Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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Die Beobachtung, dass Tumorzellen häufig eine Abhängigkeit gegenüber einer einzelnen und treibenden Mutation entwickeln, obwohl sie zahlreiche Mutationen aufweisen, bildet die Grundlage der mittlerweile etablierten, zielgerichteten Tumortherapie (Weinstein, 2002). Mit der Identifikation verantwortlicher Signalwege sowie beteiligter Signalkomponenten, sind Ansatzpunkte für diese Therapieform geschaffen worden, die bereits zu einigen Erfolgen in der Leukämie-, Brustkrebs- oder Lungenkrebsbehandlung geführt haben (Druker et al., 2001; Slamon et al., 2001; Kwak et al., 2010) . In vielen Fällen stellt sich jedoch ein Rückfall aufgrund der Ausbildung von Resistenzen ein oder auch das Nichtanschlagen der Therapien wird beobachtet (Ramos & Bentires-Alj, 2015).
Verschiedenste Mechanismen kommen dabei in Frage, doch häufig werden kompensatorische Veränderungen in den Signalwegen beobachtet, die schließlich zur Umgehung der Inhibition führen (Holohan et al., 2013). Grundlage hierfür ist die Redundanz und Verknüpfung der Signalwege mit- und untereinander, die es der Zelle im Sinne der Homöostase ermöglichen sich flexibel an ihre Umgebung anzupassen (Rosell et al., 2013; Sun & Bernards, 2014) . Daher ist es von äußerster Wichtigkeit, die Mechanismen der Inhibition im Hinblick auf die Signalwege der Zellen genauer zu verstehen, und dabei nicht nur die direkten, sondern auch die indirekten Effekte der Inhibition zu analysieren. So lassen sich Rückschlüsse auf den Einsatz zielgerichteter Medikamenten ziehen, die in besseren Therapiekombinationen resultieren und dadurch die Entstehung von Resistenzen verhindern.
Eine Hyper-Aktivierung von STAT3 sowie das dadurch induzierte Genmuster sind als starkes onkogenes Signal identifiziert worden, und spielen darüber hinaus an der Vermittlung von Resistenzen gegenüber Tumortherapien eine entscheidende Rolle. Durch seine Rolle in diversen zellulären Prozessen, beeinflusst STAT3 die Proliferation und das Überleben von Tumorzellen, ihr migratorisches und invasives Verhalten sowie ihre Kommunikation mit Stroma- und Immunzellen. (Bromberg et al., 1999; Wake & Watson, 2015) Sehr selten ist die aberrante Aktivierung des Transkriptionsfaktors auf eigene Mutationen zurückzuführen, vielmehr sorgen Treiber überhalb für diese (Johnston & Grandis, 2011; Kucuk et al., 2015).
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene STAT3-Inhibitionen in unterschiedlichen Modellen verglichen um darüber Rückschlüsse auf Kriterien einer Therapie zu ziehen. In einem Gliommodell aus der Maus, dem eine v-SRC-Expression als Treiber zu Grunde liegt (Smilowitz et al., 2007), wurde eine indirekte, BMX-vermittelte STAT3-Inhibition mit einer zielgerichteten STAT3-Hemmung verglichen. BMX, die zur TEC-Kinase-Familie gehört, wird als STAT3-aktivierende Kinase beschrieben. In letzter Zeit wurde ihr Einfluss bei der Tumorentwicklung immer deutlicher (Dai et al., 2006; Hart et al., 2011; Holopainen et al., 2012). Unter anderem konnte in Glioblastom-Stammzellen eine BMX-vermittelte STAT3-Aktivierung als Treiber für die Selbsterneurungskapazität und das tumorigene Potential identifiziert werden (Guryanova et al., 2011). Mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor Canertinib ist es gelungen, in den murinen Tu-2449-Gliomzellen eine BMX-vermittelte STAT3-Aktivierung nachzuweisen und zu inhibieren. Dies ist damit die erste Arbeit, in der Canertinib als BMX-Inhibitor in einem endogenen Zellsystem getestet wurde. Die einmalige Canertinib-Gabe resultierte in einem Zellzyklusarrest der G1-Phase und die Aufrechterhaltung der Inhibitorwirkung im Zelltod. Im Vergleich dazu konnte eine RNAivermittelte STAT3-Stilllegung nicht das Absterben dieser Zellen induzieren. Mit der Suche weiterer Zielstrukturen von Canertinib, die die Grundlage dieser unterschiedlichen Phänotypen bilden, konnte eine zusätzliche AKT-Inhibition identifiziert werden. Sehr wahrscheinlich wird die AKT-Inhibition ebenfalls durch BMX vermittelt, da keine Inhibition der ERBB-Familie bestätigt werden konnte. Um die Effekte weiter abzugleichen wurden Canertinib-Versuche mit einem humanen Brustkrebsmodell durchgeführt, das als Treiber eine Überexpression des EGFR aufweist.
