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Angesichts heutiger Umweltprobleme ist die Stärkung positiver Mensch-Natur-Beziehungen wichtiger denn je. Zeitgenössische Umweltbildung zielt darauf ab, Motivation und Einstellungen zu fördern sowie eine grundlegende Wissensbasis zu schaffen (IUCN, UNEP, & WWF, 1991; Potter, 2010), um einen selbstbestimmten, verantwortungsvollen Umgang mit der Natur zu ermöglichen. Positiver Naturbezug und Umwelteinstellungen gelten als Basis für aktiven Umweltschutz. Direkte Naturerfahrungen gelten dabei als didaktische Möglichkeit, die Motivation für Umweltschutz zu festigen (Kaiser, Roczen, & Bogner, 2008). Einstellungen verändern sich im Laufe des Lebens und so kann das Alter eine wichtige Rolle bezüglich der Effektivität von Umweltbildungsprogrammen spielen (Ernst & Theimer, 2011). Auch Umweltwissen gilt als Grundlage von Umwelthandeln. Denn sinnliche Erfahrungen allein führen nicht zum Verständnis ökologischer Zusammenhänge (Frick, Kaiser, & Wilson, 2004; Liefländer, Bogner, Kibbe, & Kaiser, 2015). Die biologiedidaktische Forschung sieht Fakten-, Handlungs- und Effektivitäts-wissen als zentral für die Genese von Umwelthandeln (Frick, Kaiser, & Wilson, 2004). Isoliertes Fachwissen wiederum führt nach aktueller Erkenntnis auch nicht zur Entwicklung von Haltungen und Wertvorstellungen, welche unser Handeln beeinflussen (Barr, 2003; Finger, 2010; Leiserowitz, Kates, & Parris, 2005).
Bis heute sind altersbasierte Unterschiede bei Schülerinnen und Schülern bezüglich ihrer Naturverbundenheit und Umwelteinstellungen nicht hinreichend untersucht. Auch ist die nötige Dauer der Naturerfahrungen noch nicht nachgewiesen. Es gibt bislang keine Studie, die Umwelteinstellungen, -wissen und –handeln von Kindern verschiedener Regionen der Erde untersucht und Daten auf internationaler Ebene erhoben und ausgewertet hat. Die gezielte Integration der drei Umweltwissensarten in ein solch globales Umweltbildungsprojekt stellt eine zusätzliche bislang nicht angegangene Aufgabe dar. Die vorliegende Arbeit schließt diese Forschungslücken, indem sie auf internationaler Ebene jene Variablen mit einbezieht, die einen nahezu vollständigen Eindruck der Effektivität von Umweltbildung in verschiedenen Regionen, Sozialisationen und Altersklassen zulässt. So wird der Einfluss eines umfassenden Umweltbildungsprogramms auf Naturverbundenheit, Umwelteinstellungen und -wissen der verschiedenen Typen untersucht und ein Bezug zur eventuellen Veränderung des Umwelthandelns hergestellt. Dabei stehen sowohl traditionelle als noch unerforschte mögliche Einflussfaktoren im Fokus. Die Studie umfasst insgesamt 1454 Schülerinnen und Schüler aus Bangladesch, Malaysia, Deutschland und Singapur, die alle an dem Umweltbildungsprojekt „Global denken, lokal handeln – wir schützen unsere Umwelt!“ bzw. “Think global, act local – we protect our environment!“ teilgenommen haben.
Zur Messung der Naturverbundenheit diente Schulz’ INS-Skala (Inclusion of Nature in Self) (2002). Umwelteinstellungen wurden mit dem 2-MEV-Modell (Two Major Environmental Values) gemessen (Johnson & Manoli, 2011). Eine Skala zur Erhebung von Umweltwissen wurde eigens erstellt und hinsichtlich der drei Wissenstypen nochmals modelliert. Eine Skala zur Ermittlung von Umwelthandeln wurde auf Grundlage von Bögeholz (1999) erstellt. Alle Skalen waren Teil eines Fragebogens, welcher in Form eines Pre-, Post- und Follow-up-Test eingesetzt wurde. Kinder aus Parallelklassen, die nicht am Projekt teilnahmen, aber Klassenunterricht zu den jeweiligen Themen erhielten, dienten als Kontrollgruppen.
Die Ergebnisse bestätigen einen positiven Effekt außerschulischer Umweltbildung bezüglich der Entwicklung der untersuchten Variablen. So wurde nach der Teilnahme am eintägigen und auch nach dem fünftägigen Umweltbildungsprogramm eine signifikante Verstärkung des Naturbezugs gemessen, wohingegen die Kontrollgruppen keine messbare Veränderung zeigten. Jedoch nur die fünftägige Intervention führte auch zu nachhaltigen Veränderungen. Hierbei am stärksten beeinflusst wurden Kinder zwischen sieben und neun Jahren.
Bei der Untersuchung demographischer Einflussfaktoren auf Umwelteinstellung, -wissen und –handeln stellten sich das Wohnsitzland sowie die städtische bzw. ländliche Prägung der Wohngegend als entscheidend heraus. So waren dies die einflussreichsten Determinanten zur Vorhersage des Grundvorhandenseins sowie Veränderungen der untersuchten Variablen in Folge der Bildungsmaßnahme. Einzig bei der Entwicklung des Umwelthandelns schien die direkte Naturerfahrung unwesentlich, zeigten die Kontrollgruppen ähnlichen Wandel in ihrem aktiven Einsatz für die Umwelt. Im internationalen Vergleich scheint die komplexe Verkettung diverser einflussnehmender Faktoren, wie der Wohlstand des jeweiligen Staates, das generelle politische System sowie spezifische bildungspolitische Begebenheiten, den Erfolg von Umweltbildungsprogrammen mit zu bestimmen.
Die Daten zeigen, dass Faktenwissen Grundlage für Handlungs- und Effektivitätswissen ist. Alle Dimensionen wurden durch die Intervention signifikant gesteigert. Effektivitätswissen wuchs am stärksten. Auch das Umweltverhalten wurde positiv verstärkt. Jedoch ließen sich nur schwache Korrelationen zwischen den einzelnen Wissenstypen und Handeln feststellen. Zusammenfassend war das durchgeführte Bildungsprojekt erfolgreich in der Förderung von Naturverbundenheit sowie Umwelteinstellungen, -wissen und- handeln. Die Ergebnisse werden im Rahmen dieser Arbeit im Hinblick auf ihre Bedeutung für die schulische Umweltbildung sowie die didaktische Forschung erörtert.
Eine qualitative und quantitative Studie zum Einsatz der virtuellen Mikroskopie in der Schule
(2019)
Das Mikroskop stellt in der Alltagswelt ein Sinnbild für naturwissenschaftliches Arbeiten dar (Coleman 2009, Paulsen 2010). Im Bereich der Lehre eröffnet dieses Laborgerät das Eintauchen in die mikroskopische Dimension und besitzt eine wesentliche Rolle bei der damit verbundenen Erkenntnisgewinnung, insbesondere von funktionsmorphologischen Konzepten (Gropengießer & Kattmann 2008, Kremer 2002). Jedoch wird die Durchführung der klassischen Mikroskopie und damit die aktive Auseinandersetzung mit mikroskopischen Präparaten im schulischen (Biologie-)Unterricht durch verschiedene Faktoren erschwert. Zu den Limitierungen gehören beispielsweise die Verfügbarkeit geeigneter Mikroskope und Dauerpräparate, die aufwendige Vor- und Nachbereitungszeit sowie der zeitliche Aufwand bei der Herstellung hochwertiger mikroskopischer Frischpräparate. Die virtuelle Mikroskopie könnte diese Schwierigkeiten umgehen. Das virtuelle Mikroskop kann als eine Simulation verstanden werden, bei der die bildanalytischen Vorgehensweisen bei mikroskopischen Präparaten analog zur klassischen Mikroskopie nachvollzogen werden können (Gu & Oglivie 2005, Hentschel 2009). Hierbei umfasst das virtuelle Mikroskop ein Akquisitionssystem zum Einscannen und Digitalisieren mikroskopischer Präparate, einen Server zum Speichern und Bereitstellen der entstandenen virtuellen hochauflösenden Aufnahmen (WSI) sowie eine Bildbetrachtungssoftware auf einem Anwendungsrechner (Kalinski et al. 2006). Basierend auf einer Nutzerbefragung wurde eine Betrachtungssoftware programmiert, die hinsicht¬lich ihrer Benutzerfreundlichkeit und ihren Eigenschaften auf den schulischen Einsatz angepasst wurde. Um die Relevanz in diesem Anwendungsfeld zu testen, wurden die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit sowohl im Schülerlabor Goethe BioLab als auch in der universitären Lehre der Abteilung für Didaktik der Biowissen¬schaften der Goethe–Universität Frankfurt am Main durchgeführt. Der Schülerlabortag „Blut und das virtuelle Mikroskop“ wurde entwickelt, um die computerbasierte virtuelle Mikroskopie mit Schülern ergänzend zur klassischen Mikroskopie in einem fachlichen Kontext anzuwenden und zu erforschen.
Beruhend auf der Vergleichbarkeit beider Mikroskopiemethoden (Paulsen et al. 2010) lagen die Forschungsschwerpunkte neben der Nutzung der Software durch Schülerinnen und Schülern auf einer gegenüberstellenden Beurteilung beider mikroskopischer Verfahren von Schülern und Lehramtsstudierenden. Es wurden in diesem Zusammenhang drei zentrale Forschungsfragen formuliert.
Die erste Forschungsfrage untersucht das Nutzerverhalten der Schüler (n = 123) bei der virtuellen Mikroskopie mittels automatisch generierter Datensätze während der Anwendung der Bildbetrachtungssoftware. Die Analyse der Anwendungsdaten zeigt, dass das mikroskopische Sehen, insbesondere das Fokussieren auf relevante Bildbereiche, im virtuellen Humanblutausstrich angewandt wurde.
Die zweite Forschungsfrage untersuchte das aktuelle Interesses bei Schülern (n = 293) im direkten Vergleich zwischen virtueller und klassischer Mikroskopie. Dabei wurde das aktuelle Interesse aufgrund des engen Zusammenhangs zum Lernen (vgl. Krapp 1992a) als Indikator der Lernwirksamkeit gewählt. Die Erhebung erfolgte mittels eines Fragebogens. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass der Einsatz beider mikroskopischer Verfahren das aktuelle Interesse fördert, das emotionale und das wertbezogene Merkmal sich jedoch zugunsten der klassischen Mikroskopie signifikant unterscheiden.
Im Rahmen der dritten Forschungsfrage erfolgte eine Beurteilung der Vorteile virtueller Mikroskopie gegenüber der klassischen Mikroskopie von Schülern (n = 504) sowie Lehramtsstudierenden (n = 247). Hierbei diente ebenfalls ein Fragebogen als Grundlage der Erhebung. Die Auswertung zeigt, dass sowohl die Schüler als auch die Studierenden die Vorteile der virtuellen Mikroskopie klar erkennen. Es liegen jedoch signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen vor. Die Schüler bewerten die Vorteile betreffend der Förderung von Lernprozessen, des Erkennens von Strukturen und des mikroskopischen Zeichnens höher.
