechanism, isotope labelling experiments, high resolution tandem mass spectrometry analysis, bioinformatic protein domain analysis and chemoinformatic comparisons of actual to hypothetical mass spectrometry spectra, the structures of Ishipeptides were elucidated and confirmed by chemical synthesis. Ishipeptide A was a branch cyclic depsidodecapeptide macrocyclised via an ester bond between serine and the terminal glutamate. It chemosynthesis route was via a late stage macrolactamation and linearised Ishipeptide B was synthesised via solid phase iterative synthesis. Ishipeptides were not N-terminally acylated despite being biosynthesised from the IshA protein that had a C-starter domain. It was highlighted that more than restoration of the histidine active site of this domain is required to restore N-terminal acylation activity.
To demonstrate the final step of determination of antimicrobial activity, minimum inhibitory concentrations of Ishipeptides and Photoditritide from Photorhabdus temperata against fungi and bacteria were determined. None were antifungal while only the macrocyclic compounds were inhibitory, with Ishipeptide A inhibitory to Gram-positive bacteria at 37 µM. The cationic Photoditritide, a cyclic hexapeptide macrocyclised via a lactam bond between homoarginine and tryptophan, was 12 times more inhibitory (3.0 µM), even more effective than a current clinical compound, Ampicillin (4.2 µM). For both, macrocyclisation was hypothesised to contribute to antimicrobial activity. Ultimately, this dissertation demonstrated not only nematophilic bacteria as a source of novel macrocyclic antimicrobial non-ribosomal peptides but also a process of antimicrobial discovery–from soil sample to inhibitory peptide– from these useful bacteria genera. This is significant for the fight against antimicrobial resistance.
Nematophilic bacteria as a source of novel macrocyclised antimicrobial non-ribosomal peptides
(2020)
A solution to ineffective clinical antimicrobials is the discovery of new ones from under-explored sources such as macrocyclic non-ribosomal peptides (NRP) from nematophilic bacteria. In this dissertation an antimicrobial discovery process –from soil sample to inhibitory peptide– is demonstrated through investigations on six nematophilic bacteria: Xenorhabdus griffiniae XN45, X. griffiniae VH1, Xenorhabdus sp. nov. BG5, Xenorhabdus sp. nov. BMMCB, X. ishibashii and Photorhabdus temperata. To demonstrate the first step of bacterium isolation and species delineation, endosymbionts were isolated from Steinernema sp. strains BG5 and VH1 that were isolated directly from soil samples in Western Kenya. After genome sequencing and assembly of novel Xenorhabdus isolates VH1 and BG5, species delineation was done via three overall genome relatedness indices. VH1 was identified as X. griffiniae VH1, BG5 as Xenorhabdus sp. nov. BG5 and X. griffiniae BMMCB was emended to Xenorhabdus sp. nov. BMMCB. The nematode host of X. griffiniae XN45, Steinernema sp. scarpo was highlighted as a putative novel species. To demonstrate the second step of genome mining and macrocyclic non-ribosomal peptide structure elucidation, chemosynthesis and biosynthesis, the non-ribosomal peptide whose production is encoded by the ishA-B genes in X. ishibashii was investigated. Through a combination of refactoring the ishA-B operon by a promoter exchange mechanism, isotope labelling experiments, high resolution tandem mass spectrometry analysis, bioinformatic protein domain analysis and chemoinformatic comparisons of actual to hypothetical mass spectrometry spectra, the structures of Ishipeptides were elucidated and confirmed by chemical synthesis. Ishipeptide A was a branch cyclic depsidodecapeptide macrocyclised via an ester bond between serine and the terminal glutamate. It chemosynthesis route was via a late stage macrolactamation and linearised Ishipeptide B was synthesised via solid phase iterative synthesis. Ishipeptides were not N-terminally acylated despite being biosynthesised from the IshA protein that had a C-starter domain. It was highlighted that more than restoration of the histidine active site of this domain is required to restore N-terminal acylation activity.
To demonstrate the final step of determination of antimicrobial activity, minimum inhibitory concentrations of Ishipeptides and Photoditritide from Photorhabdus temperata against fungi and bacteria were determined. None were antifungal while only the macrocyclic compounds were inhibitory, with Ishipeptide A inhibitory to Gram-positive bacteria at 37 µM. The cationic Photoditritide, a cyclic hexapeptide macrocyclised via a lactam bond between homoarginine and tryptophan, was 12 times more inhibitory (3.0 µM), even more effective than a current clinical compound, Ampicillin (4.2 µM). For both, macrocyclisation was hypothesised to contribute to antimicrobial activity. Ultimately, this dissertation demonstrated not only nematophilic bacteria as a source of novel macrocyclic antimicrobial non-ribosomal peptides but also a process of antimicrobial discovery–from soil sample to inhibitory peptide– from these useful bacteria genera. This is significant for the fight against antimicrobial resistance.
It has been estimated that about 1% of live births carry severe congenital heart defects and 20-30% among them have valve malformations. Despite its medical importance the underlying cause of many valvular diseases remains undiscovered. Thus, it is important to identify genes that play a crucial role in cardiac valve formation and maturation.
A temporal RNA expression analysis of heart development suggested that the extracellular matrix protein Nephronectin might be a novel regulator of valve development and/or trabeculation. Nephronectin is transiently expressed during rat heart development at the time of heart valve morphogenesis and trabeculation. Moreover, the extracellular matrix is known to be crucial for organogenesis. It is a complex, dynamic and critical component that regulates cell behavior by modulating the activity, bioavailability, or presentation of growth factors to cell surface receptors.
In order to verify the hypothesis that Nephronectin is a novel regulator of valve formation and/or trabeculation the zebrafish was chosen as model system. Females are able to spawn at intervals of 5 days laying hundreds of eggs in each clutch. Development progresses rapidly with precursors to all major organs appearing within 36 hours post fertilization. Zebrafish embryos develop externally, are translucent and continue to grow for several days despite developing severely malformed, non functional hearts. In addition, gene expression can be easily modulated. During the present study it has been shown that Nephronectin expression is correlated to valve development and trabeculation. Morpholinomediated knockdown of Nephronectin in zebrafish caused failure of valve formation and trabeculation resulting in > 85% lethality at 7 days post fertilization.
Cardiac valve formation is initiated at the junction of atrium and ventricle and is characterized by extracellular matrix deposition and endocardial cell differentiation. In accordance with the above-described phenotype the earliest observed abnormality in Nephronectin morphants was an extended tube like structure at the atrio-ventricular boundary. In addition, the expression of myocardial genes involved in cardiac valve formation (cspg2, fibulin1, tbx2b, bmp4) was expanded and endocardial cells along the extended tube like structure exhibited characteristics of atrio-ventricular cells (has2, notch1b and Alcam expression, cuboidal cell shape). Inhibition of has2 in Nephronectin morphants rescued the endocardial but not the myocardial expansion. In contrast, diminishment of BMP signaling in npnt morphants resulted in reduced ectopic expression of myocardial and endocardial atrio-ventricular markers. Taken together, these results identify Nephronectin as a novel upstream regulator of BMP4-HAS2 signaling playing a crucial role in atrio-ventricular canal differentiation.
Durch natürliche Selektion werden Funktionen, die dem Überleben und dem Fortpflanzungserfolg eines Organismus dienen, optimiert. Da die Struktur eines Organs dessen Funktion und umgekehrt die Funktion eines Organs dessen Struktur bestimmt, kann durch das Studium der Morphologie die Funktionsweise von Organen verstanden werden. Trotz des umfangreichen Wissens über die Struktur von Nervensystemen sowohl auf mikro- als auch auf makroskopischer Ebene, ist es weiterhin unklar, wie Bewusstsein und ein kohärentes Abbild der Umwelt im Gehirn erzeugt werden. Der Grund hierfür ist vor allem die gewaltige Komplexität neuronaler Netzwerke, die unmöglich geistig erfasst werden können. Eine Möglichkeit, das Gehirn ohne das detaillierte Wissen über all seine Bestandteile zu verstehen, bietet das Studium von Optimierungsprinzipien und deren Anwendung in theoretischen Modellen. So wie eingangs erwähnt die Funktion von Organen durch natürliche Selektion optimiert wird, sollte auch die Funktion neuronaler Netzwerke optimiert werden und neuronale Netzwerke sollten entsprechend solcher Optimierungsprinzipien aufgebaut sein. Ein wichtiges Prinzip, das essenziell für die Effizienz neuronaler Netzwerke ist, ist die Minimierung der Verbindungslänge zwischen Neuronen. Basierend auf diesem Prinzip wurde im Rahmen dieser Dissertation eine algorithmische Methode etabliert, die es ermöglicht Vorhersagen der relativen Position von Neuronen anhand ihrer Verbindungen zu treffen. Diese neuronale Platzierungsmethode beruht darauf, dass Neuronen mit ähnlicher Verbindungsnachbarschaft näher zueinander platziert werden als zu Neuronen mit weniger ähnlichen Verbindungsnachbarn, wodurch die durchschnittliche Verbindungslänge minimiert wird. Nach der Etablierung dieser Methode, wurde diese benutzt um Modelle zu erstellen, die es ermöglichen die Entstehung neuronaler Karten und kortikaler Faltungen im Zusammenhang mit der Konnektivität und der Anzahl der Neuronen zu untersuchen.
Neuronale Karten sind geordnete Muster auf der Oberfläche des Kortex, die durch die präferierte Aktivität einzelner Neuronen in Antwort auf Stimuli einer Modalität beobachtet werden können. Im visuellen Kortex existieren sogar mehrere Karten, je nachdem welche Qualität visueller Stimuli man betrachtet. Abhängig von der Präferenz für einen Sehwinkel, ein stimuliertes Auge oder der Orientierung eines Balken-Stimulus, können retinotopische Karten, Karten mit streifenartigen Mustern oder Karten mit sogenannten „Pinwheel“-Strukturen beobachtet werden. Pinwheels sind periodische Strukturen, die sichtbar werden indem man die Orientierungspräferenz von Neuronen für die spezifische Orientierung eines Balken-Stimulus mit der entsprechenden Farbe des Farbkreises visualisiert. Da diese Strukturen eine Ähnlichkeit mit bunten Windrädern haben, werde sie als Pinwheels bezeichnet. Die in dieser Dissertation erstellten Modelle sagen vorher, dass die Entstehung strukturierter neuronaler Karten im Allgemeinen von der Anzahl der Neuronen abhängt. In der Tat könnte diese Abhängigkeit auch für neuronale Karten im Kortex gelten. Während strukturierte Karten im visuellen Kortex in verschiedenen Säugerordnungen wie Primaten, Karnivoren und Huftieren existieren, sind sie in kleinen Nagern mit weniger Neuronen nicht vorhanden, trotz ähnlicher Verbindungsspezifizität. Folglich müssen Unterschiede in der Struktur neuronaler Karten im Kortex nicht zwangsläufig mit einer unterschiedlichen Funktionsweise zusammenhängen, sondern könnten auch durch allgemeine Optimierungsprinzipien beim Aufbau neuronaler Netzwerke bedingt werden. Eine weitere Gemeinsamkeit zwischen verschiedenen Säugetierordnungen ist, dass die relative Dichte der Pinwheels ziemlich genau bei der Zahl Pi liegt. Entsprechend der Ergebnisse dieser Dissertation könnte dies dadurch erklärt werden, dass für neuronale Karten ähnlicher Struktur die Anzahl der Neuronen pro Pinwheel relativ konstant ist. Unterschiede in der räumlichen Dichte der Pinwheels könnten dann einfach durch Unterschiede in der Dichte der Neuronen erklärt werden.
