Biochemie und Chemie
Refine
Year of publication
- 2006 (70) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (52)
- Article (14)
- Report (4)
Has Fulltext
- yes (70)
Is part of the Bibliography
- no (70)
Keywords
- Cytochromoxidase (4)
- Elektronentransfer (3)
- Electron transfer (2)
- Elektronenspinresonanzspektroskopie (2)
- Membranprotein (2)
- NMR-Spektroskopie (2)
- Paracoccus denitrificans (2)
- Peptide (2)
- Protonentransfer (2)
- Ubihydrochinon-Cytochrom-c-Reductase (2)
- Absorptionsspektroskopie (1)
- Adolf von (1)
- Aktivitätsmuster (1)
- Alcohols (1)
- Anorganische Synthese (1)
- Antisense-Nucleinsäuren (1)
- Antisense-Oligonucleotide (1)
- Apoptosis (1)
- Artifizielle Ribonucleasen (1)
- Atmungskette (1)
- Azide (1)
- Baeyer (1)
- Bindungsaffinität (1)
- Bioenergetik (1)
- Biphasisch (1)
- Bivalentes Ion (1)
- Black Lipid Membrane (1)
- Bororganische Verbindungen (1)
- Chalcogen-Liganden (1)
- Chemische Synthese (1)
- Crystal Structure (1)
- Cytochrom c Oxidase (1)
- Cytochrome c Oxidase (1)
- Cytochrome c oxidase (1)
- DNA (1)
- DNS (1)
- Decalin (1)
- Dekalin (1)
- Detergenz (1)
- Diabetes (1)
- Diffraktometrie (1)
- EAAC1 (1)
- EAAT3 (1)
- EAAT4 (1)
- EPR spectroscopy (1)
- Elektronenspinresonanz (1)
- Endothelin (1)
- Endothelin B Rezeptor (1)
- Endothelin Receptor B (1)
- Enthalpie (1)
- Entzündung (1)
- Epoxides (1)
- Esters (1)
- Fermats letzter Satz (1)
- Ferrocenderivate (1)
- Festkörperunterstützte Membran (1)
- Fluorig (1)
- Fluororganische Verbindungen (1)
- Fluorous (1)
- Funktionelle Gruppe (1)
- G-Protein gekoppelte Rezeptoren (1)
- G-protein coupled receptor (1)
- Gefrierpunkt (1)
- Glatter Krallenfrosch (1)
- Glutamattransport (1)
- Gramicidin A (1)
- Grignard Reagents (1)
- Harnstoffderivate (1)
- Heterologe Genexpression (1)
- High throughput screening (1)
- Hitlers Atombombe (1)
- Homologe <Chemie> (1)
- Hydroquinone (1)
- Indikator (1)
- Integrale Membranproteine (1)
- Interferonrezeptor (1)
- Ionenkanal (1)
- Isomerie (1)
- J coupling constants (1)
- Kaiser-Wilhelm-Gesellschaft (1)
- Katalyse (1)
- Kinetik (1)
- Konformation (1)
- Konformationsanalyse (1)
- Kopplungskonstante (1)
- Kristallographie (1)
- Kupfer-ATPase (1)
- Künstliche Ribonucleasen (1)
- Ligand <Biochemie> (1)
- Lise Meitner (1)
- MD simulations (1)
- MD-Simulation (1)
- Magnetische Kernresonanz (1)
- Membranproteine (1)
- Membrantransport (1)
- Messenger-RNS (1)
- Metallfreie Ribonucleasen (1)
- Metallion (1)
- Metallorganische Polymere (1)
- Minigramicidin (1)
- Molekulardynamik (1)
- Molekularer Schalter (1)
- Mutante (1)
- NMR spectroscopy (1)
- Natriumglutamat <Natrium-L-glutamat> (1)
- NhaA (1)
- Nitro Compounds (1)
- Nitroxylradikal (1)
- Oligonucleotide (1)
- Oozyten von Xenopus laevis (1)
- Organocatalysis (1)
- Organokatalyse (1)
- Otto Hahn (1)
- Oxoferrylzustand (1)
- PELDOR (1)
- PPAR (Peroxisome proliferator-activated receptors) (1)
- Patch-Clamp-Methode (1)
- Phosphorsäureester (1)
- Polyphenole (1)
- Primär aktive Transporter (1)
- Protein (1)
- Proteine (1)
- Proteorhodopsin (1)
- Proton transfer (1)
- Protonenpumpe (1)
- Pythagoreische Tripel (1)
- Quinhydrone (1)
- Quinon-Fumarat-Reduktase (1)
- RNA (1)
- RNS (1)
- RNS-Synthese (1)
- Radikal <Chemie> (1)
- Redoxactive Ligands (1)
- Ribonucleasen (1)
- Ribozym (1)
- Ruthenium (1)
- Ruthenium-Laserflash-Spektroskopie (1)
- Schmelzpunktalternanz (1)
- Semiquinone (1)
- Silicium (1)
- Silicon (1)
- Spin-Spin-Kopplungskonstante (1)
- Stilbene (1)
- Stofftransport <Biologie> (1)
- Taddol (1)
- Temperatur (1)
- Temperaturabhängigkeit (1)
- Thermus thermophilus (1)
- Typ I Interferone (1)
- Tyrosin (1)
- U4/U6 (1)
- UV-VIS-Spektroskopie (1)
- Ubiquinon-Cytochrome c-Reductase (1)
- Wasserstoffionenkonzentration (1)
- Wilson Disease Protein (1)
- affinities (1)
- analysis (1)
- antibiotics (1)
- artificial ribonucleases (1)
- bc1-complex (1)
- bioenergetics (1)
- biphasic (1)
- black lipid membrane (1)
- chalcogen ligands (1)
- cytochrome c oxidase (1)
- detergent (1)
- electron transfer (1)
- glutamate transport (1)
- glutamate transporter (1)
- homologe Reihe (1)
- inorganic synthesis (1)
- integral membrane proteins (1)
- interferon receptor (1)
- isomere Reihe (1)
- katalytischer Zyklus (1)
- kinetics (1)
- metal-free ribonucleases (1)
- molecular switch (1)
- mutants (1)
- pH-indicator dye (1)
- patch-clamp technique (1)
- peptides (1)
- pre-steady state (1)
- preparative cell-free expression (1)
- protein folding (1)
- proton transfer (1)
- respiratory chain (1)
- response patterns (1)
- rna (1)
- site-directed spinlabeling (1)
- skalare Kopplungskonstanten (1)
- solid supported membrane (1)
- spectrum (1)
- taddol (1)
- temperature (1)
- thiostrepton (1)
- time-resolved absorption spectroscopy (1)
- transition metal (1)
- type I interferon (1)
- tyrosine radical (1)
- zellfreie Expression (1)
- Überbrückte Verbindungen (1)
- Übergangsmetall (1)
The multidrug resistance like protein 1 (Mdl1p) belongs to the class of ATP binding cassette (ABC) transporters which comprise a large family of membrane proteins utilising ATP hydrolysis to drive up-hill transport of a wide variety of solutes across membranes. Mdl1p is a mitochondrial ABC transporter involved in the export of protein fragments derived from the proteolysis of non-assembled inner membrane proteins out of the mitochondrial matrix. Mdl1p forms a homodimeric complex consisting of two polytrophic transmembrane domains (TMDs) and two nucleotide binding domains (NBDs). The transport function and structural organisation of Mdl1p have not been elucidated yet. To characterise the ATP hydrolysis cycle of Mdl1p, the His-tagged NBD (amino acids D423-R695) was over-expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis. The ATPase activity was non-linear regarding to the protein concentration, indicating that the functional state is a dimer. Dimeric