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Despite all advancements in cancer research and clinical practice, cancer remains a life- threatening disease with an increasing incidence. According to a 2018 WHO forecast, cancer incidence will double to approximately 37 million new cancer cases by 2040. Today, clinical management of cancer is based on a "one-fits-all" strategy. Most cancers are still treated by surgical therapy followed by adjuvant or neoadjuvant chemotherapy based on rather strict guidelines (S3 guidelines in Europe) which are based on studies of large cohorts of patients with the same tumor entity. While this approach has led to substantial increases in progression-free survival and overall patient survival, most patients do not benefit from the administered treatment regimen. One reason for this is intra-tumor heterogeneity, which results from clonal evolution between cancer cells and their environment. This means that cancer patients may respond differently to a particular drug due to the different mutation patterns of their tumor cells. Therefore, patients should be screened in advance for reliable cancer biomarkers that definitively predict whether they will respond to a particular therapy. This would increase the probability of a successful treatment.
Colorectal cancer (CRC) is the third most diagnosed cancer and the second leading cause of cancer deaths worldwide. The main cause of death in CRC is a metastatic disease, which is presented in 20 % of patients and eventually develops in more than 30 % of early-stage patients. Despite the significant increase (to more than 30 months) in median survival with the development of cytotoxic agents and the introduction of targeted therapy, the progression-free survival in the first-line setting has remained largely unchanged over the past decade.
The heterogeneity in CRC is characterized by alterations in multiple signaling pathways that affect cellular functions such as cell proliferation or apoptosis. Commonly affected signaling pathways include the mitogen-activated protein kinase (MAPK)- and the transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein (TGF-β/BMP)-pathway. Alterations in the TGF-β/BMP pathway, due to mutations in the SMAD4 gene (mothers against decapentaplegic homolog 4), are associated with different drug response and promote resistance to chemotherapy. In addition, they are associated with a higher recurrence rate.
SMAD4 is one of the most common cancer driver genes, and mutations occur in up to 15 % of CRC cases. Therefore, there is an urgent need for therapeutic agents that can specifically target SMAD4-mutated tumors.
The aim of the present study was the identification of the clinical relevance of the SMAD4 gene and the investigation of its suitability as a potential biomarker in CRC.
For this purpose, I investigated sibling patient-derived organoids (PDOs) derived from different regions of a chemo-naïve CRC tumor. PDOs are 3D cell cultures that reliably recapitulate the architecture of the tissue of origin, as well as preserve the genomic background and intra-tumor heterogeneity. The sibling PDOs (R1R361H and R4wt) shared the most common CRC mutations, such as KRASG12D (kirsten rat sarcoma), PIK3CAH1047R (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit alpha), and TP53C242F (tumor protein 53), but differed in a SMAD4R361H mutation and showed a different drug response. The single nucleotide variant R361H of the SMAD4 gene is among the most common pathogenic alterations in various cancers, including CRC.
The sibling PDOs showed significant differences in response to the MEK-inhibitors cobimetinib, trametinib, and selumetinib. MEK-inhibitors are antineoplastic agents that inhibit the function of MEK1 and MEK2, preventing phosphorylation of transcription factors, which leads to inhibition of tumor cell proliferation. MEK-inhibitors are approved for the treatment of malignant melanoma. Currently, they are in phase-III clinical trials for the treatment of patients with metastatic CRC.
To investigate whether SMAD4R361H is responsible for sensitivity to MEK-inhibitors, Iestablished three syngeneic PDOs harboring a SMAD4R361H mutation using the CRISPR/Cas9 genome editing system. All CRISPR-PDOs were significantly more sensitive to the MEK-inhibitors, compared to R4wt. I have shown that the SMAD4R361H mutation is responsible for sensitivity to MEK inhibition in CRC models and may be a predictive biomarker.
To test this hypothesis, I examined 62 CRC PDO models and treated them with the MEK-inhibitors cobimetinib, trametinib, and selumetinib. All models that had a pathogenic mutation or deletion in the SMAD4 gene (15 %) were sensitive to cobimetinib, 10 % of models were sensitive to trametinib, and 8 % were sensitive to selumetinib.
I performed transcriptome (RNA sequencing) and proteome analyses using the DigiWest® method to investigate the mechanism underlying MEK-inhibitor sensitivity.
DigiWest® is a Luminex® bead-based analysis that allows the simultaneous analysis of over 100 (phospho-)proteins. The transcriptome and proteome data support the observation that MEK inhibition primarily affects SMAD4R361H PDOs. Furthermore, I have shown that activation of the BMP signaling pathway in organoids with wild-type SMAD4 appears to be responsible for resistance to MEK-inhibitors. Thus, a genetic alteration in the BMP signaling pathway, beyond SMAD4, could lead to sensitivity to MEK-inhibitors.
I identified four genes involved in the TGF-β/BMP signaling pathway that are frequently mutated in CRC and grouped them into the so-called SFAB-signature (SMAD4, FBXW7 (F-box/WD repeat-containing protein 7), ARID1A (AT-rich interactive domain-containing protein 1A), or BMPR2 (Bone morphogenetic protein receptor type II). Clinical data show that approximately 36 % of CRC patients have at least one pathogenic mutation in these genes.
I tested all 62 CRC PDO models and found a significant positive prediction for sensitivity to cobimetinib (95 %) and selumetinib (70 %) for the SFAB-signature. Trametinib and the newly approved MEK-inhibitor binimetinib showed a similar trend. Therefore, the SFAB-signature has high predictive power for response to MEK-inhibitors and could be used as a predictive biomarker panel.
The current clinically used biomarkers for CRC are based on the mutation status of driver genes KRAS and BRAF, which are present in up to 50 % and 10 % of CRC, respectively. Investigation of molecular alterations in CRC revealed that mutations in the KRAS gene, which is downstream of EGFR (epidermal growth factor receptor) in the MAPK-pathway, interfere with an anti-EGFR-antibody therapy (e.g., cetuximab). Therefore, cetuximab is only relevant for RAS wild-type tumors. However, approximately 40 % of patients with RAS wild-type status do not respond to this treatment.
About 53 % of CRC PDO models carry a pathogenic RAS mutation, about 10 % harbor a pathogenic BRAF mutation. Both, the RAS and RAF status alone as well as the combination of RAS and RAF status with SFAB-signature did not provide a better prediction of sensitivity to MEK inhibition.
Eine große Gruppe von Aptameren sind die Guanosintriphosphat (GTP) Aptamere. Diese zeigt sehr eindrücklich, wie RNA unterschiedliche Strategien nutzt, um denselben Liganden zu erkennen. Die komplette Struktur des GTP Klasse II Aptamers wird in der ersten Publikation gezeigt. Interessanterweise zeichnet die Struktur ein stabil protoniertes Adenine unterhalb der GTP-Bindestelle aus. Dieses wurde durch eine Kombination aus weiterführenden NMR- und ITC-Experimente untersucht und charakterisiert. Es zeigte sich, dass die protonierte Base einen pKs-Wert hat, der weit von der Neutralität verschoben ist. Die Protonierung ist auch noch bei sehr basischen Puffern stabil.
Eine Art der funktionellen Protonierung wird von den zyklischen di-Nukleotiden (CDN) bindenden Riboswitches genutzt, um zwei CDN mit ähnlicher Affinität zu binden. c-di-GMP Riboswitches wurden als regulatorische Einheit beschrieben und deren Kristallstruktur aufgeklärt. Mutationsexperimente führten dazu, dass bei einer G-zu-A Mutation an der Gα-Bindestelle die Selektivität des Riboswitches verändert wurde. Die Mutante bindet sowohl c-di-GMP als auch cGAMP mit ähnlichen Bindungsaffinitäten. Riboswitche, die cGAMP binden wurden auch in der bakteriellen Genomen gefunden. Hierbei ist die Promiskuität unterschiedlich stark ausgeprägt. Die Untersuchung des Bindungsmodus und der damit verbundenen Promiskuität ist in der zweiten Publikation beschrieben. Hier wurde gezeigt, dass die Riboswitche beide Liganden nur binden können, wenn zur Bindung von c-di-GMP das Ligand bindende A protoniert vorliegt. Auch diese Protonierung konnte mit weiterführenden NMR- und ITC-Experimenten charakterisiert werden. Die Untersuchungen einer solch großen RNA sind mit NMR Spektroskopie herausfordernd. Hierbei wurde ausgenutzt, dass die Kristallstruktur bereits bekannt war, welche allerdings die Protonierung nicht zeigte. Auch diese Protonierung zeigt einen pKs-Wert, der weit von der Neutralität verschoben ist und außerdem bei unterschiedlichen pH stabil ist.
In den beiden untersuchten Beispielen wurden zwei verschiedene Arten von Protonierung gezeigt: eine strukturelle und eine funktionelle. Das GTP Klasse II Aptamer benutzt die Protonierung als strukturelle Basis für die Basis der Ligandenbindungsstelle. Hierbei werden durch die Protonierung des Adenines mehr nutzbare Wasserstoffbrücken ausgebildet und damit die Tertiärstruktur stabilisiert. Im Unterschied dazu nutzen die promiskuitiven CDN Ribsowicthes die Protonierung, um verschiedene Liganden binden zu können und es kommt damit zu einer Verschiebung der Funktionalität. Der regulatorische Nutzen dafür ist allerdings noch unbekannt.