Zusammenfassend bestärken die Ergebnisse dieser Studie die Ansicht, dass das virtuelle Mikroskop nicht als Ersatz, sondern als sinnvolle Ergänzung zu der klassischen Lichtmikroskopie angesehen werden sollte (Bloodgood et al. 2006, Berg et al. 2016, Braun & Kearns 2008, Hufnagl et al. 2012, Mione et al. 2013, Santiago 2018, Scoville & Buskirk 2007). Dabei sollte die vorliegende Arbeit als Einstieg verstanden werden, um bestehende Forschungslücken zu verkleinern, damit ein Transfer der virtuellen Mikroskopie in den schulischen Kontext möglichst lernwirksam erfolgen kann.
Die Endometriose ist eine gynäkologische Erkrankung, bei der epitheliale und stromale Zellen des Endometriums Läsionen außerhalb des Uterus bilden, die in ihrem Aufbau dem Endometrium gleichen. Diese Läsionen, sowie deren zyklische Proliferation, führen zu Schmerzen bei betroffenen Frauen. In isolierten, invasiven Epithelzellen (EEC145T) einer Endometriose-Läsion konnte die Expression von Shrew-1 gezeigt werden. Auch in anderen zellulären Zusammenhängen fördert die Expression von Shrew-1 den invasiven Phänotyp. Shrew-1 ist ein Transmembranprotein, das in Epithelzellen mit den Adhärenzverbindungen assoziiert ist und Interaktionen mit β-Catenin und E-Cadherin eingeht. In MCF7-Zellen fördert die Expression von Shrew-1 die EGF-induzierte Internalisierung von E-Cadherin, welche zur Verminderung der Zell-Zell-Adhäsion führt. In 12Z- und HT1080-Zellen konnte eine Interaktion mit CD147 gezeigt werden. CD147 fördert die Aktivität von MMPs und in Shrew-1-überexprimierenden HT1080-Zellen konnte eine erhöhte Aktivität der MMP9 gezeigt werden. Shrew-1 wirkt somit auf die Invasivität von Zellen und ist gleichzeitig Teil der Adhärenzverbindung. Aus diesem Grund wird Shrew-1 eine modulatorische Rolle in diesem Kontext zugeschrieben.
In immunhistologischen Färbungen von Shrew-1 und E-Cadherin konnte in Adenomyose-Läsionen eine inverse Expression der beiden Proteine in einigen epithelialen Zellen gezeigt werden, die im Endometrium nicht detektiert werden konnten. In den epithelialen Endometriose-Zelllinien 12Z und 49Z, die kein E-Cadherin exprimieren und äquivalent zu der Zelllinie EEC145T sind, führte die Herunterregulation von Shrew-1 (Shrew-1 KD) zur Reexpression von E-Cadherin. E-Cadherin ist in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen an der Plasmamembran lokalisiert und interagiert mit β-Catenin, wodurch seine Assoziation mit den Adhärenzverbindungen wahrscheinlich ist. Die Herunterregulation von Shrew-1 führt zu einer verminderten Motilität und Invasivität der 12Z-Zellen, wobei die reduzierte Invasivität nicht alleine auf die Reexpression von E-Cadherin zurückgeführt werden kann. Es ist zu vermuten, dass das verminderte invasive Verhalten mit der ausbleibenden Interaktion von Shrew-1 mit CD147 zusammenhängt, welches die Aktivität von MMPs fördert.
Da Shrew-1 eine direkte Interaktion mit β-Catenin eingehen kann, ist es möglich, dass die Herunterregulation von Shrew-1 zu Veränderungen in der Lokalisation von β-Catenin und weiteren Proteinen, die mit den Adhärenzverbindungen assoziiert sind (p120 Catenin und Aktin), führen. Dies konnte jedoch nicht beobachtet werden. Eine verstärkte Lokalisation von Vinculin an den Enden von Aktin-Stressfasern sowohl in Zellausstülpungen als auch an Zell-Zell-Kontakten konnte in 12Z-Zellen nach der Herunterregulation von Shrew-1 beobachtet werden. Dies könnte eine Folge der E-Cadherin-Reexpression oder entscheidend für die Lokalisation von E-Cadherin an der Membran sein.
Die Reexpression von E-Cadherin, die in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden kann, erfolgt in den 12Z-Zellen vermutlich hauptsächlich über Veränderungen von Histon-Acetylierungen, da die Behandlung mit dem HDAC-Inhibitor TSA die Expression von E-Cadherin in den 12Z-Zellen induziert. Eine verstärkte H3K9-Acetylierung am CDH1-Promotor konnte in ChIP-Analysen in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen gezeigt werden. Die gesteigerte Acetylierung resultiert vermutlich aus der verminderten Assoziation von HDAC1 und HDAC2 mit dem CDH1-Promotor in diesen Zellen. Eine Beteiligung der Repressoren Snail, Slug, Twist und ZEB1 an der Reexpression von E-Cadherin in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen konnte nicht gezeigt werden. Ebenso scheinen Veränderungen am Methylierungsstatus des CDH1-Promotors nach der Herunterregulation von Shrew-1 nicht zu erfolgen.
TSA induziert auch in weiteren epithelialen Endometriose-Zelllinien (10Z und 49Z) die Expression von E-Cadherin. In stromalen Zellen führt hingegen weder TSA noch die Herunterregulation von Shrew-1 zur Expression von E-Cadherin (17B, 18B und 22B). Dies weist darauf hin, dass die Herunterregulation von Shrew-1 über die Veränderungen von Histon-Acetylierungen wirkt und dass dieser Mechanismus in epithelialen Endometriose-Zellen entscheidend ist. In den stromalen Zellen muss die Expression von E-Cadherin über einen anderen und/oder weitere Mechanismen blockiert sein.
Auch der Wnt-Signalweg scheint an der Reexpression von E-Cadherin in 12Z-Zellen beteiligt zu sein. Die Inhibierung der GSK3β (LiCl und SB216763) führt zur Expression von geringen Mengen an E-Cadherin. In 12Z Shrew-1 KD-Zellen führt die Stabilisierung von Axin (XAV939) zur verminderten Expression von E-Cadherin. Dies lässt darauf schließen, dass Shrew-1 auch einen Einfluss auf den Wnt-Signalweg hat, was vor allem durch dessen Interaktion mit β-Catenin wahrscheinlich ist.
Im Kindes- und Jugendalter gehoert das Rhabdomyosarkom zu den haeufigsten Weichteilsarkomen. Bisher belaeuft sich das Therapieverfahren auf chirurgische Entfernung, gefolgt von Chemotherapie, bzw. bei nicht-operablen Faellen auf Radiotherapie und Chemotherapie, jedoch haben sich die Ueberlebenschancen fuer Patienten mit einer Erkrankung in metastasiertem oder rezidiviertem Stadium trotz intensiver Forschung ueber mehrere Jahrzehnte hinweg kaum gebessert und bleiben bei unter 30%. Neue therapeutische Strategien versuchen das Immunsystem des Patienten zu modulieren und dieses gezielter oder aggressiver gegen Tumorzellen zu machen. Nebst direkter Injektion von Zytokinen oder Antikoerpern bietet die adoptive Immunzelltherapie einen vielversprechenden Ansatz. In der vorliegenden Arbeit lag der Fokus auf Natuerlichen Killer- (NK) Zellen, da diese ein hohes zytotoxisches Potential gegenueber Tumorzellen aufweisen. Eine der groessten Herausforderungen der NK-Zellforschung ist die Breitstellung ausreichender Mengen an NK-Zellen mit optimaler antitumoraler Funktion fuer den klinischen Einsatz. Viele aktuell erprobte NK-Zellexpansionsstrategien basieren auf der Verwendung von Hilfs- oder Feeder-Zellen (Versorgerzellen), die jedoch vor der Applikation in Patienten aus dem finalen Produkt entfernt werden muessen. In der vorliegenden Arbeit sollten Feeder-zellfreie NK-Zellexpansionsprotokolle unter Verwendung von Gammakettenzytokinen getestet werden.
Interleukin (IL-) 15 erwies sich dabei vor allem fuer die Vermehrung der NK-Zellen als besonders foerderlich. Im Vergleich dazu fielen die Expansionsraten mit IL-2 oder IL-21 geringer aus. Interessanterweise wurde der expansionsfoerdernde Effekt von IL-15 durch dauerhafte Anwesenheit von IL-21 im Kulturmedium gehemmt. Ein kurzer, dreitaegiger IL-21-Boost am Ende der Expansionsphase wirkte sich wiederum positiv auf die NK-Zellexpansionsraten aus. Zudem zeigte sich durch IL-21 ein vermehrtes Auftreten von NK-Zellen des reiferen CD16posCD56dim Phaenotyps, der die zytotoxische Funktion vermittelt. Bei Degranulationsuntersuchungen wurden eine IL-21-induzierte Exozytoseaktivitaet und die vermehrte Ausschuettung von Perforin und Granzym B, welche Apoptose in den Zielzellen ausloesen, beobachtet. Vor allem der dreitaegige Boost mit IL-21 bewirkte eine gesteigerte Zytotoxizitaet gegenueber Tumorzellen, insbesondere gegenueber Rhabdomyosarkomzellen.
Auf dieser Grundlage bot es sich an fuer die NK-Zellexpansion ein Zwei-Phasen-Protokoll anzuwenden, bestehend aus einer initialen Proliferationsphase mit IL-15 und einem anschliessendem IL-21-Boost, durch den die antitumorale Funktionalitaet der NK-Zellen gesteigert wurde. Dieses IL-15+21boost-Protokoll wurde mit anderen Kombinationen aus den Gammakettenzytokinen IL-2, IL-15 und IL-21 verglichen und stellte sich hinsichtlich der NK-Zellexpansionsraten, der Degranulationskapazitaet und der damit verbundenen Zytotoxizitaet als den anderen Protokollen ueberlegen heraus.
Zytokinexpandierte NK-Zellen zeigten eine hoehere Rezeptorexpression an ihren Oberflaechen als unstimulierte Zellen. Die Expansion mit dem IL-15+21boost-Protokoll bewirkte die hoechste Dichte des Todesrezeptors TRAIL, jedoch auch der inhibitorischen KIR2D-Rezeptorfamilie. Fuer andere Oberflaechenmarker ergab sich jeweils eine mittlere Expressionsdichte verglichen mit dem IL-15- bzw. dem IL-15+21-Expansionsprotokoll. Die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interferon-gamma (IFN-g) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-a) wurde zudem verstaerkt durch IL-21 angeregt, aber ebenso die Sekretion des immunsupprimierenden IL-10.