catalytic transition states could be trapped and three different intermediate states were isolated, containing two ATPs, one ATP and one ADP, or two DPs, which are trapped by orthovanadate or beryllium fluoride. These experiments showed that (i) ATP binding to the NBDs induces dimerisation, (ii) in all isolated dimeric states, two nucleotides are present, (iii) phosphate can dissociate from the dimer, (iv) both nucleotides are hydrolysed, and (v) hydrolysis occurs in a sequential mode. Studies in the workgroup systematically screened for over-expression of the full-length Mdl1p and expression conditions were optimised. These studies showed that highest expression was obtained in S. cerevisiae, where the protein was over-expressed 100-fold. In this work over-expressed His-tagged protein was purified via immobilised metal-ion affinity chromatography that was active in ATP binding and hydrolysis with a turn-over of 2.5 ATP per second. N-terminal amino acid sequencing of purified Mdl1p by Edman degradation confirmed experimentally a N-terminal targeting sequence of a mitochondrial ABC transporter of S. cerevisiae for the first time. This sequence was determined to be 59 amino acids in length. Mdl1p was reconstituted into liposomes, which was confirmed by freeze fracture electron microscopy. The reconstituted protein showed ATP hydrolysis similar to the solubilised Mdl1p. However peptide translocation with radiolabelled X(8) or X(23) libraries as done for the transporter associated with antigen processing TAP could not be shown with this setup. Furthermore, structural insights of the mitochondrial transport complex and its oligomeric state were obtained via single particle electron microscopy. It was shown that Mdl1p forms a homodimer in detergent. These in vitro studies provide the basis for further detailed investigation of the mitochondrial ABC transporter Mdl1p.
The present work wishes to contribute with information on two members of the primary active transporter group, which differ both in structure and function: Wilson Disease Protein which uses the energy released by ATP hydrolysis to transport copper across cell membranes, and Proteorhodopsin, which uses the energy of light to build up a proton gradient across the bacterial cell membrane, both heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. The surface detection experiments using HA-tagged WNDP confirm the proposed topology of WNDP. The HA-tag per se does not interfere with the function of WNDP, as shown for WNDP HA56 by ATP-dependent phosphorylation after expression in Sf9 cells. Sequence modifications within the WNDP HA56 template-construct reveal some interesting features: i) the N-terminal domain, which contains the 6 metal binding sites, is not necessary for plasma membrane targeting; ii) elevated surface expression of WNDP was observed when the carboxy terminus containing the tri-Leu motif is missing, which suggests that this motif might be involved in the retrieval of the protein from the plasma membrane; iii) the mutations TGE>AAA (proposed to lock the protein in the E1 conformation and lead to constitutive plasma membrane localisation) and D1027A (phosphorylation deficient) did not interfere with the surface localisation of the protein; iv) the mutations CPC>SPS (copper transport deficient) and H1069Q (phosphorylation deficient, most common mutation in Wilson Disease) reduced plasma membrane expression to less then 50%. Western blot analysis shows that the overall expression level of all constructs is similar to that of the reference construct WNDP HA56. These findings suggest that motifs involved in copper binding and catalytic activity do not interfere with plasma membrane targeting of WNDP in Xenopus oocytes. However, the H1069Q mutation could interfere with the distribution of WNDP protein within the cells. In the case of Proteorhodopsin, data presented in this work support earlier observations according to which proteorhodopsin can operate as an outwardly and inwardly directed light-driven ion pump. The residues proposed to play the roles of proton donor (E108) and acceptor (D97) are important for proton translocation. In the absence of an anionic residue at position 97 no outward pumping takes place, but inward charge translocation may occurs under appropriate conditions. An M-like state similar to that known from BR detectably accumulates under neutral pH conditions or under conditions where reprotonation of the Schiff base from the cytoplasmic side is slowed down, as in case of the mutants at position 108. Under acidic conditions PR pumps inwardly under the concerted action of pH and transmembrane potential. The experiments performed in parallel with PR and BR wild-types brought not only interesting information about similarities and differences between the two retinylidene ion pumps, but also led to the observation that the life-time of the M state in BR wild-type can be extended in addition to hyperpolarising transmembrane potentials also by extracellular acidic pH, when the proton gradient through the cell membrane is directed opposite to the ion transport (i.e. when the electrochemical gradient opposing the direction of proton transport increases). Direct photocurrent measurements of HA-tagged PR and BR have shown that the inserted tag may interfere with the functionality of the protein. Next to E108 and D97 in PR other residues in the vicinity of the retinal binding pocket contribute to the translocation of protons, as exemplified by the mutant L105Q: additionally to changing the absorption maximum of the protein, this mutant is a less effective proton pump than the wild type. The example of PR suggests that transduction of light energy by – and reaction mechanisms of retinylidene ion pumps have not been entirely deciphered by the extensive studies of bacteriorhodopsin.