Auch bei den SAM Riboswitches wurde ein promiskuitiver Vertreter beschrieben. SAM Riboswitches gehören zu den am längsten bekannten Klassen der Riboswitches. Bis heute sind hier die meisten unterschiedlichen Klassen bekannt. SAM wird häufig als Donor für funktionelle Gruppen benutzt, besonders häufig als Methlygruppendonor für die Methylierung einer Reihe unterschiedlicher Substrate (z.B. DNA, Proteine, Metabolite etc.). Bei dieser Reaktion entsteht SAH als Nebenprodukt. Zusätzlich ist SAH zelltoxisch, da es affin an Methyltransferasen bindet und damit diese essenzielle Reaktion inhibiert. Eine enge Kontrolle der SAH-Konzentration ist daher kritisch. SAM bindende Riboswitches haben zu SAM eine bis zu 1000-fach höhere Bindungsaffinität im Vergleich zu SAH. Die Beschreibung eines translationalen OFF-Riboswitches, der SAM und SAH mit ähnlicher Affinität bindet, ist daher überraschend. Zumal seine Genassoziation fast ausschließlich zu SAM Synthetasen ist, deren Regulation durch SAH wenig sinnvoll erscheint. Um ein besseres Verständnis für die Funktion des SAM/SAH Riboswitches zu erhalten, wurde seine 3D-Struktur mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt, wie in der vierten Publikation beschrieben. Dafür mussten zunächst alle Resonanzen der Sequenz und dem Liganden zugeordnet werden, wie in der dritten Publikation beschrieben. Dabei wurde als Ligand SAH gewählt, da dieser chemisch stabiler und damit für die teils tagelangen NMR-Messungen besser geeignet ist. Zusätzlich wurden Mutanten bzw. verwandte Liganden mittels ITC Experimente auf ihre Bindungseigenschaften untersucht, um die Bedeutung der Linkerlänge, einzelner Basenpaare und funktionelle Gruppen des Liganden zu untersuchen. Bei anderen bekannten SAM Riboswitches umschließt die RNA den Liganden fast komplett. Dabei wird zum einem das Sulfoniumion spezifisch durch die Carboxylgruppen verschiedener Uracil-Nukleotide erkennt und koordiniert. Außerdem bildet sich eine Bindetasche aus, die genug Platz für die stabile Bindung der Methylgruppe hat. Beim SAH Riboswitch wird die Selektivität für SAH dadurch erreicht, dass die Bindetasche sterisch keinen Platz für die Methylgruppe von SAM bereitstellt.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit drei verschiedene Ligand bindende RNA-Strukturen untersucht, die alle sehr unterschiedliche Strategien zur Bindung der Liganden nutzen. Obwohl Portionierungen bei Aptameren und Riboswitches selten beschrieben wurden, haben sie eine maßgebliche Funktion in den beiden zuerst untersuchten Strukturen. Obwohl bisher im Hinblick auf alle bekannten RNA Strukturen eher selten beschrieben, gibt es doch neben den genannten zwei, einige Beispiele für strukturelle oder funktionelle Protonierungen. Auch in Hinblick auf zukünftige bzw. Verbesserung bestehender RNA-Strukturvorhersage-Programme ähnlich wie sie für Proteine schon lange nutzt werden, müssen protonierte Nukleobasen ernsthaft in Betracht gezogen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass zwei der untersuchten Riboswitches zwei Liganden mit ähnlicher Affinität binden. Die genutzte Strategie ist hierbei unterschiedlich. Während bei den promiskuitiven CDN Riboswitches der regulatorische Nutzen noch unbekannt ist, konnte für den SAM/SAH Ribsowitch gezeigt werden, dass SAH nur zufällig aufgrund der wahrscheinlich sehr niedrigen intrazellulären Konzentration gebunden wird und dieser daher wahrscheinlich später in der evolutionären Entwicklung entstanden ist. Riboswitches halten es weiterhin spannend.
The intensive use of the North Sea area through offshore activities, sand mining, and the spreading of dredged material is leading to increasing pollution of the ecosystem by chemicals such as hydrophobic organic contaminants (HOCs). Due to their toxicological properties and their ability to accumulate in the environment, HOCs are of particular concern. The contaminants partition between aqueous (pore water, overlying water) and solid phases (sediment, suspended particulate matter, and biota) within these systems. The accumulated contaminants in the sediment are of major concern for benthic organisms, who are in close contact with sediment and interstitial water. It is thus particularly important to better understand how contaminants interact with biota, as these animals may contribute to trophic transfer through the food web. Furthermore, sediments are a crucial factor for the water quality of aquatic systems. They not only represent a sink for contaminants but also determine environmental fate, bioavailability, and toxicity. The Marine Strategy Framework Directive (MSFD) was introduced to protect our marine environment across Europe and includes the assessment of pollutant concentrations in the total sediment, which, however, rarely reflects the actual exposure situation. The consideration of the pollutant concentrations in the pore water is not implemented, although this is needed for the evaluation of bioavailability and risk assessment. For this reason, special attention is given to further development, implementation, and validation of pollutant monitoring methods that can determine the bioavailable fraction in sediment pore water. For risk assessment purposes, it is furthermore important to use biological indicators in addition to classical analytics to determine the effect of pollutants on organisms. The main objective of this thesis was to gain insight into the pollution load and the potential risk of hydrophobic organic chemicals (HOCs) in the sediment of the North Sea and to evaluate these results with regard to possible risks for benthic organisms and the ecosystem. The following five aims are covered within these studies to gain a holistic assessment of sediment contamination:
1. Assessment of the pore water concentrations of PAHs and PCBs
2. Determination of the bioturbation potential by macrofauna analysis
3. Application of the SPME method on biological tissue
4. Assessment of recreated environmental mixtures in passive dosing bioassays
5. Development of SPME method for DDT in sediments
The thesis is comprised of three main studies supported by three additional studies ...
Autism spectrum disorder (ASD) is a common neurodevelopmental disorder with a multifarious clinical presentation. Even though many genetic risk factors have been identified and studied in mouse models, the neurophysiological mechanisms underlying the autistic phenotype are still unclear. Based on the high rates of comorbidity with epilepsy, it was hypothesized that the balance between excitation and inhibition in neural circuits may be disrupted in autistic individuals.
In this dissertation, synaptic and network activity was measured in three different genetically modified mouse models that exhibit the characteristic behavioral abnormalities of the disorder: the Neurobeachin (Nbea) haploinsufficient mouse, the Neuroligin-3 (Nlgn3) knockout (KO) mouse, and the Neuroligin-4 (Nlgn4) KO mouse. Each of the affected proteins is involved in the formation and/or function of synapses in the central nervous system. Therefore, it was posited that the reduction or deletion of these proteins might alter the balance of excitatory to inhibitory synaptic transmission in individual neurons and in neural circuits. Extracellular recordings in the hippocampal dentate gyrus of anesthetized mice revealed that the excitation-inhibition (E-I) balance was reduced in Nbea haploinsufficient and Nlgn4 KO mice, but unchanged in Nlgn3 KO mice despite a reduction in excitatory synaptic transmission to dentate granule cells. Unexpectedly, the intrinsic excitability of dentate granule cells was altered in all three mouse models. These results imply that a homeostatic increase in the intrinsic excitability is able to compensate for the decreased excitatory transmission in Nlgn3 KO mice, whereas the decreased intrinsic excitability in the Nbea haploinsufficient and Nlgn4 KO mice leads to a reduction in the E-I balance. Taken together, these findings suggest that the influence of genetic factors on the E-I balance might be a potential common mechanism underlying the development of ASD.
Weltweit werden etwa 17% aller Infektionskrankheiten von Vektoren auf den Menschen übertragen. Dabei dienen meist blutsaugende Arthropoden wie Stechmücken, Zecken oder Sandfliegen als Überträger von Bakterien, Viren oder einzelligen Parasiten. Zur letzteren Gruppe gehört auch der protozoische Erreger der Chagas-Krankheit Trypanosoma cruzi. Er wird von hämatophagen Triatominae, einer Unterfamilie der Raubwanzen (Hemiptera: Reduviidae) während der Blutmahlzeit an einem infizierten Säugerwirt aufgenommen, durchläuft komplexe Entwicklungsschritte im intestinalen Trakt der triatominen Insekten und wird anschließend über den Fäzes und Urin der Wanzen abgegeben. Die Infektion des nächsten Wirts erfolgt dann durch das versehentliche Einreiben der Erreger in die Stichwunde oder auf Schleimhäute. Auch eine Infektion über die orale Aufnahme von kontaminierter Nahrung, Mutter-Kind-Infektionen und die Übertragung durch Blutkonserven und Organtransplantate sind möglich. Die Chagas‑Krankheit, oder auch Amerikanische Trypanosomiasis, ist insbesondere in Mittel- und Südamerika verbreitet und betrifft nach Schätzungen der WHO 6 bis 7 Millionen Menschen. Infolge von globaler Immigration und erhöhtem Reiseverkehr treten jedoch in den letzten Jahrzehnten auch vermehrt Fälle in Europa, den USA, Kanada und den westlichen Pazifikstaaten auf. Da dort bislang geeignete Vektoren fehlen, kommt es außerhalb des lateinamerikanischen Kontinents nicht zu vektorübertragenen Infektionen. Dies könnte sich jedoch im Zuge des Klimawandels und einer voranschreitenden Globalisierung ändern, sollte der Ausbreitung der Chagas-Krankheit eine Ausbreitung ihrer triatominen Vektoren folgen.
Inwieweit Triatominae unter heutigen Bedingungen klimatisch geeignete Habitate außerhalb des amerikanischen Kontinents finden, wurde innerhalb des ersten Projekts der vorliegenden Dissertation untersucht. Dazu wurde mit Hilfe der ökologischen Nischenmodellierung und Vorkommensdaten verschiedener vektorkompetenter Raubwanzenarten sowie klimatischer Umweltvariablen die klimatische Eignung verschiedenster Lebensräume modelliert und global projiziert. Es zeigte sich, dass insbesondere tropische und subtropische Gebiete Afrikas sowie Ost- und Südostasiens zwischen 21° nördlicher Breite und 24° südlicher Breite für viele triatomine Vektorarten geeignete Bedingungen aufweisen. Auffällig ist dabei insbesondere die Art Triatoma rubrofasciata, welche nachweislich bereits in Südchina, Vietnam und weiteren Ländern Afrikas und Asiens gefunden wurde. Die Modellierung
offenbarte, dass weitere ausgedehnte Teile der Küstenregionen Afrikas und Südostasiens als für T. rubrofasciata klimatisch geeignet angesehen werden müssen. Eine weitere Ausbreitung dieser Art ist demnach äußerst wahrscheinlich und stellt bislang das größte Risiko autochthon übertragener Chagas-Infektionen außerhalb des amerikanischen Kontinents dar. Es konnten außerdem zwei triatomine Arten identifiziert werden, namentlich T. infestans und T. sordida, welche in gemäßigten Klimazonen geeignete Habitate finden. Zu diesen gehören beispielsweise Neuseeland und Teile Australiens, aber auch südeuropäische Länder wie Spanien, Italien, Griechenland und Portugal. Da mit einer Ausweitung der klimatisch geeigneten Gebiete infolge des sich verändernden Klimas zu rechnen ist, wäre ein Monitoring der Vektoren, wie es bereits in Südchina etabliert ist, aber insbesondere die Einführung der Meldepflicht für Amerikanische Trypanosomiasis in diesen Regionen sinnvoll. Die Ergebnisse der Studie zeigen deutlich, dass die bisher vernachlässigte Tropenkrankheit Chagas nicht allein ein Problem des lateinamerikanischen Kontinents ist, sondern deren Erforschung vielmehr weltweit Beachtung finden sollte.
So konzentrierten sich die folgenden Forschungsprojekte der Promotion verstärkt auf die Mechanismen, welche die Entwicklung und Transmission des Parasiten und die Interaktion mit seinen Vektoren betreffen. Von besonderem Interesse waren dabei die ökologischen Prozesse, welche bei der Kolonisation des Darmtrakts der Vektoren durch T. cruzi ablaufen und essentiell für die Proliferation und damit die Übertragung des Parasiten sind. Eine entscheidende Rolle spielen dabei die mit dem Vektor assoziierten Mikroorganismen und ihre funktionellen Fähigkeiten – zusammengefasst als Mikrobiom bezeichnet. Dieses erfüllt wichtige physiologische Funktionen des Insekts und kann beispielsweise das Immunsystem und die Detoxifikation beeinflussen. Um die Veränderungen der organismischen Zusammensetzung und der funktionellen Kapazitäten, welche die Infektion mit dem Pathogen im Darmtrakt der Vektoren auslösen, zu untersuchen, wurde ein metagenomischer Shotgun Sequenzierungsansatz gewählt. Die daraus resultierenden Datensätze wurden anschließend bioinformatisch ausgewertet und auf ihre mikrobielle Zusammensetzung und metabolischen Fähigkeiten hin untersucht. Es zeigte sich zunächst, dass das Bakterium Rhodococcus rhodnii, welches lange als alleiniger echter Symbiont des untersuchten Vektors Rhodnius prolixus galt, in seiner Funktionalität nicht einzigartig im Mikrobiom des Insekts ist. ...