Weiter wurden die zytoinexpandierten NK-Zellen zur UEberpruefung ihrer in vivo Funktionalitaet anhand eines praeklinischen Xenograftmodells unter Verwendung von NOD SCID IL-2-Rgamma-/- (NSG) Maeusen und der Technologie der in-vivo-Biolumineszenzbildgebung getestet. Dabei konnte beobachtet werden, dass die NK-Zellen das Wachstum luciferaseexprimierender humaner Rhabdomyosarkome verlangsamten. Die Wirksamkeit der IL-15+21boost-expandierten NK-Zellen zeigte sich vor allem in einem kombinierten Ansatz, bei dem die Tumore zunaechst mit ionisierender Strahlung behandelt wurden und residuale Rhabdomyosarkomzellen anschliessend durch den adoptiven Transfer von humanen NK-Zellen in ihrem Wachstum gehemmt waren, solange die NK-Zelltherapie andauerte. Somit stellte sich die Kombination aus Bestrahlung und NK-Zelltransfer als wirksamer im Einsatz gegen Rhabdomyosarkome heraus als die alleinige Behandlung der Tumore durch Radiotherapie.
Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit ein NK-Zellexpansionsprotokoll entwickelt werden, dass durch den ausschliesslichen Einsatz von Gammakettenzytokinen zu einem funktionalen NK-Zellprodukt fuehrte, welches auch in vivo lytische Aktivitaet gegenueber Rhabdomyosarkomzellen aufwies.
Hämophilie A ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die aufgrund von Mutationen innerhalb des Gens von Gerinnungsfaktor VIII (FVIII) zum funktionellen Defekt oder zum Fehlen des körpereigenen FVIII führt. FVIII zirkuliert als Heterodimer und besteht aus einer schweren Kette mit der Domänenstruktur A1-A2-B und einer leichten Kette mit der Domänenstruktur A3-C1-C2. Bei Patienten unter Prophylaxe wird durch regelmäßige Substitution mit rekombinanten oder aus Plasma gewonnenen FVIII-Präparaten die Hämostase wiederhergestellt. Allerdings entwickeln hierbei etwa 30% der Patienten mit einer schweren Hämophilie eine FVIII-spezifische Immunantwort in Form von neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren). Die sogenannte Immuntoleranz-Therapie (engl. immune tolerance induction therapy, ITI) ist bisher die einzige etablierte Therapie, die zu einer dauerhaften Eradikation der FVIII-Inhibitoren und Induktion von Toleranz gegenüber FVIII führen kann. Die Therapie beruht auf einer meist täglichen Gabe hoher FVIII-Dosen, welche sich, je nach Behandlungsdauer, über Wochen bis hin zu Jahren erstrecken kann. Bei etwa 30% der Patienten ist diese Therapie nicht erfolgreich. Für solche Patienten besteht die Gefahr lebensbedrohlicher, unkontrollierbarer Blutungen und erheblicher Gelenkschäden.
Die spezifische Ansteuerung des Membran-gebundenen Immunglobulin G (mIg) des B-Zellrezeptors (BZR) mithilfe von Immuntoxinen ist eine mögliche Option zur selektiven Eliminierung FVIII-spezifischer B-Zellen und somit zur Eradikation von FVIII-Inhibitoren. Solche Immuntoxine bestehen aus einer zellbindenden und einer zytotoxischen Domäne, welche nach Internalisierung zur Apoptose der Zielzelle führen soll. Da FVIII aufgrund der Größe als zellbindende Domäne ungeeignet ist, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit der Entwicklung und Evaluierung alternativer Immuntoxine zur selektiven Eliminierung FVIII-spezifischer B-Zellen. Die FVIII-spezifische Immunantwort ist zwar polyklonal, jedoch vor allem gegen A2- und die C2-Domäne gerichtet. Aus diesem Grund wurden die humane A2- und C2-Domäne (hA2, hC2) als zellbindende Domäne verwendet und jeweils genetisch an eine verkürzte Version des Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa fusioniert, bei welcher die natürliche zellbindende Domäne entfernt wurde. Die rekombinanten Proteine wurden bakteriell produziert und im Anschluss an die Aufreinigung biochemisch charakterisiert. Während das bakterielle Expressionssystem für hA2-ETA nicht geeignet war, konnte hC2-ETA neben weiteren Kontrollproteinen mit korrekter Konformation der hC2-Domäne hergestellt und aufgereinigt werden.
Die Fähigkeit zur selektiven Eliminierung hC2-spezifischer B-Zellen wurde im weiteren Verlauf sowohl in vitro mithilfe einer hC2-spezifischen Hybridomazelllinie als auch ex vivo und in vivo mithilfe von Splenozyten aus FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen untersucht.
Durch Inkubation der hC2-spezifischen Hybridomazelllinie mit hC2-ETA konnten ca. 38 % der Zellen eliminiert werden. Weitere Untersuchungen der Zelllinie ergaben, dass diese keinen vollständigen funktionalen B-Zellrezeptor auf der Oberfläche exprimierte, welcher für die Bindung und die korrekte Internalisierung des Immuntoxins notwendig ist. Aufgrund dessen eignet sich diese Zelllinie nicht als Modell für eine genauere Analyse der in vitro Eliminierungseffizienz von hC2-ETA.
Weitere Analysen mithilfe von Splenozyten aus FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen haben jedoch gezeigt, dass durch ex vivo Inkubation der Splenozyten mit hC2-ETA, alle hC2-spezifischen B-Zellen vollständig, selektiv und konzentrations-abhängig eliminiert werden konnten. Auch die mehrfache Applikation von hC2-ETA in FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen führte bei der Hälfte der Tiere zur vollständigen Eliminierung aller hC2-spezifischen B-Zellen. Eine Reduktion des hC2-spezifischen Antikörpersignals konnte nach Gabe von hC2-ETA in allen behandelten Tieren beobachtet werden. Die unvollständige Eliminierung in der Hälfte der Tiere ist vermutlich auf die Präsenz hC2-spezifischer Antikörper zurückzuführen, die einen Teil des applizierten Immuntoxins neutralisiert haben, sodass nicht alle hC2-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen erreicht und eliminiert werden konnten. Um die Eliminierungseffizienz von hC2-ETA weiter zu erhöhen, müsste das Behandlungsprotokoll geändert werden. Sowohl eine Verlängerung des Behandlungszeitraums als auch eine kombinierte Therapie aus FVIII und hC2-ETA sollte zu einer erhöhten Bioverfügbarkeit des Toxins und dadurch zu einer gesteigerten Eliminierungseffizienz führen.
Die Ausweitung des hier vorgestellten Ansatzes auf weitere FVIII-Domänen ist generell möglich, jedoch muss hierzu ein alternatives Expressionssystem aufgrund des eukaryotischen Ursprungs von FVIII in Betracht gezogen werden. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen dennoch, dass FVIII-Domänen-Immuntoxine ein wirkungsvolles Mittel sind, um FVIII-spezifische B-Zellen selektiv zu eliminieren. Die Anpassung der Gabe von FVIII-Domänen-Immuntoxinen an die individuelle Immunantwort des Patienten könnte das Auftreten von Nebenwirkungen minimieren. Außerdem könnte eine kombinierte Therapie aus ITI und FVIII-Domänen-Immuntoxinen die Zeit bis zur Induktion von Toleranz verkürzen und die Chancen für den generellen Therapieerfolg erhöhen.
Patients harboring mutations in the gene DEPDC5 often display variations of neurological diseases including epilepsy, autism spectrum disorders (ASD) and other neuro-architectural alterations. DEPDC5 protein has been identified as an amino acid sensor responsible for negatively regulating the mechanistic target of rapamycin (mTOR), a central regulator in cell growth and cell homeostasis. Often, mutations of the DEPDC5 protein result in mTOR hyperactivity leading to abnormal neuronal phenotypes and the generation of excitatory/inhibitory imbalances in animal models. Complete knockout (KO) of DEPDC5 results in death shortly after birth, while inhibition of mTOR activity recovers postnatal death (Marsan et al. 2016). However, heterozygous DEPDC5-KOs in animals have been variable in their disease phenotypes during adulthood indicating developmental differences between subspecies and early development mechanisms which could be impactful on the outcome of the diseases.
To understand the mechanisms underlying DEPDC5 mutations during early development, a novel primary human neural progenitor cell line extracted from fetal tissue was characterized during proliferation and differentiation. CRISPR-Cas9 induced mutations of the DEPDC5 gene resulted in hyperphosphorylation of mTOR signaling processes and rapid expansion of the neuronal population during differentiation. Analysis of transcriptome data identified deregulation amongst p53 signaling, ribosome biogenesis, nucleotide and lipid synthesis as well as protein degradation pathways due to loss of DEPDC5. Disease gene datasets identified a correlation between Tuberous Sclerosis mutations as being more closely associated with DEPDC5 mutations while also finding overlap with some ASD and epilepsy genes. By using the mTOR inhibitor rapamycin, a substantial amount of the deregulated gene network was recovered while also reversing rapid neuronal differentiation caused by loss of DEPDC5. Though we saw increased dendritic arborization and subsequent decreases in dendrite lengths and soma sizes, rapamycin failed to recover these effects suggesting mTOR independent processes produced by DEPDC5-KO. This study provides new insights on the relationship between mutations in DEPDC5 and the functional, genomic and deregulatory networks it intertwines in humans and highlights that the DEPDC5 associated pathomechanisms are not fully related to mTOR hyperactivation, but include independent processes. This also sheds light on the question why rapamycin treatment only partially restores DEPDC5 related phenotypes and gives insight on treatments for DEPDC5 patients.
To date, chemicals are used ubiquitous in everyday life and an increasing consumption of pharmaceuticals and personal care products and industrial chemicals results in an increased water pollution. Conventional wastewater treatment plants are not able to completely remove the variety of (polar) organic compounds from today’s wastewater and thus serve as constant key point sources for the unintentional release of (micro-)pollutants into the aquatic environment. Anthropogenic micropollutants are detectable in very low concentrations in almost every aquatic compartment and may cause adverse effects on aquatic organisms. Considering the current situation of water pollution and to enhance water quality with regard to environmental and human health, the implementation of advanced wastewater treatment technologies, such as ozonation and activated carbon filtration was extensively discussed and investigated in recent years. Yet, besides their advantages regarding the efficient removal of a variety of recalcitrant, organic compounds as well as pathogens from the wastewater, it is known that especially the treatment with ozone may lead to the formation of largely unknown ozonation by-products with often unknown toxicity and unknown threats to human and the environment. To address these topics the joint research project TransRisk aimed at the “characterization, communication and minimization of risks originating from emerging contaminants and pathogens in the water cycle”. Within this research project the present thesis focuses on the ecotoxicological investigation of emerging waterborne contaminants, including their potential transformation products (TPs). Additionally, focus was laid on the investigation of combined effects of anthropogenic contaminants and pathogens with effects especially on aquatic invertebrate organisms.
The potential ecotoxicological effects of the antiviral drug acyclovir and two of its structurally identified TPs, were investigated on three aquatic organisms (Raphidocelis subcapitata, Daphnia magna and embryos of Danio rerio). While the parent compound acyclovir caused no acute toxicity up to a tested concentration of 100 mg/l on any of the investigated organisms, both TPs were shown to exhibit an increased aquatic toxicity. Carboxy-acyclovir, the biodegradation product of acyclovir, significantly reduced reproduction of D. magna by 40% at 102 mg/l, and the ozonation product COFA significantly inhibited growth of green algae R. subcapitata (EC10 = 14.1 mg/l). In the present case, advanced wastewater treatment was shown to lead to the formation of TPs, that reveal a higher toxicity towards investigated organisms, than the parent compound. Results highlight the necessity of further research related to the topic of identification and characterization of TPs, formed during advanced wastewater treatment processes.