Das humane MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) ist in chromosomale Translokationen mit mehr als 50 verschiedenen Partnergenen involviert. Alle diese Rearrangements sind mit akuter lymphatischer oder akuter myeloischer Leukämie assoziiert. Die reziproke Translokation t(4;11) ist ursächlich für die Entstehung einer akuten lymphatischen Leukämie, die gehäuft bei Kleinkindern auftritt. Die Prognose dieser aggressiven Leukämie ist sehr schlecht, da die leukämischen Blasten nahezu Therapie-resistent sind. Für einige MLL-Rearrangements konnte in Transduktions/Transplantations-Experimenten gezeigt werden, dass das MLL-Fusionsgen akute myeloische Leukämien in Mäusen induzieren kann. Aus diesem Grund steht immer noch das jeweilige MLL-Fusionsprotein im Mittelpunkt der Suche nach einem zugrunde liegenden Pathomechanismus. Die Versuche, ein Tiermodell mit dem MLL/AF4- Fusionsprodukt zu etablieren, blieben lange Zeit erfolglos. Erst Anfang dieses Jahres gelang es, durch eine knock-in Strategie, transgene Mäuse zu generieren, die das MLL/AF4 Translokationsprodukt tragen. Diese Mäuse entwickeln nach einer sehr langen Latenzzeit von bis zu 540 Tagen diffuse B-Zell-Lymphome. An der t(4;11) sind die Gene MLL auf Chromosom 11q23 und AF4 auf Chromosom 4q21 beteiligt. Die reziproke Translokation führt zur Entstehung von zwei Fusionsgenen (MLL/AF4 und AF4/MLL) mit intaktem Leserahmen. Wir nehmen an, dass beide Fusionsgene notwendig sind, um die Entartung der Zellen zu bewirken. Zum Einen ist der beschriebene Phänotyp der transgenen MLL/AF4 positiven Mäuse mit dem aggressiven Verlauf der t(4;11) Leukämie nicht vergleichbar, und zum Anderen findet man bei der Mehrzahl der Patienten mit einer t(4;11) beide Fusionstranskripte in den leukämischen Blasten. Um die Eigenschaften der Fusionsproteine AF4/MLL und MLL/AF4 zu untersuchen, wurden stabil transfizierte murine embryonale Fibroblasten-Linien etabliert, die entweder eines oder beide Fusionsgene regulierbar exprimierten. Mit Hilfe dieses in vitro Modells konnte man erstmals die Auswirkungen der gleichzeitigen Expression beider Fusionsgene auf das Verhalten der Zellen analysieren. Die Untersuchungen der Proliferation und der Apoptoseraten der verschiedenen transfizierten Zelllinien ergab, dass das AF4/MLL Fusionsprotein in den Zellen zu Wachstumstransformation führt, aber gleichzeitig die Zellen für den Zelltod durch bislang unbekannte Apoptosemechanismen sensitiviert. Das MLL/AF4 Translokationsprodukt war nicht in der Lage, eine Wachstumstransformation auszulösen. Vielmehr wurde deutlich, dass die Expression von MLL/AF4 die Proliferation der Zellen hemmt. Die Untersuchung der spezifischen Apoptoserate in den MLL/AF4 positiven Zellen ergab, dass die Zellen sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stress-Konditionen Apoptose-resistent waren. Damit besitzen beide Fusionsproteine onkogene Eigenschaften. Da nur die mit AF4/MLL und MLL/AF4 transfizierten Zellen eine stark erhöhte Proliferation aufwiesen, im Wachstum transformiert waren und eine erhöhte Apoptoseresistenz zeigten, wurde deutlich, dass die Eigenschaften beider Fusionsproteine notwendig sind, um den vollständig transformierten Phänotyp auszulösen. Um die Veränderungen in den Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde mittels quantitativer PCR die Expression verschiedener Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Expression Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene in allen drei Zellen verändert war. Genexpressionsprofil-Studien der Zellen ergaben schließlich, dass der Transkriptionsfaktor Nanog in den doppelt-transfizierten Zellen verstärkt exprimiert wurde. Nanog ist in die Aufrechterhaltung der Pluripotenz und des Selbsterneuerungspotenzials von embryonalen Stammzellen involviert. In dieser Arbeit konnte erstmals der Phänotyp einer Zelllinie beschrieben werden, die beide Fusionskonstrukte, AF4/MLL und MLL/AF4, stabil exprimierte. Dabei wurde deutlich, dass nur durch die Expression beider Fusionsgene ein Phänotyp erzeugt wird, der den Leukämoblasten sehr ähnlich ist. Die Expression von Nanog in diesen Zellen erklärt den Stammzell-Charakter der leukämischen Zellen.
Natrium/Protonen-Austauscher sind integrale Proteine biologischer Membranen und aufgrund ihrer funktionalen Abhängigkeit von einem elektrochemischen Gradienten der Klasse der Sekundärtransporter zugeordnet. Sie spielen eine essentielle Rolle sowohl in der Adaption von Bakterien an eine saline, alkalische Umgebung, als auch in der Regulation des intrazellulären pH- und Natriumhaushalts in Eukaryonten. Aufgrund der medizinischen Relevanz, unter anderem im Rahmen in der Behandlung des Herzinfarkts, besteht großes Interesse an der Struktur und den biochemischen Charakteristika des im Menschen ubiquitär vorkommenden Natrium/Protonen-Austauschers NHE1. Die heterologe und funktional aktive Produktion eukaryontischer Membranproteine stellt jedoch immer noch eine enorme Herausforderung dar, bei der sich das auf dem Semliki Forest Virus basierende Expressionssystem als gut geeignet erwiesen hat. Da die Überexpression von NHE1 mittels verschiedener eukaryontischer Expressionssysteme bisher kein kristallisationsfähiges Material liefern konnte, sollte in dieser Arbeit die heterologe Gewinnung von NHE1 mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem ermöglicht werden. Das Semliki Forest Virus Expressionssystem wurde auf Basis eines Vektorkonstrukts mit GFP zur späteren Übertragung der Parameter auf die Produktion von NHE1 etabliert. Konstrukte von NHE1 mit N- und C-terminalem Affinitäts-Tag wurden erfolgreich kloniert und zur Infektion von BHK-21 Zellkulturen eingesetzt. Dabei konnte beobachtet werden, dass der N-Terminus abgespalten wird und wahrscheinlich als Signalpeptid zum Einbau in die Membran dient. Das Protein wurde im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert, wo die Glykosylierung zum Transport in die Plasmamembran