In MDA-MB-468-Zellen, in denen keine BMX-Aktivierung vorliegt, resultierte eine Canertinib-Behandlung in der sehr prominenten Inhibition des ERK-Signalweges und in einer weniger ausgeprägten Verminderung der STAT3- und AKT-Aktivierung. Auch in diesen Zellen führte die Canertinib-Behandlung zum Zelltod. Diese Effekte werden sehr wahrscheinlich durch die Inhibition des EGFR induziert, da Canertinib als pan-ERBBInhibitor beschrieben ist (Slichenmyer et al., 2001; Djerf Severinsson et al., 2011) .
Resultate die früher in der Arbeitsgruppe gewonnen wurden, beweisen, dass eine Herunterregulation von STAT3 in der Brustkrebszelllinie MDA-MB-468 ausreicht um ein Absterben der Zellen zu induzieren (Groner et al., 2008).
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Canertinib-Behandlung über die Inhibition unterschiedlicher Signalwege den Zelltod in beiden Zelllinien induziert. Obwohl beide Zelllinien Treiber-vermitteltes, konstitutiv aktives STAT3 aufweisen, stellt nur in den Brustkrebszellen seine Inhibition eine ausreichende Therapiebedingung dar. Somit sind die Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien essentiell für ein Überleben der Zellen nach einer STAT3-Inhibition. In Zukunft ist es wichtig, diese Unterschiede zu identifizieren um damit zu definieren, in welchen Patientengruppen eine STAT3-Inhibition zum Erfolg führt.
Die paravertebralen Grenzstränge entwickeln sich aus Neuralleistenzellen des Rumpf- und Lendenbereichs. Diese sammeln sich im Hühnerembryo an Embryonaltag 2,5-3 an der dorsalen Aorta und formen die primären sympathischen Ganglien. Die dorsale Aorta sezerniert Morphogene, welche einen Teil der Vorläuferzellen zur Differenzierung zu Neuroblasten anregt. Die sympathischen Neuroblasten sind, obgleich sie bereits neurale und noradrenerge Marker exprimieren, zur Zellteilung fähig. Sie unterscheiden sich darin von anderen Neuralleistenderivaten wie beispielsweise den Neuronen der parasympathischen Ziliarganglien und der sensorischen Hinterwurzelganglien. Schließlich wandern die primären sympathischen Ganglien weiter und bilden lateral zum Notochord die paravertebralen Grenzstränge (Rohrer, 2011).
Der Homöodomänen-Transkriptionsfaktor PROX1 wird im Laufe der Entwicklung höherer Vertebraten in vielen Geweben exprimiert. Welche Wirkung PROX1 dabei auf Überleben, Migration, Proliferation und Differenzierung hat, hängt davon ab, in welchem Zelltyp er aktiv ist (Dyer et al., 2003; Lavado et al., 2010). Im peripheren Nervensystem konnte PROX1 embryonal in den Hinterwurzelganglien und den sympathischen Ganglien nachgewiesen werden (Becker et al., 2009; Diplomarbeit Julia Holzmann, 2010). Zielsetzung dieser Dissertation war es, die Expression und die Funktion von PROX1 in sympathischen Ganglien von Hühnerembryonen zu analysieren.
Die Expressionsanalyse von PROX1 zeigte, dass der Anteil der PROX1-positiven Neurone an Embryonaltag 5 (E5) ein Maximum erreicht und danach im Laufe der Entwicklung stetig abnimmt. Dies gilt ebenso für die Population der proliferierenden Neuroblasten, welche ebenfalls im Laufe der Hühnerentwicklung erstmals detailliert untersucht wurde. Diese Korrelation führte zu der Vermutung, dass PROX1 hauptsächlich in proliferierenden Zellen exprimiert wird, welche anschließend experimentell bestätigt werden konnte. Die Population der PROX1-positiven und die der p27-negativen Neuroblasten haben in allen untersuchten Hamburger Hamilton-Stadien (HH-St 21-37) eine vergleichbare Größe. Dennoch ist PROX1 durchgehend in einem kleinen Teil der p27-positiven Neurone enthalten. Diese Population verändert sich im Laufe der Entwicklung kaum und das Fluoreszenzsignal eines oder beider Proteine ist bei doppelpositiven Zellen deutlich schwächer. Diese und andere Daten dieser Arbeit weisen darauf hin, dass es sich um Neuroblasten handelt, welche gerade aus dem Zellzyklus austreten. In postmitotischen Neuronen geht PROX1 verloren. Obwohl PROX1 in allen untersuchten HH-Stadien stark in der Population proliferierender Neurone exprimiert wird, zeichnet sich ab E7 eine kleinere Population von Neuroblasten in S-Phase ab, welche kein PROX1 enthalten.