To investigate the potential reduction or enhancement of toxic effects of nine differently treated wastewater effluents, selected bioassays with Daphnia magna, Lumbriculus variegatus and Lemna minor were conducted in flow-through test systems on a pilot treatment plant. The different treatment processes included ozonation of conventional biological treatment, with subsequent filtration processes as well as membrane bioreactor treatment in combination with ozonation. While exposure to the conventionally treated wastewater did not result in significant impairing effects on D. magna and L. minor, a reduced abundance of L. variegatus (by up to 46%) was observed compared to the medium control. Subsequent ozonation and additional filtration of the wastewater enhanced water quality, visible in an improved performance of L. variegatus. In general, direct evidence for the formation of toxic TPs due to the advanced wastewater treatments was not found, at least not in concentrations high enough to cause measurable effects in the investigated test systems. Additionally, no evidence for immunotoxic effects of the investigated wastewater effluents were observed. Yet, study-site- and species-specific effects hindered the definite interpretation of results. That underline the importance of a suitable test battery consisting of representatives of different taxonomic groups and trophic levels, to ensure a comprehensive evaluation of the complex matrix of wastewater and to avoid false-negative or false-positive results.
With aim to improve knowledge regarding immunotoxicity in invertebrates, the potential immunotoxic effects of the immunosuppressive pharmaceutical cyclosporine A (CsA) were investigated by applying the host-parasite model system Daphnia magna – Pasteuria ramosa in an adapted host resistance assay. Co-exposure to CsA and Pasteuria synergistically affected long-term survival of D. magna. Additionally, the enhanced virulence of the pathogen upon chemical co-exposure was expressed in synergistically increased infection rates and an increased speed of Pasteuria-induced host sterilization. In conclusion, results provide evidence for a suppressed disease resistance in a chemically stressed invertebrate host, highlighting the importance of investigating the conjunction of environmental pollutants and pathogens in the environmental risk assessment of anthropogenic pollutants.
Cardiovascular diseases are still regarded as the main cause of death in the modern world. However, the generic term "cardiovascular diseases" is not uniformly defined. It essentially describes diseases of the cardiovascular system and includes diseases such as hypertension, arteriosclerosis, myocardial infarctions, heart failure, coronary heart diseases, rheumatic heart diseases and heart valve defects. In addition to the well-known risk factors such as obesity, smoking, hypercholesterolemia and lack of exercise, age is a further risk factor that plays an important role in the development of cardiovascular diseases. As the modern societies age; this becomes an increasing problem.
But why does the prevalence of cardiovascular diseases increase with age? In gen-eral, age-dependent changes at the cellular level are assumed to be responsible for the pathological changes in the cardiac and vascular tissues. Important mechanisms such as autophagy, oxidative stress, mitochondrial dysfunctions, genomic instability, cellular senescence and disturbances in signaling pathways of growth factors play a decisive role. In old age, myocardial hypertrophy occurs, which results in cardiac wall thickening and an altered geometry of the ventricle. Chronic inflammations, paracrine and age-dependent cell-intrinsic factors further lead to activation of cardiac fibro-blasts with increase cell proliferation, collagen secretion and matrix cross-linking. The consequences are interstitial and perivascular fibrosis, which stiffen the heart and blood vessels. Oxidative stress and inflammations additionally attack the blood ves-sels and impair endothelial function, which is further aggravated by possible pre-existing conditions such as diabetes mellitus and hypertension.
In the past decades, the main focus has therefore been on researching these age-dependent changes in the hope of better understanding cardiovascular ageing and developing possible regenerative interventions. By studying the repair mechanisms of other organs such as the lungs and the bone marrow, the endothelium in particular showed a high regenerative capacity, which influences the proliferation and cell func-tion of the surrounding cells.
For a long time, the general opinion was that the endothelium is only the internal lin-ing of blood and lymphatic vessels, as well as the heart chambers, which as a single-layer barrier guarantees the integrity of the blood vessels. However, endothelial cells are very heterogeneous, depending on the type of blood vessel and the type of tis-sue they serve. In addition to their barrier function, endothelial cells also regulate the exchange of substances between blood and tissue, stimulate the formation of new blood vessels and re-model existing vascular networks. They are also able to re-structure the extracellular matrix that surrounds them. They release not only matrix proteins, but also cytokines and growth factors into the extracellular space. On de-mand, these factors are then released and stimulate angiogenesis or cell prolifera-tion. In addition, the secretion of various matrix proteins not only stabilizes the cellu-lar neighborhood, but also regulates various cell functions.
By modelling the endothelial environment - the so-called vascular niche - endothelial cells are able to communicate with the surrounding cells. As a result, a regenerative effect of the vascular niche has already been described in various organs. In the liv-er, for example, it has been shown that increased concentrations of endothelial Ang2 and decreased endothelial activin A after partial hepatectomy stimulate the prolifera-tion of hepatocytes and thus liver regeneration. In the bone marrow, endothelial cells mobilize stem cells via nitric oxide and in the lungs, endothelial MMP14 releases growth factors from the extracellular matrix, which stimulate epithelial cell prolifera-tion after partial pneumectomy. Whether such a regenerative effect of the vascular niche also plays a role in the heart is largely unknown.
Since both the regenerative capacity of the heart and endothelial function decrease with age, the aim of this dissertation was to investigate the role of the vascular niche and endothelial cell communication in the aged heart. Human cell lines as well as mouse and artificial rat models were used for these investigations. Since this thesis is a cumulative dissertation with partially published papers, it is divided into three parts.
In the first part of this thesis, the transcriptional signature of secretory genes in the aged cardiac endothelium was studied. Perfused endothelial cells from hearts of young (12-week-old animals) and old mice (20-month-old animals) were isolated and used for bulk RNA sequencing. The two matrix proteins laminin β1 and β2 were among the top-regulated genes. While laminin β2 was particularly expressed in the young cardiac endothelium, laminin β1 was predominantly found in the old endotheli-um. This change in laminin expression was confirmed histologically at protein level and its autocrine function was investigated in vitro. To mimic the in vivo situation in vitro, cell culture dishes were coated with human recombinant laminin 421 or laminin 411 and sutured with human endothelial cells from the umbilical vein (HUVEC). Di-verse functional investigations showed that endothelial cells migrated and adhered poorly in the presence of laminin 411, while in Matrigel tube formation assays HU-VEC formed reduced endothelial networks when cultured on LM 411.
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The growing number of infections with multi-resistant bacteria or the current COVID-19 pandemic put compounds with therapeutic properties into the public focus. Non-ribosomal peptides (NRPs) are natural products that are already marketed as antibiotics, cytotoxic agents or immunosuppressants. Their biological activities rely on the structural diversity including non-proteinogenic amino acids (AAs), heterocycles or modifications like methylation or acylation.
The biosynthesis of NRPs is carried out by non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs). These multifunctional megaenzymes show a modular architecture like in an assembly-line. Each module is thereby responsible for the incorporation and modification of one AA and therefore contains different catalytic domains. The adenylation (A) domain recognizes and activates its specific substrate in an ATP-dependent manner which is transferred to a 4’-phosphopantetheine cofactor post-translationally attached to the thiolation (T) domain. Peptide bond formation between two T domain bound substrates catalysed by the condensation (C) domain transfers the growing peptide chain to the following module. Such a C-A-T module can be extended with optional domains to integrate structural diversity and a terminal thioesterase (TE) domain usually releases the peptide via hydrolysis or intramolecular attack of nucleophiles. Inspired by the modular architecture, NRPS engineering deals with the modification of NRPs in order to increase biological activities, circumvent bacterial resistances or create de novo peptides. This can be achieved by mutasynthesis or modification of the substrate binding pocket as well as single and multiple domain substitution. However, the few successful approaches led to impaired enzymes and did not establish a general applicable guideline. In the first publication as part of this work, the development of such a guideline comprising three rules is addressed. First, the A-T-C tridomain named exchange unit (XU) is seen as a catalytic unit instead of a module. When using them as building blocks, the C domain’s specificity for the AA of the following XU has to be considered as second rule. Third, a conserved WNATE motif within the C-A linker depicts the fusion point of the XUs. Upon heterologous expression of the cloned plasmids in E. coli and high performance liquid chromatography coupled mass spectrometry-based analysis of the extracts, the ambactin-producing NRPS from Xenorhabdus was reprogrammed with one and two XUs. This only leads to a moderate loss of production titre or an even higher one when the AA configuration was changed by introducing a dual condensation/epimerization (C/E) domain. The pentamodular GameXPeptide-producing NRPS was reconstructed using up to five XUs of four different NRPSs and even completely de novo synthetases were created. The second publication describes the exchange unit condensation domain (XUC) concept and relies on a fusion point between the two subdomains (N-terminal CDsub and C-terminal CAsub) of the C domain’s V-shaped pseudodimeric structure which generates A-T didomains with flanking CAsub and CDsub. These hybrid C domain-forming building blocks depict an improvement to the XU concept by avoiding the drawback of C domain specificity. This allows a more flexible NRPS engineering that can e.g. enable peptide library design. Furthermore, beside a combination of both concepts within one NRPS and a transfer to Bacillus NRPSs, the use of XUC with relaxed A domain specificity allowed further peptide modifications by introducing non-natural AAs. The third publication deals with aldehyde and alcohol-generating reductase (R) domains which depict an alternative for peptide release in NRPSs. A promoter exchange in X. indica identified a pyrazine-producing NRPS with a minimal architecture of an A, T and R domain and was therefore termed ATRed. R domains were additionally used in engineered NRPSs to produce pyrazinones and derivatives thereof by XU substitution although most constructs failed to show production. Beyond that, an R domain has been shown to replace a TE domain in wild type synthetases leading to slightly modified NRPs and the postulated biosynthesis was incidentally revised. Furthermore, an NRPS with terminal R domain was engineered to produce a free peptide aldehyde, which are known to be potent proteasome inhibitors. For the above mentioned ATReds, the presence of up to three coding regions was further identified in 20 different Xenorhabdus strains but only six of them were verified to produce pyrazines. All ATReds share variable sequence similarities among each other and were subsequently divided into three subtypes. One subtype is supposed to perform the pyrazine biosynthesis via a non-canonical catalytic triad.
