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Proton-powered c-ring rotation in mitochondrial ATP synthase is crucial to convert the transmembrane protonmotive force into torque to drive the synthesis of ATP. Capitalizing on recent cryo-EM structures, we aim at a structural and energetic understanding of how functional directional rotation is achieved. We performed multi-microsecond atomistic simulations to determine the free energy profiles along the c-ring rotation angle before and after the arrival of a new proton. Our results reveal that rotation proceeds by dynamic sliding of the ring over the a-subunit surface, during which interactions with conserved polar residues stabilize distinct intermediates. Ordered water chains line up for a Grotthuss-type proton transfer in one of these intermediates. After proton transfer, a high barrier prevents backward rotation and an overall drop in free energy favors forward rotation, ensuring the directionality of c-ring rotation required for the thermodynamically disfavored ATP synthesis. The essential arginine of the a-subunit stabilizes the rotated configuration through a salt-bridge with the c-ring. Overall, we describe a complete mechanism for the rotation step of the ATP synthase rotor, thereby illuminating a process critical to all life at atomic resolution.
Cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful method to elucidate subcellular architecture and to structurally analyse biomolecules in situ by subtomogram averaging (STA). Specimen thickness is a key factor affecting cryo-ET data quality. Cells that are too thick for transmission imaging can be thinned by cryo-focused-ion-beam (cryo-FIB) milling. However, optimal specimen thickness for cryo-ET on lamellae has not been systematically investigated. Furthermore, the ions used to ablate material can cause damage in the lamellae, thereby reducing STA resolution. Here, we systematically benchmark the resolution depending on lamella thickness and the depth of the particles within the sample. Up to ca. 180 nm, lamella thickness does not negatively impact resolution. This shows that there is no need to generate very thin lamellae and thickness can be chosen such that it captures major cellular features. Furthermore, we show that gallium-ion-induced damage extends to depths of up to 30 nm from either lamella surface.
Hemoproteinoids related to contemporary porphyrin-dependent peroxidases were synthesized under simple conditions. The peroxidative activity of hematin increased by a factor of 50 if the hematin was bound to proteinoids whereas the catalatic activity of hematin decreased rather under the same conditions. The peroxidative activity of hemoproteinoids particularly increased with their lysine content whereas the catalatic activity especially decreased in proteinoids with high phenylalanine content. The isoelectric points of the lysine-rich peroxidic hemoproteinoids were about 8. Their relatively broad pH-activity optimum was about pH 7.0. The molecular weights were a little below 20 000. Hematin content and amino acid composition of the synthetic materials were varied greatly. The substrate specificity appeared as broad as that of biogenous peroxidases, e. g., horseradish peroxidase. Among the many substrates was NADH. The possible importance of the peroxidative oxidation of NADH-type coenzymes by primitive heterotrophic organisms or prebiological systems in an anaerobic environment is discussed.
Physikalische und thermische Kontrastierung führt bei Fixierung in Glutaraldehyd und Einbettung in Vestopal bei Parenchymzellen der Leber zu weitgehend ähnlichen Kontrastunterschieden auch bei Mitochondrien und den Membranen des Retikulums. Beide Verfahren wirken also weitgehend unspezifisch. Von den chemischen Verfahren liefert Uranylacetat im Cytoplasma ähnliche Kontrastverhältnisse wie die beiden genannten Verfahren. Das spezifische Verhalten des Uranylacetats kann z. B. an der Kontrastierung des Chromatins demonstriert werden. Sie bleibt aus, wenn die färbbare Substanz auf der Wasseroberfläche des Messertroges herausgewaschen wurde. Bleicitrat-Kontrastierung hat hier im Gegensatz zu Uranylacetat eine spezifische Wirkung nur auf RNS-haltige Zellbestandteile.
Nucleic acid and histone modifications critically depend on the tricarboxylic acid (TCA) cycle for substrates and cofactors. Although a few TCA cycle enzymes have been reported in the nucleus, the corresponding pathways are considered to operate in mitochondria. Here, we show that a part of the TCA cycle is operational also in the nucleus. Using 13C-tracer analysis, we identified activity of glutamine-to-fumarate, citrate-to-succinate, and glutamine-to-aspartate routes in the nuclei of HeLa cells. Proximity labeling mass spectrometry revealed a spatial vicinity of the involved enzymes with core nuclear proteins. We further show nuclear localization of aconitase 2 and 2-oxoglutarate dehydrogenase in mouse embryonic stem cells. Nuclear localization of the latter enzyme, which produces succinyl-CoA, changed from pluripotency to a differentiated state with accompanying changes in the nuclear protein succinylation. Together, our results demonstrate operation of an extended metabolic pathway in the nucleus, warranting a revision of the canonical view on metabolic compartmentalization.