In Zeiten der globalen Klimaerwärmung und des Klimawandels werden Strategien zur Vermeidung, Reduzierung oder Wiederverwertung von CO2-Emissionen sowie die Abkehr von fossilen Energieträgern immer wichtiger. Aus diesem Grund finden Technologien zur Bindung, Speicherung und Wiederverwertung von CO2 immer größere Aufmerksamkeit und diverse chemische als auch biologische Ansätze werden verfolgt. Eine dieser Möglichkeiten umfasst die Reduktion von CO2 mit Hilfe von molekularem Wasserstoff. Im Prozess der direkten Hydrogenierung von CO2 zu Ameisensäure bzw. Formiat wird nicht nur CO2 gebunden, sondern ebenfalls H2 in flüssiger Form gespeichert. Die Ameisensäure weist gegenüber dem hochflüchtigen Wasserstoffgas verschiedene Vorteile auf und zählt zu der Gruppe der flüssigen, organischen Wasserstoffspeicherverbindungen. Daneben ist das Einsatzgebiet von Ameisensäure als Ausgangstoff für Chemikalien oder als mikrobielle Kohlenstoffquelle sehr vielseitig und die Verbindung erfreut sich zunehmenden Interesses.
Die Natur hält biologische Katalysatoren (Enzyme) für die Reduktion von CO2 bereit. Die Gruppe der obligat anaeroben, acetogenen Bakterien verwendet so genannte Formiatdehydrogenasen als CO2-Reduktasen, um CO2 im Wood-Ljungdahl-Weg (WLP) der Bakterien fixieren zu können. Diese Enzyme katalysieren die reversible 2-Elektronen Reduktion von CO2 zu Ameisensäure. Kürzlich konnte aus den beiden Vertretern A. woodii (mesophil) und T. kivui (thermophil) ein neuartiger, cytoplasmatischer Enzymkomplex isoliert werden. Dieser Enzymkomplex koppelt die Reduktion von CO2 direkt an die Oxidation von H2 und wird deshalb als Wasserstoff-abhängige CO2-Reduktase bezeichnet (engl. hydrogen-dependent CO2 reductase, HDCR). Die HDCR katalysiert dabei die reversible Hydrogenierung von CO2 zu Formiat mit annähernd gleicher Kinetik und gleichen Umsatzraten. Die bei der CO2 Reduktion erreichten Umsatzraten übertrafen dabei bisherige chemische als auch biologische Katalysatoren um mehre Größenordnungen.
Im Hinblick auf die besonderen katalytischen Eigenschaften der HDCRs wurde in dieser Arbeit die biotechnologische Anwendbarkeit der Enzyme als Biokatalysatoren zur Speicherung und Sequestrierung von H2 und CO2 in Form von Ameisensäure untersucht. Im Speziellen wurde ein HDCR-basiertes Ganz-Zell-System für das thermophile Bakterium T. kivui entwickelt. Um eine Ganz-Zell basierte Umwandlung von H2 und CO2 zu Formiat zu gewährleisten, wurde zuvor die Weiterverwertung des Formiats zu Acetat im WLP gestoppt. Durch eine Reduktion des zellulären ATP-Gehalts konnte eine weitere Prozessierung des aus der HDCR-Reaktion gebildeten Formiats im Zellstoffwechsel des Bakteriums unterbunden werden. Die Formiatbildung aus H2 und CO2 wurde in Zellsuspensionen von T. kivui untersucht und charakterisiert. Hier zeigten T. kivui Zellen die höchste spezifische Formiatbildungsrate, die bis dato in der Literatur genannt wurde. Ebenfalls wurde in dieser Arbeit die Umwandlung von Synthesegas (H2 + CO2 und CO) und CO zu Formiat geprüft. Bioenergetisch entkoppelte und auf CO-adaptierte T. kivui Zellen konnten in der Tat Synthesegas exklusiv zu Formiat umsetzen. Um die CO-Verwertung zu Acetat und Formiat im Stoffwechsel der Rnf- (A. woodii) und Ech-Acetogenen (T. kivui) verstehen zu können, wurden Mutanten von Δhdcr, ΔcooS, ΔhydBA, Δrnf and Δech2 von A. woodii und T. kivui zur Hilfe genommen. In beiden Organismen war die CO-basierte Formiatbildung vom Vorhandensein eines funktionalen HDCR-Enzymkomplexes abhängig.
Für eine mögliche biotechnologische Anwendung wurde die Maßstabsvergrößerung des Ganz-Zell-Systems angestrebt und hin zum Bioreaktormaßstab mit kontrollierten Prozessbedingungen skaliert. Diese Arbeit demonstriert die effiziente Umwandlung von H2 und CO2 zu Formiat und vice versa unter Verwendung eines Rührkesselreaktors. Der Prozess zeigte eine Effizienz von 100% für die Umwandlung von CO2 zu Formiat und spezifische Raten von 48.3 mmol g-1 h-1 wurden von A. woodii Zellen erreicht. Die spezifische H2-Produktionsrate (qH2) aus der Ameisensäureoxidation betrug 27.6 mmol g-1 h-1 und mehr als 2.12 M Ameisensäure konnte über einen Zeitraum von 195 h oxidiert werden. Wichtige Parameter der Enzymkatalyse wie Wechselzahl (engl. turnover frequency, TOF) und katalytische Produktivität (engl. turnover number, TON) wurden ebenfalls im Versuch bestimmt. Basierend auf dem generierten Prozessverständnis und der effizienten Reversibilität der katalysierten Reaktionen wurde abschließend ein Ganz-Zell-basierter Bioreaktoraufbau gewählt, der die vielfache Speicherung und Freisetzung von H2 in einem einzigen Rührkesselreaktor und unter Verwendung des gleichen Katalysators ermöglicht. Über eine Prozesszeit von 2 Wochen und 15 CO2 Reduktions-/Formiat Oxidations-Zyklen konnte so im Mittel 330 mM Formiat produziert und oxidiert werden.
Zusammenfassend thematisiert diese Arbeit die biotechnologische Anwendbarkeit eines Ganz-Zell-Systems zur Speicherung und Sequestrierung von H2 und CO2 in Form von Formiat und vice versa. Die katalytische Aktivität der betrachteten Organismen fußt dabei auf der Aktivität eines neuartigen Enzymkomplexes, der erstmals in der Gruppe der acetogenen Bakterien entdeckt wurde. Der als Wasserstoff-abhängige CO2-Reduktase bezeichnete Enzymkomplex könnte die zukünftige Konzipierung Enzym-inspirierter und effizienter chemischer Katalysatoren vorantreiben. Auch der Einsatz des Enzyms/der Zellen in so genannten Hydrogelen oder die Etablierung elektrochemischer Prozesse sind vorstellbar. Diese Arbeit stellt somit eine Basis für mögliche zukünftige Anwendungen des etablierten Ganz-Zell-Systems von A. woodii und T. kivui im Bereich der Wasserstoffökonomie dar.
The increasing demand of the high value ω-3 fatty acids due to its beneficial role for human health, explains the huge need for alternative production ways of ω-3 fatty acids. The oleaginous alga Phaeodactylum tricornutum is a prominent candidate and has been investigated as biofactory for ω-3 fatty acids, e.g. the synthesis of eicosapentaenoic acid (EPA). In general, the growth and the lipid content of diatoms can be enhanced by genetic engineering or are influenced by environmental factors, e.g. nutrients, light or temperature.
In this study, the potential of P. tricornutum as biofactory was improved by heterologously expressing the hexose uptake protein 1 (HUP1) from the Chlorophyte Chlorella kessleri.
An in situ localization study revealed that only the full length HUP1 protein fused to eGFP was correctly targeted to the plasma membrane, whereas the N-terminal sequence of the protein is only sufficient to enter the ER. Protein and gene expression data displayed that the gene-promoter combination was relevant for the expression level of HUP1, while only cells expressing the protein under the light-inducible fcpA promoter showed a significant expression. In these mutants an efficient glucose uptake was detectable under mixotrophic growth condition, low light intensities and low glucose concentrations leading to an increased cell dry weight.
In a second approach, the growth and lipid content of wildtype cells were analyzed in a small 1l photobioreactor. Here, a commercial F/2 medium and a common culture medium, ASP and modified versions were compared. There was neither a significant impact on the growth and lipid content in P. tricornutum cells due to the supplemention of trace elements nor due to elevated salt concentrations in the media. In a modified version of ASP medium, with adapted nitrate and phosphate concentration a constantly high biomass productivity was achieved, yielding the highest value of 82 mg l-1 d-1 during the first three days. This was achieved even though light intensity was reduced by 40%. The differences in biomass productivity as well as the lipid content and the lipid composition underlined the importance of the choice of culture medium and the harvest time for enhanced growth and EPA yields in P. tricornutum.
With 5-10 newly diagnosed patients per 100,000 people every year, glioblastoma is the most common malignant primary brain tumor. Despite extensive research activity in the last decades, clinical effectiveness of the currently available therapy standard of surgery, radiochemotherapy and tumor-treating fields is still limited and mean survival rates in unselected collectives are only about one year. Accordingly, there is an urgent need to explore new therapeutic options. The current standard of care includes surgery followed by radiation therapy in combination with the alkylating chemotherapeutic agent Temozolomide. Even with successful initial therapy, tumor recurrence is still inevitable. Currently, there are no defined recommendations for clinical management of the disease in the event of tumor recurrence. Only 20-30% of patients qualify for a second surgical resection, while other options include retreatment with Temozolomide, CCNU (Lomustine) or Regorafenib and enrollment in a clinical trial.
The development of immunotherapies for glioblastoma, in particular, has been the focus of intense preclinical and clinical efforts. However, low numbers of mutations and a highly immunosuppressive tumor microenvironment result in glioblastoma being considered an immunologically “cold” tumor. Strategies successfully established in mutagen-induced tumors with antibodies directed against the PD-1, PD-L1 or CTLA-A4 immune checkpoints have therefore failed in glioblastoma.
Cellular immunotherapies based on chimeric antigen receptor (CAR)-technology have emerged as an alternative powerful option to tackle immunologically “cold” tumors. Several CAR-T cell products targeting glioma antigens have been developed and some evidence of clinical activity has been demonstrated. Natural killer (NK) cells as carriers of CAR constructs have several advantages over T cells, including a much lower risk of neurotoxicity and better interaction with immune cells in the microenvironment. Based on the human NK cell line NK-92, a clinical-grade product, suitable as an off-the-shelf therapeutic, has been developed. The NK-92/5.28.z clone (CAR-NK) expresses a CAR based on the HER2-specific antibody FRP5 in addition to signal-enhancing CD28 and CD3ζ domains. Similar to several other tumor entities, overexpression of the growth factor receptor HER2 is often found in glioblastoma patients. Because of its substantial role in the regulation of cell proliferation, survival, differentiation, angiogenesis and invasion, this receptor is classified as an oncogene. HER2 overexpression plays a major role in the malignant transformation of cells and its oncogenic potential has been studied in detail in breast cancer. However, HER2 expression was also found in up to 80% of glioblastomas, which correlates with an impaired probability of survival. Under physiological conditions, HER2 is not expressed in the adult central nervous system, making it a promising target antigen for glioblastoma immunotherapy.