Neben den Modellen für neuronale Karten wurde im Rahmen dieser Dissertation auch ein Modell kortikaler Faltungen mit derselben neuronalen Platzierungsmethode erstellt. Die Existenz kortikaler Faltungen wird gemeinhin damit erklärt, dass der Kortex ohne Faltungen wegen seiner verhältnismäßig großen Oberfläche nicht in den Schädel gepackt werden könnte. Allerdings haben Experimente gezeigt, dass die Faltungen nicht durch eine Restriktion des wachsenden Kortex an der Schädeloberfläche entstehen, da auch mit mehr Platz für die Expansion des Kortex die gleichen Faltungsmuster exprimiert werden. Interessanterweise entstehen die kortikalen Faltungen erst, wenn die Proliferation der Neuronen während der Entwicklung größtenteils abgeschlossen ist und die Neuronen anfangen ihre Verbindungen auszubilden. Um kortikale Faltungen basierend auf der Konnektivität zwischen Neuronen im Modell vorherzusagen, genügt es das allgemeine Muster einer starken lokalen, aber schwachen globalen Konnektivität zwischen Neuronen nachzubilden. Abhängig von Variationen dieser Konnektivität, der Anzahl der kortikalen Kolumnen und der Neuronenanzahl innerhalb dieser Kolumnen, können im Modell viele Eigenschaften kortikaler Faltungsmuster in Säugetieren vorhergesagt werden. Ähnlich wie in Säugetieren ist der Faltungsgrad der vom Modell vorhergesagt wird von dem Verhältnis zwischen Parametern, die die Größe und Dicke des Kortex beschreiben, abhängig. Dementsprechend werden mehr und mehr Faltungen mit steigender Anzahl der Kolumnen, aber gleicher Anzahl von Neuronen pro Kolumne vorhergesagt. Wie in Säugetieren entstehen dabei auch die größeren primären Faltungen zuerst bevor es innerhalb der größeren Faltungen zu kleineren Faltungen höherer Ordnung kommt. Neben der Abhängigkeit des Faltungsgrads von der Größe des Kortex können Variationen in der Konnektivität erklären, wie es einerseits zu stereotypischen Faltungsmustern kommen kann, aber andererseits auch warum der Faltungsgrad zwischen verschiedenen Säugerordnungen unterschiedlich mit der Größe des Kortex skaliert. Letztlich könnten pathologische Veränderungen der Konnektivität zu den entsprechenden Änderungen im Faltungsmuster führen.
Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass mittels einfacher Prinzipien, die die Verbindung zwischen Neuronen und deren relative Position zueinander beschreiben, komplexe neuroanatomische Strukturen vorhergesagt werden können. Da mit derselben Methode zur neuronalen Platzierung sowohl neuronale Karten als auch kortikalen Faltungen, also sehr unterschiedliche Strukturen vorhergesagt werden konnten, stellt sich die Frage, ob diese Strukturen durch einen gemeinsamen biologischen Mechanismus entstehen. Neuronale Zugkräfte sind ein möglicher Mechanismus, der die Entstehung kortikaler Faltungen erklären könnte. Auch wenn es eher unwahrscheinlich ist, dass die Entstehung neuronaler Karten von Zugkräften zwischen Neuronen abhängt, kann es nicht vollständig ausgeschlossen werden. Ob solche Kräfte an der Selbstorganisation neuronaler Netzwerke beteiligt sein könnten, ist eine interessante Fragestellung für zukünftige empirische Studien.
Eine große Gruppe von Aptameren sind die Guanosintriphosphat (GTP) Aptamere. Diese zeigt sehr eindrücklich, wie RNA unterschiedliche Strategien nutzt, um denselben Liganden zu erkennen. Die komplette Struktur des GTP Klasse II Aptamers wird in der ersten Publikation gezeigt. Interessanterweise zeichnet die Struktur ein stabil protoniertes Adenine unterhalb der GTP-Bindestelle aus. Dieses wurde durch eine Kombination aus weiterführenden NMR- und ITC-Experimente untersucht und charakterisiert. Es zeigte sich, dass die protonierte Base einen pKs-Wert hat, der weit von der Neutralität verschoben ist. Die Protonierung ist auch noch bei sehr basischen Puffern stabil.
Eine Art der funktionellen Protonierung wird von den zyklischen di-Nukleotiden (CDN) bindenden Riboswitches genutzt, um zwei CDN mit ähnlicher Affinität zu binden. c-di-GMP Riboswitches wurden als regulatorische Einheit beschrieben und deren Kristallstruktur aufgeklärt. Mutationsexperimente führten dazu, dass bei einer G-zu-A Mutation an der Gα-Bindestelle die Selektivität des Riboswitches verändert wurde. Die Mutante bindet sowohl c-di-GMP als auch cGAMP mit ähnlichen Bindungsaffinitäten. Riboswitche, die cGAMP binden wurden auch in der bakteriellen Genomen gefunden. Hierbei ist die Promiskuität unterschiedlich stark ausgeprägt. Die Untersuchung des Bindungsmodus und der damit verbundenen Promiskuität ist in der zweiten Publikation beschrieben. Hier wurde gezeigt, dass die Riboswitche beide Liganden nur binden können, wenn zur Bindung von c-di-GMP das Ligand bindende A protoniert vorliegt. Auch diese Protonierung konnte mit weiterführenden NMR- und ITC-Experimenten charakterisiert werden. Die Untersuchungen einer solch großen RNA sind mit NMR Spektroskopie herausfordernd. Hierbei wurde ausgenutzt, dass die Kristallstruktur bereits bekannt war, welche allerdings die Protonierung nicht zeigte. Auch diese Protonierung zeigt einen pKs-Wert, der weit von der Neutralität verschoben ist und außerdem bei unterschiedlichen pH stabil ist.
In den beiden untersuchten Beispielen wurden zwei verschiedene Arten von Protonierung gezeigt: eine strukturelle und eine funktionelle. Das GTP Klasse II Aptamer benutzt die Protonierung als strukturelle Basis für die Basis der Ligandenbindungsstelle. Hierbei werden durch die Protonierung des Adenines mehr nutzbare Wasserstoffbrücken ausgebildet und damit die Tertiärstruktur stabilisiert. Im Unterschied dazu nutzen die promiskuitiven CDN Ribsowicthes die Protonierung, um verschiedene Liganden binden zu können und es kommt damit zu einer Verschiebung der Funktionalität. Der regulatorische Nutzen dafür ist allerdings noch unbekannt.
Auch bei den SAM Riboswitches wurde ein promiskuitiver Vertreter beschrieben. SAM Riboswitches gehören zu den am längsten bekannten Klassen der Riboswitches. Bis heute sind hier die meisten unterschiedlichen Klassen bekannt. SAM wird häufig als Donor für funktionelle Gruppen benutzt, besonders häufig als Methlygruppendonor für die Methylierung einer Reihe unterschiedlicher Substrate (z.B. DNA, Proteine, Metabolite etc.). Bei dieser Reaktion entsteht SAH als Nebenprodukt. Zusätzlich ist SAH zelltoxisch, da es affin an Methyltransferasen bindet und damit diese essenzielle Reaktion inhibiert. Eine enge Kontrolle der SAH-Konzentration ist daher kritisch. SAM bindende Riboswitches haben zu SAM eine bis zu 1000-fach höhere Bindungsaffinität im Vergleich zu SAH. Die Beschreibung eines translationalen OFF-Riboswitches, der SAM und SAH mit ähnlicher Affinität bindet, ist daher überraschend. Zumal seine Genassoziation fast ausschließlich zu SAM Synthetasen ist, deren Regulation durch SAH wenig sinnvoll erscheint. Um ein besseres Verständnis für die Funktion des SAM/SAH Riboswitches zu erhalten, wurde seine 3D-Struktur mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt, wie in der vierten Publikation beschrieben. Dafür mussten zunächst alle Resonanzen der Sequenz und dem Liganden zugeordnet werden, wie in der dritten Publikation beschrieben. Dabei wurde als Ligand SAH gewählt, da dieser chemisch stabiler und damit für die teils tagelangen NMR-Messungen besser geeignet ist. Zusätzlich wurden Mutanten bzw. verwandte Liganden mittels ITC Experimente auf ihre Bindungseigenschaften untersucht, um die Bedeutung der Linkerlänge, einzelner Basenpaare und funktionelle Gruppen des Liganden zu untersuchen. Bei anderen bekannten SAM Riboswitches umschließt die RNA den Liganden fast komplett. Dabei wird zum einem das Sulfoniumion spezifisch durch die Carboxylgruppen verschiedener Uracil-Nukleotide erkennt und koordiniert. Außerdem bildet sich eine Bindetasche aus, die genug Platz für die stabile Bindung der Methylgruppe hat. Beim SAH Riboswitch wird die Selektivität für SAH dadurch erreicht, dass die Bindetasche sterisch keinen Platz für die Methylgruppe von SAM bereitstellt.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit drei verschiedene Ligand bindende RNA-Strukturen untersucht, die alle sehr unterschiedliche Strategien zur Bindung der Liganden nutzen. Obwohl Portionierungen bei Aptameren und Riboswitches selten beschrieben wurden, haben sie eine maßgebliche Funktion in den beiden zuerst untersuchten Strukturen. Obwohl bisher im Hinblick auf alle bekannten RNA Strukturen eher selten beschrieben, gibt es doch neben den genannten zwei, einige Beispiele für strukturelle oder funktionelle Protonierungen. Auch in Hinblick auf zukünftige bzw. Verbesserung bestehender RNA-Strukturvorhersage-Programme ähnlich wie sie für Proteine schon lange nutzt werden, müssen protonierte Nukleobasen ernsthaft in Betracht gezogen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass zwei der untersuchten Riboswitches zwei Liganden mit ähnlicher Affinität binden. Die genutzte Strategie ist hierbei unterschiedlich. Während bei den promiskuitiven CDN Riboswitches der regulatorische Nutzen noch unbekannt ist, konnte für den SAM/SAH Ribsowitch gezeigt werden, dass SAH nur zufällig aufgrund der wahrscheinlich sehr niedrigen intrazellulären Konzentration gebunden wird und dieser daher wahrscheinlich später in der evolutionären Entwicklung entstanden ist. Riboswitches halten es weiterhin spannend.
Non-ribosomal peptide synthetase docking domains : structure, function and engineering strategies
(2021)
Non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) are known for their capability to produce a wide range of natural compounds and some of them possess interesting bioactivities relevant for clinical application like antibiotics, anticancer, and immunosuppressive drugs. The diverse bioactivity of non-ribosomal peptides (NRPs) originates from their structural diversity, which results not only from the incorporation of non-proteinogenic amino acids into the growing peptide chain, but also the formation of heterocycles or further peptide modifications like methylation, hydroxylation and acetylation.