unterbleibt, was auf eine Interferenz mit der Virusinfektion zurückgeführt wurde. Eine Infektion der Zellen mit dem Semliki Forest Virus hat neben einem bereits bekannten massiven Anstieg des intrazellulären Natriumgehalts eine starke Alkalinisierung des Zytoplasma zur Folge. Ähnliches ist bisher über die Infektion von Zellen mit dem Poliovirus bekannt und stellt dort ein Schlüsselelement in der Sicherstellung der viralen Replikation dar, was auch für das Semliki Forest Virus zu gelten scheint. Die Expression von NHE1 konnte im 8 Liter-Maßstab optimiert und sowohl die Präparation als auch die Solubilisierung mit verschiedenen Detergenzien erfolgreich eingeführt werden. NHE1 erfährt jedoch bereits in vivo einen erheblichen proteolytischen Abbau, der sich während der Membranpräparation und Aufreinigung fortsetzt und zu einer Fragmentierung führt, die trotz des Einsatzes unterschiedlicher Kultivierungszeiten, Detergenzien, Additive oder Proteaseinhibitoren in vivo als auch in vitro nicht in einem Maße reduziert werden konnte, welches zur Gewinnung von kristallisationsfähigem Material erforderlich gewesen wäre. Es muss empfohlen werden einen in vivo Ansatz zu etablieren, um die proteolytische Degradation zu unterdrücken. Da die Virusreplikation nicht erforderlich ist, wäre Bafilomycin als Inhibitor der V-Typ ATPase geeignet, um die intrazelluläre Alkalinisierung und somit wahrscheinlich den Abbau von NHE1 zu verhindern. Ebenso erscheint der Einsatz von MG-132 zur spezifischen Inhibierung des Proteasoms Erfolg versprechend, was aber wegen hoher Kosten praktisch kaum in Frage kommt. Da man trotz individuell gelagerter Unterschiede zwischen den einzelnen Natrium/Protonen-Austauschern von einem ähnlichen Prinzip in Regulation und Transport ausgeht, wurden Strukturuntersuchungen mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie am bakteriellen Natrium/Protonen-Antiporter NhaA aus Escherichia coli durchgeführt, um die strukturelle Basis der pH-Wahrnehmung und die Translokation von Natrium in das Periplasma besser zu verstehen. Die vorliegende Röntgen- und EM-Struktur repräsentieren den inaktiven Zustand, weshalb der eigentliche Ablauf des Transportvorgangs bisher biochemisch herzuleiten war, da bislang keine Kristalle im aktiven Zustand gezüchtet werden konnten. Durch die in situ Inkubation von 2D-Kristallen konnten aktive Zustände des Proteins direkt auf dem EM-Netz induziert und kryo-elektronenmikroskopisch festgehalten werden. Einzelne Datensätzen wiesen Reflexe bis zu 5 Å auf. Aus den angefertigten Projektionsdichte- und Differenzkarten ergaben sich pH- und Natrium-abhängige Konformationsänderungen. Die Röntgenstruktur wurde mit Hilfe des Molekularen Ersatzes in die EM-Struktur eingepasst und diente der Zuordnung und Interpretation der beobachteten Zustände als Basis. Die pH-abhängige Konformationsänderung wurde einem mit der funktional wichtigen Helix 9 assoziierten Bereich zugeordnet, welcher durch die Röntgenstruktur nicht definiert ist und wahrscheinlich die fehlenden Aminosäuren des regulatorisch relevanten N-Terminus enthält. Die beobachtete Konformationsänderung stellt das Entstehen einer besser geordneten Struktur dar und geht mit der pH-regulierten Aktivierung von NhaA zwischen pH 6 und 7 einher, weshalb dieser Bereich des Proteins zumindest als Bestandteil des sogenannten pH-Sensors betrachtet werden kann. Nach der vollständigen Aktivierung durch den pH-Wert, welche der folgenden Natrium-abhängigen Konformationsänderung vorauslaufen muss, konnte beobachtet werden, dass die Präsenz von Natrium im Rahmen der Ionentranslokation eine Bewegung des periplasmatischen Teils von Helix 4 induziert. Es wäre interessant, eine tiefergehende und genauere Charakterisierung der beobachteten Konformationsänderungen durch die Erstellung einer dreidimensionalen EM-Dichtekarte zu ermöglichen. Des Weiteren hat die eingehendere Untersuchung des röntgenkristallographischen Monomers nach der Einpassung in das physiologisch vorliegende Dimer der EM-Struktur sowohl eine für Membranproteine neuartige „Joint β-Sheet“ Dimerisierungsdomäne im Periplasma, als auch eine Verzahnung von Helix 7 und 9 an der Monomer-Monomer-Grenze aufgezeigt. Diesen Charakteristika kommt wahrscheinlich eine tragende Rolle in der Dimerisierung von NhaA zu, was durch weitere Untersuchungen im Rahmen einer Mutagenesestudie unter Einbeziehung der periplasmatischen β-Haarnadelstrukturen überprüft werden sollte.
An den Folgen von AIDS sind bisher fast 20 Millionen Menschen gestorben. Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte erstmals die Viruslast bei gleichzeitiger Erhöhung der CD4-Lymphozytenzahl effizient erniedrigt werden. Dadurch konnte zwar eine Kontrolle der Virusreplikation und damit verbunden eine längere Überlebenszeit erreicht werden, jedoch ist eine vollständige Eradikation des Virus bisher nicht möglich. Hohe Behandlungskosten, Nebenwirkungen der antiviralen Substanzen, ihre unzureichende Wirkung in manchen Körperkompartimenten und die rasche Verbreitung resistenter Viren schränken die Effektivität von HAART ein. Alternative Therapieformen zielen in den letzten Jahren verstärkt auf die HIV-Eintrittshemmung durch Inhibition der Membranfusion von Virus und Wirtszelle („Fusionsinhibitoren“). Peptide, die sich aus der „heptad repeat“ Region 2, HR2, des gp41 ableiten (C-Peptide), sind äußerst wirksame antivirale Substanzen. 