In previous projects, it has already been shown that these CAR-NK cells exhibit a high and specific lytic activity towards HER2+ glioblastoma cells. While repetitive intratumoral injections of CAR-NK cells already significantly extended symptom-free survival in murine orthotopic xenograft models, CAR-NK cell therapy in immunocompetent mice promotes an endogenous anti-tumor immune response which improves tumor control and provides persisting anti-tumor immunity after therapy of early-stage tumors. However, in more advanced tumor models, efficacy is limited and induction of the checkpoint-molecule PD-L1 in response to CAR-NK-cell therapy was identified as a key mechanism of therapy resistance.
Immunotherapy employing the intravenous administration of checkpoint inhibitors has already revolutionized the treatment of various malignant diseases such as melanoma or lung cancer. In particular, the approach of cancer immunotherapy has focused on the systemic administration of antibodies directed against immune checkpoints such as PD-1, PD-L1 and CTLA-4. In glioblastoma, both tumor cells and microglia, the brain-resident macrophages, express PD-L1, which hinders the activation of CD8+ and CD4+ T cells. Therefore, immunotherapy directed against the PD-1/PD-L1 axis represents a promising approach for the treatment of glioblastoma. One problem, however, is the severe toxicity caused by the systemic effects of checkpoint inhibitors, since the immune response is stimulated not only in tumor tissue but also in healthy organs. Serious side effects such as colitis, hepatitis, pancreatitis or hypophysitis, including numerous deaths, have been reported.
This study aimed to improve the efficacy of CAR-NK cell therapy by combining it with adeno-associated virus (AAV)-mediated transfer of anti-PD-1 antibodies as a strategy to enable local combination therapy to control intracranial tumors.
AAVs carrying a payload coding for an anti-PD-1 immunoadhesin (aPD-1) retargeted to HER2-expressing cells by fusion of so-called Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) with a viral capsid protein were employed for this to focus checkpoint inhibitor therapy to the tumor area, resulting in high intratumoral and low systemic drug concentrations. ...
Sleep is one of the fundamental requirements of all animals from nematodes to humans. It appears in different formats with shared features such as reduced muscle activities and reduced responsiveness to the environment. Despite the long history of sleep research, why a brain must be taken offline for a large portion of each day remains unknown. Moreover, sleep research focused on mammals and birds reveals two stages, rapid-eye-movement (REM) and slow-wave (SW) sleep, alternating during sleep. Whether these two stages of sleep exist in other vertebrates, particularly reptiles, is debated, as is the evolution of sleep in general.
Recordings from the brain of a lizard, the Australian bearded dragon Pogona vitticeps, indicate the presence of two electrophysiological states and provides a better picture of their sleep. Local field potential (LFP) signals, head velocity, eye movements, and heart rate during sleep match the pattern of REM and SW sleep in mammals. The SW and REM sleep patterns that we observed in lizards oscillated continuously for 6 to 10 hours with a period of 80-100 seconds when the ambient temperature was ~27°C. Lizard SW dynamics closely resemble those observed in rodent hippocampal CA1, yet originated from a brain area, the dorsal ventricular ridge (DVR), that does not correspond anatomically or transcriptomically to the mammalian hippocampus. This finding pushes back the probable evolution of these dynamics to the emergence of amniotes, at least 300 million years ago.
Unlike mammals and birds, REM and SW sleep in lizards occupy an almost equal amount of time during sleep. The clock-like alternation between these two sleep states was found initially by measuring the power modulation of two frequency bands, delta and beta. I recorded the full-band LFP and found an infra-slow oscillation (ISO) in the frequency range between 5 and 20 milli-Hz during sleep. The magnitude of ISO increased during sleep and decreased during both wakefulness and arousal during sleep. The up- and down-states of ISO were synchronized with the sleep state alternating rhythm but with a significant time lag dependent on the locations of the recording electrodes. Multi-site LFP recordings indicated that this ISO is a putative propagation wave sweeping extremely slowly, 30-67 µm/sec, from the posterior-dorsal pole to the anterior-ventral pole of the DVR.
Previous studies in other animals showed that brainstem areas such as the locus coeruleus, laterodorsal tegmentum, and periaqueductal gray are involved in sleep states regulation. It is sadly impossible to carry out in vivo recordings in the lizard brainstem without severely affecting them and their quality of life. I thus carried out ex vivo recordings in both DVR and brainstem. Pharmacological stimulation of the brainstem could reversibly silence one distinct EEG pattern characteristic of SW sleep, the sharp-wave and ripple complex, in DVR. An ISO could be recorded simultaneously in both DVR and brainstem. From data collected in both intact and split ex vivo brains, I concluded that there are independent ISO generators in at least two areas, the brainstem and the telencephalon. Their signals may normally be synchronized by long-range connections. The DVR ISO leads the brainstem ISO by ~29 sec. Optogenetic stimulation of brainstem neurons was able to disrupt the ISO in DVR reversibly.
In conclusion, the lizard brain offers a relatively simple model system to study sleep. Despite a diversity of results in different lizard species, my results revealed a number of new findings. Relevant for sleep research in general: 1) REM and SW sleep exist in a reptile. Since they also exist in birds and mammals, they probably existed in their common amniote ancestor, if not earlier. 2) REM and SW occupy equal amounts of time during sleep (50% duty cycle), a unique feature among all described sleep electrophysiological patterns, suggesting the possible existence of a simple central pattern generator of sleep, possibly ancestral. 3) I discovered the existence, in the local field potential, of an infra slow oscillation with extremely slow propagation, locked to the SW-REM alternating rhythm. The causes and mechanisms of this ISO remain to be understood. To my knowledge, the correlation between sleep states and a slow rhythm has only been reported in human scalp EEG recordings so far.
Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved cytosolic isobutanol biosynthesis
(2021)
The finite nature of fossil resources and the environmental problems caused by their excessive usage requires alternative approaches. The transformation from a fossil based economy to one based on renewable biomass is called a “bioeconomy”. To substitute fossil resources, various microorganisms have already been modified for the biosynthesis of valuable chemicals from biomass. However, the development of such efficient microorganisms at an industrial scale, remains a major challenge. The most prominent and robust microorganism for industrial production is the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is known to produce ethanol that is used as renewable biofuel. However, S. cerevisiae is also naturally able to produce isobutanol in small amounts. Isobutanol is favoured as a biofuel compared to ethanol due to its higher octane number and lower hygroscopicity, which makes it more suitable for application in conventional combustion engines. In S. cerevisiae, the biosynthesis of isobutanol is permitted by the combination of mitochondrial valine synthesis (catalysed by Ilv2, Ilv5 and Ilv3) and its cytosolic degradation (catalysed by Aro10 and Adh2). The different compartmentalisation of the two pathways limit isobutanol biosynthesis. Thus, Brat et al. (2012) were able to increase the isobutanol yield up to 15 mg/gGlc by cytosolic re localisation of the enzymes Ilv2Δ54, Ilv5Δ48 and Ilv3Δ19 (cyt-ILV), with simultaneous deletion of ilv2. This corresponds to approximately 3.7% of the theoretical yield of 410 mg/gGlc, implying existing limitations in isobutanol biosynthesis, which have been investigated in this work.
For yet unknown reasons, isobutanol was only produced by S. cerevisiae in a valine free medium, according to Brat et al. (2012). This work shows that this can be attributed to the catalytic activity of Ilv2Δ54, which acted as growth inhibitor to S. cerevisiae. By this logic, a negative selection on the ILV2∆54 gene was exerted, which made the ilv2 deletion and simultaneous valine exclusion necessary to maintain the functional expression of toxic ILV2∆54. Furthermore, it was shown that valine exclusion is not mandatory due to the feedback regulation of Ilv2, permitted by Ilv6. Rather, increased isobutanol yield was observed when cytosolic Ilv6∆61 was expressed in the valine free medium, which is explained by the enhanced regulation of Ilv2Δ54 by Ilv6∆61 when BCAA are absent. Isobutanol biosynthesis is neither redox nor NAD(P)H co factor balanced. It was seen that co factor imbalance could be mitigated by the expression of an NADH oxidase (NOX), but not by expression of the NADH dependent ilvC6E6, since the latter showed low in vivo activity. Furthermore, it was seen that NAD(H) imbalance did already limit isobutanol biosynthesis, but the NADP(H) imbalance did not. Another limitation of cytosolic isobutanol biosynthesis is the secretion of the intermediate 2‑dihydroxyisovalerate, which then no longer is taken up by S. cerevisiae, causing a reduced isobutanol yield. This is attributed to insufficient Ilv3∆19 activity, due to poor iron sulphur cluster apo protein maturation. Therefore, it was aimed to replace Ilv3∆19 by heterologous dihydroxyacid dehydratases. Even though some of the enzymes were functionally expressed, none showed better in vivo activity than Ilv3∆19. Therefore, the Ilv3∆19 apo protein maturation was improved. This was achieved by the genomic deletion of fra2 or pim1 as well as by the cytosolic expression of Grx5∆29.
In addition to the isobutanol pathway, S. cerevisiae was optimised for isobutanol biosynthesis by rational and evolutionary engineering. For this purpose, the genes which are necessary for isobutanol production were integrated into the ilv2 locus, and the resulting strain was evolved in a medium containing the toxic amino acid analogue norvaline. Evolved single colonies were isolated, which presented improved growth and increased isobutanol yields (0.59 mg/gGlc) in a valine free medium, as compared to the initial strain. This is explained by a gene dosage effect which occurred during the evolutionary engineering experiment. In collaboration with Dr. Wess, the genes ilv2, bdh1/2, leu4/9, ecm31, ilv1, adh1, gpd1/2 and ald6 were cumulatively deleted in CEN.PK113 7D to block competing metabolic pathways. The resulting strain JWY23 achieved isobutanol yields up to 67.3 mg/gGlc, when expressing the cyt ILV enzymes from a multi copy vector. The most promising approaches of this work, namely the deletion of fra2 and the expression of Grx5∆29, Ilv6∆61, and NOX, were confirmed in this JWY23 strain. The highest isobutanol yield from this work was observed at 72 mg/gGlc for Ilv6∆61 and cyt ILV enzymes expressing JWY23, which corresponds to 17.6% of the theoretical isobutanol yield.
Isobutyric acid (IBA) is a by product of isobutanol biosynthesis, but it is also considered a valuable platform chemical. Therefore, the approaches that improved isobutanol biosynthesis were applied to the biosynthesis of IBA in S. cerevisiae. The highest IBA yield of 9.8 mg/gGlc was observed in a valine free medium by expression of cyt ILV enzymes, NOX and Ald6 in JWY04 (CEN.PK113 7D Δilv2; Δbdh1; Δbdh2; Δleu4; Δleu9; Δecm31; Δilv1). This corresponded to an 8.9 fold increase compared with the control and is, to our best knowledge, the highest IBA yield reported to date for S. cerevisiae.