Nucleic acid and histone modifications critically depend on central metabolism for substrates and co-factors. Although a few enzymes related to the formation of these required metabolites have been reported in the nucleus, the corresponding metabolic pathways are considered to function elsewhere in the cell. Here we show that a substantial part of the mitochondrial tricarboxylic acid (TCA) cycle, the biosynthetic hub of epigenetic modification factors, is operational also in the nucleus. Using 13C-tracer analysis, we identified activity of glutamine-to-fumarate, citrate-to-succinate, and glutamine-to-aspartate routes in the nuclei of HeLa cells. Proximity labeling mass-spectrometry revealed a spatial vicinity of the involved enzymes with core nuclear proteins, supporting their nuclear location. We further show nuclear localization of aconitase 2 and 2-oxoglutarate dehydrogenase in mouse embryonic stem cells. Together, our results demonstrate operation of an extended metabolic pathway in the nucleus warranting a revision of the canonical view on metabolic compartmentalization and gene expression regulation.
Ribosomes translate the genetic code into proteins. Recent technical advances have facilitated in situ structural analyses of ribosome functional states inside eukaryotic cells and the minimal bacterium Mycoplasma. However, such analyses of Gram-negative bacteria are lacking, despite their ribosomes being major antimicrobial drug targets. Here we compare two E. coli strains, a lab E. coli K-12 and human gut isolate E. coli ED1a, for which tetracycline exhibits bacteriostatic and bactericidal action, respectively. The in situ ribosome structures upon tetracycline treatment show a virtually identical drug binding-site in both strains, yet the distribution of ribosomal complexes clearly differs. While K-12 retains ribosomes in a translation competent state, tRNAs are lost in the vast majority of ED1a ribosomes. A differential response is also reflected in proteome-wide abundance and thermal stability assessment. Our study underlines the need to include molecular analyses and to consider gut bacteria when addressing antibiotic mode of action.
Cyclophilins, or immunophilins, are proteins found in many organisms including bacteria, plants and humans. Most of them display peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity, and play roles as chaperones or in signal transduction. Here, we show that cyclophilin anaCyp40 from the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 is enzymatically active, and seems to be involved in general stress responses and in assembly of photosynthetic complexes. The protein is associated with the thylakoid membrane and interacts with phycobilisome and photosystem components. Knockdown of anacyp40 leads to growth defects under high-salt and high-light conditions, and reduced energy transfer from phycobilisomes to photosystems. Elucidation of the anaCyp40 crystal structure at 1.2-Å resolution reveals an N-terminal helical domain with similarity to PsbQ components of plant photosystem II, and a C-terminal cyclophilin domain with a substrate-binding site. The anaCyp40 structure is distinct from that of other multi-domain cyclophilins (such as Arabidopsis thaliana Cyp38), and presents features that are absent in single-domain cyclophilins.
Das aufgefundene Ribonucleoprotein besitzt die Eigenschaft eines Vollantigens. Die durchgeführten Immunisierungsversuche ergaben eine Artspezifität des Antigens. Eine Organspezifität war nicht nachweisbar. Erste Lokalisierungsversuche mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Methode ergaben in der Niere eine besondere Anreicherung des Nucleoproteins in den Glomerulokapseln.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß im menschlichen Serum ein Serumprotein vorhanden ist, welches das aus menschlichem Gewebe gewonnene Nucleoprotein spezifisch bindet. Zur Zeit sind Untersuchungen im Gang. den Serumgehalt des Nucleoproteins und des spezifisch bindenden Serumproteins bei verschiedenen Erkrankungen des Bindegewebsapparates quantitativ zu erfassen.
In weiteren Versuchen wurden Streptokokken der Gruppe A und C dem in der I. Mitteilung beschriebenen Trennungsgang unterworfen. Es gelang dabei, aus diesen Streptokokken ein Nucleoprotein zu isolieren, das in bezug auf seine elektrophoretischen Eigenschaften, Farbreaktionen, UV-Absorptionskurve, Zuckeranalyse mit dem aus menschlichen und tierischen Organen gewonnenen Nucleoprotein identisch ist.
Das in der I. Mitteilung beschriebene Nucleoprotein führt bei Zugabe zu Tropokollagen-Lösungen zur Bildung von kollagenen Fibrillen. Die Fibrillen-bildende Potenz des Nucleoproteins ist sehr groß. Die gebildeten Fibrillen zeigen eine sehr gute Feinstruktur und weisen eine 640 Å Hauptperiodik auf. Es ist zu vermuten, daß dem ubiquitär im Organismus vorkommenden Nucleoprotein eine bedeutende oder gar ausschlaggebende Rolle bei der Bildung von kollagenen Fibrillen aus Tropokollagen im Organismus zukommt.