The biosynthesis of NRPs is achieved via the orchestrated interplay of distinct catalytic domains, which are grouped to modules that are located on one or more polypeptide chains. Each cycle starts with the selection and activation of a specific amino acid by the adenylation (A) domain, which catalyzes the aminoacyl adenylate formation under ATP consumption. This activated amino acid is then bound via a thioester bond to the 4’-phosphopantetheine cofactor (PPant-arm) of the following thiolation (T) domain. Before substrate loading, the PPant-arm is post-translationally added to the T domain by a phosphopantetheinyl transferase (PPTase), which converts the inactive apo-T domain in its active holo-form. In the last step of the catalytic cycle, two T domain bound peptide building blocks are connected by the condensation (C) domain, resulting in peptide bond formation and transfer of the nascent peptide chain to the following module. Each catalytic cycle is performed by a C-A-T elongation module until the termination module with a C-terminal thioesterase (TE) domain is reached. Here, the peptide product is released by hydrolysis or intramolecular cyclisation.
In comparison to single-protein NRPSs, where all modules are encoded on a single polypeptide chain, multi-protein NRPS systems must also maintain a specific module order during the peptide biosynthesis. Therefore, small C-terminal and N-terminal communication-mediating (COM) domains/docking domains (DD) were identified in the C- and N-terminal regions of multi-protein NRPSs. It was shown that these domains mediate specific and selective non-covalent protein-protein interaction, even though DD interactions are generally characterized by low affinities.
The first publication of this work focuses on the Peptide-Antimicrobial-Xenorhabdus peptide-producing NRPS called PaxS, which consists of the three proteins PaxA, PaxB and PaxC. Here, in particular the trans DD interface between the C-terminal attached DD of PaxB and N-terminal attached DD of PaxC was structurally investigated and thermodynamically characterized by isothermal titration calorimetry (ITC), yielding a dissociation constant (KD) of ~25 µM, which is a DD typical affinity known from further characterized DD pairs. The artificial linking of the PaxB/C C/NDD pair via a glycine-serine (GS) linker facilitated the structure determination of the DD complex by solution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. In comparison to known docking domain structures, this DD complex assembles in a completely new fold which is characterized by a central α-helix of PaxC NDD wrapped in two V-shaped α-helices of PaxB CDD.
The first manuscript of this work focuses on the application of synthetic zippers (SZ) to mimic natural docking domains, enabling the easy assembly of NRPS building blocks encoded on different plasmids in a functional way. Here, the high-affinity interaction of SZs unambiguously defines the order of the synthetases derived from single-protein NRPSs in the engineered NRPS system and allows the recombination in a plug-and-play manner. Notably, the SZ engineering strategy even facilitates the functional assembly of NRPSs derived from Gram-positive and Gram-negative bacteria. Furthermore, the functional incorporation of SZs into NRPS modules is not limited to a specific linker region, so we could introduce them within all native NRPS linker regions (A-T, T-C, C-A).
The second publication and the second manuscript of this thesis again focus on the multi-protein PaxS, in particular on the trans interface between the proteins PaxA and PaxB on a molecular level by solution NMR. Therefore, the PaxA CDD adjacent T domain was included into the structural investigation besides the native interaction partner PaxB NDD. Before a three-dimensional structure could be obtained from NMR data, the NH groups located in the peptide bonds had to be assigned to the respective amino acids of the proteins (backbone assignment). Based on these backbone assignments, the secondary structure of PaxA T1-CDD and PaxB NDD in the absence and presence of the respective interaction partner were predicted.
The structural and functional characterization of the PaxA T1-CDD:PaxB NDD complex is summarized in manuscript two. The thermodynamic analysis of this complex by ITC determined a KD value of ~250 nM, whereas the discrete DDs did not interact at all. The high-affinity interaction allowed to determine the solution NMR structure of the PaxA T1-CDD:PaxB NDD complex without the covalent linkage of the interaction partners and an extended docking domain interface could be determined. This interface comprises on the one hand α-helix 4 of the PaxA T1 domain together with the α-helical CDD, and on the other hand the PaxB NDD, which is composed of two α-helices separated by a sharp bend.
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A promising strategy to reduce the dependency from fossil fuels is to use the yeast Saccharomyces cerevisiae to bioconvert renewable non-food feedstocks or waste streams, like lignocellulosic biomass, into bioethanol and other valuable molecule blocks. Lignocellulosic feedstocks contain glucose and significant fractions of the pentoses xylose and arabinose in varying proportions depending on the biomass type. S. cerevisiae is an efficient glucose consumer, but it cannot metabolize xylose and arabinose naturally. Therefore, extensive research using recombinant DNA techniques has been conducted to introduce and improve the biochemical pathways necessary to utilize these non-physiological substrates. However, any functional pathway capable of metabolizing D xylose and L arabinose in S. cerevisiae requires the transport of these sugars across the plasma membrane. The endogenous sugar transport system of S. cerevisiae can conduct a limited uptake of D-xylose and L-arabinose; this uptake enables only basal growth when the enzymatic pathways are provided. For this reason, the uptake of D xylose and L-arabinose has been recognized as a limiting step for the efficient utilization of these non-physiological substrates.
Gal2, a member of the major facilitator superfamily, is one of the most studied hexose transporters in S. cerevisiae. Although its expression is repressed in the presence of glucose, it also transports this sugar with high affinity when constitutively expressed. Recent efforts to engineer yeast strains for the utilization of plant biomass have unraveled the ability of Gal2 to transport non-physiological substrates like xylose and arabinose, among others. Improving Gal2 kinetic and substrate specificity, particularly for pentoses, has become a crucial target in strain engineering. The main goal of this study is to improve the utilization of xylose and arabinose by increasing the cell permeability of these non physiological substrates through the engineering of the galactose permease Gal2.
GAL2 gene expression depends on galactose, which acts as an inducer; nevertheless, even in the presence of galactose, glucose act as a strict repressor; consequently, GAL2 gene is usually placed under the control of a constitutive promoter. However, the presence of glucose additionally triggers the Gal2 degradation, which is mediated by the covalent attachment of the small 76 amino acid protein ubiquitin (Ub) to the targeted transporter; in a multi-step process called ubiquitination.
Ubiquitination of hexose permeases involves the activation of the Ub molecule by the E1 Ub-activating enzyme using ATP; then, the activated Ub is transferred to a specific Ub-conjugating enzyme E2, which donates the Ub indirectly through a specific HECT E3 enzyme (Rsp5) to a lysine residue of the substrate, with the aid of an adaptor protein which recognizes the target (Rsp5-adaptor). Ubiquitinated permeases are sent by membrane invagination to early endosomes, where they encounter ESCRTs (endosomal sorting complex required for transport). The targeted permeases are sorted in intralumenal vesicles (ILV) inside of the endosome, which after several cycles, turns into a multivesicular body (MVB) that subsequently fuses with the vacuole to expose the protein content of the ILVs to lumenal hydrolases for degradation.
Gal2 contains 30 lysine residues that may accept the ubiquitin molecule, which targets its degradation. It is known that mono-ubiquitination by Rsp5 on multiple lysine residues is necessary to internalize Gal2 (Horak & Wolf, 2001). However, the authors did not identify the specific lysine residues involved in the ubiquitination processes. This study screened several Gal2 variants where lysine residues were mutated or removed from the protein sequence to discover which lysine residues are likely involved in ubiquitination and consequent turnover of the transporter. The results of the screening showed that mutation of the N terminal lysine residues 27, 37, and 44 to arginine (Gal23KR) produced a functional transporter that, when fused with GFP (Gal23KR_GFP), showed an exclusive localization at the plasma membrane in cells growing in galactose or glucose as a sole carbon source (Tamayo Rojas et al., 2021b).
This study furthermore evaluated upstream signals caused by phosphorylation which triggers ubiquitination and consequent turnover of the targeted protein; using similar screening approaches to assess the stabilization of Gal2 by lysine residue modifications, it was possible to identify that N terminal serine residues 32, 35, 39, 48, 53, and 55 are likely involved in the internalization of Gal2, since a Gal2 construct where all these serines were mutated to alanine residues and tagged with GFP (Gal26SA_GFP) exhibited practically complete localization at the plasma membrane in cells growing in galactose or glucose as a sole carbon source (Tamayo Rojas et al., 2021b)...
In view of a growing world population and the finite nature of fossil resources, the development of eco-friendly production processes is essential for the transition towards a sustainable industry. Methanol, which can be produced both petrochemically and from renewable resources, offers itself as bridging technology and attractive alternative raw material for biotechnological processes. This work describes developments for the progress of the well-studied methylotrophic α proteobacterium Methylorubrum extorquens AM1 towards an efficient methylotrophic cell factory. Although many homologous and heterologous production routes have already been described and realized for M. extorquens in a laboratory scale, no industrial process has yet been realized. Three major reasons can be identified for this: (1) A limited choice of tools for genetic modifications, (2) a lack of understanding of carbon fluxes and side reactions occurring in modified strains, such as product reimports, and (3) the lack of tailored production strains for profitable target products and optimized bioprocessing protocols. The aim of the present work was to achieve developments for the mentioned areas. As a model application, the high-level production of chiral dicarboxylic acids from the substrate methanol was chosen. Enantiomerically pure chiral compounds are of great interest, e.g., as building blocks for chiral drugs. The ethylmalonyl CoA metabolic pathway (EMCP) which is part of the primary metabolism of M. extorquens, harbors unique chiral CoA-ester intermediates. Their acid derivatives can be released by cleavage of the CoA-moiety using heterologous enzymes. The dicarboxylic acids 2 methylsuccinic acid and mesaconic acid were produced in a previous study by introducing the heterologous thioesterase YciA into M. extorquens. In the said study, a combined product titer of 0.65 g/L was obtained in shake flask experiments. These results serve as the basis for the developments in the present work.
First, the previously described reuptake of products was thoroughly investigated and dctA2, a gene encoding for an acid transporter, was identified as target for reducing the product reuptake. In addition, reuptake of mesaconic acid was prevented by converting it to (S)-citramalic acid, a product not metabolizable by M. extorquens, by the introduction of a heterologous mesaconase. Together with 2-methylsuccinic acid, for which a high enantiomeric excess of (S)-2-methylsuccinic acid was determined, a second chiral molecule was thus added to the product spectrum. For the release of dicarboxylic acid products, YciA, a broad-range thioesterase that accepts a variety of CoA-esters with different chain lengths as substrates, was chosen. The enzyme should theoretically be able to hydrolyze all CoA-esters of interest present in the EMCP. However, in culture supernatants of M. extorquens strains that were overexpressing the corresponding yciA gene, only mesaconic acid and 2 methylsuccinic acid could be detected. To expand the substrate spectrum of YciA thioesterase with respect to other EMCP intermediates, semi-rational enzyme engineering was attempted. Screening of the corresponding strains carrying the respective YciA variants did not result in strains capable of producing new dicarboxylic acid products. However, the experiments revealed an amino acid position that strongly affected the production of mesaconic acid and 2-methylsuccinic acid in vivo. By substituting the according amino acid in YciA, the maximum titers of mesaconic acid and 2-methylsuccinic acid could be increased substantially. Application of an improved thioesterase variant in a second E. coli-based process confirmed the enhanced activity of the enzyme. The desired extension of the product spectrum by another chiral molecule (2-hydroxy-3-methylsuccinic acid, presumably the (2S,3R)-form) was finally achieved by using an alternative thioesterase. Tailored fermentation strategies were developed for the high-level production of the above-mentioned products.
