Georg-Speyer-Haus
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Die Transkription vieler Gene wird über den Acetylierungsgrad der Histone reguliert. Entsprechend erweiterte die Entdeckung von Histondeacetylase-Inhibitoren das Verständnis um Transkriptions-Repressoren und ihre Rolle in der Pathogenese beträchtlich. Zur Zeit stehen die Modifikationen der Histondeacetylasen (HDACs) sowie die biologischen Rollen der verschiedenen HDAC-Isoenzyme im Zentrum intensiver Forschungsarbeiten.
In der vorliegenden Arbeit wurde anhand verschiedener Zelllinien und mit murinem Primärmaterial nachgewiesen, dass das gut verträgliche Antiepileptikum Valproinsäure (VPA) ein potenter HDAC-Inhibitor ist. Dies zeigt sich daran, dass VPA in vivo die durch HDACs vermittelte transkriptionelle Repression aufhebt und zur Akkumulation hyperacetylierter Histone führt. In vitro Enzymassays weisen darauf hin, dass VPA selbst und nicht ein hypothetischer Metabolit die Histondeacetylasen hemmt. Darüber hinaus wurde mit Bindungs- und Kompetitionsstudien festgestellt, dass eine Interaktion von VPA mit dem katalytischen Zentrum der HDACs stattfindet.
Weitere Analysen zeigten, dass VPA bevorzugt Klasse I HDACs hemmt. Durch dieses Merkmal einer erhöhten Spezifität bei gleichzeitig guter Bioverfügbarkeit definiert VPA eine neue Klasse von HDAC-Inhibitoren. Hieraus ergeben sich Hinweise auf strukturelle Anforderungen, die ein HDAC-Inhibitor erfüllen muß, um spezifischer und weniger toxisch als konventionelle Chemotherapeutika zu wirken. Außerdem eröffnete das neu entdeckte pharmakologische Wirkungsspektrum von VPA auf HDACs Erkenntnisse um zusätzliche therapeutische Einsatzmöglichkeiten dieses etablierten Arzneimittels. Bereits jetzt wird VPA in klinischen Studien an Patienten mit Krebs verabreicht.
HDAC-Inhibitoren gelten als potentielle Medikamente für die Therapie maligner Neoplasien. Deshalb besteht großes Interesse an den molekularen Mechanismen, mit denen Substanzen dieser Wirkstoffklasse das Wachstum transformierter Zellen in vitro und in vivo hemmen. In den humanen Melanomzelllinien SK-Mel-37 und Mz-Mel-19 bewirken klinisch relevante VPA-Dosen eine zeit- und dosisabhängige Akkumulation von Zellzyklusinhibitoren und hyperacetylierten Histonen, morphologische Veränderungen und eine verringerte Proliferationsrate. Die verminderte Proliferation wird von einem veränderten Zellzyklusprofil und Apoptose unter Beteiligung sowohl der extrinsisch als auch der intrinsisch bedingten Caspase-Kaskade begleitet. Dies manifestiert sich in der Spaltung der Caspasen 3, 8 und 9, einer Schädigung der Mitochondrien, der apoptotischen PARP-Spaltung, einem Abbau der genomischen DNA und einer Inaktivierung des GFP-Proteins.
Diese Analysen in Melanomzellen sprechen dafür, dass die weitgehend selektive Wirkung von VPA auf Klasse I HDACs der Mechanismus ist, mit dem diese Substanz das Wachstum bestimmter Tumorzellen hemmt. Durch Genexpressions-Analysen konnten außerdem neue Modelle zum Einfluss von VPA auf solide Tumoren postuliert werden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Expression und Induzierbarkeit der Zellzyklusregulatoren p21WAF/CIP1 und p27Kip1 und des latent cytoplasmatischen Transkriptionsfaktors Stat1 Biomarker für die Sensitivität von Melanomzellen gegenüber HDAC-Inhibitoren sind. Im Einklang hiermit wird die proapoptotische Wirkung von VPA durch das Cytokin Interferon α und den S-Phase-Inhibitor Hydroxyharnstoff deutlich gesteigert. Diese Ergebnisse sprechen für den Einsatz von VPA in tierexperimentellen und klinischen Studien.