Es wird auf die Mannigfaltigkeit der Kontraste hingewiesen, die sich bei mit Aldehyden fixiertem, in Vestopal W oder Durcupan ACM eingebettetem Gewebe durch gesteuerte Elektronenbestrahlung erreichen läßt. Voraussetzung für einen einwandfreien Vergleich von Kontrasten bei z. B. verschieden gefärbten Schnitten ist daher eine Bestrahlung, die zu ausreichend definierten Objektveränderungen führt. Brauchbar in diesem Sinne ist eine Bestrahlung, die zum maximalen „reinen Strahlenverlust“ führt, bei der aber thermische Substanzverluste vermieden werden. Der Negativkontrast von Chromatin und Nucleolen und die offenbar physikalisch bedingte Färbbarkeit der nucleinsäurehaltigen Zellbestandteile mittels der „negative-staining“-Methode werden diskutiert.
The TOM complex is the main entry point for precursor proteins into mitochondria. Precursor proteins containing targeting sequences are recognized by the TOM complex and imported into the mitochondria. We have determined the structure of the TOM core complex from Neurospora crassa by single-particle cryoEM at 3.3 Å resolution, showing its interaction with a bound presequence at 4 Å resolution, and of the TOM holo complex including the Tom20 receptor at 6-7 Å resolution. TOM is a transmembrane complex consisting of two β-barrels, three receptor subunits and three short transmembrane subunits. Tom20 has a transmembrane helix and a receptor domain on the cytoplasmic side. We propose that Tom20 acts as a dynamic gatekeeper, guiding precursor proteins into the pores of the TOM complex. We analyze the interactions of Tom20 with other TOM subunits, present insights into the structure of the TOM holo complex, and suggest a translocation mechanism.
Um die von RAJEWSKY und WOLF aufgeworfene Frage nach dem Einfluß der DNS-Struktur auf die radiationschemische Veränderung der Basen zu untersuchen, wurde die DNS-Spirale bei einem Teil der Untersuchungen in dest. Wasser aufgelöst und mit Röntgenstrahlen bestrahlt. Es ergab sich eine Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit der Basen, vor allem zu Beginn der Bestrahlung auf den Wert, den man bei der Bestrahlung der Monomerlösungen beobachtet. Bei Bestrahlung in 0,1 und 1-n. NaCl gelöster DNS sind dagegen die Basen gegen die Einwirkung der im Wasser gebildeten Radikale geschützt, solange sie innerhalb der intakten Spirale gebunden sind. Dieser strukturbedingte Schutzeffekt besteht nicht gegenüber der direkten Strahlenwirkung von UV-Licht. Dieses Ergebnis ist von strahlenbiologischem Interesse, da das Optimum der Strahlenwirkung auf den Mitoseablauf nach Arbeiten von CARLSON und GRAY in der frühen Prophase liegt17, also ebenfalls in einem Stadium, in dem die DNS-Spirale (vor der Verdoppelung) völlig aufgelöst ist. (Vgl. auch BACQ-ALEXANDER und FRITZ-NIGGLI.
Die von verschiedenen Autoren 2–8 experimentell bestimmten Kontrastdicken für Kohle stimmen nicht mit den heute of benutzten numerischen Werten aus der Lenz schen Theorie überein. Die Diskrepanz läßt sich beheben, wenn man zur Auswertung der Theorie einen anderen, schon von LENZ zur Diskussion gestellten Θ-Wert benutzt. Durch Experimente wird gezeigt, daß auch der Bereich, in dem das Exponentialgesetz nicht mehr gilt, gut durch eine aus der Lenz schen Theorie hergeleitete Formel dargestellt werden kann. Der Bereich, in dem das Exponentialgesetz verwandt werden darf, wird näher diskutiert.
Cells maintain membrane fluidity by regulating lipid saturation, but the molecular mechanisms of this homeoviscous adaptation remain poorly understood. We have reconstituted the core machinery for regulating lipid saturation in baker’s yeast to study its molecular mechanism. By combining molecular dynamics simulations with experiments, we uncover a remarkable sensitivity of the transcriptional regulator Mga2 to the abundance, position, and configuration of double bonds in lipid acyl chains, and provide insights into the molecular rules of membrane adaptation. Our data challenge the prevailing hypothesis that membrane fluidity serves as the measured variable for regulating lipid saturation. Rather, we show that Mga2 senses the molecular lipid-packing density in a defined region of the membrane. Our findings suggest that membrane property sensors have evolved remarkable sensitivities to highly specific aspects of membrane structure and dynamics, thus paving the way toward the development of genetically encoded reporters for such properties in the future.
Eine einfache Methode wird erklärt, die es gestattet, genaue Aussagen über das Verteilungsgesetz elektrischer Relaxationszeiten in frequenzabhängigen Dielektrika zu machen. Die Methode setzt die Gültigkeit einer verallgemeinerten Form des von Cole und Cole formulierten Verteilungsgesetzes elektrischer Relaxationszeiten voraus. Sie basiert auf der Tatsache, daß dielektrische Verluste. die bei wesentlich kleineren Frequenzen als der mittleren charakteristischen Frequenz bestimmt werden, außerordentlich empfindlich sind gegen geringe Änderungen im Verteilungsgesetz. Die Methode wird am Beispiel dielektrischer Messungen an Wasser demonstriert. Die Auswertung eigener Messungen ergibt, daß sich im Rahmen der erzielbaren hohen Genauigkeit das dielektrische Verhalten von Wasser durch eine einzige Relaxationszeit charakterisieren läßt.