In recent years, several neuronal differentiation protocols were published that circumvent the requirement of embryoid body (EB) formation under serum-deprivation and simplified medium conditions. But a neuronal default model to establish an approach that works efficiently for all pluripotent cells and neuronal precursors is still lacking. Whether such a default neural mechanism exist and how this is implemented across a broad spectrum of cell source, is addressed in several studies and still controversially discussed. It was proposed that the default neuronal fate is initiated in the absence of extrinsic signals and is achieved by eliminating extracellular inhibitors of neuroectodermal fate and suppressing cell-cell signalling through limited cell density. Previous studies reported that ESC and ECC grown at low density and in absence of exogenous factors or feeder layers die within 24 h but acquire a neural identity as indicated by expression of the neural marker Nestin. Thus, this application is not suitable for generating neural cultures. Furthermore, it was reported that P19 cells survive and express neuroectodermal marker genes in serum-free DMEM/F12 medium containing transferrin, insulin, and selenite, although no neurites were identified.
Based on this background, in this study, a novel approach to induce neuronal differentiation in vitro was developed that implements a nutrient-poor environment, which, in contrast to previous studies, ensures the survival of neuronally differentiated cells over a long period of time and allows normal formation of neurites. Neither the formation of free-floating aggregates nor supplementation of growth factors or known inducers was required to establish a reliable neuronal differentiation protocol. A simple medium, consisting of DMEM/F12+N2 that was highly diluted in salt solution, was sufficient to drive a fast neuronal differentiation in monolayer cultures. Serum deprivation and strong dilution of DMEM/F12+N2 medium cause a nutrient-poor environment in which the influence of growth factors and inducers is minimized. This medium creates a metabolically defined environment that is presumably free of extrinsic signals that prevent the decision of neuronal fate. Analysis of the medium components discovered no actual inducer. Hence, it was suggested that the metabolic composition of the medium exclusively covers specific cell requirements of neurons, therefore ensures their survival, and drives the switch from pluripotent cells to neurons. The self-developed method was established by usage of the murine embryonal carcinoma cell line P19 and could be transferred to murine ESC. Consequently, the method could provide a feasible protocol for a generally valid neuronal default model.
The established protocol provides several advantages such as the possibility to generate stable pure neuronal cultures by a fast, simple, and highly reproducible one-step induction under defined medium conditions with a minimum of exogen effectors. The method is characterised by clear and steady medium conditions that makes the investigation of specific cell requirements during differentiation accessible. It is therefore expected to be a useful tool to investigate the molecular basis of neuronal differentiation as well as for high throughput screenings. The phenotype of mature postmitotic neurons was arising within one week and cultures were shown to stay stable at least for three weeks. The neuronal identity was confirmed by expression of neuronal markers through immunofluorescence staining and mass spectrometry analysis. Furthermore, increased levels of axon markers were detected in early neuronal differentiation and functionality of the synapses of the P19-derived neurons was ascertained by detection of calcium activity. Axonal laser ablation, immediately followed by fast regrowth of connections in the neuronal network, revealed a strong regeneration potential under the given conditions. Furthermore, the generated neurons showed a morphologically distinct phenotype and the formation of neural rosettes. Immunofluorescence staining demonstrated the generation of pure and homogeneous neuronal cultures, free of glial cells.
Retinoic acid (RA) plays an essential role in cell signalling during embryogenesis and efficiently induces neuronal differentiation in vitro in a concentration dependent manner. Neither retinol nor retinoic acid was included in any of the components of the self-prepared medium in this work. However, I observed, dependence on RARβ- and/or RARγ-regulated RA signalling in serum-free monolayer cultures. Nevertheless, neuronal differentiation in serum-free monolayer cultures was assumed to be RARα-independent because (i) RARα was slightly downregulated after neuronal induction, (ii) the truncated RARα of the RAC65 mutant had no effect on induction efficiency, and (iii) a pan-RAR inhibitor suppressed neuronal differentiation. In contrast to serum-free monolayer cultures, the truncated RARα prevented neuronal differentiation by application of the conventional protocol where cells are grown in free floating cell aggregates in serum-containing medium. Proteome analysis of P19 cells, treated by the self-developed differentiation protocol over five days showed increased levels of cellular RA binding proteins that mediate the cellular RA transport and are involved in canonical as well as non-canonical RA signalling.
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1. Das Wachstum und die Fähigkeit zur Butyratproduktion von E. callanderi KIST612 wurde in geschlossenen Batch-Kulturen mit den Substraten Glukose, Methanol, Formiat, H2 + CO2 und CO untersucht. E. callanderi KIST612 zeigte sich nur bei Wachstum auf 20 mM Glukose oder 20 mM Methanol in der Lage, Butyrat in größeren Mengen (3,7 – 4,3 mM) zu produzieren. Das Hauptprodukt bei allen untersuchten Wachstumssubstraten war jedoch Acetat.
2. In bioinformatischen Analysen des Genoms von E. callanderi KIST612 konnte nur eine A1AO-ATP-Synthase gefunden werden, welche eine V-typ c-Untereinheit bestehend aus 4 TMH‘s mit nur einer Na+-Bindestelle aufweist. Diese konnte aus gewaschenen Membranen von E. callanderi durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE) sowie einer Größenausschluss-Chromatographie (Superose 6) bis zur apparenten Homogenität gereinigt werden. Nach Produktion einzelner Untereinheiten (A, B, C, D, E, F und H) in E. coli und Generierung von Antikörpern, konnten alle Untereinheiten (A, B, C, D, E, F, H, a sowie c) in der gereinigten Enzympräparation immunologisch oder mittels „Peptide-Mass-Fingerprinting“ nachgewiesen werden. Es konnte somit erstmals eine A1AO-ATP-Synthase aus einem mesophilen Organismus ohne Verlust von Untereinheiten gereinigt werden.
3. Der Gesamtkomplex wies unter nativen Bedingungen eine molekulare Masse von ca. 670 kDa auf. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte sich anhand der hantelförmigen Strukturen, dass die A1AO-ATP-Synthase als intakter Gesamtkomplex gereinigt werden konnte.
4. Die gereinigte A1AO-ATP-Synthase wurde zunächst anhand ihrer ATP-Hydrolyse-Aktivität biochemisch charakterisiert. Die ATP-Hydrolyse-Aktivität hatte ein pH-Optimum von 7 – 7,5 und ein Temperaturoptimum bei 37 °C. Durch Messung der ATPase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Mengen an Na+ konnte die vorhergesagte Na+-Abhängigkeit des Enzyms nachgewiesen werden. Zudem zeigten Hemmstoffexperimente mit DCCD, dass dieser Inhibitor mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert. Dies bestätigte nochmals, dass das Enzym funktionell gekoppelt gereinigt werden konnte.
5. Zur weiteren Untersuchung der Ionenspezifität wurde der an die ATP-Hydrolyse gekoppelte Ionentransport durch Rekonstitution des Enzyms in Liposomen und anschließender Messung des Na+- oder H+-Transports gemessen. In den Proteoliposomen konnte mit Hilfe von 22Na+ gezeigt werden, dass das Enzym Natriumionen translozieren kann. Während in Anwesenheit des Natriumionophors ETH 2120 kein 22Na+-Transport beobachtet werden konnte, führte die Anwesenheit des Protonophors TCS zu einer geringfügigen Stimulation der 22Na+-Translokation. Insgesamt konnte ein primärer Na+-Transport nachgewiesen werden, welcher von der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi katalysiert wird.
6. Durch Rekonstitution der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi in Liposomen konnte erstmals biochemisch nachgewiesen werden, dass ein solches Enzym trotz seiner V-Typ c-Untereinheit in der Lage ist, ATP zu synthetisieren. Durch die Zugabe von Ionophoren (ETH 2120 und TCS) konnte der elektrochemische Ionengradient aufgehoben werden, wodurch keine ATP-Synthese beobachtet werden konnte. Der erstmalige Nachweis der ATP-Synthese wurde bei einem ΔµNa+ von 270 mV erbracht.
7. Die ATP-Synthese zeigte sich ebenfalls abhängig von der Na+-Konzentration. Der KM-Wert lag bei 1,1 ± 0,4 mM und war vergleichbar mit dem für die ATP-Hydrolyse ermittelten Wert. Ebenso konnte für die ATP-Synthese-Richtung gezeigt werden, dass DCCD mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert.
8. Um den biochemischen Nachweis zu erbringen, dass die A1AO-ATP-Synthase auch unter physiologisch relevanten Potentialen zur ATP-Synthese befähigt ist, wurde der energetische Schwellenwert der ATP-Synthese bestimmt. Dieser betrug 87 mV als Triebkraft für ΔpNa, 94 mV als Triebkraft für Δψ und 90 mV als Triebkraft für ΔµNa+. Erstaunlicherweise konnte die ATP-Synthese der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 sowohl durch Δψ als auch ΔpNa angetrieben werden. Unterschiedliche Kombinationen von Δψ und ΔpNa führten zu dem gleichen energetischen Schwellenwert; Δψ und ΔpNa waren im Enzym aus E. callanderi KIST612 äquivalente Triebkräfte.
9. Der energetische Schwellenwert der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 wurde mit dem der F1FO-ATP-Synthasen aus A. woodii, E. coli und P. modestum verglichen. Dazu wurden die Enzyme im ATP-Synthase-defizienten E. coli-Stamm DK8 produziert und anschließend durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Einbau der Enzyme in Liposomen waren alle Enzyme in der Lage, ATP als Reaktion auf ΔµNa+ (A. woodii und P. modestum) oder ΔµH+ (E. coli) zu synthetisieren. Im Vergleich zum Enzym aus E. callanderi zeigten sich zwei auffällige Unterschiede. Erstens war keine der F1FO-ATP-Synthasen in der Lage, ΔpNa/ΔpH als alleinige Triebkraft zu nutzen. Während die ATP-Synthese in den Enzymen aus E. coli und P. modestum nur durch ΔµH+ bzw. ΔµNa+ angetrieben werden konnte, konnte das Enzym aus A. woodii zusätzlich auch durch Δψ als einzige Triebkraft angetrieben werden.
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This work comprises the investigation of four different biosynthesis gene clusters from Xenorhabdus. Xenorhabdus is an entomopathogenic bacterium that lives in mutualistic symbiosis with its Steinernema nematode host and together they infect and kill insect larvae. Xenorhabdus is well known for the production of so-called specialised metabolites and many of these compounds are synthesised by non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) or NRPS-polyketide synthase (PKS)-hybrids. These enzymes are organised in a modular manner and produce structurally very diverse molecules, often with the help of modifying domains and tailoring enzymes. In general, the genes involved in the biosynthesis are organised in so-called biosynthetic gene clusters (BGCs) in the genome of the producing strain. Exchanging the native promoter with an inducible promoter, e.g. PBAD, allows the targeted activation of the BGC and in turn the analysis of the biosynthesis product via LC-MS analysis.