2003 wurde T-20, ein 36 Aminosäure langes C-Peptid, als erster Fusionsinhibitor zugelassen. Sein breiter Einsatz ist jedoch aufgrund rascher Resistenzbildung, mangelnder oraler Verfügbarkeit, einer äußerst kurzen Serumhalbwertszeit sowie daraus resultierender hoher Therapiekosten limitiert. Aufgrund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit mit der Entwicklung von RNA-Aptameren als HIV-Fusionsinhibitoren ein neuer therapeutischer Ansatz etabliert werden. Zur Isolierung dieser RNA-Aptamere wurden zwei hoch komplexe RNA-Bibliotheken in manuellen sowie automatisierten Selektionen gegen verschiedene Zielstrukturen auf dem HIV-1 gp41 mit Hilfe der SELEX-Technologie selektiert. Der Wirkmechanismus der isolierten RNA-Aptamere sollte analog zu den gp41 HR-abgeleiteten Peptiden auf der Hemmung der Ausbildung des Sechs-Helix-Bündels als fusionaktive Struktur beruhen. So sollten die RNA-Aptamere die Ausbildung der zentralen N coiled-coil Struktur verhindern (Selektion gegen HR1-Peptide) oder die Anlagerung der HR-2 Domänen an die konservierten hydrophoben Furchen des zentralen N coiled-coils inhibieren (Selektion gegen HR2-Peptide). Die gewählten Zielstrukturen wurden entweder als freie synthetische Peptide oder membrangebunden auf der Oberfläche von humanen T-Zellen präsentiert. Um die Selektion von serumstabilen Aptameren zu gewährleisten, wurden die RNA-Aptamere unter Einsatz von 2’-F- oder 2’-NH2-modifizierten Pyrimidinen transkribiert. Nach initialen Selektionsrunden wurden die isolierten Aptamerfraktionen in einer „single-round infection“ unter Einsatz von HIV-Pseudotypvektoren auf spezifische Inhibition des Eintritts von HIV in die Zielzellen analysiert. Die isolierten RNA-Aptamere waren in der Lage, den HIV-Eintritt zu inhibieren, ihre Wirksamkeit war allerdings im Vergelich zu der naiven Bibliothek gering. Nach Durchführung von verschiedenen Reifungsstrategien, um die Affinität der vorselektieren RNA-Fraktionen zum jeweiligen Zielepitop zu erhöhen, konnte die inhibitorische Wirkung der gereiften RNA-Fraktionen auf das 10Fache im Vergleich zu der Urspungsbibliothek verbessert werden. Die wirksamste RNA-Fraktion, 435UU, wurde aus einer Selektion einer aminomodifizierten N30 RNA-Bibliothek gegen das membranverankerte Fusionsprotein M435, bestehend aus gp41 C46 und dem membranproximalen HIV-Linker, und anschließender Kompetiton mit dem 2F5 Antikörper gewonnen. Die 435UU RNA-Fraktion konnte den Eintritt von HIV mit einer IC50 ≈ 200 nM spezifisch hemmen. Weiterhin konnte die spezifische Fusionsinhibition der 435UU Aptamerfraktion in einem Zell-Zellfusionsassay unter Einsatz von HIV env exprimierenden Zellen und einer humanen T-Zelllinie demonstriert werden. Die Affinität der 435UU-Fraktion wurde in einem Gelmobilitätsversuch bestimmt. Die moderate HIV-Eintrittshemmung beruhte auf einer schwachen Bindung (Kd ≈ 750 nM) an das Zielepitop auf dem gp41. Die Analyse von Einzelaptameren aus der 435UU RNA-Population ergab keine signifikanten Unterschiede in ihrem HIV-Neutralisationspotential. Des Weiteren konnten nur wenig gemeinsame Primärstrukturmotive bestimmt werden. Der Gehalt an inkorporierten Pyrimidinen in den 435UU-Einzelaptameren war allerdings mit ca. 70% vergleichsweise hoch. Unter Einsatz von randomisierten RNA-Transkripte mit definiertem Pyrimidingehalt konnte festgestellt werden, dass tendenziell ein höherer Gehalt an NH2-Pyrimidinen die HIV-Neutralisation fördert. Allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Bindung an das C46-HIVLinker Fusionskonstrukt und dem Pyrimidingehalt der Transkripte ermittelt werden. Die Sekundärstukturvorhersage ergab keine strukturelle Verwandtschaft unter den 435UU-Einzelaptameren noch konnten klar definierte Sekundärstrukturmotive gefunden werden. Die Selektion der 435UU-Aptamerfraktion erfolgte deshalb nich allein aufgrund ihres hohen Pyrimidingehaltes. Ein direkter Vergleich der 435UU Aptamerfraktion mit dem bisher einzigen RNA-Eintrittsinhibitor, einem anti-gp120 RNA-Aptamer, ergab zwar eine geringfügig schwächere HIV-Inhibition, jedoch ein wesentlich breiteres Wirkspektrum der isolierten anti-gp41 RNA-Aptamere wahrscheinlich durch ihren hoch konservierten Wirkmechanismus. Schlussendlich könnte die Wahl der Präsentation der Zielstrukturen sowie der Selektionsdurchführung die Gewinnung von RNA-Aptameren mit moderater Affinität fördern und gleichzeitig zum Verlust von hoch affinen RNA-Strukturen führen. In nachfolgenden Selektionen sollte deshalb die Selektionsstringenz erhöht sowie gegen membrangebundene Zielstrukturen selektiert werden, die die tatsächliche native gp41 Konformation darstellen.
Apoptose ist für grundlegende Prozesse des Lebens wie die Embryonalentwicklung und die Infektabwehr unentbehrlich. Defekte im Apoptoseprozess haben ernste Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Folge. Ein charakteristisches Kennzeichen von Krebszellen ist deren Apoptoseresistenz, die verhindert, dass Krebszellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Die Tumorzellen reagieren im allgemeine nicht mehr auf Zelltod-Signale, die z. B. bei Nähr- und Sauerstoffmangel oder einem Angriff durch Effektorzellen des Immnunsystems empfangen werden. Ein wesentlicher Grund dafür sind Mutationen im Signalweg der Apoptose. Häufig wird in Tumoren die Überaktivierung von antiapoptotischen Proteinen beobachtet. Die Aufklärung der Apoptose-Signalwege und die Charakterisierung der ihnen zu Grunde liegenden molekularen Interaktionsmechanismen sind wichtig für die Erklärung der Pathogenesse vieler Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, neue anti-apoptotische Proteine zu identifizieren, die als Targets zur Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien benutzt werden können. Ein wichtiger Bestandteil des Apoptoseweges ist das Mitochondrium. Ausgangspunkt für den mitochondrialen oder intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweg ist die Freisetzung von Cytochrom c (Cyt c) und anderen apoptogenen Faktoren aus dem Mitochondrien. Zytoplasmatisches Cytochrom c bindet zusammen mit ATP oder dATP an das Adaptorprotein Apaf-1 und induziert daraufhin eine Konformationsänderung sowie die Oligomerisation von Apaf-1. Die Selbstassoziation von Apaf-1 führt zur zusätzlichen Rekrutierung von Caspase-9, die in diesem des sogenannten Apoptosomskomplexes durch die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration autokatalytisch aktiviert wird. Aktive Caspase-9 wiederum spaltet und aktiviert Effektorcaspasen wie