In der vorliegenden Arbeit wird die Frequenzabhängigkeit des dielektrischen Verhaltens einer Suspension von Kugeln mit Schale untersucht. Es werden die allgemeine Lösung sowie spezielle Näherungsformeln angegeben. Das Frequenzverhalten wird exakt durch 2 Relaxationsausdrücke vom Debye - Typ, die sich superponieren, charakterisiert.
Die vorgetragenen Formeln erlauben die Analyse der Impedanzkurven von Zellsuspensionen aus Erythrozyten, Bakterien, Seeigeleiern u. a. m., aber auch von Proteinlösungen und anderen Suspensionen.
Bei B. cadaveris, die in einem an organischen Substanzen reichen Medium kultiviert wurden, nimmt der O2-Verbrauch pro Zeiteinheit bei Glucoseveratmung mit der Röntgenstrahlendosis ab, während bei Bakterien, die in einem Salzmedium gewachsen sind, die Atmung bis zu einer Dosis von 2 - 3 Mr erst ansteigt, um erst bei höheren Dosen abzufallen. Die Atmung wird erst bei Dosen in der Größenordnung von 1 Million r merklich beeinflußt.
Die Atmung der Bakterien ist damit unter den hier untersuchten Bedingungen noch strahlenresistenter als die Gewebeatmung von Säugetierzellen.
Es wurde das Leitfähigkeitsverhalten von reinem, lufthaltigem Wasser bei kontinuierlicher und impulsgetasteter Röntgenbestrahlung (60 kV8) untersucht. Hierbei ergaben sich zwei einander überlagerte Effekte: 1. Ein der Röntgen-Dosisleistung proportionaler irreversibler Leitfähigkeitsanstieg, der vermutlich auf eine Strahlenreaktion des gelösten CO2 zurückzuführen ist, 2. eine reversible Leitfähigkeitserhöhung während der Bestrahlung, die sich mit der Entstehung einer Ionenart mit einer mittleren Lebensdauer von ca. 0,15 sec erklären läßt. Es wird angenommen, daß es sich dabei um Radikalionen O2⊖ handelt, welche durch die Reaktion der als Strahlungsprodukt entstehenden Η-Radikale mit dem gelösten Sauerstoff gebildet werden. Ein möglicher chemischer Reaktionsmechanismus wird angegeben, der zu befriedigender quantitativer Übereinstimmung der Versuchsergebnisse mit Ausbeutewerten und Reaktionskonstanten aus der Literatur führt.
Trockene Mildisäure-Dehydrogenase wurde mit Protonen verschiedener Energie bis maximal 80 keV in dünnen Schichten bestrahlt. Die Inaktivierungsquerschnitte betrugen bei Zimmertemperatur ca. 0,4·10-12 cm2 und waren in dem gemessenen Energiebereich konstant. Der Einfluß der Teilchenenergie auf den Inaktivierungsverlauf wurde insbesondere bei sehr kleinen Energien abgeschätzt. Bestrahlungen bei verschiedenen Temperaturen zeigten eine Abnahme des Strahleneffektes nach niedrigeren Temperaturen.
Es wird der Einfluß von Röntgenstrahlen und ultravioletten Strahlen verschiedener Wellenlängen auf kernhaltige Zellteile von Acetabularia mediterranea untersucht. Die Röntgenbestrahlung führt zu einer Verminderung des Regenerationsvermögens der Zellteile, zu einer Verringerung der Cystenbildung der Regenerate und zu einer Herabsetzung der Lebensfähigkeit der Cysten. Erst nach einer Dosis von 400 kr ist das Regenerationsvermögen fast völlig zerstört. Die Fähigkeit zur Bildung fortpflanzungsfähiger Gameten geht bereits nach 40 kr verloren. Die Wirkung von UV-Bestrahlungen ist demgegenüber sehr gering. Es wird geschlossen, daß die beobachteten Leistungen der kernhaltigen Zellteile wesentlich durch den Zellkern bestimmt sind, der im Rhizoid gegen die UV-Strahlung weitgehend abgeschirmt ist. Erfolgt eine vollständige Regeneration bis zur Hutbildung, so scheinen Größe und Gestalt der ausgewachsenen Regenerate nicht wesentlich von der Röntgenbestrahlung beeinflußt zu sein. In den meisten Fällen bilden Hutregenerate auch Cysten.