Auf der Oberfläche von Erythrozyten, Thrombozyten und Neutrophilen befinden sich mehrere hundert verschiedene polymorphe, ungekoppelt vererbte Blutgruppenantigene. Dementsprechend birgt jede Bluttransfusion das Risiko einer Immunisierung gegen fremde Blutgruppenmerkmale. Auch während der Schwangerschaft können aufgrund väterlich vererbter Antigene Alloantikörper induziert werden. Deshalb muss das Blut vor jeder Transfusion oder während einer Schwangerschaft auf das Vorhandensein irregulärer erythrozytärer Antikörper untersucht werden. Dabei greifen die aktuellen diagnostischen Verfahren auf primäre, stabilisierte Testerythrozyten von Blutspendern zurück, deren relevante Blutgruppenantigene bekannt sind. Antikörperspezifitäten können anhand von Agglutinationsreaktionen der Testzellen mit dem zu untersuchenden Patientenplasma auf ein oder mehrere Antigene zurückgeführt werden. Ist jedoch ein Antikörper gegen ein häufiges, ein hochfrequentes oder ein nicht-polymorphes, ubiquitäres Antigen gerichtet, kann in Ermangelung Antigen-negativer Testzellen keine adäquate Diagnostik gewährleistet, die Verträglichkeit der Transfusion also nicht definitiv sichergestellt werden. Auch der medizinische Einsatz therapeutischer Antikörper, welche Antigene adressieren, die auch auf Erythrozyten exprimiert werden, führt zunehmend zu Problemen. Tests auf granulozytäre Antikörper sind mangelhaft bezüglich ihrer Robustheit, besitzen eine unzureichende Auflösung und sind zudem meist zeitaufwändig und daher teuer. Antikörper gegen humane Plättchenantigene spielen insbesondere in der Schwangerschaft eine Rolle; sie vermögen bei Neugeborenen thrombozytopenische Blutungen bis hin zu massiven Hirnblutungen zu verursachen, die zu schweren Entwicklungsstörungen führen können. Bisher erfolgt jedoch mangels geeigneter Reagenzien keine standardisierte pränatale Untersuchung auf thrombozytäre Antikörper. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Verfahren für die Identifikation und Differenzierung irregulärer Blutgruppenantikörper etabliert, welches auf gentechnisch hergestellten, xenogenen Testzellen basiert, die einzelne definierte humane Blutgruppenantigene auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die nicht humanen Zellen co exprimieren Fluorochrome, anhand derer Antikörper-markierte Testzellen durchflusszytometrisch voneinander unterscheidbar sind. Weiterhin können die generierten Testzellen zur Depletion von Antikörpern aus polyagglutinierenden Plasmen unter Erhalt der anderen Antikörperspezifitäten verwendet werden. Diese Technologie könnte die konventionelle Diagnostik erheblich erleichtern und bietet zudem die Möglichkeit, therapeutische Antikörper (wie z. B. anti-CD38, anti CD47, etc.), die häufig zu Interferenzen mit der Routinediagnostik führen, spezifisch prädiagnostisch aus Patientenproben zu entfernen.
This dissertation aimed to shed light on changes of the epigenetic landscape in heart and skeletal muscle tissue of the turquoise Killifish N. furzeri, a novel, short-lived animal model for aging research. The following results could be obtained:
1. A global trend towards closed chromatin conformation could be observed; histone markers for H3K27me3, H3K9me3 and H4K20me3 accumulated in skeletal muscle tissue from old N. furzeri. Markers for open chromatin conformation such as H3K4me3, H3K9ac and H4K16ac decreased in old skeletal muscle tissue. In old hearts from N. furzeri an accumulation of H3K27me3 could be detected while H3K9ac was found to increase with age as well. mRNA expression levels of methylating enzymes were higher in skeletal muscle tissue from old N. furzeri when compared to expression levels in skeletal muscle tissue from young N. furzeri.
2. The shift of epigenetic pattern was accompanied by a change of gene expression. Via mRNA sequencing in collaboration with the MPI, Bad Nauheim it could be shown that genes associated with cell cycle and DNA repair were lower expressed in skeletal muscle tissue from old N. furzeri than in tissue from young N. furzeri. Genes, associated with inflammatory signaling and glycolysis, displayed increased mRNA levels in skeletal muscle tissue from old N. furzeri. These results could be confirmed by Western blot and qRT-PCR analyses.
3. Markers for DNA damage and senescence increased in skeletal muscle tissue from old N. furzeri.
4. Cells derived from young and old N. furzeri skeletal muscle could be isolated and cultured for many passages. These cells were a mix of different cell types with properties and features of the native tissue. They could be used for treatment with drugs and/small compounds modulating the epigenetic landscape via specific interference with methylating enzymes.
5. DNA methylation and hydroxy-methylation were found to go in different directions in skeletal muscle and heart tissue from N. furzeri: while increasing in skeletal muscle tissue, a both DNA modifications declined in heart tissue with age.
6. In the heart of N. furzeri microRNA expression changes with age were assed with sequencing in collaboration with the FLI, Jena. It could be demonstrated that miRNA expression is age-dependent. Particular focus was on miR-29 and its target genes: miR-29 was highly upregulated in heart and skeletal muscle tissue, while target genes such as collagens and dnmts were reduced with age in the heart of N. furzeri.
7. Cardiac function remained stable with age and no accumulation of collagens could be found when comparing hearts of young and old N. furzeri despite the increase of markers for oxidative stress.
8. Cell culture experiments with human cardiac fibroblasts revealed that miR-29 is upregulated with increasing age of the donor. In addition to that, it could be shown that miR-29 is positively regulated by oxidative stress.
9. A zebrafish mutant with modified expression of miR-29 that was created in collaboration with the SNS, Pisa, presented a severe hypoxic phenotype and an altered mRNA expression profile compared to wild type control zebrafish. Cardiac dysfunction and hypertrophy were observed as well as an increase in DNA methylation and collagens.
Taken together, it could be shown that the aging process in skeletal muscle and heart tissue from N. furzeri leads to a series of changes on epigenetic levels. It remains to be elucidated whether these changes are result or cause for further changes of mRNA expression, protein levels and pathophysiology, yet the N. furzeri represents a promising research model for further aging studies.
European pea crabs - taxonomy, morphology, and host-ecology (Crustacea: Brachyura: Pinnotheridae)
(2010)
Pinnotherids are small crabs symbiotic to a variety of invertebrates. The European species infest bivalves and sea squirts. Their way of life is parasitic and poses a threat to commercially exploited bivalves. While juveniles of both sexes still look very similar - being agile swimmers and partially free living - a metamorphosis takes place in the female after mating and results in a conspicuous sexual dimorphism. Thereafter, the female settles in its host definitely and is morphologically strongly adapted to the parasitic life phase. A very high reproductive output was demonstrated among several pea crab species infesting bivalves. Despite from that, hardly any information is present in the literature on the pinnotherids’ reproductive biology and the underlying morphology.
Due to their cryptic way of life, the sexual dimorphism, and the different morphotypes of the female, the taxonomy of the Pinnotheridae is a serious challenge. Two widely accepted species are recognized on European coasts: Pinnotheres pisum and Nepinnotheres pinnotheres. Pinnotheres pectunculi was so far only known from the bivalve Glycymeris glycymeris in its type locality Roscoff (France), while Pinnotheres ascidicola and Pinnotheres marioni were described as living exclusively in ascidians without careful comparison with the previously described species. In order to produce standardized comparative descriptions, pea crabs were collected and studied from different hosts and localities in the Northeast Atlantic and in the Mediterranean. Nepinnotheres pinnotheres and Pinnotheres pisum were redescribed with consideration to characters of female and male. According to our morphological analysis, Pinnotheres ascidicola and Pinnotheres marioni are junior synonyms of Nepinnotheres pinnotheres, whereas the status of Pinnotheres pectunculi as a valid species was ascertained. Important characters are the mouthparts, the male gonopods, and especially chelipeds that showed consistent characteristics among different crab stages of both sexes.
Based on our sampling, we estimated the host-range of the European species. Nepinnotheres pinnotheres lives in ascidians and in the pen shell Pinna nobilis. Pinnotheres pisum infests numerous bivalve species - Pinna nobilis included. For Pinnotheres pectunculi novel host records are presented, all from the bivalve family Veneridae. Furthermore, feeding of the Pinnotheres-species was observed. They use a setae comb ventrally on the claw to brush mucus (and the accumulated food particles) from the bivalve gills. Feeding strategies and host-ecology will be thoroughly discussed in consideration to other Pinnotheridae.
We investigated the reproductive systems of European pinnotherids by histological methods, scanning and transmission electron microscopy, and confocal laser scanning microscopy.
The Eubrachyura have internal fertilization: paired vaginas enlarge into storage structures, the spermathecae, which are connected to the ovaries by oviducts. Sperm is stored until the oocytes are mature and transported into the spermathecae, where fertilization takes place. In the investigated pinnotherids, the vagina is of the ‘concave pattern’. Musculature is attached alongside flexible parts of the vagina-wall to control the dimension of its lumen. The genital opening is closed by a muscular mobile operculum.
The spermatheca can be divided into two distinct regions by function and morphology. The ventral part includes the connection with vagina and oviduct and is regarded as the zone where fertilization takes place. It is lined with cuticle except where the oviduct enters the spermatheca by the ‘holocrine transfer tissue’. At ovulation, the oocytes have to pass through this multi-layered glandular epithelium, which has a holocrine mode secretion. The dorsal part of the spermatheca is lined by a highly secretory apocrine glandular epithelium, which was to date only found in fiddler crabs of the genus Uca.
The male internal reproductive system consists of paired testes and corresponding vasa deferentia. The sperm morphology of pinnotherids conforms to other thoracotremes, with slight differences between Nepinnotheres pinnotheres and Pinnotheres pisum. Spermatozoa become enveloped into spermatophores in the secretory proximal vas deferens. The medial vas deferens is strongly enlarged and stores spermatophores embedded in seminal plasma. The distal vas deferens holds tubular appendices, which extend into the ventral cephalothorax and slightly into the pleon. These appendices produce and store vast quantities of seminal plasma. The copulatory system of the Brachyura is formed by paired penes and two pairs of gonopods, which function in sperm transfer. In pinnotherids, the long first gonopods transfers the sperm mass to the female. It holds the ejaculatory canal inside, which opens proximally and distally. The second gonopod is solid, short and conical. During copulation, the penis and the second gonopod are inserted into the base of the tubular first gonopod. The second gonopod functions in the transport of the sperm mass inside the ejaculatory canal towards its distal opening. The specific shape of the second gonopod is strongly adapted for a sealing of the tubular first gonopod with longitudinal cuticle foldings that interlock inside the first gonopod. The presented results are discussed concerning their function in reproduction and in respect of the systematic account.
The role of secretion in sperm transfer, storage and fertilization among the Brachyura is still under debate. It is notable that structure and function of secretion are more complex in pinnotherids and probably more efficient than in other brachyuran crabs, which will be discussed, in view of the parasitic way of life and the high fecundity of pinnotherids.