As second part of the work, two novel genetic tools for M. extorquens were developed and characterized. The pBBR1-derived plasmid pMis1_1B was shown to be stably maintained in M. extorquens cells. In addition, its suitability for co-transformations with other plasmids was demonstrated. The second tool, the cumate-inducible promoter Ps6, is tailored for expression of pathways with toxic products, as the transcription of genes controlled by Ps6 is strongly repressed in the absence of an inducer.
Overall, the present work demonstrates the enormous potential of using M. extorquens as a methylotrophic cell factory. In the applications shown, the biotechnological production of high-priced chiral molecules is combined with the use of an attractive alternative substrate. In addition, new achievements and approaches are presented to facilitate the development of future M. extorquens production strains.
In conclusion, I described for the first time the in vivo functions of PAK2 during cardiac development and its requirement for heart contractility
AIM1 – Characterization of Pak2a and Pak2b functions during cardiovascular system development: description of the phenotype triggered by the loss of expression of pak2b in the pak2a mutant Firstly, in addition to the confirmation of the published data regarding the pak2a mutant and morphant phenotype, I showed that pak2bbns159 mutant does not exhibit morphological defects, neither in the ISV formation nor in the brain vascular patterning. More importantly, I analyzed in more details the phenotypic consequences of pak2a and pak2b loss of expression in the trunk and brain vasculatures. Indeed, the lack of blood flow in the embryos, was associated with central arteries migration defects and reduced lumen in these central arteries and the ISVs. Moreover, pak2a and pak2b loss of expression resulted in cardiac failure.
AIM2 – Role of Pak2 on cardiac contractility From 40 -46 hpf, I found a weaker heart contractility in the pak2ami149/mi149;pak2bbns159/bns159. Although, the PAK proteins have been shown to impact the actin cytoskeleton organization, the heart morphological defects associated with the altered contractility, were not associated with acto-myosin filament reorganization. However, by analyzing in more details the structure of the sarcomeres, I was able to demonstrate that the proteins constituting the sarcomeres were strongly affected and showed an altered spatial organization. Then, I also described the effects of the loss of expression of both paralogs on the junctional protein localization. I demonstrated the loss of Pak2 function resulted in junction protein rearrangement in the cardiomyocytes in the pak2ami149/mi149;pak2bbns159/bns159 mutants at 40 and 46 hpf.
Thus, I was able for the first time to demonstrate in vivo PAK2 functions during cardiac development and its requirement for proper cardiac contractility activity.
AIM3 – Decipher mechanism of Pak2 signaling cascade involved during cardiac development Both pak2a and pak2b WT mRNAs were able to rescue the pak2ami149/mi149;pak2bbns159/bns159 mutant heart defects and the results indicated that these paralogs share overlapping function during cardiac development. Moreover, although I was not able to examine the control transgenic lines, myocardial and endothelial specific pak2a overexpression did not ameliorate the mutant cardiac deficiency. Thus,the absence of rescue by reactivating pak2a in cardiomyocytes indicates a non-cell autonomous function of Pak2a on cardiomyocytes.
For the first time, this study allowed to follow PAK2 in vivo functions during cardiovascular development. More importantly, its role on heart contractility regulation would enable further investigations to generate new tools for the treatment of cardiomyopathies.
The intensive use of the North Sea area through offshore activities, sand mining, and the spreading of dredged material is leading to increasing pollution of the ecosystem by chemicals such as hydrophobic organic contaminants (HOCs). Due to their toxicological properties and their ability to accumulate in the environment, HOCs are of particular concern. The contaminants partition between aqueous (pore water, overlying water) and solid phases (sediment, suspended particulate matter, and biota) within these systems. The accumulated contaminants in the sediment are of major concern for benthic organisms, who are in close contact with sediment and interstitial water. It is thus particularly important to better understand how contaminants interact with biota, as these animals may contribute to trophic transfer through the food web. Furthermore, sediments are a crucial factor for the water quality of aquatic systems. They not only represent a sink for contaminants but also determine environmental fate, bioavailability, and toxicity. The Marine Strategy Framework Directive (MSFD) was introduced to protect our marine environment across Europe and includes the assessment of pollutant concentrations in the total sediment, which, however, rarely reflects the actual exposure situation. The consideration of the pollutant concentrations in the pore water is not implemented, although this is needed for the evaluation of bioavailability and risk assessment. For this reason, special attention is given to further development, implementation, and validation of pollutant monitoring methods that can determine the bioavailable fraction in sediment pore water. For risk assessment purposes, it is furthermore important to use biological indicators in addition to classical analytics to determine the effect of pollutants on organisms. The main objective of this thesis was to gain insight into the pollution load and the potential risk of hydrophobic organic chemicals (HOCs) in the sediment of the North Sea and to evaluate these results with regard to possible risks for benthic organisms and the ecosystem. The following five aims are covered within these studies to gain a holistic assessment of sediment contamination:
1. Assessment of the pore water concentrations of PAHs and PCBs
2. Determination of the bioturbation potential by macrofauna analysis
3. Application of the SPME method on biological tissue
4. Assessment of recreated environmental mixtures in passive dosing bioassays
5. Development of SPME method for DDT in sediments
The thesis is comprised of three main studies supported by three additional studies ...
Phenology is the study of periodic life cycle events of living organisms and how these are influenced by environmental factors. Late phenological phases such as the timing of seed release and subsequent seed dispersal considerably affect ecology and evolution in plants. Since plants are mostly sessile organisms, seed dispersal is a crucial life cycle event for the ecology and evolution of plants. In fact, long-distance seed dispersal (LDD) is a very complex process in plant biology and significantly shapes the spatial and temporal dynamics of plant populations. For example, wind dispersal in plants is influenced by a variety of factors such as plant traits, habitat type and environmental conditions (e.g. wind speed). Considering the variability of wind conditions throughout the year, the timing of seed release and dispersal is known to have considerable effects on LDD. Even though late phenologies such as ripening duration and timing of seed release and subsequent dispersal are vital in estimating ecologically highly relevant LDD, these phenologies are not appropriately addressed in ecological research. The aim of this thesis is to gain insights into the factors that shape late plant phenologies. In particular, we address the following questions: which ecologically or evolutionary parameters drive the ripening process of plant species? How does the seasonal variability of wind affect the seed release phenology of plant species? How do these factors interact for plant species in different habitat types?
In order to address these questions, we applied different methodological approaches, ranging from fieldwork and monitoring phenology to computational simulation studies and statistical modeling. To study the ripening process of species, we monitored the flowering, ripening and seed release phenology of more than 100 Central European plant species. We conducted computational simulation studies for estimating LDD by wind to study the phenology of seed release and the parameters determining LDD by wind. In conjunction with phenological data from literature, we used the obtained simulation results to investigate evidence for the existence of phenological adaptations towards LDD in 165 plant species. Further, we used the results from simulation studies of LDD by wind to disentangle the effects of species, habitat types and meteorological conditions and their interactions on the spatial spread of plant species.
The results of the relationship between plant traits, phylogeny, the ripening process and climatic factors provide insights into the basic understanding of the ripening process of plants. We identified ecological factors that shape species’ ripening phenology and seed release timing. In particular, we suggest that the species’ seed weight, life form and phylogeny shapes ripening and seed release phenology. With the statistical models on species’ temperature demands for reproduction, we introduce data that that are well suitable for parametrization and further development of plant dispersal models. The results from the simulation study based on a seasonal perspective showed that heavier seeded tree species with medium wind dispersal potential (including genera Abies, Acer, Fraxinus and Larix) have a clear synchronisation of seed abscission with periods favouring LDD. These species, which are both ecologically and economically important, showed significant synchronisation of the highest rate of seed release with high wind-speed that promoted LDD by wind in wintertime. For the tree species mentioned, we suggest strong seasonal synchronisation as evidence for phenological adaptations in order to match favourable conditions during seed release. With a closer look at the wind conditions that promote LDD by wind, our results showed considerable differences in how specific wind conditions affect LDD in different species and habitat types. We suggest that LDD by wind in species from open habitats with high wind dispersal potential is likely to be driven by thermal updrafts that are mainly driven by the sun providing energy to the ground. By contrast, LDD of heavier-seeded species from open and forested habitats is more likely to be driven by storms that produce shear-driven turbulence. The results from this thesis contribute to an increased understanding of the complete dispersal process of plants and to making more realistic projections of (future) plant distribution.
The results obtained on factors driving ripening and release phenology provide valuable insights into their ecological and phylogenetic factor constraints. The implementation of more realistic assumptions in assessing species’ dispersal potential throughout the year could help considerably in improving landscape management (e.g. timing of mowing) and in the conservation of plant populations. The evidence found for phenological adaptations towards LDD in plants is an important step in understanding the evolutionary basis of LDD in these species.
Freshwater is one of the most fundamental resources for life and is the habitat for a wide diversity of species. One of the most diverse aquatic insect taxa is Trichoptera Kirby, 1813, caddisflies. These semi-aquatic insects have aquatic larvae and terrestrial adults and are found all around the globe in freshwater habitats. Water is also one of the most important natural resources for the human population, but alarmingly, freshwaters are among the most threatened natural habitats. Thus, the monitoring and preservation of the quality of freshwater habitats should have a high priority. In order to track changes in the biota a baseline reference is necessary, but freshwater biodiversity is under-studied in many parts of the Earth such as the biodiversity hotspots of the Himalaya and the Hengduan Mountains. This thesis treats the trichopteran genus Himalopsyche Banks, 1940 (Rhyacophilidae) which has its diversity center in the Himalayas and the Hengduan Mountains. Himalopsyche larvae are large and conspicuous and only occur in clean, unpolluted streams. This makes Himalopsyche potentially suited as indicator organisms for freshwater quality monitoring, but taxonomic knowledge is yet insufficient. Based on samples from a field survey in the Hengduan Mountains targeting both larvae and adults I uncovered three new Himalopsyche species which are described in this thesis (Chapter II), and with the aid of molecular data I associated larvae of Himalopsyche to adult species (Chapter I). The molecular association enabled the first comparative morphological study of Himalopsyche species in the larval stage, and the morphological study in Chapter II revealed that there are four distinct larval types of Himalopsyche. However, no diagnostic characters to identify Himalopsyche larvae to species level were found. To understand Himalopsyche larval morphology from an evolutionary perspective, I reconstructed the first molecular phylogeny of the genus (Chapter III). This demonstrated that each larval type corresponds to a deep phylogenetic split, indicating that larval types evolved early in Himalopsyche evolution and remained constant since. Based on the phylogenetic results as well as larval and adult morphology, I re-defined five species groups of Himalopsyche: H. kuldschensis Group, H. lepcha Group, H. navasi Group, H. phryganea Group, and H. tibetana Group. The species groups differ with respect to their diversity centers. The monotypic H. lepcha Group resides in the Himalayas, and the monotypic H. phryganea Group inhabits Western Nearctic. The H. kuldschensis and H. tibetana Groups are geographically overlapping with distributions in the Himalayas, but the distribution of H. kuldschensis Group stretches more to the west to include the Tian Shan, and the H. tibetana Group is more concentrated around the eastern Himalayas and the Hengduan Mountains. The H. navasi Group has a more eastern distribution than most Himalopsyche including isolated areas such as Japan and Indonesia. The earliest split in Himalopsyche divides the H. navasi Group from remaining Himalopsyche, suggesting a more eastern area of origin of Himalopsyche than its current diversity center, with subsequent radiations in the Himalayas and Hengduan Mountains. In addition to the three chapters, in this thesis I discuss further aspects of Himalopsyche biology including genital evolution, species complexes, and Himalopsyche ecology.