Wir berichten im folgenden über histologische Befunde und physikalische Messungen, die zeigen, daß unter besonderen Beschallungsbedingungen in verschiedenen Säugetiergeweben Vorgänge ablaufen, die im Sinne einer Pseudokavitation gedeutet werden müssen. Die Einzelheiten der Untersuchungen sind teils in der Habilitationsschrift von O. Hug, Frankfurt a. M. 1953, teils in der Dissertation von R.Pape, Frankfurt a. M. 1953, niedergelegt.
Die Inaktivierung durch Röntgenstrahlen der an Lebermitochondrien gebundenen Bernsteinsäure-Oxydase wurde untersucht. Ihre Halbwertsdosis beträgt 3,5 · 106 r. Bernsteinsäure-Oxydase, die an Hepatommitochondrien gebunden ist, ist empfindlicher als die normaler Mitochondrien. Die Bernsteinsäure-Oxydase an kleinsten Partikeln zeigt dagegen in beiden Fällen eine größere Strahlenresistenz.
Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Messungen von Dielektrizitätskonstanten und Leitfähigkeiten biologischer Substanzen im Bereich von 9 bis 180 cm Wellenlänge werden nach einem Resonanzverfahren durchgeführt. Dies ermöglicht trotz der starken Absorption der untersuchten Materialien eine genügende Meßgenauigkeit und einen relativ einfachen Aufbau der Meßanordnung. Die beschriebene Methode zur Auswertung der Messung ist so vereinfacht, daß sie auch von angelerntem Hilfspersonal leicht durchgeführt werden kann. Für den Wellenlängenbereich von 40 bis 180 cm wird eine Lecher-Leitung in Paralleldraht-Aus-führung benutzt, während sie für den Bereich von 9 bis 40 cm Wellenlänge konzentrisch aufgebaut ist. Die Meßfehler werden eingehend diskutiert und in Kurven anschaulich dargestellt. Anschließend werden die Ergebnisse der Messungen von DK und Leitfähigkeit an Blut, Leber, Muskel und Fettgewebe mitgeteilt. Bei allen Substanzen konnte unterhalb etwa 30 cm Wellenlänge eine Abnahme der DK und vor allem eine eindeutige Zunahme der Leitfähigkeit festgestellt werden. Diese Dispersion wird den polaren Molekülen in den Substanzen zugeschrieben und dürfte zumindest bei Blut und Leber im wesentlichen durch die Dispersion des Wassers verursacht werden.
Der Einfluß von Elektrodenpolarisation auf die Bestimmung der elektrischen Konstanten leitfähiger Substanzen wird untersucht; es wird gezeigt, daß der durch Polarisation bedingte Effekt auf die Kapazität um mehrere Zehnerpotenzen größer ist als der auf die Wirkwiderstandskomponente. Die Bestimmung der Dielektrizitätskonstante stark leitfähiger Materialien bei Niederfrequenz wird dadurch sehr erschwert. Die verschiedenen Möglichkeiten, Polarisationseinflüsse herabzusetzen, werden diskutiert und es wird gezeigt, daß einzig eine Messung mit verschiedenem Elektrodenabstand einwandfreie Ergebnisse gewährleistet, wenn Polarisation merklich auftritt. Eine bei biologischen Arbeiten öfter angewandte Methodik geht von der Voraussetzung aus, daß beim Austausch biologischen Materials gegen eine Salzlösung gleicher Beschaffenheit, wie sie intrazellular im biologischen Material vorliegt und in Kontakt mit den Elektroden steht, die Polarisationsimpedanz keiner Änderung unterliegt. Die Analyse eigener experimenteller Untersuchungen, über die berichtet wird, zeigt, daß diese Annahme nur berechtigt ist, wenn das biologische Material in so hinreichend großem Abstand von den Elektroden angeordnet wird, daß keine Schattenwirkung auftreten kann. In allen anderen Fällen ist sie falsch, und Arbeiten, die dem nicht Rechnung tragen, sind kritisch zu bewerten.
Single-particle electron cryo-microscopy (cryoEM) has undergone a “resolution revolution” that makes it possible to characterize megadalton (MDa) complexes at atomic resolution without crystals. To fully exploit the new opportunities in molecular microscopy, new procedures for the cloning, expression and purification of macromolecular complexes need to be explored. Macromolecular assemblies are often unstable, and invasive construct design or inadequate purification conditions or sample preparation methods can result in disassembly or denaturation. The structure of the 2.6 MDa yeast fatty acid synthase (FAS) has been studied by electron microscopy since the 1960s. We report a new, streamlined protocol for the rapid production of purified yeast FAS for structure determination by high-resolution cryoEM. Together with a companion protocol for preparing cryoEM specimens on a hydrophilized graphene layer, our new protocol has yielded a 3.1 Å map of yeast FAS from 15,000 automatically picked particles within a day. The high map quality enabled us to build a complete atomic model of an intact fungal FAS.