Introduction:
The evolutionary patterns of symbiotic organisms are inferred using cophylogenetic methods. Congruent phylogenies indicate cospeciation or host-switches to closely-related hosts, whereas incongruent topologies indicate independent speciation. Recent studies suggest that coordinated speciation is a rare event, and may not occur even in the highly specialized associations. The cospeciation hypothesis was mainly tested for free-living mutualistic associations, such as plant-pollinator interactions, and host-parasitic systems but was rarely tested on obligate, mutualistic associations involving intimate physiological interactions. Symbionts with lower partner selectivity may not experience coordinated speciation due to frequent switching of partners. On the other hand, symbionts with high partner selectivity may influence each other’s evolution owing to the highly interdependent lifestyles. Symbiont association patterns are also influenced by habitat and it has been proposed that symbiotic interactions are stronger in warm regions as compared to cooler regions (also referred as latitudinal gradient of biotic specialization). This hypothesis however, has recently been challenged and it has been suggested that a gradient of biotic specialization may not exist at all. Reliable species concepts are a prerequisite for understanding the association and evolutionary patterns of symbiotic organisms. The species concepts of many groups traditionally relied on the morphological species concept, which may not be adequate for distinguishing species due to the: i) homoplasious nature of morphological characters, an due to the inability to distinguish cryptic species. Thus phylogenetic species concept along with coalescent-based species delimitation approaches, which utilize molecular data for inferring species boundaries have been used widely for resolving taxonomic relationships. Lichens are obligatory symbiotic associations consisting of a fungal partner (mycobiont) and one or more photosynthetic partners, algae, and/or cyanobacteria (photobionts). I used the lichen forming fungal genus Protoparmelia as my study system, which consists of ~25-30 previously described species inhabiting different habitats, from the arctic to the tropics. This makes Protoparmelia an ideal system to explore the association and evolutionary patterns across different macrohabitats.
Objectives:
The objectives of this thesis were to 1. Elucidate the phylogenetic position of Protoparmelia within Lecanorales, and infer the monophyly of Protoparmelia; 2. Understand species diversity within Protoparmelia s.str. using coalescent-based species delimitation approaches; and 3. To identify the Trebouxia species associated with Protoparmelia using phylogenetic and species delimitation approaches and to infer the association and cophylogenetic patterns Protoparmelia and Trebouxia in different macrohabitats.
Results and discussion:
Chapter 1: Taxonomic position of Protoparmelia
In the first part of this study I explored the taxonomic position of Protoparmelia within the order Lecanorales. Overall this study included 54 taxa from four families, sequenced at five loci (178 sequences). I found Protoparmelia to be polyphyletic and sister to Parmeliaceae.
Chapter 2: Multilocus phylogeny and species delimitation of Protoparmelia spp.
In this part of the study, I identified and delimited the Protoparmelia species forming a monophyletic clade sister to Parmeliaceae i.e., Protoparmelia sensu stricto group, based on the multilocus phylogeny and coalescent-based species delimitation approaches. I included 18 previously described and three unidentified Protoparmelia species, which represents ~70% of the total described species, and 73 other taxa, sequenced at six loci. I found that the sensu stricto group comprised of 25 supported clades instead of 12 previously described Protoparmelia species. I tested the speciation probabilities of these 25 clades using species delimitation softwares BP&P and spedeSTEM. I found nine previously unrecognized lineages in Protoparmelia and I propose the presence of at least 23 species for Protoparmelia s.str., in contrast to the 12 described species included in the study.
Chapter 3: Association and cophylogenetic patterns of Protoparmelia and its symbiotic partner Trebouxia
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Die CXCR4/CXCL12-Achse ist von entscheidender Bedeutung für die Entstehung und Aufrechterhaltung einer gesunden, reifen Hämatopoese. Erstmals beschrieben wurde der später als CXCR4 bezeichnete Rezeptor 1996 allerdings als Co-Rezeptor für den Eintritt humaner HI-Viren in Lymphozyten. Ein großes Interesse bestand daraufhin darin, sowohl natürliche Inhibitoren des G-Protein gekoppelten Rezeptors zu identifizieren, als auch synthetische herzustellen, um einen Eintritt des Virus in den menschlichen Organismus zu verhindern bzw. seine Ausbreitung zu unterbinden. Ein natürlich vorkommender CXCR4-Ligand, der 2015 von Zirafi und Kollegen erstmals beschrieben wurde, fand sich im Hämofiltrat von Dialysepatienten. Der im weiteren Verlauf als EPI-X4 bezeichnete CXCR4-Antagonist wurde als Spaltprodukt von Albumin identifiziert, welches über viele Spezies hochkonserviert ist. Diese Eigenschaft interpretieren wir als Hinweis auf eine relevante physiologische Funktion des Peptids. Da die Halbwertszeit von natürlich vorkommendem EPI-X4 beim Menschen vermutlich sehr kurz ist, sind in vivo- und darauffolgende in vitro-Analysen schwierig durchzuführen. In-vitro-Spike-Analysen von synthetischem EPI-X4 in humanem Plasma ergaben eine Halbwertszeit von nur 17 Minuten. Die geringen auftretenden Konzentrationen erschweren die Problematik zusätzlich. In dieser Arbeit sollen deshalb im Mausmodell in vivo-Analysen durchgeführt werden, um die Effekte von potentiell entstehendem EPI-X4 in verschiedenen experimentellen Ansätzen aufzudecken. Ein probates, hier verwendetes Mittel, ist die Analyse einer Knock-out (KO)-Maus. Die für die Bindung an CXCR4 entscheidende Aminosäure von EPI-X4, das am N-Terminus gelegene Leucin, wurde durch Alanin ersetzt, welches die Entstehung von EPI-X4 unterbindet und zusätzlich dessen Bindung an CXCR4 verhindert. Mit Hilfe zweier Mausmodelle können nun Analysen im EPI-X4-defizienten Modell durchgeführt werden, die im Umkehrschluss Informationen über die organismische Wirkung von EPI-X4 beinhalten. Zunächst wurde in beiden Modellen die physiologisch normale reife und unreife Hämatopoese charakterisiert. Hierbei zeigte sich kein signifikanter systematischer Einfluss von EPI-X4 auf reife Leukozyten (WBC), lediglich eine leichte Lymphozytose in der HR-Ala-Variante. Im weiteren Verlauf der homöostatischen Analyse der Hämatopoese der Ala-EPI-X4-Mäuse zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zu wildtypischen Mäusen. Sowohl reife als auch unreife Zellen zeigten, außer in der T- und B-Zelllinie, keine zahlenmäßigen oder funktionalen Auffälligkeiten, weder im Blut, noch in der Milz oder im Knochenmark. Analysen der Zellzyklusaktivität unterschiedlicher Unreifestufen wiesen ebenfalls keine Auffälligkeiten auf. Diese Daten einer normalen, von einer C57Bl/6-Maus zu erwartenden Ergebnisse dienten als Grundlage zur Bewertung und Analyse von durchgeführten hämatopoetischen Stressmodellen. Hierfür wurden
zunächst hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) mobilisiert. In den angewandten Mobilisierungsmodellen fanden sich lediglich unter G-CSF-Behandlung im Knochenmark eine größere Anzahl Granulozyten, was auf einen Einfluss von EPI-X4 auf HSPC schließen lässt. Um potentielle Auswirkungen von EPI-X4 im Knochenmark weiter zu untersuchen, wurde ein weiteres Stressmodell gewählt, welches ebenfalls mutmaßlich die Bedingungen zur EPI-X4-Generierung schafft: Subletale Bestrahlung der Mäuse sorgt für Schäden an allen Zellarten im Knochenmark, es wird ein steriles entzündliches Milieu kreiert. Unter diesen Umständen wurde die Regeneration von Blutzellen analysiert. Es zeigten sich keine nennenswerten Unterschiede sowohl in der akuten Phase des Schadens als auch in regelmäßigen Blutentnahmen während der Regenerierung.
Die Beschreibung von natürlich vorkommendem EPI-X4 in Vaginal- und Rektalschleimhaut zeigt seine Entstehung an Schleimhautbarrieren auf. Ala-EPI-X4-Muse werden deshalb auf deren Durchlässigkeit untersucht: LPS-Konzentrationen als Marker für eindringende pathogene Bakterien wurden im Plasma untersucht. Hierbei zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen, eine Störung scheint hier nicht vorzuliegen. Zusätzlich wurde die Zusammensetzung des Mikrobioms im Darm untersucht, da beschrieben wurde, dass sich Mikrobiom und die Integrität der Darmschleimhaut gegenseitig beeinflussen. Im Falle der EPI-X4-defizienten Mäuse liegt zwar keine offensichtliche pathologische Veränderung vor, dennoch konnte in männlichen HR-Ala-Mäusen die Abwesenheit des Proteobakteriums Parasutterella nachgewiesen werden. Um eine mögliche Defizienz der Barrierefunktion weiter zu testen, wurden zwei Stressmodelle gewählt: Zunächst wurde den Mäusen eine akute, sterile Peritonitis zugefügt, woraufhin die Anzahl und Zusammensetzung der ins Peritoneum einströmenden Leukozyten analysiert wird. Die Reaktion auf diesen Entzündungsprozess war nicht verändert. Ähnliche Ergebnisse zeigten sich auch in einem akuten Colitis-Stressmodell.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit mithilfe zweier KO-Mausmodelle die Rolle von EPI-X4 in der Hämatopoese und der Immunologie von Mäusen beginnend charakterisiert werden. Die homöostatische Hämatopoese scheint kaum von EPI-X4 abhängig zu sein, lediglich die Zahl der B- und T-Zellen, insbesondere der regulatorischen T-Zellen, scheint beeinflusst. Damit einhergehend konnten Veränderungen in Zytokinlevels bei inflammatorischen Ereignissen gezeigt werden. Experimente zur beeinflussten, eventuell gestörten Barrierefunktion von Ala-EPI-X4-Mäusen zeigten vielversprechende Ansätze und sollten in Zukunft weiter analysiert werden.
The objectives of this thesis were to understand how distinct classes of cell types interact to shape oscillatory activity in cortical circuits of the turtle. We chose the turtle cortex as a model system for cortical computations for two reasons. One is that the phylogenetic position of turtles makes their cortex functionally and anatomically particularly interesting. The second is that reptilian brains present several unique experimental advantages. Turtles have a three-layered cortex that forms the dorsalmost part of their pallium and receives direct input from visual thalamus. Thus turtle cortex, while sharing several features with mammalian cortices, constitutes a simpler system for studying cortical computations and dynamics. Freshwater turtles are semiaquatic species, that dive for hours and hibernate for months without breathing. Their brains are adapted to these behaviors so that they can operate under severe anoxia. This property allows for ex vivo wholebrain and whole-cortex (”cortical slab”) preparations in vitro, enabling the use of many sophisticated techniques for monitoring activity in parallel.
I thus set out to utilize the advantages of our model system, by using optogenetic methods to reliably evoke oscillations in an ex vivo whole-cortex preparation while observing activity in parallel with planar multi-electrode arrays (MEA), linear silicon depth-electrodes and patch-clamp recording techniques. This required several technical aspects to be solved. Prior work in turtle cortex (Prechtl, 1994; Prechtl et al., 1997; Senseman and Robbins, 2002) indicated that visual stimuli evoke complex activity patterns (e. g. wave patterns) in dorsal cortex. The goal was to examine these dynamics in detail and to provide mechanistic explanations for them whenever possible. The recent advent of optogenetics, the development of microelectrode arrays, and the possibility to combine these techniques with classical electrophysiological approaches on a resistant, accessible and stable preparation led me to explore a number of technical avenues.
