530 Physik
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During the co-translational assembly of protein complexes, a fully synthesized subunit engages with the nascent chain of a newly synthesized interaction partner. Such events are thought to contribute to productive assembly, but their exact physiological relevance remains underexplored. Here, we examine structural motifs contained in nucleoporins for their potential to facilitate co-translational assembly. We experimentally test candidate structural motifs and identify several previously unknown co-translational interactions. We demonstrate by selective ribosome profiling that domain invasion motifs of beta-propellers, coiled-coils, and short linear motifs may act as co-translational assembly domains. Such motifs are often contained in proteins that are members of multiple complexes (moonlighters) and engage with closely related paralogs. Surprisingly, moonlighters and paralogs assemble co-translationally in only some but not all of the relevant biogenesis pathways. Our results highlight the regulatory complexity of assembly pathways.
As cryo-EM approaches the physical resolution limits imposed by electron optics and radiation damage, it becomes increasingly urgent to address the issues that impede high-resolution structure determination of biological specimens. One of the persistent problems has been beam-induced movement, which occurs when the specimen is irradiated with high-energy electrons. Beam-induced movement results in image blurring and loss of high-resolution information. It is particularly severe for biological samples in unsupported thin films of vitreous water. By controlled devitrification of conventionally plunge-frozen samples, the suspended film of vitrified water was converted into cubic ice, a polycrystalline, mechanically stable solid. It is shown that compared with vitrified samples, devitrification reduces beam-induced movement in the first 5 e Å−2 of an exposure by a factor of ∼4, substantially enhancing the contribution of the initial, minimally damaged frames to a structure. A 3D apoferritin map reconstructed from the first frames of 20 000 particle images of devitrified samples resolved undamaged side chains. Devitrification of frozen-hydrated specimens helps to overcome beam-induced specimen motion in single-particle cryo-EM, as a further step towards realizing the full potential of cryo-EM for high-resolution structure determination.
Upon antibiotic stress Gram-negative pathogens deploy resistance-nodulation-cell division-type tripartite efflux pumps. These include a H+/drug antiporter module that recognizes structurally diverse substances, including antibiotics. Here, we show the 3.5 Å structure of subunit AdeB from the Acinetobacter baumannii AdeABC efflux pump solved by single-particle cryo-electron microscopy. The AdeB trimer adopts mainly a resting state with all protomers in a conformation devoid of transport channels or antibiotic binding sites. However, 10% of the protomers adopt a state where three transport channels lead to the closed substrate (deep) binding pocket. A comparison between drug binding of AdeB and Escherichia coli AcrB is made via activity analysis of 20 AdeB variants, selected on basis of side chain interactions with antibiotics observed in the AcrB periplasmic domain X-ray co-structures with fusidic acid (2.3 Å), doxycycline (2.1 Å) and levofloxacin (2.7 Å). AdeABC, compared to AcrAB-TolC, confers higher resistance to E. coli towards polyaromatic compounds and lower resistance towards antibiotic compounds.
Bei der UV-Bestrahlung (2537 Å) des Zn-Insulins beobachtet man für kleinere Dosen (bis 10 Einstein/Mol) eine direkte Korrelation zwischen der Inaktivierung und der Photoreduktion einer der drei Disulfidbrücken. Mit steigender Dosis wird die Quantenausbeute für die Reduktion der Disulfidbrücken (Bildung von SH-Gruppen) sehr klein, dagegen führen dann andere Prozesse zunehmend zur photochemischen Zerstörung der Disulfidbrücken. Für größere Strahlendosen (über 100 Einstein/Mol) ergibt die Extrapolation, daß für die völlige Inaktivierung des Insulins sämtliche drei Cystinreste zerstört werden müssen. Von den übrigen Aminosäuren wird durch Dosen um 100 Einstein/Mol nur der Tyrosin-Anteil signifikant vermindert. Mit steigender Strahlendosis ändert sich — wahrscheinlich infolge von Konformationsänderungen der Polypeptidketten — die Photosensibilität der Aminosäuren.
Some quantitative data about the carbon-metabolism in Saccharomyces-cells of different ploidy were determined. The amount of carbon, necessary for the formation of a cell, proved to be proportional to the degree of ploidy of the cells. For the duplication of a diploid cell 6,7·10-11g glucose were used. In comparison with respiratory deficient cells the simultaneous utilization of fermentation and respiration metabolism in respiration sufficient cells leads to a decrease of the cell cycle duration, however, the energy needed for the formation of a cell is not decreased. The rate of cell multiplication has a maximum at about 30 °C for all classes of ploidy. Certain assumptions about the utilization of the carbon source were confirmed by experiments with 14C marked glucose.