Aufgrund der Schlüsselrolle der HDACs für die physiologische und aberrante Genexpression ist es wichtig, die Mechanismen ihrer Regulation zu kennen. In der vorliegenden Arbeit wurde anhand zahlreicher kultivierter Zelllinien und mittels eines Mausmodells gezeigt, dass therapeutisch einsetzbare VPA-Dosen neben der Hemmung enzymatischer Aktivität auch zu einer isoenzymspezifischen Verringerung der Klasse I Histondeacetylase HDAC2 führen. Als Ursache hierfür konnten eine verstärkte Poly-Ubiquitinylierung und ein proteasomaler Abbau ermittelt werden. Gleichzeitig wurden die Beteiligung etlicher Proteasen und eine veränderte Synthese oder Prozessierung der HDAC2-mRNA als Mechanismen ausgeschlossen.
Expressionsanalysen identifizierten die E2 Ubiquitinkonjugase Ubc8 als von HDAC-Inhibitoren induziertes Gen. Mittels transienter Überexpression („Gain-of-Function“) und siRNA-Experimenten („Loss-of-Function“) konnte dieses Gen als limitierender Faktor des HDAC2-Umsatzes in vivo erkannt werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass die E3 Ubiquitinligase RLIM spezifisch mit HDAC2 interagiert. Die Expression von RLIM beziehungsweise seine enzymatische Funktion beeinflusst die HDAC2-Konzentration in vivo. Hierbei kann VPA klar von dem HDACInhibitor Trichostatin A (TSA) abgegrenzt werden. Dieser hemmt ein breites Spektrum an HDACs und induziert Ubc8, führt aber gleichzeitig zu einem proteasomal vermittelten Abbau des RLIM-Proteins. Analysen mit überexprimiertem RLIM zeigten, dass TSA aufgrund dieses Mechanismus nicht in der Lage ist, den Abbau von HDAC2 zu induzieren. Somit ist im Rahmen dieser Arbeit die Ubiquitinylierungs-Maschinerie für HDAC2 charakterisiert worden. Hierdurch sind neue Aspekte zum Zusammenspiel zwischen dem Ubiquitin-Proteasom-System und der Transkriptionsrepression nachgewiesen worden.
Isoenzymspezifische HDAC-Inhibitoren können zur Aufklärung der Funktion einzelner Histondeacetylasen beitragen, insbesondere wenn Knock-Out-Studien zu aufwendig oder aufgrund embryonaler Letalität nicht durchführbar sind. Die Wichtigkeit dieser Analysen wird gerade bei HDAC2 deutlich, da diese Histondeacetylase in vielen soliden und hämatologischen Tumoren überexprimiert ist, und ihre Deregulation möglicherweise zur Krebsentstehung beiträgt. Die in der vorliegenden Arbeit identifizierte Regulation dieses HDAC-Isoenzyms könnte Hinweise auf den Ablauf eines malignen Transformationsprozesses geben. Darüber hinaus zeigt der nachgewiesene Regulationsmechanismus Erfordernisse und potentielle Zielstrukturen einer pharmakologischen Intervention auf. Schließlich könnten die Selektivität von VPA für Klasse I HDACs zusammen mit der Spezifität für HDAC2 die Gründe für die geringen Nebenwirkungen der VPA-Behandlung bei gleichzeitigem Auftreten antitumoraler Effekte sein.
Es wurden 34 polyvalente Immunoglobulinpräparate zur i.m. und i.v. Anwendung verschiedener Hersteller und verschiedener Chargen sowie 9 spezifische Tetanus-Immunglobulinpräparate auf das Vorhandensein von HBsAg-Immunkomplexen untersucht. Möglicherweise vorhandene Immunkomplexe wurden vorher mit der sauren Dissoziationsmethode gespalten. Der anschließende Nachweis von HBsAg erfolgte mit dem von uns modifizierten AUSRIA* II-725-Test der Firma Abbot. Von den polyvalenten Immunglobulinen wurden 22 positiv für HBsAg gefunden. Von den spezifischen Immunglobulinen waren 3 positiv.
Rinderplasma-Albumin wurde bei seinem isoelektrischen Punkt gelöst und in einer Unterschichtungszelle ultrazentrifugiert. Die mit Philpot-Svensson- Optik und Phasenplatte gewonnenen Sedimentationskurven wurden nach der SvEdbERG-Methode 1 (Sv.M.), nach der Maximalgradienten-Methode 2 (Mg.M.) und nach der Drei-Punkte-Methode 2 (D.P.M.) ausgewertet.