First I had to establish gene delivery methods in reptiles. I settled on recombinant viruses, and show results from several serotypes of adeno-associated virus (AAV), i lentivirus and rabies virus. I report successful gene expression of genes of interest with several subtypes of AAV, including the commonly used AAV2/1 and AAV2/5 serotypes. Second I had to find promoters enabling global and cell-type specific gene expression in reptiles. Ubiquitous high-yield promoters such as CAG/CB7 or CMV drive high levels of expression in turtles; cell-type specific promoters such as hSyn (expression limited to neurons) and CaMKIIa (expression limited exclusively o mostly to excitatory neurons) appear similarly biased in turtles. Other cell-type specific promoters reported in the literature (fNPY, fPV, fSST) failed to express in turtles.
A second major aspect of my work focused on electrophysiological recordings using microelectrode arrays and the interpretation of extracellular signals recorded from cortex in ex vivo preparations. We observed that spike signals produced by pyramidal and inhibitory neurons were very often followed by a slower potential. We identified these slower potentials as reflections of synaptic currents, and thus of the axonal projections of the neurons, at least within the deep layers of cortex. This also resulted in a means to classify neurons as excitatory or inhibitory with much higher reliability than classical methods (e. g. spike width). The final aspect of my work concerns the use of optogenetics to dissect the mechanisms of cortical oscillations and wave propagation. I show that oscillations can be induced by light in turtle cortex after transfection with AAV2/1 carrying the gene for channelrhodopsin 2 (ChR2). By using the CaMKIIa promoter, ChR2 induced currents are limited to LII/III excitatory cells; we can therefore control excitatory drive to cortical networks. If this drive is strong enough, layer III inhibitory interneurons are recruited and fire in a concerted fashion, silencing the excitatory population. The visually evoked 20 Hz oscillations observed in chronically recorded animals (Schneider, 2015) or in anaesthetized animals (Fournier et al., in press) thus appear to result from a feedback loop between E and I cells within layers II & III. Details of these interactions are being investigated but - layer I interneurons, by contrast, do not seem to be involved. By pulsing light I could control the frequency of the oscillations within a range of several Hz around the natural oscillation frequency. Above this range, cortex could only follow the stimulus at a fraction (1/2, 1/3,...) of the light pulse frequency. Using a digital micromirror device, I limited activation of the cortical networks spatially, enabling the study of wave propagation in this system.
Reptilian cortex offers a relatively simple model system for a reductionist and comparative strategy on understanding cortical computations and dynamics. Turtle dorsal cortex could thus give fundamental insights to the primordial organization tional, computational and functional principles of cortical networks. These insights are relevant to our understanding of mammalian brains and may prove valuable to decipher fundamental questions of modern neuroscience.
Exploring the in vivo subthreshold membrane activity of phasic firing in midbrain dopamine neurons
(2021)
Dopamine is a key neurotransmitter that serves several essential functions in daily behaviors such as locomotion, motivation, stimulus coding, and learning. Disrupted dopamine circuits can result in altered functions of these behaviors which can lead to motor and psychiatric symptoms and diseases. In the central nervous system, dopamine is primarily released by dopamine neurons located in the substantia nigra pars compacta (SNc) and ventral tegmental area (VTA) within the midbrain, where they signal behaviorally-relevant information to downstream structures by altering their firing patterns. Their “pacemaker” firing maintains baseline dopamine levels at projection sites, whereas phasic “burst” firing transiently elevates dopamine concentrations. Firing activity of dopamine neurons projecting to different brain regions controls the activation of distinct dopamine pathways and circuits. Therefore, characterization of how distinct firing patterns are generated in dopamine neuron populations will be necessary to further advance our understanding of dopamine circuits that encode environmental information and facilitate a behavior.
However, there is currently a large gap in the knowledge of biophysical mechanisms of phasic firing in dopamine neurons, as spontaneous burst firing is only observed in the intact brain, where access to intrinsic neuronal activity remains a challenge. So far, a series of highly-influential studies published in the 1980s by Grace and Bunney is the only available source of information on the intrinsic activity of midbrain dopamine neurons in vivo, in which sharp electrodes were used to penetrate dopamine neurons to record their intracellular activity. A novel approach is thus needed to fill in the gap. In vivo whole-cell patch-clamp method is a tool that enables access to a neuron’s intrinsic activity and subthreshold membrane potential dynamics in the intact brain. It has been used to record from neurons in superficial brain regions such as the cortex and hippocampus, and more recently in deeper regions such as the amygdala and brainstem, but has not yet been performed on midbrain dopamine neurons. Thus, the deep brain in vivo patch-clamp recording method was established in the lab in an attempt to investigate the subthreshold membrane potential dynamics of tonic and phasic firing in dopamine neurons in vivo.
The use of this method allowed the first in-depth examination of burst firing and its subthreshold membrane potential activity of in vivo midbrain dopamine neurons, which illuminated that firing activity and subthreshold membrane activity of dopamine neurons are very closely related. Furthermore, systematic characterization of subthreshold membrane patterns revealed that tonic and phasic firing patterns of in vivo dopamine neurons can be classified based on three distinct subthreshold membrane signatures: 1) tonic firing, characterized by stable, non-fluctuating subthreshold membrane potentials; 2) rebound bursting, characterized by prominent hyperpolarizations that initiate bursting; and 3) plateau bursting, characterized by transient, depolarized plateaus on which bursting terminates. The results thus demonstrated that different types of phasic firing are driven by distinct patterns of subthreshold membrane activity, which may potentially signal distinct types of information. Taken together, the deep brain in vivo patch-clamp technique can be used for the investigation of firing mechanisms of dopamine neurons in the intact brain and will help address open questions in the dopamine field, particularly regarding the biophysical mechanisms of burst firing in dopamine neurons that control behavior.
Humans and other primates are highly visual animals. Our daily visual activities such as recognizing familiar faces, interacting with objects, or reading, are supported by an extensive system of interacting brain areas. The interactions between the many individual nerve cells both within and between brain areas need to be coordinated. One possible solution to achieve flexible coordination between cells in the network is rhythmic activity, or oscillations. The focus of the thesis will be activity in the largest visual area, V1, in non-human primates. In V1, high-frequency activity, so-called gamma-band activity (“gamma”, ca. 30-90 Hz) can be frequently observed and has been suggested to play a role in coordinating activity in the visual system. In Chapter 1, the coordination problem, the primate visual system and gamma-band oscillations are introduced in detail. The following chapters explore the dependence of gamma on contextual influences. Does V1 use contextual information to optimize co-ordination? In the first part, the short-term consequences of repeated encounters with visual stimuli on V1 responses are explored (Chapters 2 and 3). Inspired by results from colored, naturalistic images in the first part, the second part tests the dependence of gamma on spatial and chromatic stimulus aspects (Chapters 4 and 5).
Stimulus repetition is a simple yet powerful way to tap into our brains’ ability to learn and adapt to our environment. Repeated presentation of a visual stimulus tends to decrease responses to this stimulus. Is this accompanied by changes in the coordination of brain activity? In Chapter 2, the stimulus-specificity of repetition effects on gamma was tested using naturalistic stimuli. V1 is most typically studied using black-and-white, artificial stimuli that are very familiar to the animals. Here, colored natural images were repeatedly presented that were initially novel to the animals, to provide a wider and more naturalistic range of stimulation. Both multi-unit spiking activity (MUA) and gamma showed stimulus-specific repetition effects. MUA responses de-creased most strongly for initial repetitions and less for later repetitions. In contrast, gamma could increase or decrease for initial repetitions, but tended to increase for later repetitions. This points to the operation of multiple plasticity mechanisms. One process may rapidly decrease MUA and gamma and be related to initial novelty or adaptation. The other increases gamma, is active for more repetitions, and could constitute a form of refinement of coordination over time. Moreover, based on the spacing of stimulus repetitions, stimulus memory in V1 persisted for tens of seconds.
In the following Chapter 3, the stimulus location specificity and persistence of the repetition effects for longer timescales were tested. To this end, the observation that the increase in gamma with repetition was strongest for the first tens of repetitions was used to test for location specificity and memory. Using simple artificial stimuli that were repeated many times at two alternating locations, both location specificity and memory on the order of minutes was observed. Due to the structure of the primate visual system, location specificity suggests that the repetition effects involve early to mid-level visual areas such as V1. Memory for previous stimulus presentations on the order of minutes has not been previously reported for V1 gamma. Taken together, these experiments demonstrate short-term plasticity of gamma that is stimulus- and location specific and persists on the timescale of minutes.
In Chapter 2, the average gamma-band response to the large, naturalistic stimuli was highly stimulus dependent. Relative increases in gamma-band activity scaled between tens and thousands of percent change depending on the stimulus. Particularly the color of the stimuli appeared to play a strong role, although the stimulus set was too limited and uncontrolled to draw strong conclusions. In Chapters 4 and 5, underlying mechanisms for the stimulus specificity of gamma were explored using more well-controlled, artificial stimuli that varied in color and spatial structure.
Much of vision relies on the analysis of spatial structure. Each nerve cell in V1 only responds to visual stimuli in a particular, small part of the visual field, its so-called “receptive field” (RF). Compared to isolated RF stimulation, nearby cells that are stimulated by a similar structure from different parts of visual space can show response decreases, commonly known as “surround suppression”, and may show coordinated activity in the gamma band. In Chapter 3, responses to large, uniformly colored disks are contrasted with responses to black or white (achromatic) disks. A first experiment showed that gamma-band responses were stronger for colored than achromatic stimuli, whereas MUA responses could decrease below baseline for colored stimuli. To test whether these phenomena were related to surround suppression, stimulus size was manipulated in a second experiment. When stimuli were of sufficient size to induce surround suppression, clear gamma-band responses emerged. Surround suppression and gamma were stronger for chromatic stimuli. However, the change of stimulus size could have changed not only surround suppression but also stimulus saliency. Therefore, in a third experiment, the overall size of the stimulus was kept constant, and the spatial structure of the stimulus was manipulated. In comparison to uniform, predictable stimulus structure, mismatches between the center of the stimulus and the surrounding visual space led to strong increases in MUA responses and strong de-creases in gamma-band activity. These effects were restricted to the recording sites with RFs at the mismatch location. These experiments underpin the strong role of both spatial structure and color for gamma in V1.
In Chapter 4, responses to different color hues are studied in more detail. Gamma response strength depended on hue, being strongest for red compared to blue and green stimuli when measured with a gray background. To better understand the underlying mechanisms of the differential responses, the spatio-temporal context in the form of the background color was manipulated. Background color had a strong influence on gamma strength. Using differently colored backgrounds, different parts of the color signaling pathways could be adapted. Response differences to different color hues could be explained well with a model that incorporates differences in adaptation between pathways involving long- compared to medium-wavelength cone signals.
Taken together, these experiments indicate a strong role of both spatial context (stimulus size and structure) and temporal context and drive (repetition, adaptation) for the generation of gamma-band activity in V1. Functional implications of these dependencies are considered in the final Chapter 6, and a role for gamma-band syn-chronization in a coding regime for visual inputs that generate strong drive and high predictability is suggested.