Caspase-3, die zelluläre Targetproteine spalten und damit den Zelltod verursachen. Viele apoptotische Stimuli aktivieren den mitochondrialen Apoptoseweg. Defekte im intrinsischen Signalweg finden sich häufig im Tumoren und sind oft mit Resistenzen gegen apoptoseauslösende Krebstherapien assoziert. Anti-apoptotische Proteine, die mit dem apoptotischen Programm an dieser Stelle interferieren und in Tumoren überexprimiert werden, stellen attraktive Targets für Tumortherapien dar. In der Arbeitsgruppe von Dr. Martin Zörnig am Georg-Speyer-Haus wurde ein S. pombe Hefesystem etabliert, um in einem funktionellen „Survival-Screen“ neue anti-apoptotische Säugergene aus Tumor-cDNA-Banken zu identifizieren. Hefen können durch die Expression bestimmter pro-apoptotischer Säugerproteine abgetötet werden. Dieser Hefezelltod weist äusserliche Gemeinsamkeiten mit apoptotischen Zellen multizelluläre Organismen auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe dieses Screens tatsächlich anti-apoptosische Säugerproteine zu identifizieren, die den induzierten Hefezelltod inhibieren können. In einem Screen, bei dem das Apaf-1 Homolog in C.elegans, CED-4, als Killerprotein verwendet wurde, konnte unter anderem das Gen Aven isoliert werden, das nicht nur CED-4-induzierten Zelltod in Hefe, sondern auch Apaf-1/Casp-9-vermittelte Apoptose in Säugerzellen inhibiert. Dabei wurde ein unvollständiges ΔAven-cDNA-Plasmid isoliert, dem das 5´-Ende fehlte. Diese Verkürzung ist vermutlich auf ein vorzeitiges Abbrechen der cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase zurückzuführen. Die vollständige humane Aven cDNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. J. M. Hardwick (J. Hopkins University, Baltimore USA) bereitgestellt, zusammen mit zwei polyklonalen anti-Aven Antiseren. Die Antisera erkennen die N-terminalen Aminosäuren 98-112 (anti-Aven A) sowie am C-terminus aa 256-268 (anti-Aven B). In der AG Zörnig wurde ein zusätzliches Antiserum (anti-Aven C) gegen ein Peptid generiert, das die letzten 17 Aminosäuren des humanen und des Maus-Aven-Proteins erkennt. Aven wurde in der Gruppe von M. Hardwick als anti-apoptotisches Protein beschrieben, das an das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xL und Apaf-1 bindet (Chau et al., 2000). Aven wurde mit Hilfe eines „Hefe-2-Hybrid Screens“ mit Bcl-xL als Köder („bait“) isoliert. Es wurde publiziert, dass Aven die Apaf-1 Selbstassoziation (und damit Caspase-9-Aktivierung) verhindert. Das humane Aven Gen kodiert für insgesamt 362 Aminosäuren. Die Sequenz ist in zahlreichen Spezies hoch konserviert. Aven mRNA Expression wurde in vielen Geweben (Herz, Nieren, Pankreas, Testis und Skelet-Muskulatur) und in mehreren Zelllinien gefunden. Dies deutet auf eine ubiquitäre Expression hin. In der Zelle ist Aven hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Immunfluoreszenzanalysen der Arbeitsgruppe Hardwick zeigten zusätzlich eine schwache Expression des Proteins im Nukleus. In der Arbeitsgruppe Zörnig konnte gezeigt werden, dass die isolierte Deletionsmutante ΔAven (aa 180-362) CED-4-induzierten Zelltod in Hefen inhibiert (Doktorarbeit M.L. Brezniceanu, unpublizierte Daten). Eine anti-apoptotische Wirkung konnte für ΔAven zusätzlich im Säugersystem verifiziert werden. Durch Überexpressionsstudien eines ΔAven- GFP-Fusionskonstruktes wurde Apaf-1/Caspase-9-induzierte Apoptose in der humanen Kolonkarzinomzelllinie RKO inhibiert. Weitere Experimente zeigten, dass sich in Tumoren des Kolons, der Niere und der Schilddrüse erhöhte Aven mRNA-Mengen nachweisen lassen und dass Aven auf mRNA-Ebene während der Entwicklung der Brustdrüse reguliert wird (unpublizierte Daten). Im Rahmen dieser Arbeit wurde Aven biochemisch und genetisch näher charakterisiert. Dabei wurden sowohl das volle-Länge-Aven sowie die artifizielle ΔAven Deletionsmutante untersucht. Zunächst wurde ein Teil der publizierten Daten verifiziert. Beschrieben ist eine Bindung zwischen Aven und Bcl-xL, die durch die N-terminale Domäne von Aven (Aminosäure 74-108) vermittelt wird. ΔAven, das den N-Terminus nicht enthält, sollte daher nicht an Bcl-xL binden können. In einem Immunpräzipitations-Experiment mit dem anti-Aven B Antiserum wurde entsprechend einer Interaktion mit Bcl-xL nur für das volle-Länge-Aven-Protein, nicht aber für ΔAven nachgewiesen. Den Publizierten Daten zufolge bindet Aven mit den Aminosäuren 180 bis 300 an Apaf-1, und diese Interaktion konnte in einem weiteren Ko-Immunpräzipitations-Experiment bestätigt werden. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluß von Aven auf die Bildung des Apoptosoms zu untersuchen. Dafür wurden Apoptosom-Immunpräzipitations-Experimente mit 293T Zelllysaten etabliert, in denen man endogene Apaf-1/Caspase-9-Komplexe nachweisen konnte. Durch Zugabe von Cytochrom c und dATP direkt zu den Zelllysaten wurde die Bildung des Apoptosoms induziert, das anschließend mit einem monoklonalen anti-Caspase-9 Antiköper immunpräzipitiert werden konnte. Bei gleichzeitiger Überexpression von ΔAven wurde weniger Apaf-1 mit Caspase-9 ko-immunpräzipitiert, ein Hinweis darauf, dass die Apoptosombildung unterdrückt wurde. Das Ergebnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass Caspase-9-Spaltung und -Aktivierung durch ΔAven vermindert wurde. Interessanterweise konnte eine Überexpression des volle-Längen Aven-Proteins die Bildung des Apoptosoms nicht verhindert. Apaf-1 wurde wie bei den Lysaten nichttransfizierter Zellen mit Caspase-9 Ko-immunopräzipitiert, und die Caspase-9 Spaltprodukte p35 und p37, die bei Aktivierung des Apoptosoms entstehen, wurden unverändert detektiert. Bei den beschriebenen Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch eine Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 (und nicht nur an Apaf-1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der C-Terminus von Aven für die Bindung an Caspase-9 wichtig ist. Interessanterweise nahm die Bindung von ΔAven an