Die klassische Svedberg - Methode liefert die Sedimentationskonstante s; mit den beiden neuen Methoden kann man auf einfache Weise unmittelbar den Quotienten s/D sowie gleichzeitig und aus denselben Meßgrößen die Sedimentationskonstante s und die Diffusionskonstante D erhalten. (Die Bestimmung des zweiten Momentes der Sedimentationskurve, wie bei der ARCAIBALD-Methode 3 ist dabei nicht erforderlich.)
Nach Sv.M. und Mg.M. ergab sich der gleiche Wert für die Sedimentationskonstante. Nach der D.P.M. wurde eine um etwa 11% größere Sedimentationskonstante erhalten. Diese Abweichung beruht vermutlich auf einem bei der D.P.M. leicht unterlaufenden systematischen Meßfehler.
Der mittlere Fehler der nach Svedberg bestimmten Sedimentationskonstante betrug ± 2,7%. Etwa sechsmal größer war der mittlere Fehler von s und s/D bei der Mg.M., nämlich ± 17%, trotz annähernd gleicher Meßgenauigkeit bei Sv.M. und Mg.M.
Es scheint, daß die neuen Methoden schärfere und eindeutigere Sedimentations-Kurven erfordern als sie mit dem Philpot-Svensson- System bisher im allgemeinen erhalten werden können.
Eine Aussnahme macht dabei die nach der Mg.M. bestimmte Diffusionskonstante D, deren mittlerer Fehler hier 1,2% betrug.
1. Es wurde festgestellt, daß die wachstumshemmende Wirkung von p-Amino- und p-Nitro-benzolsulfonyl-l-glutaminsäure sowie von p-Nitro-benzoyl-glutaminsäure gegenüber Streptobacterium plantarum sehr gering, und zwar noch geringer ist, als diejenige der p-Amino-benzolsulfonsäure (Sulfanilsäure).
2. Entgegen dem Befund von Auhagen erwies sich die sulfonamid-antagonistisehe (Wachstums-) Wirkung der p-Amino-benzoesäure derjenigen der p-Amino-benzoyl-l-glutaminsäure als weit überlegen. Letzterer dürfte daher eine allgemeine Bedeutung als Wirkungsgruppe eines Wachstumsfaktors nicht zukommen.
Die im Trockenweißkraut vorkommende Kropfnoxe wird durch haushaltsübliches Kochen zerstört. Durch Wasserdampfdestillation verliert das Kraut rund 50% seines Gesamtschwefelgehaltes sowie seine strumigene Aktivität. Eine Isolierung der wahrscheinlich S-haltigen Noxe ist bisher nicht gelungen.
Die Noxe des getrockneten Weißkrautes ist im Gegensatz zu der des weißen Senfsamens in heißem Alkohol unlöslich.
Das Senfölglykosid Sinalbin scheint bei Anwesenheit von Myrosinase die Schilddrüse im Sinne einer Struma diffusa parenchymatosa zu beeinflussen.
Die Reizschwelle des in kürzester Zeit basedowifizierend wirkenden Allylthioharnstoffs liegt bei gewöhnlichen Kaninchen zwischen 30 und 40 mg pro 1 kg Körpergewicht, für Angorakaninchen darunter. Allylthioharnstoff verändert die Schilddrüse zunächst im Sinne einer Struma diffusa parenchymatosa, die aber sehr schnell in eine Struma basedowificata übergeht. Tyronorman beeinflußt die Allylthioharnstoffwirkung, wenn es gleichzeitig mit der chemischen Noxe verabfolgt wird; die Drüse verharrt dabei in einem Präbasedowzustand.
Dijodtyrosin ruft unter den gleichen Bedingungen eine ähnliche, aber stärkere Wirkung hervor. Bei kurzfristiger Behandlung einer bereits längere Zeit durch Allylthioharnstoff geschädigten SD kommt es zur Ausbildung einer SD, die histologisch der Jodbasedow-Struma gleicht. Benzylthioharnstoff verändert die SD vorwiegend im Sinne einer Struma diffusa parenchymatosa und steht somit in seiner Wirkung der im Weißkraut vorhandenen Kropfnoxe nahe. Auch für Benzylthioharnstoff scheint die Reizschwelle im gleichen Größenbereich wie beim Allylthioharnstoff zu liegen.