The first BGC investigated in this work is responsible for the biosynthesis of xenofuranones. Based on gene deletions, this work shows that the NRPS-like enzyme XfsA produces a carboxylated furanone intermediate which is subsequently decarboxylated by XfsB to yield xenofuranone B. The next step in xenofuranone biosynthesis is the O-methylation of xenofuranone B to yield xenofuranone A. A comparative proteomics approach allowed the identification of four methyltransferase candidates and subsequent gene deletions confirmed one of the candidates to be responsible for methylation of xenofuranone B. The proteome analysis was based on the comparison of X. szentirmaii WT and X. szentirmaii Δhfq because distinct levels of the methylated xenofuranone A were observed when the xfs BGC was activated in either WT or Δhfq strain. Hfq is a global transcriptional regulator whose deletion is associated with the down regulation of natural product biosynthesis in Xenorhabdus. The strong PBAD activation of the xfs BGC also allowed the detection of two novel xenofuranone derivatives which arise from incorporation of one 4-hydroxyphenylpyruvic acid as first or second building block, respectively.
PBAD based activation of the second BGC addressed in this work lead to the detection of a novel metabolite and compound purification allowed NMR-based structure elucidation. The molecule exhibits two pyrrolizidine moieties and was named pyrrolizwilline (pyrrolizidine + twin (German: “Zwilling”)). The BGC comprises seven genes and single gene deletions as well as heterologous expression in E. coli and NRPS engineering were conducted to investigate the biosynthesis. The first two genes xhpA and xhpB encode a bimodular NRPS and a monooxygenase which synthesise a pyrrolizixenamide-like structure, similar to PxaA and PxaB in pyrrolizixenamide biosynthesis. It is suggested that the acyl side chain incorporated by XhpA is removed by the α,β-hydrolase XhpG. The keto function is then reduced by two subsequent two electron reductions catalysed by XhpC and XhpD. One of these two reduced pyrrolizidine units most likely is extended with glyoxalate prior to non-enzymatic dimerisation with the second pyrrolizidine moiety. To finally yield pyrrolizwilline, L-valine is incorporated, probably by the free-standing condensation domain XhpF.
The third BGC investigated is responsible for the production of a tripeptide composed of β-D-homoserine, α-hydroxyglycine and L-valine and is referred to as glyoxpeptide. This work demonstrates that the previously observed glyoxpeptide derivative is derived from glycerol present in the culture medium. Furthermore, this work shows that the monooxygenase domain, which is found in an unusual position between motifs A8 and A9 within the adenylation domain, is responsible for the α-hydroxylation of glycine. It is suggested that the α-hydroxylation of glycine renders the tripeptide prone to hydrolysis via hemiacetal formation. Hence, the XgsC_MonoOx domain might be an interesting candidate for further NRPS engineering.
The fourth BGC addressed is responsible for the production of xildivalines and this work describes two additional derivatives which are detected only when the promoter is exchanged and activated in the X. hominickii WT strain but not in X. hominickii Δhfq. Deletion of the methyltransferase encoding gene xisE results in the production of non-methylated xildivalines. It remains to be determined when the N-methylation of L-valine takes place. It is discussed that the methyltransferase could act on the NRPS released product but also during the assembly. The peptide deformylase is not involved in the proposed biosynthesis as xildivaline production is detected in a ΔxisD strain. The PKS XisB features two adjacent, so-called tandem T domains. The inactivation of the first or the second T domain by point mutation causes decreased production titres of detected xildivalines in the respective mutant strain when compared to the wild type.
Clean water is fundamental to human health and ecosystem integrity. However, water quality deteriorates due to novel anthropogenic pollutants present at microgram per liter concentrations in urban water cycles (termed micropollutants). Wastewater treatment plants (WWTP) have been identified as major point sources for aquatic (micro-)pollutants. Chemical and ecotoxicological analyses have shown that conventional biological WWTPs do not fully remove micropollutants and associated toxicities, which is often because of mobile, polar and/or recalcitrant compounds and transformation products (TPs). To minimize possible environmental risks, advanced wastewater treatment (AWWT) technologies could be a promising mitigation measure. Multiple processes are therefore being developed and evaluated such as ozonation and ozonation followed by granulated activated carbon (GAC) or biological filtration. Assessing the performance of these combined AWWTs was the focus the TransRisk project. Within this project, this thesis accomplished four major goals.
Firstly, the preparation of (waste)water samples was optimised for in vitro bioassays. Acidification, filtration and solid phase extraction (SPE) were tested for their impact on environmentally relevant in vitro endocrine activities, mutagenicity, genotoxicity and cytotoxicity. Significantly different outcomes of these assays were detected comparing neutral and acidified samples. Sample filtration had a lesser impact, but in some cases retention of particle-bound compounds could have caused significant toxicity losses. Out of three SPE sorbents the Telos C18/ENV at sample pH 2.5 extracted highest toxicity, some undetected in aqueous samples. These results indicate that sample preparation needs to be optimised for specific sample matrices and bioassays to avoid false-positive or -negative detects in effect-based analyses.
Secondly, the above listed in vitro toxicities were monitored in a protected region for drinking water production in South-West Germany (2012-2015). Out of 30 sampling sites surface water and groundwater were the least polluted. Nonetheless, a few groundwater samples induced high anti-estrogenic activity that prompted further monitoring. The latter included a waterworks in which no toxicity was detected. Hospital wastewater also had elevated in vitro toxicities and hospitals are, thus, relevant intervention points for source control. The biological WWTPs were effective in removing most of the detected toxicity, and the selected bioassays proved to be pertinent tools for water quality assessment and prioritisation of pollution hotspots.
Thirdly, the in vivo bioassay ISO10872 based on Caenorhabditis elegans (C. elegans) was adapted for this thesis. Using this model, a median effect concentration (EC50) for reproductive toxicity of the polycyclic aromatic hydrocarbon β-naphthoflavone (β- NF) of 114 µg/L was computed which is slightly lower than reported in the scientific literature. β-NF induced cyp-35A3::GFP (a biomarker in transgenic animals) in a time and concentration dependent manner (≤ 21.3–24 fold above controls). β-NF spiked wastewater samples supported earlier hypotheses on particle-bound pollutants. Reproductive toxicity (96 h) and cyp-35A3 induction (24 h) of biologically treated and/or ozonated wastewater extracts and growth promoting effects of GAC/biologically filtered ozonated wastewater extracts were observed. This suggested the presence of residual bioactive/toxic chemicals not included in the targeted chemical analysis. It also highlighted the importance of integrating multiple (apical and molecular) endpoints in wastewater assessments.
Fourthly, five in vitro and the adapted C. elegans bioassay were integrated into a wastewater quality evaluation (developed within TransRisk). Out of the five AWWT options, ozonation (at 1 g O3,applied/g DOC, HRT ~ 18 min) combined with nonaerated GAC filtration was rated most effective for toxicity removal. All five AWWTs largely removed estrogenic and (anti-)androgenic activities, but not anti-estrogenic activity and mutagenicity, which even increased during ozonation. This has been observed in related studies and points towards toxic TPs. These results also emphasized the need for implementing an effective post-treatment for ozonation. The results from a parallel in vivo study with Lumbriculus variegatus and Potamopyrgus antipodarum conducted on site at the WWTP (using flow through systems) were in accordance with the C. elegans results. In this context, it is suggested to further implement C. elegans as sensitive, feasible and ecologically relevant model.
In conclusion, this thesis shows how optimised sample preparation, long-term (in vitro) environmental monitoring, sensitive and ecologically relevant (in vivo) bioassays as well as innovative evaluation concepts, are pivotal in improving the removal of micropollutants and their toxicities with AWWTs. Future research should further develop and evaluate measures at sewer systems, conventional biological, tertiary and other advanced treatment technologies, as well as sociopolitical strategies (e.g., source control or natural conservation) and restoration projects. The effect-based tools optimised in this thesis will support assessing their success.
Zur Evolution der Hirnmorphologie und Anpassungen an Extremhabitate im Taxon Poecilia (Teleostei)
(2020)
Diese Dissertation befasst sich mit den Auswirkungen kontrastierender Umweltbedingungen auf die Gehirnmorphologie von neotropischen Fischen der Gattung Poecilia, welche unterschiedlichen abiotischen sowie biotischen Stressoren ausgesetzt sind. Da das Gehirn der Teleostei ein energetisch kostspieliges Organ und viel plastischer ist als z. B. bei Säugetieren, stellt sich die Frage, wie die Gehirnanatomie durch divergierende ökologische Faktoren in verschiedenen Umgebungen geformt wird, die ´extreme´, ´ressourcenbeschränkte und günstige´ Umgebungen repräsentieren. Zur Beantwortung dieser Frage wurden intraspezifische Studien an freilebenden und Laborindividuen von Poecilia-Arten durchgeführt, um die evolutionäre und ökologische Formgebung des Gehirns besser verstehen zu lernen. Im ersten Teil der Arbeit wurden Gehirnvolumina verglichen zwischen reproduktiv isolierten Populationen des neotropischen Fisches Poecilia mexicana (Ntotal = 95), die in Dunkelheit leben (Cueva Luna Azufre), in einem nahegelegenen Oberflächenhabitat (El Azufre), welcher giftigen Schwefelwasserstoff enthält und einer Kombination aus beiden Stressoren Dunkelheit und H2S (Cueva del Azufre). In einer zweiten Studie wurde auf anatomische („konvergente“) Veränderungen im Teleost-Gehirn entlang eines natürlichen Gradienten von Sulfidkonzentrationen getestet. Hierfür wurden Gehirne (Ntotal = 100) von P. mexicana verglichen, die in drei Flusssystemen im Süden Mexikos unabhängig voneinander eine erhöhte Toleranz gegenüber Schwefelwasserstoff (H2S) entwickelt haben. Dazu gehörten eine phylogenetisch alte H2S-adaptierte Form (P. sulphuraria) und zwei P. mexicana Formen, welche frühere Stufen der Anpassung an H2S darstellen. Zur Überprüfung des Einflusses anderer abiotischer und biotischer Faktoren auf die Morphologie der Gehirnregionen wurde eine weitere Studie durchgeführt. Hierbei wurden die phänotypischen Variationen der Gehirnregionen und der Körpermorphologie von Poecilia vivipara-Populationen (Ntotal = 211) aus Lagunen des Restinga de Jurubatiba Nationalpark untersucht, die sich in abiotischen Umgebungsbedingungen, insbesondere in Salzgehalt, Wassertransparenz, Phosphat und Nitrat sowie biotischen Faktoren wie Prädatorendichte unterschieden. Die erste Studie zeigte lebensraumabhängige Unterschiede bei freilebenden Fischen. Bei Fischen, die in Dunkelheit ohne H2S (LA) oder in Oberflächenhabitaten mit H2S lebten, wurden vergrößerte telenzephale Lappen, kleinere Augen und optische Tekta gefunden. Fische aus der sulfidischen Höhle (CA) zeigten zusätzlich vergrößerte Corpus cerebelli. Der Vergleich mit den Gehirnen von Labor aufgezogenen weiblichen Fischen (Ntotal = 25) zeigt eine allgemeine Verringerung der Gehirngröße sowie eine geringe Abweichung der Gehirngröße zwischen Labor aufgezogenen und freilebenden Fischen. Auch in der zweiten Studie zeigten alle in H2S-haltigen Lebensräumen lebenden Fische kleinere Augen, ein kleineres optisches Tektum und ein kleineres Gehirnvolumen, jedoch größere Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen als Fische aus nicht-sulfidischen Lebensräumen. Flusssystem-spezifische Effekte wurden für die telenzephalen Lappen, das gesamte Gehirn und die Augengröße festgestellt, da die Geschlechter je nach Quelle des Flusssystems unterschiedlich auf das Vorhandensein von H2S reagierten. Die dritte Studie zeigt auch, dass andere Umwelteinflüsse bemerkenswerte Verschiebungen im Gehirn und in den Gehirnregionen verursachen können. Fische, die im Süßwasser leben, zeigten eine verringerte Gesamthirngröße, telenzephale Lappen, Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen. Darüber hinaus zeigten Fische aus Salzwasserlagunen (hypersalin), ein verringertes Volumen des optischen Tektum, während telenzephale Lappen, Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen im Vergleich zu Süßwasserfischen vergrößert waren. Im Brackwasser lebende Fische wiesen im Vergleich zu Süß- und Salzwasserfischen die größten Gehirnregion-Volumen auf. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse über die Lagunen hinweg auch Unterschiede in der Morphologie der Kopf- und Augendurchmesser. Bei Augengröße, Kopfgröße, optischem Tektum Volumen, Hypothalamusvolumen und dem Gesamthirnvolumen wurde ein sexueller Dimorphismus beobachtet. Die dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass die gefundenen Muster nahezu mit denen von H2S-Fischen identisch sind. Die ausgeprägten Unterschiede in den Hirnregionen zwischen freilebenden Fischen können als Teil der Mosaikentwicklung interpretiert werden. Die Ergebnisse der Laborpopulation zeigen jedoch eine hohe phänotypische Plastizität. Diese Studie unterstreicht damit die Bedeutung der Kombination der Untersuchung von freilebenden mit im Labor lebenden Individuen zur Beantwortung von Fragen der Gehirnentwicklung. Kleinere Augen und ein kleineres optisches Tektum, aber größere telenzephale Lappen wurden auch bei Fischen aus einem sulfidischen Oberflächenhabitat in der Nähe einer der Höhlen gefunden und sind den Ergebnissen zufolge das Resultat begrenzter Sehkraft in trüben sulfidischen Lebensräumen.