Die Vorläuferzellen von Ziliarganglien werden, ähnlich wie die der sympathischen Ganglien, durch BMP-Proteine zur Differenzierung angeregt (Müller und Rohrer, 2002). Aufgrund der Ähnlichkeiten in der Entwicklung beider Neuralleistenderivate wurde die Expression von PROX1 in dieser Dissertation auch in Ziliarganglien untersucht: Der Transkriptionsfaktor wird dort nur an E4 und E5 vereinzelt in Neuronen exprimiert und nahezu gar nicht in Vorläuferzellen. In späteren HH-Stadien ist PROX1 in Ziliarganglien nicht mehr nachweisbar.
Ebenfalls konnte hier gezeigt werden, dass PROX1 in primären sympathischen Ganglien an E3 (HH-St 21) in Vorläuferzellen exprimiert wird, welche bereits begonnen haben, sich zu Neuroblasten zu differenzieren. Noch bevor die Differenzierung dieser Zellen jedoch abgeschlossen ist, wird PROX1 transient herunterreguliert. Die entstehenden Neuroblasten treten in dieser Phase kurzzeitig aus dem Zellzyklus aus. Da sich die Größe der p27-negativen und der PROX1-positiven Population auch an E3 stark ähnelt, kann man schließen, dass die Zellteilung in den Neuroblasten erst bei erneuter PROX1-Expression wieder aufgenommen wird. Ab E5 ist PROX1 fast ausschließlich in Neuroblasten nachweisbar.
Eine Funktionsanalyse von PROX1 unter Kulturbedingungen und im Hühnerembryo sollte durch Knockdown und Überexpression zeigen, welchen Einfluss der Transkriptionsfaktor auf die Proliferation der Neuroblasten nimmt. Die Manipulation der PROX1-Expression hatte in vitro einen proproliferativen Effekt. In vivo unterschieden sich Knockdown und Überexpression aber nicht von der Kontrolle.
Zusammenfassend wurde in dieser Doktorarbeit die Expression von PROX1 in sympathischen Ganglien von Hühnerembryonen im Detail analysiert. Der Transkriptionsfaktor ist sowohl in Vorläuferzellen als auch in Neuroblasten nur transient vorhanden. Zwar konnte eine klare Korrelation zwischen der Expression von PROX1 und der Proliferation der sympathischen Neuroblasten festgestellt werden, allerdings konnte eine Wirkung von PROX1 auf die Proliferation durch Funktionsanalysen nur teilweise bestätigt werden. Zusammen weisen die Daten darauf hin, dass PROX1 eine Rolle in der Feinregulation der Proliferation spielt.
In the last couple of years the research on natural products concerning ecological questions has gained more and more interest. Especially natural products play an important role for the maintenance of symbiotic relationships.
Here we present the application of the “overlap extension PCR-yeast homologous recombination“(ExRec) to simplify the availability of natural products. We successfully cloned a 45 kb gene cluster and characterized two new peptides ambactin and xenolindicin from Xenorhabdus – the latter derived from a silent gene cluster. ExRec is a very efficient cloning technique and resembles a powerful method regarding the assembly of large gene clusters as well as the cloning from metagenomic libraries or RNA pools.
In addition, we discovered bacterial pyrrolizidine alkaloids from Xenorhabdus, referred to as pyrrolizixenamides. The gene cluster consisted of a NRPS and a hydroxylase encoding gene. Surprisingly, this gene cluster and its variations (type A to D) can be found throughout the bacterial kingdom which might indicate an essential function. While these substances are mainly known to play a role in the defense mechanism of plants, the function of the identified pyrrolizixenamides from Xenorhabdus yet remains unsolved.
Moreover, we firstly identified a phosphopantetheinyl transferase (PPTase) from the lichenized fungus of Evernia prunastri. The gene eppA encoding a Sfp-type PPTase was heterologously expressed in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae and functional characterized by indigoidine production and complementation of lys5, respectively. All represented results contribute to the elucidation of natural products and thereby to their role in nature with special regard to symbiotic associations.