Cryo-electron tomography (CryoET) resolves individual macromolecules inside living cells. However, the complex composition and high density of cells challenge the faithful identification of features in tomograms. Here, we capitalize on recent advances in electron tomography and demonstrate that 3D template matching (TM) localizes a wide range of structures inside crowded eukaryotic cells with confidence 10 to 100-fold above the noise level. We establish a TM pipeline with systematically tuned parameters for automated, objective and comprehensive feature identification. High-fidelity and high-confidence localizations of nuclear pore complexes, vaults, ribosomes, proteasomes, lipid membranes and microtubules, and individual subunits, demonstrate that TM is generic. We resolve ~100-kDa proteins, connect the functional states of complexes to their cellular localization, and capture vaults carrying ribosomal cargo in situ. By capturing individual molecular events inside living cells with defined statistical confidence, high-confidence TM greatly speeds up the CryoET workflow and sets the stage for visual proteomics.
Physikalische und thermische Kontrastierung führt bei Fixierung in Glutaraldehyd und Einbettung in Vestopal bei Parenchymzellen der Leber zu weitgehend ähnlichen Kontrastunterschieden auch bei Mitochondrien und den Membranen des Retikulums. Beide Verfahren wirken also weitgehend unspezifisch. Von den chemischen Verfahren liefert Uranylacetat im Cytoplasma ähnliche Kontrastverhältnisse wie die beiden genannten Verfahren. Das spezifische Verhalten des Uranylacetats kann z. B. an der Kontrastierung des Chromatins demonstriert werden. Sie bleibt aus, wenn die färbbare Substanz auf der Wasseroberfläche des Messertroges herausgewaschen wurde. Bleicitrat-Kontrastierung hat hier im Gegensatz zu Uranylacetat eine spezifische Wirkung nur auf RNS-haltige Zellbestandteile.
Es wird auf die Mannigfaltigkeit der Kontraste hingewiesen, die sich bei mit Aldehyden fixiertem, in Vestopal W oder Durcupan ACM eingebettetem Gewebe durch gesteuerte Elektronenbestrahlung erreichen läßt. Voraussetzung für einen einwandfreien Vergleich von Kontrasten bei z. B. verschieden gefärbten Schnitten ist daher eine Bestrahlung, die zu ausreichend definierten Objektveränderungen führt. Brauchbar in diesem Sinne ist eine Bestrahlung, die zum maximalen „reinen Strahlenverlust“ führt, bei der aber thermische Substanzverluste vermieden werden. Der Negativkontrast von Chromatin und Nucleolen und die offenbar physikalisch bedingte Färbbarkeit der nucleinsäurehaltigen Zellbestandteile mittels der „negative-staining“-Methode werden diskutiert.
Um die von RAJEWSKY und WOLF aufgeworfene Frage nach dem Einfluß der DNS-Struktur auf die radiationschemische Veränderung der Basen zu untersuchen, wurde die DNS-Spirale bei einem Teil der Untersuchungen in dest. Wasser aufgelöst und mit Röntgenstrahlen bestrahlt. Es ergab sich eine Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit der Basen, vor allem zu Beginn der Bestrahlung auf den Wert, den man bei der Bestrahlung der Monomerlösungen beobachtet. Bei Bestrahlung in 0,1 und 1-n. NaCl gelöster DNS sind dagegen die Basen gegen die Einwirkung der im Wasser gebildeten Radikale geschützt, solange sie innerhalb der intakten Spirale gebunden sind. Dieser strukturbedingte Schutzeffekt besteht nicht gegenüber der direkten Strahlenwirkung von UV-Licht. Dieses Ergebnis ist von strahlenbiologischem Interesse, da das Optimum der Strahlenwirkung auf den Mitoseablauf nach Arbeiten von CARLSON und GRAY in der frühen Prophase liegt17, also ebenfalls in einem Stadium, in dem die DNS-Spirale (vor der Verdoppelung) völlig aufgelöst ist. (Vgl. auch BACQ-ALEXANDER und FRITZ-NIGGLI.