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Ziel dieser Arbeit war es, einen genaueren Einblick in die Rolle von PaCLPXP für den Energiemetabolismus von P. anserina zu erhalten und mögliche Komponenten zu identifizieren, welche wichtig für die Langlebigkeit der PaClpP-Deletionsmutante sind. Folgende neue Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden:
1. Die Substrat-Analyse durch eine Cycloheximid-Behandlung und anschließender Proteom-Analyse legte erfolgreich eine Reihe potentieller bisher nicht bekannter Substrate von PaCLPP offen. Interessanterweise waren unter den identifizierten Proteinen viele ribosomale Untereinheiten und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege des Energiemetabolismus zu finden. Am auffälligsten unter diesen Substraten war die extreme Anreicherung eines Retikulon-ähnlichen Proteins, das einen neuen Aspekt der möglichen molekularbiologischen Rolle von PaCLPP in P. anserina andeutet.
2. Durch die Zugabe von Butyrat zum Medium, konnte erfolgreich die Autophagie sowohl im P. anserina Wildtyp als auch in der PaClpP-Deletionsmutante reduziert werden. Diese Verminderung der Autophagie sorgt bei ΔPaClpP für eine Verkürzung der Lebensspanne. Dieser Effekt ist spezifisch für die PaClpP-Deletionsmutante, während die Auswirkung von Butyrat auf den Wildtyp nur marginal ist. Dieses Ergebnis untermauert frühere Analysen dieser Deletionsmutante, welche besagen, dass die Langlebigkeit von ΔPaClpP Autophagie abhängig ist (Knuppertz und Osiewacz, 2017).
3. Die Metabolom-Analyse von ΔPaClpP im Vergleich zum Wildtyp zeigt, dass das Fehlen der PaCLPP zu Veränderungen in der Menge der Metaboliten der Glykolyse und des Citratzyklus kommt. Außerdem sind die Mengen der meisten Aminosäuren und der Nukleotide betroffen. Diese Analyse beweist, dass das Fehlen dieser mitochondrialen Protease weitreichende Folgen für die ganze Zelle hat. Durch die signifikante Verringerung von ATP und die Anreicherung von AMP in jungen ΔPaClpP-Stämmen und durch den Umstand der gesteigerten Autophagie in dieser Mutante, fiel das Augenmerk auf die AMPK. Dieses veränderte AMP/ATP-Verhältnis ist ein Indiz für eine gesteigerte AMPK-Aktivität und könnte auch den Umstand der gesteigerten Autophagie in ΔPaClpP erklären.
4. Das Gen codierend für die katalytische α-Untereinheit der AMPK (PaSnf1) konnte erfolgreich in P. anserina deletiert werden. Das Fehlen von PaSNF1 führt zu einer reduzierten Wuchsrate, eine beeinträchtige weibliche Fertilität und eine verzögerte Sporenreifung. Es konnte gezeigt werden, dass die Autophagie infolge einer PaSnf1-Deletion nicht gänzlich unterdrückt wird, PaSNF1 allerdings für die Stress-induzierte Autophagie notwendig ist. Überraschenderweise führt die Abwesenheit von PaSNF1 zu einer verlängerten Lebensspanne im Vergleich zum Wildtyp. Die meisten Effekte infolge einer PaSnf1-Deletion konnten durch die Einbringung eines FLAG::PaSNF1-Konstrukts komplementiert werden.
5. Eine gleichzeitige PaSnf1 und PaClpP-Deletion führt zu eine unerwarteten, extremen Lebenspannenverlängerung, die die Verlängerung der Lebensspanne bei der PaClpP-Deletionsmutante noch übertrifft. Interessanterweise geht dieser Phänotyp nicht mit einer erhöhten Autophagie einher. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass das Fehlen von PaSNF1 sowohl in ΔPaSnf1 als auch in ΔPaSnf1/ΔPaClpP zu einer veränderten Mitochondrien-Morphologie im Alter führt. Die Abwesenheit von PaSNF1 verursacht, dass die Stämme auch im Alter (20d) noch überwiegend filamentöse Mitochondrien aufweisen. Zudem zeigen die drei analysierten Deletionsstämme (ΔPaSnf1, ΔPaClpP und ΔPaSnf1/ΔPaClpP) massive Einschränkungen wenn sie auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind.
6. Auffallend war, dass bei ΔPaSnf1, ΔPaClpP und bei ΔPaSnf1/ΔPaClpP die Stämme mit dem Paarungstyp „mat-“ langlebiger sind als die Stämme mit dem Paarungstyp „mat+“. Dieser Effekt ist bei der ΔPaSnf1/ΔPaClpP-Doppelmutante am stärksten ausgeprägt. Weitere Untersuchungen dazu ergaben, dass die Paarungstypen immer dann eine Rolle spielen, wenn die Stämme mitochondrialem Stress ausgesetzt, oder aber auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind. Verantwortlich für diese Unterschiede sind zwei rmp1-Allele, die mit den unterschiedlichen Paarungstyp-Loci gekoppelt sind und mit dem jeweiligen Paarungstyp-Locus vererbt werden (rmp1-1 mit „mat-“; rmp1-2 mit „mat+“).
Seit den 1950er Jahren hat sich Plastik als unverzichtbare Ressource im menschlichen Alltag etabliert. Als negative Folge dieses Booms wird seit einigen Jahrzehnten jedoch eine zunehmende Belastung aquatischer Ökosysteme mit Plastikmüll bzw. dessen Degradationsprodukten, sogenanntes „Mikroplastik“ (MP, < 5 mm) bzw. „Nanoplastik“ (NP, < 1 µm), beobachtet. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des aktuellen Vorkommens von MP in limnischen Gewässern, die Analyse der Interaktion zwischen MP und limnischen Wirbellosenarten und der daraus resultierenden Toxizität sowie eine erste Risikoabschätzung.
Das Vorkommen von Mikroplastik in limnischen Gewässern wurde exemplarisch anhand der Elbe als großes Fließgewässer in Deutschland untersucht. Durch die Auswertung von elf Probestellen entlang des Verlaufs der Mittel- und Unterelbe konnte gezeigt werden, dass die MP-Konzentrationen im Sediment (2,26x10^4 – 2,27x10^7 P m^-3) im Mittel fast 150.000-fach höher sind als in der Wasserphase (0,88–13,24 P m^-3). Sedimente sind somit eine Senke für MP. Die Zusammensetzung der Polymerarten sowie MP-Formen deuten zudem an, dass die Partikel sowohl aus diffusen wie auch aus Punktquellen (z.B. Industrieabwässer) stammen. Im globalen Vergleich können die MP-Konzentrationen in deutschen Fließgewässern z. Z. als durchschnittlich betrachtet werden. Allerdings muss insgesamt davon ausgegangen werden, dass die bisher bestimmten MP-Umweltkonzentrationen die realen Konzentrationen möglicherweise unterschätzen. So zeigte die Elbestudie, dass die Sedimentfeinfraktion < 100 µm einen bedeutenden Polymeranteil enthielt. Die meisten bisher durchgeführten Studien zur Bestimmung von MP-Partikeln in Flüssen haben Partikel < 100 µm jedoch nicht in ihrer Analyse berücksichtigt.
Die Interaktion von MP mit limnischer Biota wurde anhand der Artgruppen der Muscheln (Bivalvia), Schnecken (Gastropoda) sowie Krebstiere (Crustacea) näher untersucht. Die Intensität der Interaktion ist maßgeblich von der Aufnahme von MP durch die verschiedenen Arten abhängig. Anhand von zahlreichen Aufnahmestudien mit verschiedenen limnischen Arten, darunter den Muschelarten Dreissena polymorpha, Sinanodonta woodiana und Anodonta anatina, der Lungenschnecke Lymnaea stagnalis sowie der Amphipodenart Gammarus pulex, wurde nachgewiesen, dass die MP-Aufnahme von den Eigenschaften der exponierten Arten bzw. Individuen, den MP-Charakteristika sowie den Expositionsbedingungen abhängt. Die Experimente mit Muscheln verdeutlichten die rasche Aufnahme, aber auch Exkretion von MP-Partikeln innerhalb weniger Stunden. In allen drei Artgruppen war die Aufnahme konzentrationsabhängig mit zunehmender Aufnahme bei steigenden MP-Konzentrationen. Die Muschelexperimente zeigten jedoch auch, dass eine gleichzeitige Exposition mit anderen Partikeln (z.B. Nahrung) zu einer reduzierten Aufnahme führt. Auch die Größe der Testorganismen beeinflusste die Aufnahme: So nahmen im Fall der Muscheln und Krebse kleinere Individuen (bzw. im Fall der Muscheln auch Arten) relativ pro Körpermasse mehr MP-Partikel auf als größere Individuen bzw. Arten. Für alle untersuchten Arten wurde darüber hinaus gezeigt, dass die MP-Größe relevanten Einfluss auf die Menge an aufgenommenen Partikeln hat.