In order to investigate the diversity of the western honeybee, Apis mellifera L., in West and Central Africa, a total of 204 colonies were sampled from 44 localities in four countries – Nigeria, Niger, Cameroon and Chad. 86 of these colonies, from 23 localities, were subjected to full morphometric analysis. In a principal component analysis (PCA) of the morphometric data, the colonies formed a single cluster. It also revealed that overall size of the body was the most important source of variation between the colonies. A hierarchical structure analysis, followed by a stepwise discriminant analysis, classified the colonies into three distinct morphoclusters; however, these clusters were not geographically demarcated. In another PCA carried out with the samples under investigation and reference samples of A. m. adansonii, A. m. jemenitica and A. m. scutellata, the colonies under investigation again formed one cluster which lying over and extended beyond the clusters of the reference subspecies. This is suggestive of a wider variation in size in the bees under investigation. In a stepwise DA, 94.2% of cross-validated grouped cases were correctly classified and the distances between group centroids were highly significant (p < 0.0005) according to F-statistic. 61 and 22 of the 83 colonies under investigation were assigned to A. m. jemenitica and A. m. adansonii, respectively. Mitochondrial DNA analysis was carried out on 148 colonies from 39 localities. Four mitochondrial haplotypes, previously reported from Africa and belonging to the African mitochondrial lineage, A, were detected: A1 (n = 62), A4 (n = 70), A4' (n = 15) and A14 (n = 1). The overall haplotype diversity was low (h = 0.478 ± S. E. 0.057). A chi-square test for association was conducted between haplotypes and type of vegetation, latitude, longitude, altitude, temperature and rainfall, severally. There was a statistically significant association between haplotype and each of the six variables and the association was strong with latitude, moderate with vegetation and rainfall and weak with the remaining variables. The neighbour-joining, maximum likelihood and maximum parsimony trees, obtained from sequence variation of the cytochrome b gene of mitochondrial DNA, showed that the samples, from the current study, unambiguously clustered with the reference sequences of A. m. scutellata from Kenya, but without showing further subdivision within this sub-Saharan cluster. 133 workers (one per colony) collected from 38 localities were subjected to microsatellite analysis. A total of 292 different alleles were recorded for the 15 microsatellite loci used. All microsatellite loci were polymorphic and the number of different alleles per locus ranged between 10, in locus At163, and 31, in locus A029. Heterozygosity (or gene diversity) was high in all loci. The unbiased expected heterozygosity, which is a better expression of gene diversity, was 0.861 ± S.E. 0.017. The overall FST value, which is a good estimate of genetic differentiation of populations, was very low: 0.007 ± S.E. 0.001 (0.001 - 0.014). AMOVA and Bayesian assignment showed no differentiation of the investigated populations. Based on morphometric analysis, the results of this study present the honeybees of western Africa as a single entity with an internal variation which lacks a geographical demarcation. Consequently the results do not support the splitting of the honeybees of the region into the two subspecies, A. m. adansonii and A. m. jemenitica, as reported in the literature. More morphometric, molecular, physiological and behavioural studies are required to confirm the taxonomic status of the honeybees of the region. Meanwhile, the use of A. m. adansonii, as the sole sub-specific name for the honeybees of West and Central Africa, is recommended.
Fossils are often anatomically and functionally compared to extant model taxa such as Pan, Gorilla, Pongo and modern Homo sapiens to put the respective fossils into the (taxonomical) context of human evolution. Therefore, knowledge of extant hominid anatomy is necessary as well as knowledge of which traits differ between sexes, populations, (sub-)species and taxa, and whether these differences are pronounced enough to separate respective groups. Dental and mandibular structures have been of particular interest in many paleoanthropological studies, simply due to the fact that these morphological structures are most abundant in the human fossil record.
Various studies have addressed questions regarding taxonomy, variation and sexual dimorphism of hominid taxa with regard to dental and mandibular size. Tooth size, however, has almost exclusively referred to crown size, with little focus on root size. The focus on tooth crowns is partly due to roots being embedded in mandibular bone which makes access difficult. With the help of micro-computed tomography (μCT) it is now possible to render virtual 3D models of dental roots and measure these models without harming the original specimens. In addition, measurements are much more precise using μCT data than previous techniques such as 2D x-rays. The present study used 3D models of 231 (first, second and third) molars and 80 mandibles of 53 Pan troglodytes verus (consisting of individuals form the Tai and Liberia populations), 14 Gorilla sp. and 13 Pongo sp. individuals to investigate molar and mandibular sizes within, and between, taxa and populations with regard to sexual dimorphism, variability and taxonomical value. Molar root size was assessed by applying 7 measurements to each molar. Mandibular size was investigated using three different measurements: overall mandibular size, mandibular robusticity (at each molar position) and 15 