Taxa under scrutiny in this thesis are Halophytophthora-like oomycetes. The genus Halophytophthora, proposed in 1990, is an assemblage of unrelated species grouped together on the basis habitat preference, i.e. the mangrove or saltmarsh biome, and morphological similarity to Phytophthora. The premise “Phytophthora-like species from the mangrove environment” became the genus concept for Halophytophthora and lasted for almost 2 decades which resulted to the addition of several species (i.e. H. elongata, H. exoprolifera, H. porrigovesica, H. kandeliae, H. masteri, and H. tartarea). At the onset of molecular phylogenetics, Halophytophthora was inferred as a highly polyphyletic taxon and the genus concept was found to be unsuitable. This thesis adds to this, since six Phytophthora spp. were isolated from the mangrove environment, two of which were found in the Philippines (Phytophthora elongata and Phytophthora insolita). After a thorough assessment of the morphologic and phylogenetic data of taxa included in this thesis, several taxonomic novelties were introduced – a new family (Salispinaceae), a new genus (Calycofera), new species (Calycofera cryptica, Phytopythium dogmae, Phytopythium leanoi, Salisapilia coffeyi, and Salispina hoi), and new combinations (Calycofera operculata, Salisapilia bahamensis, S. elongata, S. epistomia, S. masteri, S. mycoparasitica). In addition, Salisapiliaceae and Salisapilia were emended.
Seed dispersal is a key ecosystem function for plant regeneration, as it involves the movement of seeds away from the parental plants to particular habitats where they can germinate and transition to seedlings and ultimately adult plants. Seed dispersal is shaped by a diversity of abiotic and biotic factors, particularly by associations between plants and climate and between plants and other species. Due to the ongoing loss of biodiversity and changing global conditions, such interactions are prone to change and pose a severe threat to plant regeneration. One way to address this challenge is to study associations between plant traits and abiotic and biotic factors to understand the potential impacts of global change on plant regeneration. Plant communities have long been analyzed through the lens of vegetative traits, mainly ignoring how other traits interact and respond to the environment. For instance, while associations between vegetative traits (e.g., specific leaf area, leaf nitrogen content) and climate are well studied, there are few case studies of reproductive traits in relation to trait-environment associations in the context of global change.
Thus, the overarching aim of this dissertation is to explore how trait-environment associations, with a special focus on reproductive traits, can improve our understanding of the effect that global change may have on seed dispersal, and ultimately on plant regeneration. To this end, my research focuses on studying associations between plant traits and abiotic and biotic factors along an elevational gradient in both forests and deforested areas of tropical mountains. This dissertation addresses three principal research objectives.
First, I investigate the extent to which reproductive (seed and fruit traits) and vegetative traits (leaf traits) are related to abiotic and biotic factors for communities of fleshy-fruited plants in the Ecuadorian Andes. I used multivariate analyses to test associations between four (a)biotic factors and seven reproductive traits and five vegetative traits measured on 18 and 33 fleshy fruited plant species respectively. My analyses demonstrate that climate and soil conditions are strongly associated with the distribution of both reproductive and vegetative traits in tropical tree communities. The production of “costly” vs. “cheap” seeds, fruits and leaves, i.e., the production of few rewarding fruits and acquisitive leaves versus the production of many less-rewarding fruits and conservative leaves, is primarily limited by temperature, whereas the size of plant organs is more related to variation in precipitation and soil conditions. My findings suggest that associations between reproductive and vegetative traits and the abiotic environment follow similar principles in tropical tree communities.
Second, I assess how climate and microhabitat conditions affect the prevalence of endozoochorous plant species in the seed rain of tropical montane forests in southern Ecuador. I analyzed seed rain data for an entire year from 162 traps located across an elevational gradient spanning of 2000 m. I documented the microhabitat conditions (leaf area index and soil moisture next to each seed trap) at small spatial scale as well as the climatic conditions (mean annual temperature and rainfall in each plot) at large spatial scale. After a one-year of sampling, I counted 331,838 seeds of 323 species/morphospecies. My analyses demonstrate that the prevalence of endozoochorous plant species in the seed rain increases with temperature across elevations and with leaf area index within elevations. These results show that the prevalence of endozoochory is shaped by the interplay of both abiotic and biotic factors at large and small spatial scales.
Third, I examine the potential of seed rain to restore deforested tropical areas along an elevational gradient in southern Ecuador. For this chapter, I collected seed rain using 324 seed traps installed in 18 1-ha plots in forests (nine forest plots) and in pastures (nine deforested plots) along an elevational gradient of 2000 m. After a sampling period of three months, I collected a total of 123,039 seeds of 255 species/morphospecies from both forests and pastures along the elevational gradient. I did not find a consistent decrease in the amount and richness of seed rain between forests and pastures, but I detected a systematic change in the type of dispersed seeds, as heavier seeds and a higher proportion of endozoochorous species were found in forests compared to pastures at all elevations. This finding suggests that deforestation acts as a strong filter selecting seed traits that are vital for plant regeneration.
Understanding the role that trait-environment associations play in how plant communities regenerate today could serve as a basis for predicting changes in regeneration processes of plant communities under changing global conditions in the near future. Here, I show how informative the measurement of reproductive traits and trait environment associations are in facilitating the conservation of forest habitats and the restoration of deforested areas in the context of global change.
The production of ribosomes is a complicated multistep, that is susceptible to changes occurring within the cell and its environment. The process itself requires many proteins, known as ribosome biogenesis factors (RBFs) and many non-coding RNAs like the small nucleolar RNAs (snoRNAs). While RBFs are required for the accurate processing of the pre-rRNA into mature rRNAs, the snoRNAs act to coordinate and guide enzymes for post-transcriptional modifications, chiefly 2´-O-ribose methylation and pseudouridylation. While ribosome biogenesis is mostly described in human and yeast model eucaryotes, similar detailed studies in the model plant Arabidopsis thaliana are far less explored and understood. Furthermore, for many experimentally confirmed modification sites the according snoRNAs and for many pre-rRNA processing steps the responsible RBFs are missing. Therefore, it is expected that a high number of snoRNAs and RBFs are not identified till yet. For this reason, RNA-deep sequencing was performed in order to identify novel snoRNAs and MS analysis data of nucleoli and nuclei of A. thaliana from a former PhD student were used in order to find new proteins involved in pre-rRNA processing.
In here, it is shown that with RNA deep-sequencing still new snoRNAs and snRNAs can be identified and that detection of predicted snoRNAs can be fulfilled with a) antisense oligonucleotides tagged with fluorescence dyes and b) with radioactive labeled antisense probes. Furthermore, a secondary structure map of the 60S and 40S subunit highlighting the predicted and moreover verified modification sites in 5.8S, 25S and 18S rRNA was created. Especially, the correlation between the modification sites and the guiding snoRNA is highlighted further shedding light on overview about current pre-rRNA modification sites and corresponding guiding snoRNAs. The next chapter reveals the complex and multi-layered existence of the 5.8S rRNA and its numerous precursors. The mutant prp24 (also known as seap1) encoding AtPRP24, is recognized as factor being important for splicing as it is promoting the recruitment of the U4 and U6 snRNAs to the spliceosome. In here, it was found that AtPRP24 is involved in processing of 5.8S rRNA precursors, recognizable by precursors that are over accumulating in the mutant. Moreover, it could be shown for the first time that the plant-specific precursor 5´-5.8S is exported to the cytoplasm, where final cleavage steps of 5.8S rRNA takes place. In the prp24.2 mutant, this precursor is exported at an increased rate to the cytoplasm, where it can be detected in the actively translating ribosomes (polysomes). A lower sensitivity of the mutant seeds to cycloheximide (CHX) suggests that due to the extension at the 5´-end of 5.8S, the structure of the 60S subunit has altered CHX binding. In conclusion, this work highlights the importance and complexity of 5.8S rRNA and its precursors for ribosome biogenesis and displays new insights into pre-rRNA processing in A. thaliana.
Polyploidie in Prokaryoten
(2018)
Diese Arbeit teilt sich in drei Teile auf, die sich mit der Regulation der Polyploidie sowie mit der Genkonversion als evolutionären Vorteil von Polyploidie in Haloferax volcanii beschäftigen.
Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde der Einfluss der DNA-Replikationsinitiatorproteine Orc1/Cdc6 auf das Ploidielevel untersucht. Hierbei konnte anhand von Deletionsmutanten zunächst gezeigt werden, dass lediglich drei der 16 Orc1/Cdc6-Proteine in H. volcanii essentiell sind. Bestimmung des Ploidielevels mittels qPCR-Analyse ergab, dass jedes der 12 untersuchten Orc1/Cdc6-Proteine das Ploidielevel mindestens eines Replikons beeinflusst und dementsprechend sowohl die mit einem Replikationsursprung assoziierten als auch die „verwaisten“ Orc1/Cdc6-Proteine eine Funktion haben. Die mit einem Replikationsursprung assoziierten Orc1/Cdc6-Proteine hatten hierbei keinen größeren Einfluss auf das Ploidielevel als die „verwaisten“. Zusätzlich konnte durch Wachstumsanalysen in Mikrotiterplatten gezeigt werden, dass die meisten Deletionsmutanten unter allen getesteten Bedingungen ein mit dem Wildtyp vergleichbares oder besseres Wachstum zeigen. Eine Deletionsmutante eines Orc1/Cdc6-Proteins hingegen zeigte nur verbessertes Wachstum bei Glukose als Kohlenstoffquelle, was ein Hinweis auf die Verwendung verschiedener Orc1/Cdc6-Proteine unter verschiedenen Bedingungen sein könnte. Zusätzlich wurden zwei mit dem Replikationsursprung assoziierte Orc1/Cdc6-Proteine überexprimiert und via ihres N-terminalen His-Tag im Western-Blot nachgewiesen, sodass diese nun für Co-Affinitätsaufreinigungen zur weiteren Charakterisierung des komplexen Zusammenspiels der Orc1/Cdc6-Proteine zur Verfügung stehen.