Bei langdauernder Injektion von Benzylthioharnstoff, der schwer resorbiert wird, entsteht beim Kaninchen keine Struma baśedowificata, sondern nur ein Präbasedow-Zustand. Eine Aktivierung der Schilddrüsen(SD)-Follikel tritt bei kurzfristiger Verfütterung von Benzylthioharnstoff auf.
Der symm. Dibenzylthioharnstoff erzeugt bei täglicher Injektion ein Vorstadium der Struma diffusa parenchymatosa. Seine Resorption ist schlecht.
Die Isothioharnstoffe sind für den Tierversuch wahrscheinlich zu giftig.
Thiouracil, subcutan gespritzt, ruft SD-Vergrößerung hervor und ist bei weitem nicht so toxisch wie Allylthioharnstoff. Die Größen der entarteten Drüsen sind den zugeführten Thiouracilmengen nicht proportional und meines Erachtens von der Konstitution der Versuchstiere weitgehend abhängig.
2-Thio-barbitursäure wirkt bei einer Injektion über drei Monate schwach schilddrüsenaktiv.
Die Natriumsalze des S-Kupfer-N-Allyl-N'-[m-carboxyphenyl]-iso-thioharnstoffes (Cuprion) und des S-Gold-N-Allyl-N'-[m-carboxyphenyl]-iso-thioharnstoffes (Lopion), parenteral gegeben, üben einen nachteiligen Einfluß auf die Schilddrüse aus. Lopion wird besser als Cuprion vertragen. Der N-Allyl-N'-[m-carboxyphenyl]-iso-thioharnstoff wird offenbar schnell vom Körper ausgeschieden, weshalb große Mengen des Grundkörpers erforderlich sind, um eine stärkere SD-Aktivität hervorzurufen.
Sulfanilylthioharnstoff verändert ein wenig die Kaninchen-SD, wenn er über zwei Monate verabfolgt wird.
Mengt man Sulfanilylguanidin dem Futter bei, dann wird die SD in geringem Grade aktiviert. Eine leichte Hypertrophie der Drüse wurde bei subcutaner Behandlung eines Tieres festgestellt.
Möglicherweise führen unter gewissen Bedingungen Benzylthioharnstoff, Sulfanilylguanidin, Cupro-N-Allyl-N'- [m-carboxyphenyl]-iso-thioharnstoff und Thiouracil, in dieser Reihe zunehmend wirksam, zu einer SD-Hypertrophie.
Die Art und Weise, wie die Kaninchen auf die schilddrüsenwirksamen Substanzen reagierten, weist auf die Entwicklung eines anormalen Zustandes der Thyreoidea hin. Unsere Befunde stehen mit der Erklärung der thyreostatischen Wirksamkeit chemischer Verbindungen durch amerikanische Autoren in Einklang.
Zur Biochemie der Schilddrüsenfunktion VII : Anzeichen der tierexperimentellen E-Hypervitaminose
(1947)
Vitamin-E-reiche Fütterung von männlichen jungen Kaninchen führt nach mehreren Wochen zu krankhaften Erscheinungen an der Schilddrüse (SD). Die drei Symptome der entstandenen E-Hypervitaminose in dem innersekretorischen Organ sind: 1. Abnorme Volumen- und Gewichtszunahme, 2. Jodfreiheit bzw. -mangel und 3. histologische Veränderung (gesteigertes Epithelwachstum). Vitamin-E-Gaben neutralisieren nicht die schilddrüsenschädigende Wirkung von Kohlkropfnahrung. Ein täglicher α-Toko-pherol-Zusatz zum Normalfutter verhindert nicht den kropferzeugenden Thiouracil-Effekt an Kaninchen, sondern wirkt im gleichen Sinne.
Arbeiten zur experimentellen Erhärtung der Vorstellungen über die Biogenese von Terpenen aus den Hemiterpenalkoholen Dimethylvinylcarbinol oder Prenol führten zur Auffindung der Dichloressigsäure als eines aliphatischen Polymerisationsbeschleunigers sowohl dieser beiden Alkohole als auch des ihnen zugrunde liegenden Dienkohlenwasserstoffs, des Isoprens. Die Ergebnisse mit dieser einfachen Carbonsäure regen zur Prüfung natürlicher organischer Säuren als Fermentmodelle an.