linear measurements. Overall mandibular size and root measurements were used to investigate the dental and mandibular size relationship. Furthermore, based on data acquired from great apes, how well fossil mandibles (including their dentition) of Australopithecus africanus, Paranthropus sp. and Homo sp. match one or multiple extant hominid taxa was examined Overall, molar root and mandibular metrics are suitable to differentiate between sexes, populations and taxa. Investigation of 40 (21 molar and 19 mandibular) different measure ments resulted in five common characteristics among Pan, Gorilla and Pongo only: firstly, molar root size sequence in root volume and root surface area (M3 < M1 < M2). Secondly, M2 as the molar with the largest cervical area, root volume, root surface area and mesial root lengths and thirdly, mandibular robusticity is larger in females than in males, yet the difference is not signifficant. Fourthly, mandibular length and premolar width are sexually dimorphic and fifthly, the best factors to discriminate between taxa are bicondyle width and molar root length. There is no generalized answer to the question which molar and/or measurement (dental or mandibular) is best to discriminate between sex or taxa in extant hominids. Moreover, size relationships differ among taxa, depending on the measurement. The overall trend, however, is that Pan is the taxa with the smallest, and Gorilla the largest, mean values. Among Pan populations, Liberian chimpanzees tend to have larger average values compared to Tai chimpanzees, with the exception of mandibular robusticity. The highest percentage of sexual dimorphic measurements is found in Pongo, yet only half of the measurements are statistically different between sexes. African apes are less sexually dimorphic compared to Pongo, and surprisingly, Gorilla is only slightly more dimorphic than Pan. The study also shows that statements and conclusions relating to \mandibular size" should not be generalized: whereas male and female Pongo do not differ significantly in overall mandibular size, they do differ in linear mandibular measurements. Moreover, Gorilla has the overall largest mandible, yet robusticity is higher in Pan, as are some linear measurements. Sexual dimorphism in overall mandibular size does not seem to reflect body mass dimorphism, whereas mandibular size appears to be related to body mass. The same was previously proposed for mandibular robusticity, yet Pan, the smallest taxa, has the most robust mandibular corpus (> Gorilla > Pongo). A substantial amount of molar measurements that positively correlate with (overall) mandibular size was found, but in African apes only. This contrasts with former studies which found no, or weak, correlations between dental and mandibular sizes. Given that the percentage of correlation is highest in Pan, and not present in Pongo, it is proposed that small jaws feature small teeth, rather than large jaws feature large teeth. This proposition assumes a size-threshold from which, when reached, dental and mandibular sizes no longer correlate, as has been previously proposed for the relationship between canine size and mandibular breadth. This assumption is further supported by the fact that the smaller and more robust Tai population shows more significant correlation compared to the less robust and larger Liberia population. Results show that fossil metrics are similar to one or multiple extant hominid taxa, depending on the measurement (dental or mandibular) used for comparison. Subsequently, the assignment to a specific sex depends on the earlier selected extant model taxa. Therefore the study questions whether choosing one model taxa for one fossil, or taxonomical group, is advisable. This study is the first to extensively investigate molar root size in extant hominids and to broadly describe differences in molar root sizes among and between taxa and therefore provides a solid database for future studies. The same applies to mandibular robusticity which has not been investigated as systematically or to such a great extent as in this work. The study specifically shows how complex the search for taxa or sex differentiating molar root and/or mandibular measurements is. Subsequently it shows that generalizations in relation to taxonomical values and statements about sexual dimorphism can be misleading.
In addition, the study contributes to the understanding of intra- and inter-population differences within Pan torglodytes verus. Furthermore, it could be demonstrated that results of a subspecies sample very likely depend on the sample composition, i.e. whether the sample consists of individuals from one or more populations. This study serves as a database for further studies investigating molar root sizes in great apes, whether these studies are investigating various relationships between taxa, population or sex, or as database to investigate functional adaptations or to examine mandibular robusticity and molar root relationships.