Caspase-9 nach Apoptosominduktion ab, während kein Unterschied in der Bindung des vollständigen Aven-Proteins an Caspase-9 vor oder nach Apoptosominduktion beobachtet werden konnte. Wegen der Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 konnte mit diesen Experimenten nicht festgestellt werden, ob Aven bzw. ΔAven Teil des gebildeten Apoptosomkomplexes sind, d. h. ob sie auch nach Apoptosombildung an Apaf-1 binden. Eine Hemmung der Apoptosomsbildung führt zur Inhibierung der Caspase-Aktivierungskaskade und damit zu verringerter Caspase-3 Aktivität. Entsprechend wurde die Caspase-3-Aktivität nach in vitro Apoptosominduktion bei Überexpression von ΔAven inhibiert, während das volle-Länge Aven keinen Einfluß auf die Caspase-3-Aktivität hatte. In weiteren Verlauf des Projektes wurden funktionelle Apoptoseexperimente mit transfizierten RKO-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Protektion durch Aven und ΔAven nach Staurosporin- und UV- Behandlungen. Dabei zeigte ΔAven einen stärkeren anti-apoptotischen Effekt als das volle-Länge-Aven in vivo. Die Tatsache, dass ΔAven ein höheres anti-apoptotisches Potential als das volle-Länge-Aven-Protein aufweist, deutet auf eine mögliche Spaltung oder Konformationsänderung von Aven in vivo hin, die zur Entstehung eines aktiven anti-apoptotischen C-terminalen Proteins führt. Um dies nachzuweisen, wurden einzel- und doppel-getaggte Fusionskonstrukte kloniert. Western Blot Analysen mit dem anti-Aven B Antiserum zeigten zusätzlich zu der volle-Längen-Aven- Bande (50 kDa) eine kleinere immunreaktive Bande mit einer Größe von ca. 35 kDa. Nach Apoptoseinduktion nahm die relative Menge dieser kleineren Bande zu. Das 35 kDa Aven-Spaltprodukt wurde nicht nur nach Überexpression, sondern auch auf endogener Proteinebene detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Spaltung Caspasen-abhängig ist. Eine Behandlung der Aven-überexprimierenden Zellen vor Apoptoseinduktion mit dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk blockierte die Spaltung von Aven vollständig. Gleiche Ergebnisse konnten mit dem endogenen Protein gezeigt werden. Obwohl die Aven-Sequenz keine in silico vorausgesagten Spaltstellen für Caspasen enthält, zeigten in vitro Experimente mit rekombinanter Caspase-3, dass Aven von Caspase-3 direkt prozessiert wird. In vivo Experimente mit Wildtyp-MCF-7-Zellen, die keine endogene Caspase-3 exprimieren, sowie mit transfizierten MCF-7-Zellen, die Caspase-3 stabil exprimieren, bestätigten dies. Aven wurde nur in den mit Caspase-3 transfizierten MCF-7-Zellen nach Staurosporin-Behandlung in das 35 kDa Fragment gespalten. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die das N-terminale Ende von Aven erkennen (anti-Flag oder anti-Aven A) zeigten eine zusätzliche kleinere Bande. Dieses Spaltprodukt ist ungefähr 30 kDa groß, und im Vergleich mit dem 35 kDa Aven-Peptid veränderte sich seine Expression kaum unter apoptotischen Bedingungen. Dieses Aven-Fragment ist jedoch nicht das Ergebnis einer Caspase-Spaltung, weil seine Entstehung nicht durch z-VAD-fmk inhibiert wurde. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch Serin-Proteasen nicht für diese Spaltung verantwortlich sind. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus von Aven gerichtet sind, zeigten erstaunlicherweise kein zusätzlichen Aven-Spaltprodukte, sondern nur das volle Länge-Aven-Protein. Offensichtlich ist das entstehende C-terminale Fragment nach Spaltung durch Caspase-3 instabil und kann nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche, nicht näher identifizierte 40 und 45 kDa große Aven Spaltprodukte wurden in MCF7-Zellen detektiert, die jedoch nicht in RKO-, HeLa-, oder 293T-Zellen beobachtet wurden. Mit Hilfe einer frei verfügbaren Software (GrabCas; ein Programm, das auch Granzyme Bund Caspase-Spaltstellen voraussagt, die sich von den Konsensusspaltsequenzen unterscheiden) sowie mit Western Blot Analysen von verschiedenen Aven-Deletionsmutante sollten potenzielle Schnittstellen näher charakterisiert werden. Dabei wurde die Spaltung durch Caspase-3 bei D293 (oder D287) bestätigt. Außerdem wurden zusätzliche mögliche Spaltstellen bei aa 240 oder zwischen aa 142-175 in Aven gefunden. Eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 142 und 175 würde zu einem ähnlichen C-terminalen Aven-Peptid führen wie das artifizielle ΔAven und sollte von daher potente anti-apoptotische Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Spaltstelle wurde ungefähr bei aa 100 kartiert. Die Isolierung von Aven Spaltprodukten aus eindimensionalen SDS-PA Gelen für eine nachfolgende massenspektrometische Analyse war aus technischen Gründe leider nicht erfolgreich. Die vorausgesagte Aven-Prozessierungsstellen sowie die in Western Blot Analysen beobachteten Aven-Fragmente lassen die Schlussfolgerung zu, dass Aven nach proteolytischer Aktivierung (d. h. nach Abspaltung inhibierender N-terminaler Sequenzen) anti-apoptotische Eigenschaften annimmt. Das generierte C-terminale Peptid wird dann möglicherweise durch Caspase-3-Spaltung bei D293 inaktiviert, wenn ein starker apoptotischer Stimulus auftritt. Zu Aufklärung der physiologischen Funktion von Aven in Normalgewebe und um zu untersuchen, ob Aven bei der Tumorentstehung eine Rolle spielt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Dazu wurde die humane Aven-cDNA zum einen unter der Kontrolle eines Hühner-ß-Aktin-Promotors und eines CMV-Enhancers kloniert. Diese Kombination regulatorischer Elemente sollte zu einer hohen und ubiquitären Expression des Transgens führen. Zusätzlich wurde die humane Aven-cDNA in den Vektor p1017 unter die Kontrolle des proximalen lck-Promotors kloniert, der eine Expression in unreifen T Zellen erlaubt. Die Etablierung der Mauslinien wurde in Kollaboration mit dem GSF-Institut für Experimentelle Genetik (AG Prof. M. Hrabé de Angelis) in München durchgeführt. Bei einer Untersuchung der Organe zeigte sich, dass in der