Es wurde der Einfluß von Röntgenbestrahlungen auf die Lebensfähigkeit und das Formbildungs-Vermögen kernloser Zellteile von Acetabularia mediterranea in Abhängigkeit von der Strahlendosis untersucht. Dabei erwies sich die Hutbildung stets als der am strahlenempfindlichste Prozeß. Die gefundenen Ergebnisse werden diskutiert und mit den entsprechenden Befunden nach UV-Bestrahlung verglichen.
Es wurde die Einwirkung monochromatischer ultravioletter Strahlen der Wellenlänge 254 mμ, 281 mμ und 297 mμ auf kernlose Zellteile von Acetabularia untersucht. Dazu wurden in Abhängigkeit von der Strahlendosis die mittlere Lebensdauer und das Formbildungs-Vermögen der kernlosen Teile bestimmt. Der 254-mμ-Strahlung kam dabei stets die größte biologische Wirksamkeit zu, während die 297-mμ-Strahlung im untersuchten Dosisbereich fast ohne Wirkung blieb. Die gefundene Wellenlängen-Abhängigkeit weist darauf hin, daß der UV-Absorption durch die Purine und Pyrimidine für den Wirkungsmechanismus der beobachteten UV-Schädigungen kernloser Zellteile besondere Bedeutung zukommen muß.
Es wird versucht, die Treffertheorie auf die indirekte Strahlenwirkung auszudehnen. Dazu wird angenommen, daß durch die Strahlung „Energieträger“ erzeugt werden, die durch Diffusion zu den „empfindlichen Bereichen“ gelangen und diese verändern können.
Der Berechnung des Wirkvolumens für derartige „indirekte Treffer“ folgt eine reaktionskinetische Betrachtung der indirekten Wirkung.
Durch die Einschaltung physikalisch-chemischer Prozesse zwischen Strahlenabsorption und „Treffer“ erscheint eine Berücksichtigung der physikalischen und chemischen Gegebenheiten im bestrahlten Objekt viel eher möglich als in der „klassischen“ Theorie der „direkten Trefferwirkung“.
Die Feldstärke- und Wärmequellenverteilung im ebenen Körper aus Muskel, Fett und Haut bei Anstrahlung wird für den Wellenbereich von 1 m bis 1,27 cm jeweils bei verschiedenen Fettschichtdicken berechnet und graphisch dargestellt. Die mit der Strahlungsfeldmethode erreichbare Tiefendosis-Leistung im Zusammenhang mit der Hautdosisleistung sowie die Frage einer geeigneten Anpassung zur Erreichung einer gleichmäßigen Tiefendosis-Leistung werden diskutiert.
Unter der Voraussetzung, daß ein Strahler benutzt wird, der ein annähernd ebenes Wellenfeld liefert und in dem bestrahlten Körpergebiet ebene, parallele Schichten Haut, Fett, Muskel senkrecht getroffen werden, ergibt sich aus der Betrachtung der berechneten Feldstärke- und Wärmequellenverteilungen für die verschiedenen Wellenlängen etwa folgendes Bild:
Das Problem einer Fettüberlastung tritt bei dm-Bestrahlung bis herab zu 10 cm Wellenlänge nicht auf. Man erhält im Gegensatz zu UKW-Kondensatorfeld-Durchflutung eine starke Wärmeentwicklung in der Haut sowie in den oberen Schichten von Muskel oder inneren Organen. Der Abfall der Dosisleistung im Muskel nach der Tiefe zu wird ab λ = 30 cm mit kürzer werdender Wellenlänge zunehmend steiler. Es kann bei dm-Bestrahlung gegenüber UKW-C-Feld eine um das Mehrfache höhere Dosisleistung an der inneren Oberfläche des Körpers auch bei großen Dicken der Fettschicht erreicht werden, wenn gegebenenfalls durch zusätzliche äußere Maßnahmen (Kühlung) eine Überlastung der Haut bei bestimmten Dicken der Fettschicht (λF/4) vermieden wird.
Bei dm-Bestrahlung paralleler Schichten mit angepaßtem Sender lassen sich weitere qualitative Aussagen machen: Bei konstanter Intensität des Strahlers erfolgt bei längeren Wellen (1 m) mit wachsender Dicke der Fettschicht nur ein monotoner Abfall der Tiefendosis-Leistung auf etwa 60%. Im unteren dm-Bereich (30 cm, 10 cm) ergibt sich bei konstanter Intensität bei Vergrößerung der Fettschichtdicke von 0 bis λF/4 ein Abfall der Tiefendosis-Leistung auf etwa ⅓ und bei weiterer Zunahme der Fettschichtdicke von λF/4 bis λF/2 wieder eine Zunahme der Tiefendosis-Leistung im Verhältnis 1:2. Diese Zahlen gelten größenordnungsmäßig bei Anstrahlung aus einem Anpassungsmedium ε-Fett. Bei Anstrahlung aus Luft ist die absolute Tiefendosis-Leistung geringer und sind die Schwankungen größer. Diese Schwankungen der Tiefendosis-Leistung bei konstanter Intensität des Senders einer Wellenlänge können durch äußere Maßnahmen weitgehend verringert werden.