Die von verschiedenen Autoren 2–8 experimentell bestimmten Kontrastdicken für Kohle stimmen nicht mit den heute of benutzten numerischen Werten aus der Lenz schen Theorie überein. Die Diskrepanz läßt sich beheben, wenn man zur Auswertung der Theorie einen anderen, schon von LENZ zur Diskussion gestellten Θ-Wert benutzt. Durch Experimente wird gezeigt, daß auch der Bereich, in dem das Exponentialgesetz nicht mehr gilt, gut durch eine aus der Lenz schen Theorie hergeleitete Formel dargestellt werden kann. Der Bereich, in dem das Exponentialgesetz verwandt werden darf, wird näher diskutiert.
Eine einfache Methode wird erklärt, die es gestattet, genaue Aussagen über das Verteilungsgesetz elektrischer Relaxationszeiten in frequenzabhängigen Dielektrika zu machen. Die Methode setzt die Gültigkeit einer verallgemeinerten Form des von Cole und Cole formulierten Verteilungsgesetzes elektrischer Relaxationszeiten voraus. Sie basiert auf der Tatsache, daß dielektrische Verluste. die bei wesentlich kleineren Frequenzen als der mittleren charakteristischen Frequenz bestimmt werden, außerordentlich empfindlich sind gegen geringe Änderungen im Verteilungsgesetz. Die Methode wird am Beispiel dielektrischer Messungen an Wasser demonstriert. Die Auswertung eigener Messungen ergibt, daß sich im Rahmen der erzielbaren hohen Genauigkeit das dielektrische Verhalten von Wasser durch eine einzige Relaxationszeit charakterisieren läßt.
In der vorliegenden Arbeit wird die Frequenzabhängigkeit des dielektrischen Verhaltens einer Suspension von Kugeln mit Schale untersucht. Es werden die allgemeine Lösung sowie spezielle Näherungsformeln angegeben. Das Frequenzverhalten wird exakt durch 2 Relaxationsausdrücke vom Debye - Typ, die sich superponieren, charakterisiert.
Die vorgetragenen Formeln erlauben die Analyse der Impedanzkurven von Zellsuspensionen aus Erythrozyten, Bakterien, Seeigeleiern u. a. m., aber auch von Proteinlösungen und anderen Suspensionen.
Bei B. cadaveris, die in einem an organischen Substanzen reichen Medium kultiviert wurden, nimmt der O2-Verbrauch pro Zeiteinheit bei Glucoseveratmung mit der Röntgenstrahlendosis ab, während bei Bakterien, die in einem Salzmedium gewachsen sind, die Atmung bis zu einer Dosis von 2 - 3 Mr erst ansteigt, um erst bei höheren Dosen abzufallen. Die Atmung wird erst bei Dosen in der Größenordnung von 1 Million r merklich beeinflußt.
Die Atmung der Bakterien ist damit unter den hier untersuchten Bedingungen noch strahlenresistenter als die Gewebeatmung von Säugetierzellen.
Es wurde das Leitfähigkeitsverhalten von reinem, lufthaltigem Wasser bei kontinuierlicher und impulsgetasteter Röntgenbestrahlung (60 kV8) untersucht. Hierbei ergaben sich zwei einander überlagerte Effekte: 1. Ein der Röntgen-Dosisleistung proportionaler irreversibler Leitfähigkeitsanstieg, der vermutlich auf eine Strahlenreaktion des gelösten CO2 zurückzuführen ist, 2. eine reversible Leitfähigkeitserhöhung während der Bestrahlung, die sich mit der Entstehung einer Ionenart mit einer mittleren Lebensdauer von ca. 0,15 sec erklären läßt. Es wird angenommen, daß es sich dabei um Radikalionen O2⊖ handelt, welche durch die Reaktion der als Strahlungsprodukt entstehenden Η-Radikale mit dem gelösten Sauerstoff gebildet werden. Ein möglicher chemischer Reaktionsmechanismus wird angegeben, der zu befriedigender quantitativer Übereinstimmung der Versuchsergebnisse mit Ausbeutewerten und Reaktionskonstanten aus der Literatur führt.
Trockene Mildisäure-Dehydrogenase wurde mit Protonen verschiedener Energie bis maximal 80 keV in dünnen Schichten bestrahlt. Die Inaktivierungsquerschnitte betrugen bei Zimmertemperatur ca. 0,4·10-12 cm2 und waren in dem gemessenen Energiebereich konstant. Der Einfluß der Teilchenenergie auf den Inaktivierungsverlauf wurde insbesondere bei sehr kleinen Energien abgeschätzt. Bestrahlungen bei verschiedenen Temperaturen zeigten eine Abnahme des Strahleneffektes nach niedrigeren Temperaturen.