Ein Vergleich zwischen den Artgruppen zeigte, dass Muscheln als filtrierende Organismen in den Laboruntersuchungen bei gleicher Expositionskonzentration mehr MP aufnahmen als Krebse (Zerkleinerer) und Schnecken (Weidegänger). Im Gegensatz zu Muscheln nutzen Krebstiere und Schnecken allerdings die Grenzschicht zwischen Wasser- und Sedimentphase als Suchraum für ihre Nahrung und sind in der Umwelt (auf Grund des höheren MP-Vorkommens in Sedimenten) somit möglicherweise gegenüber höheren MP-Konzentrationen exponiert als Muscheln. Die Extrapolation der gewonnenen Labordaten sowie der Vergleich mit publizierten Umweltdaten legen allerdings nahe, dass das MP-Vorkommen in Individuen aller drei Artgruppen bisher auf einige wenige MP-Partikel begrenzt ist. Ausgeprägte Unterschiede zwischen den Artgruppen sind bisher nicht erkennbar.
MP-Toxizitätsstudien mit G. pulex, L. stagnalis sowie D. polymorpha konnten trotz der Berücksichtigung einer Vielzahl an Endpunkten (Mortalität, Reproduktion, Nahrungsaufnahme, oxidativer Stress, Energiereserven, Immunzellaktivität) und trotz des Einsatzes zum Teil sehr hoher MP-Konzentrationen weit oberhalb aktueller Umweltkonzentrationen nur sehr wenige MP-induzierte Effekte nachweisen, darunter eine Steigerung der Filtrationsaktivität (D. polymorpha) bzw. Veränderung der Immunfunktion von Hämolymphzellen (L. stagnalis).
Zur weiteren Risikoabschätzung wurden diese Studienergebnisse mit publizierten Daten für marine und limnische Muschel- und Krebsarten in Artenempfindlichkeitsverteilungen (Species Sensitivity Distributions, SSD) zusammengeführt und jeweils eine SSD für Muscheln und Krebstiere erstellt. Die Erstellung einer SSD nur für limnische Arten ist zum jetzigen Zeitpunkt auf Grund der geringen Datenlage noch nicht möglich.
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Human GLUTs represent a family of specialized transporters that facilitate the diffusion of hexoses through membranes along a concentration gradient. The 14 isoforms share high sequence identity but differ in substrate specificity and affinity, and tissue distribution. According to their structure similarity, GLUTs are divided into three classes, with class 1 comprising the most intensively studied isoforms GLUTs1 4. An abnormal function of different GLUT members has been related to the pathogenesis of various diseases, including cancer and diabetes. Hence, GLUTs are the subject of intensive research, and efforts concentrate on identifying GLUT-selective ligands for putative medical purposes and their application in studies aiming to further unravel the metabolic roles of these transporters.
The hexose transporter deficient (hxt0) yeast strain EBY.VW4000 is devoid of all its endogenous hexose transporters and unable to grow on glucose or related hexoses. This strain has proven to be a valuable platform to investigate heterologous transporters due to its easy handling, increased robustness, and versatile applications. However, the functional expression of GLUTs in yeast requires certain modifications. Single point mutations of GLUT1 and GLUT5 led to their functional expression in EBY.VW4000, whereas the native GLUT1 was actively expressed in EBY.S7, a hxt0 strain carrying the fgy1 mutation that putatively reduces the phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) content in the plasma membrane. GLUT4 was only actively expressed in the hxt0 strain SDY.022, which also contains the fgy1 mutation and in which ERG4 is additionally deleted. Erg4 is one of the late enzymes in the ergosterol pathway, and therefore SDY.022 probably has an altered sterol composition in its membrane.
The goal of this thesis was to actively express GLUT2 and GLUT3 in a hxt0 yeast strain, providing a convenient system for their ligand screening. A PCR-derived amino acid exchange in the sequence of GLUT3 enabled its functional expression in EBY.VW4000 and the unmodified GLUT3 protein was active in EBY.S7. Functional expression of GLUT2 was achieved by rational design. The extracellular loop between the transmembrane regions 1 and 2 is significantly larger in GLUT2 than in other class 1 GLUTs. By truncating this loop by 34 amino acids and exchanging an alanine for a serine, a GLUT3-like loop was implemented. The resulting construct GLUT2∆loopS was functional in EBY.S7. With an additional point mutation in the transmembrane region 11, GLUT2∆loopS_Q455R was also actively expressed in EBY.VW4000. Inhibition studies with the known GLUT inhibitors phloretin and quercetin showed a reduced transporter activity for GLUT2 and GLUT3 in uptake assays and growth tests when inhibitors were present, demonstrating that both systems are amenable for ligand screening experiments.
The newly established GLUT2 yeast system was then used to screen a library of compounds pre-selected by in silico screening. Thereby, eleven identified GLUT2 inhibitors exhibited strong potencies with IC50 values ranging from 0.61 to 19.3 µM. By employing the other yeast systems, these compounds were tested for their effects on GLUT1, and GLUTs3-5, revealing that nine of the identified ligands were GLUT2-selective. In contrast, one was a pan-class 1 inhibitor (inhibiting GLUTs1-4), and one affected GLUT2 and GLUT5, the two fructose transporting isoforms. These compounds will serve as useful tools for investigations on the role of GLUT2 in metabolic diseases and might even evolve into pharmaceutical agents targeting GLUT2-associated diseases.
Due to the beneficial effect of the putatively changed sterol composition in SDY.022 (by ERG4 deletion) on the functional expression of GLUT4, it was hypothesized that the presence of the human sterol cholesterol, or cholesterol-like sterols, might have a beneficial effect on GLUT expression, too. Thus, it was attempted to generate hxt0 strains that synthesize these sterols by genetic modifications targeting the ergosterol pathway. In the scope of these experiments, several strains with different sterol compositions were generated. Drop tests on glucose medium with the different strains expressing GLUT1 or GLUT4 revealed that the deletion of ERG6 is clearly advantageous for a functional expression of GLUT1 (but not GLUT4). This indicates that the methyl group at the ergosterol side chain (introduced by Erg6 and reduced by Erg4) negatively influences GLUT1 activity. However, this effect on GLUT1 activity was less pronounced than the putative altered PI4P content in EBY.S7.
Additionally, in this thesis, a new tool to measure glucose transport rates of transporters expressed in the hxt0 yeast system was developed to facilitate their kinetic characterization. For this, the pH-sensitive GFP variant pHluorin was employed as a biosensor for the cytosolic pH (pHcyt) by measuring the ratio (R390/470) of emission intensities at 512 nm from two different excitation wavelengths (390 and 470 nm). Sugar-starved cells exhibit a slightly acidic pHcyt because ATP production is depleted, reducing the activity of ATP-dependent proton pumps.
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My PhD work employed genetic and pharmacological manipulations, coupled with highresolution live imaging, to understand intercellular communications during zebrafish cardiovascular development. The heart is the first organ to form, and it is composed of several tissues, among which interactions are crucial. I identified two important interactions between muscular and non-muscular tissues in poorly characterized contexts, and the molecules required for the signalling. First, I discovered an important cellular and molecular crosstalk orchestrating the development of the cardiac outflow tract (i.e., the aortic root in mammals).
Endothelial-derived TGF-beta signalling controls the generation of the local extracellular matrix (ECM). The ECM in turn affects endothelial proliferation as well as smooth muscle cell organization (Boezio et al, 2020; Bensimon-Brito*, Boezio* et al, 2020). In my second project, I investigated the crosstalk between the epicardial layer and the myocardial wall. By generating epicardial-impairment models, I identified a novel role for the epicardium in regulating cardiomyocyte volume during heart development (Boezio et al, 2021). Ultimately, this research contributed to our understanding of how paracrine signalling controls the multicellular interactions integral to organogenesis.
Tissue translocation, multigenerational and population effects of microplastics in Daphnia magna
(2021)
The last century saw the widespread adoption of plastic materials throughout nearly every aspect of our lives. Plastics are synthetic polymers that are made up of monomer chains. The properties of the monomer in conjunction with chemical additives allow plastics to have a sheer endless variety of features and use cases. They are cheap, lightweight, and extremely durable. Plastic materials are often engineered for single-use and in conjunction with high production volumes and insufficient waste management and recycling across the globe, this leads to a large number of plastics entering the environment. Marine ecosystems are considered sinks. However, freshwater ecosystems as entry pathways are highly affected by plastic waste as well. Throughout the past decade, the impact of plastic waste on human and environmental health has received a lot of attention from the ecotoxicological community as well as the public. Small plastic fragments (< 1 mm called microplastics) are a large part of this emerging field of research. Within this, the water flea Daphnia magna is probably the most common organism that is used to assess microplastics toxicity. As a filter-feeding organism, it indiscriminately ingests particles from the water column and is thus highly susceptible to microplastics. For this thesis, we identified some gaps in the available data on the ecotoxicity of microplastics to daphnids. To illuminate some of those gaps the present thesis was aimed at five main aspects:
(1) Tissue translocation of spherical microplastics in Daphnia magna
(2) Investigation of the toxicity of irregularly shaped microplastics
(3) Multigenerational and population effects of microplastics
(4) Comparison of the toxicity of microplastics and natural particles
(5) Effects of particle-aging on microplastics toxicity
The thesis is comprised of three peer-reviewed articles and one so-far unpublished study as “additional results”. The first study was aimed at understanding tissue translocation of spherical microplastics to lipid storage droplets of daphnids. The crossing of biological membranes is discussed as a prerequisite to eliciting tissue damage and an inflammatory response. Previously, researchers reported the translocation of fluorescently labeled spherical microplastics to lipid storage droplets of daphnids, even though no plausible biological mechanism to explain this occurrence. Therefore, in order to learn more about this process and potentially illuminate the mechanism we replicated the study. We were able to observe a fluorescence signal inside the lipid droplets only after increasing the exposure concentrations. Nonetheless, it appeared to be independent of particles. This led to the hypothesis, that the lipophilic fluorescent dye uncoupled from the particles and subsequently accumulated in lipid storage droplets. The hypothesis was further confirmed through an additional experiment with a silicone-based passive sampling device showing that the fluorescence occurred both independent of particles and digestive processes. Accordingly, we concluded that the reported findings were a microscopic artifact caused by the uncoupling of the dye from the particles. Therefore, a fluorescence signal alone is not a sufficient proxy to assume that particles have translocated. It needs to be coupled with additional methods to ensure that the observation is indeed caused by the translocation of particles.
It is still unclear whether the toxicity profile of microplastics is different from that of naturally occurring particles or if they are “just another particle”, as there are innumerable amounts in the natural environment surrounding an organism. The goal of the second study was to compare the toxicity of irregularly shaped polystyrene microplastics to that of the natural particle kaolin. The environment is full of natural non-food particles that daphnids ingest more or less indiscriminately and therefore are well adapted to deal with. Daphnids have a short generation time and usually experience food limitation in nature. Therefore, short-term studies only looking at acute toxicity with ad libitum food availability are not representative of the exposure scenario in nature. For a more realistic scenario, we, therefore, used a four-generation multigenerational design under food limitation to investigate how effects translate from one generation to the next. We observed concentration-dependent effects of microplastics but not of natural particles on mortality, reproduction, and growth. Some of the effects increased from generation to generation, leading to the extinction of two treatment groups. Here, microplastics were more toxic than natural particles. At least part of this difference can be explained by physical properties leading to the quick sedimentation of the kaolin, while microplastics remained in the water column. Nonetheless, buoyancy and sedimentation would also affect exposure in the environment and are likely different for most microplastics than for most naturally occurring particle types.
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