Wenn der Sender bei verschiedenen Fettschichtdicken jeweils auf gleiche Hautdosisleistung eingestellt wird (Dosierung nach der Hautempfindung), nimmt die Tiefendosis-Leistung bei Vergrößerung der Fettschichtdicke von 0 bis λF/4 stark ab auf etwa ⅙, die Tiefendosis-Leistungen bei weiterer Vergrößerung der Fettschichtdicke von λF/4 bis λF/2 verhalten sich dann etwa wie 1 : 3. Diese Schwankungen sind unabhängig von der Wahl des Anpassungsmediums. Eine Tiefendosierung nach der Hautempfindung ohne genauere Berücksichtigung der Fettschichtdicke wird daher bei Vorliegen von zu den Wellenflächen parallelen Schichten unzuverlässig sein. Es ergibt sich jedoch die Möglichkeit einer instrumentellen, brauchbaren Dosierung durch Einstellung der Intensität des Senders ohne Rücksichtnahme auf die Hautempfindung, wenn man die Schwankungen der Tiefendosis-Leistung mit der Fettschichtdicke bei konstanter Intensität durch die erwähnten Anpassungsmaßnahmen reduziert.
Die kurzen Wellenlängen von 3 cm und 1 cm sind für eine Wärmetherapie in der Tiefe wegen der hohen Absorptionsverluste in Haut und Fett kaum brauchbar, können jedoch zu einer Wärmetherapie der Haut und damit indirekten Beeinflussung innerer Erkrankungen oder zur Erwärmung oberflächiger bzw. weniger leitender Schichten herangezogen werden. Die Oberflächendosis-Leistung steigt bei derselben Intensität mit abnehmender Wellenlänge stark an.
Bezüglich der Angaben über die Dosisleistungs-Verteilung ist zu berücksichtigen, daß das Interferenz-Feld vor der Strahleröffnung bei der Rechnung vernachlässigt wurde. Ferner entspricht die Dosisleistungs-Verteilung nur dann der Temperaturverteilung während der Bestrahlung, wenn die Unterschiede in den Anfangstemperaturen und in den spezifischen Wärmen der biologischen Schichten außer Acht gelassen werden sowie intensiv und kurzzeitig bestrahlt wird, so daß noch kein merklicher Wärmetransport während der Bestrahlung stattfindet. Über die Temperaturverteilung bei Berücksichtigung des Wärmetransports, der bei schwacher, langdauernder Bestrahlung eine merkliche Erwärmung auch tieferer innerer Schichten, eine höhere Erwärmung des Fetts und eine geringere der Haut zur Folge haben kann, sind weitere Betrachtungen erforderlich.
Es wird eine einfache und billig herzustellende Resonanzanordnung beschrieben, mit der genaue Bestimmungen elektrischer Impedanzwerte und Materialkonstanten im Dezimeterwellenbereich durchführbar sind. Prinzip der Methode, Meßbereich, Genauigkeit und Einzelheiten des Aufbaues werden angegeben und an einigen Beispielen erläutert.
Die Primärwirkung von Röntgenstrahlen einer Dosis von etwa 0,5 bis 150 Millionen r auf die kristallisierte Trockensubstanz von Aminosäuren und Peptiden wurde mit Hilfe chemischer, biochemischer und physikalisch-chemischer Arbeitsmethoden untersucht. Es wurde gefunden, daß in allen prinzipiell möglichen Fällen folgende Reaktionen stets wiederkehren : Aminbildung infolge Decarboxylierung; Bildung einer α-Imino- bzw. α-Ketocarbonsäure infolge einer Dehydrierung in α-,β-Stellung; Bildung von β,γ- bzw. γ-δ-ungesättigten α-Aminocarbonsäuren oder deren γ- bzw. δ-Lactonen; Bruch und Vernetzung der aliphatischen Kohlenstoffketten. Bei Peptiden treten die gleichen Reaktionen wie bei den Aminosäuren auf, jedoch in einem anderen Verhältnis; hinzu kommt die strahlenchemische Dehydrierung einer Peptidbindung an der Aminogruppe zu einer energiereichen Iminoacyl-Bindung, welche bei Gegenwart von Wasser sofort hydrolysiert wird. Endprodukt namentlich bei längerkettigen Peptiden : Zwei Bruchstücke (daneben NH3); das eine mit alter amino-endständiger und neuer carboxyl-endständiger Aminosäure und das andere mit der alten carboxy-endständigen Aminosäure, statt Aminogruppe am anderen Ende jetzt Ketogruppe. — In fast allen Fällen wurden die Ionenausbeuten auch quantitativ bestimmt. Die lonenausbeuten für die Bildung von α-Ketosäuren aus α-Aminosäuren fallen exponentiell mit der eingestrahlten Dosis. Eine relativ einfache Funktion erklärt diese Verhältnisse. Die Ionenausbeute für die Bildung von Brenztraubensäure aus Serin ist dagegen unabhängig von der Dosis.