Im Rahme des zweiten Teils der Arbeit wurde der Einfluss der in der 5‘-Region der der Replikationsursprünge ori1 und ori2 kodierten Proteine auf Wachstum und die Kopienzahl des Hauptchromosoms bestimmt. Zunächst wurde die Expression der drei in Haloarchaea hoch-konservierten oap-Gene upstream von ori1 mittels Nothern-Blot untersucht und es konnte gezeigt werden, dass das oap-Operon tatsächlich als Operon abgelesen wird. Um alle Gene in den 5‘-Regionen von ori1 und ori2 genauer zu charakterisieren, wurden induzierbare Überexpressionsmutanten im Wildtyp-Hintergrund angefertigt. Es konnte mittels Wachstumsversuchen in Mikrotiterplatten gezeigt werden, dass bei Induktion von Beginn an die Überexpression der Hef-Helikase und des oapB-Proteins zu einem starken Wachstumsdefekt führen, die von oapC und HVO_1724 zu einem moderaten Wachstumsdefekt, wohingegen für die Überexpressionsmutante von oapA vergleichbares Wachstum zum Wildtyp und für die Überexpression der Rad25d-Helikase verbessertes Wachstum beobachtet werden konnte. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass sowohl die Deletion als auch die Überexpression der Helikasen keinen Einfluss auf das Ploidielevel hat; die Deletion von oapC führt jedoch zu einer Reduktion der Genomkopienzahl in exponentieller und stationärer Phase, was ein erster Hinweis darauf ist, dass das oap-Operon eine Rolle bei der Regulation des Ploidielevels spielen könnte.
Im dritten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um Genkonversion farblich sichtbar zu machen. Hierbei wurde sich H. volcaniis Carotinoidbiosynthese zu Nutze gemacht. Es wurden zwei verschiedene, auxotrophe Elternstämme mittels Protoplastenfusion verschmolzen, um eine heterozygote Tochterzelle zu erzeugen. Ein Genkonversionsereignis wurde durch einen roten Keil angezeigt, der aus einer weißen Kolonie wuchs und durch die erfolgreiche Reparatur des Carotinoidbiosynthesegens entstand. Es wurden insgesamt 8525 Klone ausgestrichen und 0,14 % der Kolonien zeigten eine entsprechende rote Färbung. Das Proof-of-Principle dieser Methode ist in damit in dieser Arbeit gelungen. Um die Genkonversion in den weißen Kolonien auf genetischer Ebene genauer zu untersuchen, wurde PCR verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass in den Zellen aller 135 untersuchten Kolonien Genkonversion stattgefunden hatte und zwar so effizient, dass nur in seltenen Fällen Heterozygotie vorlag. Unter Selektionsdruck stehende Loci hatten in beiden untersuchten Fällen eine starke Präferenz in Richtung Homozygotie und Erhalt der Prototrophie. Für nicht unter Selektionsdruck stehende Loci konnte gezeigt werden, dass die Hälfte der untersuchten Kolonien dem Elternstamm 1 glich, während die andere Hälfte dem Elternstamm 2 glich. Auch hier waren die Zellen nur in seltenen Fällen homozygot.
By far not all genetic information is expressed by mRNA coding regions of the DNA. 98% of the human genome is not encoding for proteins. Therefore, these non-coding regions have been considered as “junk DNA” for a long time [1, 2]. The last years, new high throughput sequencing techniques have allowed the elucidation of the heterogeneous population of non-coding RNAs (ncRNAs, Table 1). RNAs longer than 200 nucleotides (nt) belong to the family of long non-coding RNAs (lncRNAs). They can exhibit numerous functions: The biggest family of RNAs is represented by the ribosomal RNAs (rRNAs). Together with the transfer RNAs (tRNAs) they are essential for the translation of mRNA into an amino acid sequence.
In welchen Situationen steht ein Tier unter Stress und wie beeinflusst Stress dessen Wohlbefinden? Dies sind die Kernfragen, mit denen Zoos konfrontiert sind, wenn es darum geht, den Bedürfnissen ihrer Tiere gerecht zu werden. Die Beantwortung dieser Fragen ist jedoch angesichts der großen individuellen Variabilität des Inputs, der Stress hervorrufen kann,und des Outputs, der das Wohlbefinden bestimmt, eine Herausforderung. Um diese Herausforderung zu meistern, brauchen Zoos Kenntnisse darüber, welche Haltungsbedingungen und Managementsituationen Verhaltens-, physiologische oder emotionale Veränderungen hervorrufen, sowohl positive als auch negative. Dies trifft insbesondere auf Arten zu, die aufgrund ihrer Biologie und des großen öffentlichen Interesses große Anforderungen an das Management in Menschenobhut stellen, wie den Afrikanischen Elefanten. Die vorliegende Arbeit hatte daher das Ziel, unter Berücksichtigung der individuellen Variation die Auswirkungen bestimmter Managementsituationen auf physiologischen Stress und das Wohlbefinden der Tiere zu evaluieren.
Für diese Arbeit wurden zehn Afrikanische Elefanten aus drei Zoos im Rahmen eines Experiments in 2016 und 2017 mehrmals untersucht. Dieses Experiment umfasste zum einen die Messung von physiologischem Stress auf der Basis der Konzentration des „Stresshormons“ Cortisol im Speichel der Elefanten. Zu diesem Zweck wurden an bestimmten Tagen und zu folgenden Zeitpunkten Speichelproben entnommen: morgens, nachmittags vor und mehrmals nach einer von zwei Managementsituationen (positives Verstärkungstraining [PRT] und neuartiges Enrichmentobjekt [NOV]). Zum anderen diente die Exposition gegenüber dem neuartigen Enrichmentobjekt als sogenannter Novel Object Test. Dieser Standardtest der Persönlichkeitsforschung bei Tieren deckte bei anderen Arten konsistente Verhaltensunterschiede zwischen Individuen auf. Um zu untersuchen, ob dies auch auf Afrikanische Elefanten zutrifft, wurden die individuellen Verhaltensreaktionen auf das neuartige Objekt aufgezeichnet. Darüber hinaus wurden unabhängig von dem Experiment vor und nach einem Transport jeweils morgens und nachmittags Speichelproben von dem transferierten Tier und von zwei Tieren im Bestimmungszoo gesammelt, um den Effekt dieses potenziellen Stressors auf die individuellen Cortisolspiegel zu untersuchen.
Publikation A zeigt, dass die Elefanten unter den Bedingungen des Routinemanagements (das heißt dem routinemäßigen Tagesablauf der Tierpflege) am Morgen signifikant höhere Cortisolwerte im Speichel aufwiesen als am Nachmittag. Diese diurnale Variation der Cortisolsekretion ist typisch für tagaktive Arten und wurde daher auch für die untersuchten Elefanten erwartet. Unter Stressbedingungen wurde weder ein signifikanter Unterschied zwischen den Cortisolspiegeln vor und nach dem Transport noch zwischen den Cortisolwerten am Morgen und am Nachmittag festgestellt. Der prozentuale Unterschied zwischen dem morgendlichen und nachmittäglichen Cortisolspiegel war jedoch beim transferierten Tier nach dem Transport wesentlich geringer als vor dem Transport, was möglicherweise auf eine Stressreaktion auf den Transport und die Eingewöhnung im neuen Zoo hindeutet. Darüber hinaus zeigten sich deutliche Cortisolanstiege unmittelbar nach der ersten Zusammenführung des transferierten Tiers mit dem Bullen im neuen Zoo. Dieses Ergebnis demonstriert zum einen, dass Cortisol physiologischen Stress widerspiegelt. Zum anderen zeigt es die Notwendigkeit, zeitnah nach einem Stressor Speichelproben zu entnehmen, was nach dem Transport nicht möglich war.
Die Studie in Manuskript B zeigt unterschiedliche durchschnittliche Zeitverläufe der Cortisolantworten im Speichel auf die Managementsituationen PRT und NOV. PRT könnte aufgrund des beobachteten cortisolsenkenden und damit potenziell stresspuffernden Effekts förderlich für das Wohlbefinden sein. NOV induzierte im Mittel eine moderate, kurzfristige Cortisolantwort. Dies deutet darauf hin, dass die Tiere geringem physiologischem Stress ausgesetzt waren, mit dem sie jedoch erfolgreich umgehen konnten. Außerdem bestand eine bemerkenswerte individuelle Variation in den Cortisolverläufen in derselben Situation. Die Unterschiede im Cortisolspiegel zwischen den Tieren hingen mit dem Alter (bei NOV) und dem Zoo (bei PRT) zusammen. Der Effekt des Geschlechts und des Haltungssystems auf den Cortisolspiegel war hingegen variabel. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass die individuelle Variation der Cortisolsekretion unbedingt berücksichtigt werden muss, um physiologischen Stress zuverlässig zu erkennen.
Die Studie in Manuskript C ergab, dass sich die untersuchten Tiere im Novel Object Test konsistent in ihrem Verhalten gegenüber einem neuartigen Objekt unterschieden. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Novel Object Test auch bei Elefanten genutzt werden kann, um die Persönlichkeit der Tiere zu untersuchen...
Photorhabdus and Xenorhabdus bacteria live in a highly specific symbiosis with nematodes that belong to the genus of Heterorhabditis and Steinernema, respectively. These cruiser type nematodes actively search for soil-dwelling insects and infect them via natural openings. Inside of the insect, the bacteria are released into the hemocoel where they start producing an array of secondary metabolites to bypass the insect immune system and kill the prey within 48 hours. Many of those natural products possess bioactivities against other bacteria, fungi, protozoa or insects, which makes them interesting candidates for pharmaceutical applications. Even though advanced molecular biological methods in combination with bioinformatics tools can now be used to predict biosynthetic gene clusters (BGCs) and their products, there are still many BGCs with unknown products. Even for the plethora of natural products that were successfully identified in the last couple of years, the exact ecological function often remains elusive, as laboratory conditions can vary considerably from the natural environment of the bacteria. Knowledge about the natural conditions that stimulate, or repress production of certain natural products and their underlying regulatory mechanisms yield new approaches for natural product research and enables possibilities for selective manipulations of the regulatory cascades.
The overarching goal of this work was to examine the regulatory networks in Photorhabdus and Xenorhabdus strains. The first part of this work focused on the Hfq-dependent regulation of specialized metabolite production. In those genera, the RNA chaperone, Hfq, represses expression of hexA, which encodes for a global transcriptional regulator that acts as the master repressor for SM production. Multiple global approaches were used to identify the sRNA ArcZ, which targets a specific region in the 5’-untranslated region of the hexA mRNA and ultimately guides Hfq in order to repress its expression. It was shown that a deletion of arcZ led to a drastic reduction of SM production in Photorhabdus and Xenorhabdus, consistent with the phenotype of their respective hfq deletion mutants. Transcriptomic profiling revealed far-reaching effects on the transcriptome, with up to 735 coding sequences significantly affected in the arcZ deletion strain. Finally, it was shown that the resulting chemical background, devoid of SMs, in combination with targeted promotor exchange can be used to exclusively overproduce a desired natural product, representing an alternative route of genetic manipulation.