Fatty acids in oomycetes
(2021)
Es gibt für die Orientierung von Vögel ein allgemeingültiges Konzept, das Karte-Kompass-Prinzip (Kramer 1953, 1957): Der Karten-Schritt besteht darin, den eigenen Standort zu ermitteln und mit dem Ziel in Beziehung zu setzten. Damit wird die geografische Richtung bestimmt, die im Kompass-Schritt in eine konkrete Richtung umgesetzt wird. Für Beides nutzen Vögel auch das Magnetfeld der Erde; in der Karte als einen Faktor den Verlauf der Intensität, im Magnetkompass die Achse der Feldlinien. Der Magnetrezeptor, der die Karte mit Informationen versorgt, ist im Schnabel lokalisiert, der des Kompasses im Auge. Ich habe mich in meiner Arbeit darauf konzentriert, die zwei potenziellen Magnetrezeptoren der Vögel feinstrukturell und immunhistologisch weiter zu charakterisieren.
Für den Magnetkompass wird auf Grund des Radikalpaar-Modells angenommen, dass Cryptochrome die Rezeptormoleküle sein könnten (Ritz et al. 2000). Bei Vögeln sind vier Cryptochrome bekannt, allerdings muss das Rezeptormolekül des Magnetkompasses auch in seiner Lokalisation bestimmte Kriterien erfüllen. Die für meine Arbeit bedeutsamen Kriterien sind: (1) die gleiche Ausrichtung der Proteine in einer Rezeptorzelle und (2), dass die einzelnen Rezeptorzellen alle Raumrichtungen abdecken. Ich habe in meiner Arbeit Cryptochrom 1a (Cry1a) und Cryptochrom 1b (Cry1b) auf ihr Vorkommen in der Retina von Rotkehlchen (Erithacus rubecula) und Hühnern (Gallus gallus) untersucht. Cry1b befindet sich bei Rotkehlchen während der Zugzeit in den Ganglienzellen, in denen es teilweise an Membranen gebunden vorliegt, die jedoch keine bevorzugte Richtung haben. Somit erscheint mir Cry1b als Rezeptormolekül für den Magnetkompass als eher ungeeignet. Cry1b könnte, wie viele Cryptochrome, an der Steuerung von circadianen Rhythmen beteiligt sein. Cry1a hingegen ist bei beiden untersuchten Vogelarten in den UV/V-Zapfen an die Diskmembranen gebunden, was eine Ausrichtung ermöglicht. Die UV/V-Zapfen sind über die gesamte Retina gleichmäßig verteilt, und durch die sphärische Form des Auges decken die einzelnen Rezeptoren jede Raumrichtung ab. Somit erfüllt Cry1a die Bedingungen des Radikalpaar-Modells, und ich schließe daraus, dass es sich hierbei um das Rezeptormolekül des Magnetkompasses handeln könnte. Cry1a ändert nach Lichtabsorption wie viele Cryptochrome seine Konformation. Der von mir verwendete Antikörper bindet nur die lichtaktivierte Form des Proteins. In Versuchen, in denen Hühner verschiedenen monochromatischen Lichtern ausgesetzt wurden, zeigt sich, dass sich Cry1a in UV bis Gelb in lichtaktiviertem Zustand befindet. Dies stimmt sowohl mit der spektralen Empfindlichkeit des Magnetkompasses der Vögel als auch mit der des Flavins, des lichtsensitiven Teils des Cryptochroms, überein. Versuche mit grünem Licht lassen vorsichtige Rückschlüsse auf das für den Magnetkompass relevante Radikalpaar zu: so ist das Flavin erst im zweiten Oxidationsschritt grünlicht-sensitiv, und Cry1a ist nur nachweisbar, also lichtaktiviert, wenn der erste Schritt bereits im Hellen abgelaufen ist. Versuche in denen die Tiere vorab im Dunkeln waren, führen nicht zur erneuten Lichtaktivierung unter grünem Licht. Dies macht nur eines der beiden im Flavinzyklus entstehenden Radikalpaare wahrscheinlich, nämlich das in der Reoxidation entstehende, da das Radikalpaar im ersten Schritt der Oxidation unter Grün nicht entsteht.
In Bezug auf den Magnetrezeptor im Schnabel konnte bereits bei Tauben eine detaillierte Struktur beschrieben werden, die als Magnetrezeptor geeignet ist, nämlich Magnetit- bzw. Maghemit-Teilchen in Dendriten der Nerven (Fleissner et al. 2003). Auch Hühner haben eisenhaltige Strukturen im Oberschnabel, die in ihrer Eisenoxid-Zusammensetzung denen der Tauben entsprechen (Falkenberg et al. 2010). Ich konnte in meiner Arbeit zeigen, dass die eisenhaltigen Strukturen im Oberschnabel der adulten Hühner an oder in Nervenfasern liegen. Elektronenoptisch bestehen diese eisenhaltigen Strukturen im Nervengewebe bei Hühnern, wie bei Tauben beschrieben, aus einem 3-5 µm großen Vesikel, der von eisenhaltigen ‘Schuppen’ besetzt ist, aus circa 1 µm langen Plättchen und Kugeln mit einem Durchmesser von etwa 1 µm. Sie sind in Feldern angeordnet, in denen diese Zellstrukturen gleich ausgerichtet sind. In der Anzahl und Lokalisation der Felder der eisenhaltigen Dendriten gibt es Unterschiede zwischen Hühnern und Tauben, allerdings ist unklar, inwie¬weit dies zu Unterschieden in der Verarbeitung im Gehirn führt. Die Entwicklung der eisenhaltigen Dendriten der Hühner beginnt erst nach dem Schlupf, am Tag des Schlupfes haben Küken noch keine eisenhaltigen Strukturen, abgesehen von roten Blutkörperchen. In den ersten 5 Tagen werden eisenhaltige Makrophagen im frontalen Bereich des Schnabels gebildet, die anschließend wieder reduziert werden. Bei 12 Tage alten Hühnern werden diese auch im lateralen Bereich des Oberschnabels angelegt und ebenfalls dort bis Tag 21 wieder reduziert. 21 Tage alte Hühner haben nur noch wenige eisenhaltige Makrophagen, allerdings ein erstes Feld von eisenhaltigen Dendriten. Die Röntgenabsorption zeigt einen Unterschied in der Eisenoxid-Zusammensetzung zwischen eisenhaltigen Makrophagen und eisenhaltigen Dendriten. Es könnte sein, dass die eisenhaltigen Makrophagen an der Synthese der eisenhaltigen Dendriten beteiligt sind, da sie Eisen aufnehmen, aber auch wieder abgeben können und in demselben Zeitraum reduziert werden, wie die eisenhaltigen Dendriten aufgebaut werden.
Sowohl Tauben als auch Rotkehlchen haben sich phylogenetisch bereits vor 95 Millionen Jahren von den Hühnern abgespalten. Es gibt sowohl in der Lokalisation von Cry1a als auch in der Struktur der einzelnen eisenhaltigen Dendriten keine Unterschiede, so dass es sich bei den beiden Magnetrezeptoren der Vögel vermutlich um sehr alte Mechanismen handelt, die sich in der Evolution kaum verändert haben. Vermutlich sind sie vogelspezifisch, da es in dieser Hinsicht keine erkennbare Gemeinsamkeit mit anderen Wirbeltieren gibt.
Regulatory required, classical toxicity studies for environmental hazard assessment are costly, time consuming, and often lack mechanistic insights about the toxic mode of action induced through a compound. In addition, classical toxicological non-human animal tests raise serious ethical concerns and are not well suited for high throughput screening approaches. Molecular biomarker-based screenings could be a suitable alternative for identifying particular hazardous effects (e.g. endocrine disruption, developmental neurotoxicity) in non-target organisms at the molecular level. This, however, requires a better mechanistic understanding of different toxic modes of action (MoA) to describe characteristic molecular key events and respective markers.
Ecotoxicgenomics, which uses modern day omic technologies and systems biology approaches to study toxicological responses at the molecular level, are a promising new way for elucidating
the processes through which chemicals cause adverse effects in environmental organisms. In this context, this PhD study was designated to investigate and describe MoA-characteristic
ecotoxicogenomic signatures in three ecotoxicologically important aquatic model organisms of different trophic levels (Danio rerio, Daphnia magna and Lemna minor).
Applying non-target transcriptomic and proteomic methodologies post chemical exposure, the aim was to identify robust functional profiles and reliable biomarker candidates with potential
predictive properties to allow for a differentiation among different MoA in these organisms. For the sublethal exposure studies in the zebrafish embryo model (96 hpf), the acute fish embryo toxicity test guideline (OECD 236) was used as conceptual framework. As different test compounds with known MoA, the thyroid hormone 3,3′,5-triiodothyronine (T3) and the thyrostatic 6-propyl-2-thiouracil (6-PTU), as well as six nerve- and muscle-targeting insecticides (abamectin, carbaryl, chlorpyrifos, fipronil, imidacloprid and methoxychlor) were evaluated. Furthermore, a novel sublethal immune challenge assay in early zebrafish embryos (48 hpf) was evaluated for its potential to assess immuno-suppressive effects at the gene expression level. Therefore, toxicogenomic profiles after an immune response inducing stimulus with and without prior clobetasol propionate (CP) treatment were compared. For the aquatic invertebrate D. magna, the study was performed with previously determined low effect concentrations (EC5 & EC20) of fipronil and imidacloprid according to the acute immobilization test in water flea (OECD 202). The aim was to compare toxicogenomic signatures of the GABA-gated chloride channel blocker (fipronil) and the nAChR agonist (imidacloprid). With similar low effect concentrations, a shortened 3 day version of the growth inhibition test with L. minor (OECD 221) was conducted to find molecular profiles differentiating between photosynthesis and HMG-CoA reductase inhibitory effects. Here, the biological interpretation of the molecular stress response profiles in L. minor due to the lack of functional annotation of the reference genome was particularly challenging. Therefore, an annotation workflow was developed based on protein sequence homology predicted from the genomic reference sequences.
With this PhD work, it was shown how transcriptomic, proteomic and computational systems biology approaches can be coupled with aquatic toxicological tests, to gain important mechanistic insights into adverse effects at the molecular level. In general, for the different investigated adverse effects for the different organisms, biomarker candidates were identified, which describe a potential functional link between impaired gene expressions and previously reported apical effects. For the assessed chemicals in the zebrafish embryo model, biomarker candidates for thyroid disruption as well as developmental toxicity targeting the heart and central nervous system were described. The biomarkers derived from nerve- and muscletargeting insecticides were associated with three major affected processes: (1) cardiac muscle cell development and functioning, (2) oxygen transport and hypoxic stress and (3) neuronal development and plasticity. To our knowledge, this is the first study linking neurotoxic insecticide exposure and affected expression of important regulatory genes for heart muscle (tcap, actc2) and forebrain (npas4a) development in a vertebrate model. The proposed immunosuppression assay found CP to affect innate immune induction by attenuating the response of genes involved in antigen processing, TLR signalling, NF-КB signalling, and complement activation ...