Bei Untersuchungen HBV-positiver Zellen konnte zunächst, anders als für HCV, eine deutlich gesteigerte Menge an TIP47 im Western Blot nachgewiesen werden. Da außerdem auch die zellulären mRNA-Spiegel von TIP47 erhöht waren, wurde in Promotorstudien der genaue Regulationsmechanismus untersucht. Für HBV sind zwei wichtige Faktoren bekannt, welche diverse zelluläre Signalkaskaden, wie z. B. die c-Raf/MAP-Kinase-Kaskade, modulieren, die PreS2-Aktivatordomäne des LHBsAg und das HBx-Protein [360]. Diese regulieren via c-Raf die Expression der unterschiedlichsten Gene. Nach eingehenden Analysen lässt sich dazu auch TIP47 zählen, dessen Expression durch HBx und LHBs gesteigert werden kann. Außerdem konnte in CLSM-Analysen eine partielle Colokalisation von LHBs und TIP47 beobachtet werden. Durch Modulation der TIP47-Expression in HBV-positiven Zellen konnte anschließend die Relevanz für die Virus-Sekretion untersucht werden. Durch gezielten knockdown von TIP47 durch spezifische siRNAs wurde die Freisetzung von viralen Partikeln gestört, wohingegen die Menge an freigesetzten subviralen Partikeln erhöht war. Die Überexpression von TIP47 hingegen konnte die Virus-Sekretion steigern, während das Niveau der subviralen Partikel nahezu gleich blieb. Des Weiteren konnte auch für HBV die Rab9-Bindung an TIP47 als essentielle Funktion Charakterisiert werden, da eine Inhibition dieser Interaktion eine Hemmung der Sekretion viraler Partikel zur Folge hatte. Auch hier konnte kein Einfluss auf die subviralen Partikel beobachtet werden. In Studien wurde a-Taxilin als neuer Bindungspartner von Proteinen der Syntaxin-Familie entdeckt. Es spielt daher eine wichtige Rolle im intrazellulären Vesikeltransport. Vor allem die Interaktion mit Syntaxin-4 ist gut untersucht [132]. Es wird vermutet, dass a-Taxilin durch die Bindung an freies Syntaxin-4 die v-SNARE-Bildung verhindert und so einen inhibitorischen Effekt auf den vesikulären Transport ausübt. Des Weiteren konnten Untersuchungen beim Hepatitis-B-Virus demonstrieren, dass die Expression von a-Taxilin durch die Virus-Replikation drastisch erhöht ist und die Sekretion der subviralen Partikel, welche mittels Vesikeln aus der Zelle transportiert werden, negativ beeinflusst. Andererseits interagiert a-Taxilin mit dem großen viralen Oberflächenprotein LHBs und dient so als Adapter zwischen LHBs und tsg101 beim ESCRT-vermittelten Export des Virus via MVBs - einem Zusammenschluss aus vielen späten Endosomen [126].Anders als für HBV, welches aktiv die Menge an intrazellulärem a-Taxilin erhöht, konnte in früheren RNA-Expressionsexperimenten mit transgenen Mäusen, welche Leberspezifisch das regulatorische HCV-Protein NS5A produzieren, eine deutlich verminderte Expression von a-Taxilin beobachtet werden [140]. Durch Analysen von Leberzelllysaten im Western Blot konnte dieser Effekt auch auf Proteinebene bestätigt werden. Dieanschließende Analyse HCV-replizierender Zellen in vitro ergab ebenfalls eine verminderte a-Taxilin-Expression und in der Folge eine reduzierte Proteinmenge. Weiterhin konnte diese Arbeit klären, dass HCV via NS5A den a-Taxilin-Promotor negativ beeinflusst und dafür den bereits für NS5A beschriebenen Mechanismus der c-Raf-Modulation nutzt [234]. Darüber hinaus wird a-Taxilin durch HCV destabilisiert, da in HCV-replizierenden Zellen die Proteinhalbwertszeit von a-Taxilin in etwa halbiert war. Der genaue Mechanismus hierfür muss jedoch noch genauer untersucht werden. Es kann aber aufgrund von anderen aktuellen Studien davon ausgegangen werden, dass a-Taxilin höchstwahrscheinlich durch HCV-Strukturproteine abgefangen wird, welche nicht am Aufbau neuer Virionen beteiligt sind. Diese werden dann, zusammen mit dem gebundenen a-Taxilin, im autophagosomalen Kompartiment recycelt. Gestützt wird diese Hypothese durch die Beobachtungen in CLSM-Analysen, dass die HCV- Strukturproteine E1, E2 und Core partiell mit a-Taxilin colokalisieren und auch durch Co-Immunpräzipitationen sowie yeast-2-hybrid-Analysen eine direkte Interaktion nachgewiesen werden konnte. Dabei konnten vor allem für das Core-Protein zwei unterschiedliche Fraktionen nachgewiesen werden, von denen nur die zytoplasmatisch lokalisierte Fraktion mit a-Taxilin colokalisierte, nicht aber mit dem an den lipid droplets gebundenen Core. Neben der Untersuchung der funktionellen Zusammenhänge wurde außerdem die Relevanz von a-Taxilin für den HCV-Lebenszyklus charakterisiert. Dabei wurde die Expression von a-Taxilin moduliert und der Einfluss auf die Freisetzung infektiöser HCV-Partikel untersucht. Durch die Überexpression von a-Taxilin konnte die Sekretion von Virionen verhindert werden, wohingegen die weitere Reduktion der a-Taxilin-Menge mittels spezifischer siRNA zu einer verstärkten Virus-Freisetzung führte. In einem parallel durchgeführten Projekt konnten durch die Modulation von Syntaxin-4 genau gegenteilige Beobachtungen gemacht werden. Demnach verstärkte eine Überexpression von Syntaxin-4 die HCV-Sekretion, während der knockdown zur Inhibition des Prozesses führte. Abschließend lässt sich festhalten, dass im Rahmen dieser Arbeit zwei zelluläre Proteine in Bezug auf die Morphogenese und Sekretion von HBV und HCV näher Charakterisiert wurden, denen zuvor für das jeweils andere Virus eine entscheidende Rolle im viralen Lebenszyklus zugeordnet werden konnte. TIP47 wurde somit als positiver Regulator für die HBV-Sekretion identifiziert, auch wenn die genaue funktionelle Relevanz bzw. der Funktionsmechanismus bisher noch nicht eindeutig geklärt werden konnte. So liegt jedoch der Schluss nahe, dass es nur die Freisetzung der viralen Partikel via MVBs beeinflusst und nicht an der Sekretion der subviralen Partikel beteiligt ist. Für HCV konnte mit a-Taxilin erstmals ein viraler Restriktionsfaktor beschrieben werden, da es entscheidend die Sekretion infektiöser Viruspartikel verhindert. Im Gegenzug hat HCV, durch die Deregulation des Promotors und durch das Abfangen von a-Taxilin, Mechanismen entwickelt, welche diesem restriktiven Effekt entgegen wirken.
Photosynthesis is one of the most vital processes that takes place on Earth. Due to its global significance related to food, energy and material production, photosynthesis research is one of the leading scientific fields in the contemporary world. Particular interest in photosynthesis research is focused on diatoms and as one of the major players of marine phytoplankton, diatoms have a huge impact on global photosynthesis.