The second part of this work focused on the influence and identification of insect related compounds that affect SM production in P. laumondii, X. szentirmaii and X. nematophila. Insect homogenate was generated from G. mellonella larvae, a model host for these bacteria. Supplementation of the cultivation medium with homogenate induced considerable shifts in the SM profiles of those bacteria. A global effect on the transcriptional output was determined by transcriptomic profiling. The core response to the simulation of an insect environment consisted of ten CDS, eight of which are involved in the degradation of fatty acids or the import of maltose and maltodextrin into the cells. Two abundant components in the insect homogenate, trehalose and putrescin, were added to the cultivation medium of those strains and subsequent HPLC-MS analysis revealed a direct correlation of their concentration in the medium and the production titres of certain SMs. These results indicated that the bacteria sense the insect environment via different insect specific components in order to initiate a metabolic adjustment, which is probably required for adaptation to the insect host.
The last part of this work examined the influence of other, so far not directly related genes on SM production, based on the isolation of P. laumondii transposon-insertion mutants with clear phenotypic alterations. Re-sequencing and SM profiling of the mutant strains revealed that a transposon-insertion in the gene encoding for a putative DNA-adenine methyltransferase affected SM production. The phenotype was confirmed by deleting this gene. Based on Single-Molecule Real-Time sequencing, the complete methylome of the WT, deletion- and complementation mutant were analysed (experimental work performed by Sacha J. Pidot, Melbourne, Australia). No obvious alterations were detected in the methylation patterns of the strains, indicating that the dam gene product does not methylate the adenine in GATC-motifs, as it was described in literature for E. coli. This data raises the question what the function of the putative DNA-adenine methyltransferase is in P. laumondii and how it can influence the secondary metabolism. Even though there is currently no clear evidence, the potential role of epigenetic gene regulation mechanisms should be considered in further work.
Heat stress transcription factors (Hsfs) are required for transcriptional changes during heat stress (HS) thereby playing a crucial role in the heat stress response (HSR). The target genes of Hsfs include heat shock proteins (Hsps), other Hsfs and genes involved in protection of the cell from irreversible damages due to exposure to elevated temperatures. Among 27 Hsfs in Solanum lycopersicum, HsfA1a, HsfA2 and HsfB1 constitute a functional triad which regulates important aspects of the HSR. HsfA1a is constitutively expressed and described as the master regulator of stress response and thermotolerance. Activation of HsfA1a under elevated temperatures leads to the induction of HsfA2 and HsfB1 which further stimulate the transcription of HS-responsive genes by forming highly active complexes with HsfA1a. Despite the well-established role of these three Hsfs in tomato HSR, information about functional relevance of other Hsfs is currently missing.
The heat stress inducible HsfA7 belongs alongside with HsfA2 to a phylogenetically distinct clade. Thereby the two proteins share high homology and a functional redundancy has been assumed. However, HsfA7 function and contribution to stress responses have not been investigated into detail in any plant species.
Tomato HsfA7 protein accumulates already at moderately elevated temperatures (~35°C) while HsfA2 becomes dominant at higher temperatures (>40°C). HsfA7 pre-mRNA undergoes complex and temperature-dependent alternative splicing resulting in several transcripts that encode for three protein isoforms. HsfA7-I contains a functional nuclear export signal (NES) and shows nucleocytoplasmic shuttling while HsfA7-II and HsfA7-III have a truncated NES which leads to the strong nuclear retention of the protein. Differences in the nucleocytoplasmic equilibrium have a major impact on the stability of protein isoforms, as nuclear retention is associated with increased protein turnover. Consequently, HsfA7-I shows a higher stability and can be detected even after 24 hours of stress attenuation, while HsfA7-II is rapidly degraded. The degradation of these factors is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway.
HsfA7 can physically interact with HsfA1a and HsfA3 and form co-activator (“superactivator”) complexes with a very high transcriptional activity as shown on different HS-inducible promoters. In order for the complex to be successfully transferred to the nucleus and confer its activity it needs a functional nuclear localization signal (NLS) of HsfA7. In contrast, the activator (AHA) motif of HsfA7 is not essential for its co-activator function. Interestingly, while interaction of HsfA7 with either HsfA3 or HsfA1a stabilizes HsfA7 isoforms, concomitantly this leads to an increased turnover of HsfA1a and HsfA3. In contrast, HsfA2 has a stabilizing effect on the master regulator HsfA1a.
Thus, HsfA7 knockout mutants generated by CRISPR/Cas9 gene editing, show increased HsfA1a levels and a stronger induction of HS-related genes at 35°C compared to wild-type plants and HsfA2 knockout mutants. Consequently, HsfA7 knockout seedlings exhibit increased thermotolerance as shown by the enhanced hypocotyl elongation under a prolonged mild stress treatment at 35°C. In summary, these results highlight the importance of HsfA7 in regulation of cellular responses at elevated temperatures. Under moderately elevated temperatures, the accumulation of HsfA7 and its subsequent interaction with HsfA1a, leads to increased turnover of the latter, thereby ensuring a milder transcriptional activation of temperature-responsive genes like Hsps. In turn, in response to further elevated temperatures, HsfA2 becomes the dominant stress-induced Hsf. HsfA2 forms co-activator complexes with HsfA1a which in contrast to HsfA7, allows the stabilization of the master regulator, leading to the stronger expression of HS-responsive genes required for survival. Thereby, this study uncovers a new regulatory mechanism, where the temperature-dependent competitive interaction of HsfA2 and HsfA7 with HsfA1a control the fate of the master regulator and consequently the activity of temperature-responsive networks.
Cancer is a disease characterized by uncontrolled cell growth and the capacity to disseminate to distant organs. The properties of cancers are caused by genetic and epigenetic alterations when compared to their normal counterparts. Genetic mutations occur in oncogenes and tumor suppressor genes and are the initial drivers of cellular transformation (Lengauer et al., 1998; Vogelstein and Kinzler, 2004). In addition, epigenetic alterations, which influence the expression of oncogenes and tumor suppressor genes independently from sequence alterations, are also involved in the transformation process (Esteller and Herman, 2001; Sharma et al., 2010). Genetic alterations and epigenetic regulatory signals cooperate in tumor etiology. Glioblastoma multiforme (GBM) is a frequent and aggressive malignant brain tumor in humans. The median survival of GBM patients is about 15 months after diagnosis. Like in other cancers, genetic and epigenetic alterations can be detected in GBM. Genetic alterations in GBM affect cell growth, apoptosis, angiogenesis, and invasion; however, epigenetic alterations in GBM also affect the expression of oncogenes or tumor suppresser genes that increase tumor malignancy (Nagarajan and Costello, 2009).
Reprogramming is a cellular process in which somatic cells can be induced to assume the properties of less differentiated stem cells. This process can be mediated through epigenetic modifications of the genome of somatic cells by the action of four defined transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) or by the action of the miR 302/367 cluster (Anokye-Danso et al., 2011; Takahashi and Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007) and result in the generation of induced pluripotent stem cells (iPS cells). Reprogramming of somatic cells by the miR 302/367 cluster can generate nontumorigenic iPS cells through the inhibition of the epithelial to mesenchymal transition (EMT), cell cycle regulatory genes and epigenetic modifiers (Lin and Ying, 2013).
Die vorliegende, publikationsbasierte Dissertation, bestehend aus den drei Einzelpublikationen Bayer (2011, 2012) und Bayer und Schönhofer (2012), verfolgte das Ziel, die Spinnenfamilie Psechridae zu revidieren. Weiterhin sollten die phylogenetische Position dieser Familie im System der höheren Webspinnen (Araneomorphae) sowie die phylogenetischen Beziehungen der einzelnen Arten innerhalb der beiden Gattungen der Psechridae untersucht werden. In Form von morphologisch-taxonomischen Bearbeitungen wurden die beiden die Psechridae bildenden Gattungen Psechrus und Fecenia revidiert, wobei sämtliches Typus-Material sowie reichhaltiges, weiteres Material eingehend beschrieben, illustriert und diagnostiziert wurde. Hierbei wurden auch intraspezifische Variabilität sowie die Prä-Epigynen subadulter Weibchen, die in taxonomischen Arbeiten bislang nur eine unwesentliche Rolle gespielt haben, beschrieben, illustriert und taxonomisch ausgewertet. Zudem wurden im Rahmen dieser Untersuchungen bereits Überlegungen über mögliche Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der beiden Gattungen angestellt. ...
Angiogenesis, the formation of new blood vessels from existing ones, is a fundamental biological process required for embryonic development; it also plays an important role during postnatal organ development and various physiological and pathological remodeling processes in the adult organism. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its main receptor, VEGF receptor-2 (VEGFR-2), play a central role in angiogenesis. VEGFR-2 expression is strongly upregulated in angiogenic vessels, but the mechanisms regulating VEGFR-2 expression are not well understood. We found in this study that the G-protein α subunit Gα13 plays an important role in the regulation of VEGFR-2 expression. In vitro, we found that knockdown of Gα13 reduced VEGFR-2 expression in human umbilical vein endothelial cells and impaired responsiveness to VEGF-A. This phenotype was rescued by adenoviral normalization of VEGFR-2 expression. Gα13-dependent VEGFR-2 expression involved activation of the small GTPase RhoA and transcription factor NF-κB; it was abrogated by deletion of the NF-κB binding site at position -84 of the VEGFR-2 promoter. In vivo, endothelial cell-specific loss of Gα13 resulted in reduced VEGFR-2 expression, impaired responsiveness towards VEGF-A in Matrigel assays, and reduced retinal angiogenesis. Importantly, also tumor vascularization was diminished in the absence of endothelial Gα13, resulting in reduced tumor growth. Taken together, we identified Gα13-dependent NF-κB activation as a new pathway underlying the transcriptional regulation of VEGFR-2 during retinal and tumor angiogenesis.
Autism spectrum disorder (ASD) is a common neurodevelopmental disorder with a multifarious clinical presentation. Even though many genetic risk factors have been identified and studied in mouse models, the neurophysiological mechanisms underlying the autistic phenotype are still unclear. Based on the high rates of comorbidity with epilepsy, it was hypothesized that the balance between excitation and inhibition in neural circuits may be disrupted in autistic individuals.
In this dissertation, synaptic and network activity was measured in three different genetically modified mouse models that exhibit the characteristic behavioral abnormalities of the disorder: the Neurobeachin (Nbea) haploinsufficient mouse, the Neuroligin-3 (Nlgn3) knockout (KO) mouse, and the Neuroligin-4 (Nlgn4) KO mouse. Each of the affected proteins is involved in the formation and/or function of synapses in the central nervous system. Therefore, it was posited that the reduction or deletion of these proteins might alter the balance of excitatory to inhibitory synaptic transmission in individual neurons and in neural circuits. Extracellular recordings in the hippocampal dentate gyrus of anesthetized mice revealed that the excitation-inhibition (E-I) balance was reduced in Nbea haploinsufficient and Nlgn4 KO mice, but unchanged in Nlgn3 KO mice despite a reduction in excitatory synaptic transmission to dentate granule cells. Unexpectedly, the intrinsic excitability of dentate granule cells was altered in all three mouse models. These results imply that a homeostatic increase in the intrinsic excitability is able to compensate for the decreased excitatory transmission in Nlgn3 KO mice, whereas the decreased intrinsic excitability in the Nbea haploinsufficient and Nlgn4 KO mice leads to a reduction in the E-I balance. Taken together, these findings suggest that the influence of genetic factors on the E-I balance might be a potential common mechanism underlying the development of ASD.