I. X-irradiation of isolated rat diaphragm with 10 to 200 kr produces a change in tissue metabolism which we schematize in two successive phases:
1st phase: Increase of oxygen comsumption, proportional to the dosage; an even greater increase of CO2 production; QCO2/QO2 > 1, that is, aerobic glycolysis; inhibition of anaerobic glycolysis.
2nd phase: Reduction of oxygen consumption, proportional to the dosage (over 65 kr the Qo2 decreases below the control); an even greater decrease of CO2 production: QCO2/QO2 > 1; a greater inhibition of anaerobic glycolysis.
With 200 kr or more no increase of respiration appears, but instead from the beginning there is a reduction of the metabolism as described in the second phase.
II. A similar effect is found in rat liver and in frog heart tissue.
III. When the tissue was incubated in the homologus serum no change in the quality of the described effect was observed. Under our experimental conditions the tissue was X-irradiated within a small quantity of incubation medium and immediately afterwards placed in a fresh medium; this limits the effect of oxidative radicals (arising in the X-irradiated water) upon the tissue.
IV. We set forth the experimental hypothesis that all the described changes in the metabolism of the cell after X-irradiation depend upon a primary alteration of electrolyte balance in the cell, especially of the potassium/sodium relationship. The well known decrease of glycolysis after X-irradiation is a consequence of the loss of potassium from the X-irradiated cell.
Die Primärwirkung von Röntgenstrahlung einer Dosis von 2 — 30 Millionen r auf kristallisiertes Lysozym wurde mit Hilfe physikalisch-chemischer (Elektrophorese, Ultrazentrifuge), chemischer, biochemischer und biologischer Arbeitsmethoden untersucht. Es wurde gefunden, daß durch Bestrahlung eine Reihe nah verwandter, jedoch weniger basischer Proteine verschiedenen Mol.-Gew. entsteht, deren Aminosäure-Bausteine als Folge der Bestrahlung teilweise in andere Verbindungen umgewandelt wurden. Bei der Untersuchung der amino- und carboxyl-endständigen Aminosäuren des bestrahlten Proteins wurden Unterschiede gegenüber Lysozym nur bei den carboxyl-terminalen Gruppen festgestellt. Die biologische Aktivität des Proteins blieb auch nach Bestrahlung mit einer Dosis von 5 Millionen r praktisch unverändert.
Die indirekte Wirkung von Röntgenstrahlen einer Dosis von 0,08 bis 7.5 Millionen r auf eine 2 · 10-2-m. wäßrige Tryptophanlösung wurde mit Hilfe chemischer und physikalisch-chemischer Arbeitsmethoden (Hochspannungs-Elektrophorese) untersucht.
Der Einfluß der Dosis, Dosisleistung, Temperatur und die durch oxydierend wirkende Radikale (HO2) ausgelösten Reaktionsschritte bei Bestrahlung in Sauerstoffatmosphäre wurden in qualitativer Hinsicht geprüft.
Aus der Vielzahl der strahlenchemisch gebildeten Abbauprodukte konnten mit Sicherheit nachgewiesen werden: Glycin, α-Alanin, Asparaginsäure, Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, 3-Oxyanthranilsäure und Tryptamin.
Schließlich wurde versucht, die experimentell gewonnenen Ergebnisse mit Hilfe von Radikalwirkungen, die sich auf
a) Decarboxylierungen
b) und Veränderungen des Kohlenstoff-Gerüstes beziehen, zu deuten.
Elektronenresonanz-Untersuchungen von Nachreaktionen in einem röntgenbestrahlten Faserprotein
(1962)
Of the 16 non-structural proteins (Nsps) encoded by SARS CoV-2, Nsp3 is the largest and plays important roles in the viral life cycle. Being a large, multidomain, transmembrane protein, Nsp3 has been the most challenging Nsp to characterize. Encoded within Nsp3 is the papain-like protease domain (PLpro) that cleaves not only the viral polypeptide but also K48-linked polyubiquitin and the ubiquitin-like modifier, ISG15, from host cell proteins. We here compare the interactors of PLpro and Nsp3 and find a largely overlapping interactome. Intriguingly, we find that near full length Nsp3 is a more active protease compared to the minimal catalytic domain of PLpro. Using a MALDI-TOF based assay, we screen 1971 approved clinical compounds and identify five compounds that inhibit PLpro with IC50s in the low micromolar range but showed cross reactivity with other human deubiquitinases and had no significant antiviral activity in cellular SARS-CoV-2 infection assays. We therefore looked for alternative methods to block PLpro activity and engineered competitive nanobodies that bind to PLpro at the substrate binding site with nanomolar affinity thus inhibiting the enzyme. Our work highlights the importance of studying Nsp3 and provides tools and valuable insights to investigate Nsp3 biology during the viral infection cycle.