Diatoms originated from a secondary endosymbiosis that took place between a putative photosynthetic red algal ancestor and a heterotrophic eukaryote. Secondary endosymbiosis resulted in the formation of chloroplasts with four membranes. Centric diatoms (e.g. Thalassiosira pseudonana or Cyclotella meneghiniana) usually possess many small chloroplasts, while pennates (e.g. Phaeodactylum tricornutum) have several larger ones, or even only one which can occupy half of the cell volume...
The canonical Wnt pathway, also known as Wnt/β-‐catenin pathway, comprises a network of proteins which control diverse developmental and adult processes in all metazoan organisms. The binding of canonical Wnt ligands to a cell surface receptor complex, consisting of frizzled family members and low density lipoprotein receptor-‐ related protein 5 or 6 co‐receptors, triggers a signaling cascade which results in a β-catenin-‐mediated transcriptional activation of different target genes, implicated in cellular proliferation, apoptosis, migration and differentiation. A couple of years ago, several groups including us, iden2fied transient activation of the canonical Wnt-pathway in endothelial cells (ECs) of the developing central nervous system (CNS). In this context, Wnt/β-‐catenin signaling could be demonstrated to be crucial for brain angio genesis as well as for the establishment of the blood-brain barrier (BBB) phenotype in the newly formed vessels.
Gliomas, in particular the glioblastoma (GBM), belong to the group of highly vascularized solid tumors which gain their vascularization due to an angiogenic switch occurring during tumor progression. Interestingly, nuclear localized β-‐catenin could be exclusively detected in the activated endothelium of induced rat gliomas and of human GBM, suggesting a so far unknown and not further characterized involvement of the canonical Wnt pathway in pathological angiogenesis. In order to systematically decipher the precise role of endothelial Wnt/β-‐catenin signaling in tumor angiogenesis, I established
murine GL261 glioma cell lines overexpressing either Wnt1 or Dickkopf (Dkk) 1 in a doxycycline-‐dependent manner, an activator and potent inhibitor of Wnt/β-‐catenin signaling, respectively. In subcutaneous and intracranial transplantations, tumor-derived Wnt1 reduced, while Dkk1 increased GL261 tumor growth without affecting in vitro proliferation, cell cycle or cell death of the established cell lines. Nowadays, it is well accepted that solid tumors are dependent on vascular support allowing them to grow beyond a certain size. In my work I could show that tumor-‐derived Wnt1 targets the tumor vasculature by increasing endothelial Wnt/β-‐catenin signaling, which reduced tumor vessel density and resulted in a more quiescent tumor vasculature. Furthermore, Wnt1-‐expression mediated tight association of smooth muscle cells (SMCs) and pericytes to the tumor endothelium, a phenotype which is unusual for tumor vessels and a described hallmark of tumor vessel normalization. In contrast, inhibition of endothelial Wnt/β-‐catenin signaling by Dkk1 mediated an opposing effect, characterized by endothelial hyper-proliferation and a tumor vasculature with a rough basal lamina distribution and loosely anached mural cells, indicative of a strong angiogenic activity. The described vascular effects in Wnt1-expressing GL261 tumors could be verified by subcutaneous transplantations of a rat glioma cell line constitutively expressing Wnt1. Furthermore, an applied in vivo MatrigelTM plug assay uncovered the reduction in vessel density upon Wnt1 simulation to be tumor cell independent, suggesting an EC-‐autonomous effect. This hypothesis was confirmed by subcutaneous transplantations of parental GL261 cells into mice with genetically generated endothelial β-‐catenin gain-of-function (GOF). The derived GOF tumor from this experiment comprised a quiescent and normalized tumor vasculature and phenocopied the vascular effects observed in Wnt1-expressing tumors.
Our previous work provided evidence that Wnt/β-‐catenin signaling contributes to the BBB phenotype of the developing CNS through the transcriptional regulation of the tight junction protein claudin-‐3. Furthermore, the coverage of pericytes to brain vessels has been described to correlate with BBB integrity. In agreement with these publications, vessels of intracranial Wnt1-‐expressing GL261 tumors retained or regained barrier properties, indicated by a reduced leakage of the tracer Evans blue and endogenous mouse immunoglobulin G and increased junctional localiza2on of the tight junction proteins claudin-‐3, -‐5 and zonula occludens-‐1.
Overall, we detected sustained endothelial Wnt/β-‐catenin signaling to induce a quiescent and normalized tumor vascularization. Interestingly, the Notch signaling pathway has been shown to inhibit the angiogenic tip cell and to promote the quiescent stalk cell phenotype via its ligand Delta-like ligand 4 (Dll4) and the receptors Notch1 and 4. Mechanistically, my work demonstrated for the first time that overactivation of endothelial Wnt/β-‐catenin signaling reactivated expression of Dll4 in the tumor endothelium, which could be shown in vitro to increase Notch signaling and to favor a stalk cell-like gene signature. Furthermore, we uncovered the platelet-derived growth factor subunit B (pdgm) as a novel transcriptional target of Wnt/β-catenin signaling in ECs. Hence endothelial-‐derived PDGF-‐B is known to promote the recruitment of mural cells, the upregulation of this factor might explain the increased SMC/pericyte coverage observed in the tumor vasculature upon sustained endothelial Wnt/β-‐catenin signaling which additionally might promote a cycle of vascular normalization.