In der vorliegenden dreiteiligen Studie werden Mongolische Wüstenrennmäuse untersucht, deren Hörspektren im tieffrequenten Bereich und deren Unterscheidungsfähigkeiten von Kommunikationsrufen denen des Menschen ähneln. Die extrazelluläre Aktivität im primären auditorischen Kortex (AI) der narkotisierten Versuchstiere, evoziert durch Reintöne und arteigene Kommunikationsrufe, wird in der linken (LH) und rechten Gehirnhemisphäre (RH) aufgenommen. Es werden Multikanalelektroden (16 Eingangskanäle) verwendet, welche eine simultane Aufnahme der neuronalen Aktivitäten aller kortikalen Schichten ermöglichen. Zur Analyse der neuronalen Mechanismen werden Wellenformen einzelner Elektrodenkanäle und Aktivitätsprofile, bestehend aus den Wellenformen aller Elektrodenkanäle in einem Zeitfenster von 600 ms, auf Ebene von Aktionspotentialen (MUA), lokalen Feldpotentialen (LFP) und Current-source-density (CSD) Analysen, untersucht. Während MUAs die neuronalen Aktionspotentiale im Nahfeld der Elektrode reflektieren, umfassen die LFPs die summierten Potentiale (inhibitorisch und exzitatorisch) von Neuronen eines größeren Areals. Die CSDs hingegen werden durch die Integration von LFP-Wellenformen benachbarter, linear angeordneter Elektrodenkanäle berechnet und ermöglichen so eine Lokalisation der Ursprünge geräuschspezifischer Aktivitätsflüsse.
Im ersten Teilprojekt werden CSD-Profile in Antwort auf unterschiedliche Reintöne untersucht, um die Aktivitätskomponenten, die so genannten Sinks, für weiterführende Analysen zu quantifizieren. Es können zwei primäre (s1 und s2), drei mittlere (s3-s5) und vier späte (s6-s9) Sinks in einem Zeitfenster von 600 ms definiert werden. Eine Veränderung der Stimulusfrequenz eine Oktave über und unter der charakteristischen Frequenz (CF), beziehungsweise des Lautstärkepegels = 24 dB über der minimalen Schwelle, führt zu qualitativen Veränderungen in der CSD-Profilstruktur. Die Sink s7 wird durch Stimuli mit niedrigem Lautstärkepegel weniger verlässlich evoziert, wohingegen die Sink s9 bei Stimuli eine Oktave über der CF verlässlicher evoziert wird. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass im AI die spektralen Informationen eine Oktave über und unter der CF asymmetrisch integriert werden.
Auf Einzelschichtebene konnte bereits gezeigt werden, dass spektrotemporale Eigenschaften von Stimuli durch MUAs schlechter reflektiert wurden als durch LFPs, was vermutlich eine direkte Konsequenz der unterschiedlichen Ursprünge der Signaltypen ist. Daher werden im zweiten Teilprojekt die spezifischen Unterschiede der MUA-, LFP- und CSD-Antworten auf Ebene kortikaler Schichten und kompletter laminarer Profile untersucht, um die Unterschiede und den Informationsgehalt der drei Signaltypen zu charakterisieren. Signifikante Unterschiede, welche durch zwei Reintöne und sieben Kommunikationssignale evoziert werden, können verstärkt im mittleren und späten Latenzbereich und in granulären und infragranulären Schichten vorgefunden werden. Der Grad der Rufspezifizität ist in LFP und CSD-Antworten im Vergleich zu demjenigen in MUA-Antworten größer. Die Segregationsleistung ist im Vergleich zu einzelnen kortikalen Schichten in den von kortikalen Kolumnen abgeleiteten laminaren Profilen um den Faktor 1,8-2,6 erhöht. Die Neuronenpopulationen einzelner kortikaler Kolumnen sind vermutlich wichtig für die Kodierung von Geräuschen, welche sich in ihren spektrotemporalen Eigenschaften unterscheiden.
Viele vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Gehirnhemisphären akustische Signale asymmetrisch verarbeiten. Daher werden im dritten Hauptteil die laminaren Profile der LH und RH quantitativ und statistisch verglichen. Die MUA-, CSD-Profile und im geringeren Maße auch die LFP-Profile zeigen systematische Unterschiede auf signifikantem Niveau in der Dauer, Onset Latenz und vertikalen Ausdehnung bestimmter Aktivitäten. Kommunikationsrufe evozieren in der LH, welche beim Menschen auf Sprachstimuli spezialisiert ist, im Vergleich zur RH komplexere CSD-Profile. Die neuronale MUA-, LFP- und CSD-Aktivitätsstärke ist in der RH für weniger komplexe Stimuli teilweise signifikant erhöht. Die Asymmetrie in der Auftrittsverlässlichkeit der Sink s6 lässt vermuten, dass sich die intrakolumnäre Vernetzung in Schicht VIa zwischen der LH und RH unterscheidet. Die wenigen, signifikanten und nicht systematischen Unterschiede zwischen den Sink-Parametern der LH und RH nach kortikaler Ausschaltung mit dem GABAA-Rezeptor Agonist Muscimol weisen darauf hin, dass die Hemisphärenasymmetrie durch Prozesse des ipsilateralen Kortex maßgeblich beeinflusst wird.
Die Neurowissenschaften sind in Forschungsarbeiten für Schüler und Studierende immer wieder als eines der schwierigsten Teilgebiete der Biologie angeführt. Die Inhalte werden überwiegend nicht verstanden. Als mögliche Ursache gelten die seltenen praktischen Zugänge für die Lernenden aufgrund limitierter Ressourcen. Diese Ursache konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Befragung der Lehrkräfte zu ihren Praxisumsetzungen bestätigt werden. 70 % der Lehrkräfte gaben an, dass sie keine Experimente in der Schule zum Thema Nervenzellen anbieten. Experimente zur Verhaltensbiologie führen 65 % der Lehrkräfte nicht durch.
Um Schülern die Möglichkeit zu geben, sich experimentell mit den Themenfeldern der Neuro- und Verhaltensbiologie auseinanderzusetzen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Schülerlabortage auf dem Feld der Neurowissenschaften konzipiert. Die Konzepte wurden schülerorientiert umgesetzt und neurowissenschaftliche Forschung durch den eigenen Umgang mit modernen Forschungsapparaturen erfahrbar gemacht. Die drei Labortage für die Sekundarstufe II wurden wissenschaftlich begleitet: 1) Verhaltensbiologie, 2) systemische Ebene der Elektrophysiologie, 3) elektrophysiologische Forschungsmethoden. Um die Qualität und Wirksamkeit der Labortage beurteilen zu können, wurden sie mit Feedbackerhebungen begleitet. Die drei Labortage wurden sowohl von den Lehrkräften als auch von den Schülern bezüglich ihrer Qualität positiv bewertet. Für die Schüler konnte gezeigt werden, dass die Beurteilung weitgehend unabhängig von einem zugrunde liegenden Interesse an Biologie und Forschung ausfällt. Anhand einer retrospektiven Erhebung wird außerdem gezeigt, dass alle drei Labortage eine höchst signifikante, selbsteingeschätzte Steigerung des „Wissens“, der „Anwendungszuversicht“ und des „Interesses“ bewirken. Schüler mit niedrigen Ausgangswerten zeigen einen besonders hohen Anstieg. Für das Interesse kann weiter gezeigt werden, dass auch Schüler mit hohem Ausgangswert eine große Interessenssteigerung durch den Labortag aufweisen. Das Interesse für den verhaltensbiologischen Labortag liegt etwas niedriger – die Labortage mit elektrophysiologischen Inhalten zeigen dagegen für die Anwendungszuversicht etwas niedrigere Werte.
Der Fokus der fachdidaktischen Forschung lag auf der Betrachtung des experimentellen Zugangs zur Elektrophysiologie über ein entwickeltes „EPhys-Setup“. Dabei handelt es sich um einen quasi-realen Messaufbau. Die Umsetzung kombiniert dazu Komponenten eines realen Elektrophysiologie-Setups (Hands-on Komponenten) mit einer speziell entwickelten schülerfreundlichen Software (Neurosimulation) und einem virtuellen Nervensystem in Form einer Platine. Als Modellnervensystem werden für diese Umsetzung Ganglien von Hirudo medicinalis verwendet – der Neurosimulation liegen originale elektrophysiologische Messspuren des Ganglions zugrunde. Experimentelle Vermittlungsansätze für die Elektrophysiologie finden sich kaum für den Schulbereich. Dem Bedarf einer entsprechenden Beforschung wurde mit verschiedenen Testinstrumenten nachgegangen, um den Vermittlungsansatz mit dem EPhys-Setup bewerten zu können. Dafür fand eine Wirksamkeitsanalyse über die Erhebung der Motivation der Schüler statt (Lab Motivation Scale; Dohn et al. 2016). Von Bedeutung war auch, inwiefern gegenüber der Umsetzung eine Technologieakzeptanz vorliegt (Technology Acceptance Model; Davis 1989), die im Schulkontext ausgehend von der steigenden Einbindung von Technologien einen entsprechenden Forschungsbedarf aufweist. Weiter wurde untersucht, ob sich die Bewertung des EPhys-Setups von der Bewertung einer Kontrollgruppe unterscheidet. Für die Kontrollgruppe wurde die Neurosimulation von den Hands-on Komponenten gelöst und die Schüler arbeiteten ausschließlich PC-basiert. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Umsetzungen die Motivation förderten und eine Technologieakzeptanz bei den Schülern aufwiesen. Der Unterschied der Untersuchungsgruppen fällt gering aus. Die Abhängigkeiten, die für die verwendete Simulationsumsetzung gefunden wurden, beziehen sich ausschließlich auf Komponenten der „Freude“. Somit wird der intrinsische Bereich von den Schülern die am EPhys-Setup gearbeitet haben höher bewertet. Zur weiteren Analyse der Testinstrumente wurde auch eine Abhängigkeit der Bewertung vom zugrunde liegenden Biologieinteresse sowie von den Computerfähigkeiten vergleichend betrachtet. Der Einfluss auf die Bewertungen der drei Testskalen ist in vielen Fällen höher als der Einfluss der verwendeten Simulation. Vom individuellen Biologieinteresse der Schüler zeigen alle untersuchten Komponenten eine Abhängigkeit. Die größeren Effekte beziehen sich auf die Komponenten der „Lernwirksamkeit“ oder der „Freude“. Von den individuellen Computerfähigkeiten der Schüler zeigen Komponenten zur „Zuversicht bezüglich der Methoden und der Inhalte“ eine Abhängigkeit.