ß-Aktin Aven-transgenen Maus eine starke Überexpression von Aven nur im Herz nachgewiesen wurde. Diese transgenen Mäuse werden zurzeit in Kollaboration mit Dr. S. Barrère-Lemaire (Institut of Functional Genomics, Montpellier, Frankreich) analysiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine lck Aven-Maus Linie untersucht. Western Blot Analyse zeigten eine starke Proteinexpression des Transgens im Thymus und auch in reifen T-Zellen (Milz). Mit Hilfe des anti-Aven C Antiserums konnte im Western Blot ein weiteres, vorher nicht beobachtetes Aven-Spaltprodukt in Thymozyten und aufgereinigten periphären T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Überexpression von Aven in Thymozyten und gereinigten T-Zellen hatte jedoch keine messbare Inhibition von Apoptose zur Folge. Dagegen wurde eine Inhibition der aktivierungsinduzierten Proliferation von T-Zellen in transgenen Aven-Mäuse beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten die transgenen Aven-Mäuse keine spontane Tumorentwicklung obwohl eine Korrelation zwischen Aven-Expression und einer schlechten Prognose in Kinderleukämien publiziert worden ist. Um zu untersuchen, ob Aven in Kombination mit anderen Onkogenen in Tumorentstehung oder Progression kooperieren kann, sollen transgene Aven-Mäuse mit anderen transonkogenen Mausstämmen (z.B. p53-/- Mäusen) gekreuzt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene proteomanalytische Methoden untersucht und evaluiert, die, basierend auf der Verwendung 2D-gelelektrophoretischer, 2D-chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken, die differentielle, quantitative Proteinanalyse zweier unterschiedlicher muriner Fibroblasten-Zelllinien ermöglichen. Hierfür wurden zunächst unterschiedliche Methoden für die 2D-elektrophoretische Proteinauftrennung analysiert. Im Hinblick auf eine größtmögliche Auflösung und Gel-zu- Gel-Reproduzierbarkeit wurden innerhalb der ersten Dimension (IEF) die Lademethode, die Fokussierungszeiten und der Reduktionsschritt (DTT oder HED) optimiert. Desweiteren wurde eine auf isoelektrischer Fokussierung basierende Vorfraktionierungsmethode auf ihre Anwendbarkeit bei einer quantitativen Proteomanalyse getestet. Für die Proteingelfärbung wurde unter anderem ein selbst synthetisierter Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, der hinsichtlich Färbesensitivität und MS-Kompatibilität mit etablierten Protokollen verglichen wurde. Eine Doppelfärbungs-Methode von Proteingelen (Silberfärbung nach Fluoreszenzfärbung) wurde auf ihre MS-Kompatibilität nach tryptischen Verdau untersucht. Desweiteren wurden manuelle und automatisierte Verdauprotokolle für eine möglichst hohe Peptide Recovery optimiert. Die zunächst durch die Anwendung von klassischen Färbe- und Quantifizierungsmethoden nach 2DE gewonnenen Ergebnisse wurden mit neueren Labelling-Methoden zur relativen Proteinquantifizierung verglichen. Dabei kamen zwei unterschiedliche Multiplexing-Verfahren zum Einsatz, die sich in der Proteinquantifizierung grundlegend unterscheiden (DIGE: gelbasierte Proteinquantifizierung; iTRAQ: LC-MS/MS basierte Peptidquantifizierung). Die für diese beiden Methoden bestehenden Protokolle wurden für die Anwendbarkeit auf die Fibroblasten-Proteinextrakte angepasst. Es konnte gezeigt werden, daß diese beiden Labelling-Methoden in Bezug auf Reproduzierbarkeit und quantitativer Aussagekraft dem klassischen 2DE-Experiment (Proteinfärbung nach der Auftrennung auf einzelnen Gelen) überlegen sind. Die statistische Absicherung der analysierten relativen Quantitätsunterschiede verbesserte sich durch die zusätzliche Anwendung der beiden neuen Labelling-Methoden erheblich. Dabei stützt sich die Signifikanz der quantitativen Bestimmung sowohl auf die große statistische Sicherheit, die innerhalb dieser beiden Multiplexing-Methoden erreicht wird, als auch auf die Wiederholbarkeit in unterschiedlichen Experimenten (21 Proteine wurden in unterschiedlichen Ansätzen bestätigt). Die beiden Labelling-Methoden DIGE und iTRAQ unterscheiden sich außer in der Quantifizierungsstrategie auch grundsätzlich in dem Ansatz der Auftrennung (DIGE: Proteine, 2DElektrophorese; iTRAQ: Peptide, 2D-Flüssigchromatographie). Damit besitzen sie unterschiedliche Limitierungen in Bezug auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Peptide/Proteine, die mit der jeweiligen Methode aufgetrennt werden können. Der daraus resultierende komplementäre Charakter beider Methoden konnte anhand mehrerer Proteine verdeutlicht werden. Durch die relative Quantifizierung konnten insgesamt 30 Proteine identifiziert werden, die aufgrund der An- oder Abwesenheit des MLL-Proteins in den beiden murinen Zelllinien differentiell reguliert sind. Die alleine schon durch die unterschiedliche Morphologie der untersuchten murinen Fibroblasten vermutete Deregulation von Struktur- und Stressproteinen (Actin, HSP27, HSP70) konnte bestätigt werden. Weitere Expressionsunterschiede zwischen Mll-/-- und Mll+/+-Fibroblasten zeigten sich vor allem bei Proteinen, die funktionell der Gruppe RNA-prozessierender Proteine (Polyadenylate Binding Protein, PTB-associated Splicing Factor, hnRNPs) zugeordnet werden können. Ein Vergleich der quantitativen Proteomdaten dieser Arbeit mit den mRNA-Expressionsprofilen der gleichen Zellen zeigt nur eine sehr geringe Korrelation bezüglich der Regulationen einzelner Gene/Proteine. Die meisten der bisherigen Studien, die eine Untersuchung des mRNA/Protein-Verhältnisses zum Gegenstand haben, bestätigen das Fehlen einer Korrelation. Diese Tatsache unterstreicht die Wichtigkeit der Kombination genomischer und proteinanalytischer Daten zur Aufklärung zellulärer molekularer Prozesse.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
It is considered whether Fermat’s so called Last Theorem can be understood by substituting variables by polynomials and discussing their properties. The same substitution yields a survey of the Pythagorean Triples.