Taken together, my work reveals several vascular effects, being mediated by reinforced endothelial Wnt/β-‐catenin signaling during tumor angiogenesis. While a moderate level of canonical Wnt signaling, observed in vessels of human astrocytomas and murine control tumors, is considered to be associated with tumor angiogenesis, dominant activation of this pathway in ECs is shown to limit angiogenesis and to promote a quiescent and normalized tumor vasculature with increased barrier properties. Furthermore, my work discovers pdgm as a novel target of canonical Wnt signaling in ECs.
The work presented in this dissertation therefore not only uncovers the role of endothelial Wnt/β-‐catenin signaling in tumor angiogenesis but additionally reveals this pathway to be a novel modulator in pathological vessel development which might proof to be a valuable therapeutic target for anti-angiogenic and edema glioma therapy.
The biogenesis and function of photosynthetically active chloroplasts relies on the import of thousands of nuclear encoded proteins via the coordinated actions of two multiprotein translocon machineries in the outer and inner envelope membrane. Trafficking of preproteins across the soluble compartment of InterMembrane Space (IMS) is currently envisioned to be facilitated by an IMS complex composed of outer envelope proteins Toc64 and Toc12, a soluble IMS component, Tic22 and an IMS-localized Hsp70. Among them, currently Tic22 is the only component that stands undisputed in terms of its existence. Having two closely related homologs in A. thaliana, their biochemical and functional characterization was still lacking. A critical analysis of Tic22 knockout mutants displayed growth phenotype reminiscent of ppi1, the mutant of Toc33. However, both the genes have similar expression patterns with no clear preference for photosynthetic or nonphotosynthetic tissues, which explained the absence of a detectable phenotype in single mutants. In addition, transgenic complementation study with either of the homolog affirmed the identical localization of both proteins in the IMS which characterizes the two homologs as functionally redundant. Based on the pale-yellow phenotype exhibited by the double mutant plants, an attempt to analyze the import capacity of a stromal substrate in the double mutant revealed threefold reduction when compared to wild-type acknowledging the essential role of Tic22 in the import mechanism. Initially, Tic22 was identified together with another protein, Tic20, which has been heavily discussed as a protein conducting channel in the inner membrane. Despite being characterized, in A. thaliana, two out of four homologs of Tic20 are differentially localized with one being additionally localized in mitochondria and the other, exclusively residing in the thylakoids.
According to in silico analysis, for all the Tic20 proteins, a four-helix transmembrane topology was predicted. Accordingly, its topology was mapped by employing the recently established selfassembling GFP-based in vivo experiments. Astonishingly, the expression of one of the inner envelope localized Tic20 homolog enforces inner membrane proliferation affecting the shape and organization of the membrane. Therefore this study focuses on analyzing the effects of high envelope protein concentrations on membrane structures, which together with the existing results, an imbalance in the lipid to protein ratio and a possible role of signaling pathway regulating membrane biogenesis is discussed.
ß1-integrins are essential for angiogenesis but the mechanisms regulating integrin function in endothelial cells (EC) and their contribution to angiogenesis remain elusive. BRAG2 is a guanine nucleotide exchange factor for the small Arf-GTPases Arf5 and Arf6. The role of BRAG2 in EC and angiogenesis and the underlying molecular mechanisms remains unclear. siRNA-mediated BRAG2-silencing reduced EC angiogenic sprouting and migration. BRAG2-siRNA-transfection differentially affected a5ß1- and aVß3-integrin function: specifically, BRAG2-silencing increased focal/fibrillar adhesions and EC adhesion on ß1-integrin-ligands (fibronectin and collagen), while reducing the adhesion on the aVß3-integrin-ligand, vitronectin. Consistent with these results, BRAG2-silencing enhanced surface expression of a5ß1-integrin, while reducing surface expression of aVß3-integrin. Mechanistically, BRAG2 mediated recycling of aVß3-integrins and endocytosis of ß1-integrins and specifically of the active/matrix bound a5ß1-integrin present in fibrillar/focal adhesions (FA), suggesting that BRAG2 contributes to the disassembly of FA via ß1-integrin-endocytosis. Arf5 and Arf6 are promoting downstream of BRAG2 angiogenic sprouting, ß1-integrin-endocytosis and the regulation of FA. In vivo silencing of the BRAG2-orthologues in zebrafish embryos using morpholinos perturbed vascular development. Furthermore, in vivo intravitral injection of plasmids containing BRAG2-shRNA reduced pathological ischemia-induced retinal and choroidal neovascularization. These data reveals that BRAG2 is essential for developmental and pathological angiogenesis by promoting EC sprouting through regulation of adhesion by mediating ß1-integrin internalization and associates for the first time the process of ß1-integrin endocytosis with angiogenesis.