540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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Isothermal titration calorimetry (ITC) is a widely used technique for the characterization of protein-protein and protein-ligand interactions. It provides information on the stoichiometry, affinity, and the thermodynamic driving forces of interactions. This chapter exemplifies the use of ITC to investigate interactions between human autophagy modifiers (LC3/GABARAP proteins) and their interaction partners, the LIR motif containing sequences. The purpose of this report is to present a detailed protocol for the production of LC3/GABARAP-interacting LIR peptides using E. coli expression systems. In addition, we outline the design of ITC experiments using the LC3/GABARAP:peptide interactions as an example. Comprehensive troubleshooting notes are provided to facilitate the adaptation of these protocols to different ligand-receptor systems. The methodology outlined for studying protein-ligand interactions will help to avoid common errors and misinterpretations of experimental results.
Mechanistic characterization of photoisomerization reactions in organic molecules and photoreceptors
(2023)
In dieser Arbeit wurden verschiedene Einflüsse auf die Dynamik von Photoisomerisierungen in Phytochromen und indigoiden Photoschaltern untersucht. Beide Forschungsgebiete teilen wesentliche Aspekte wie die Kontrolle durch sterische Wechselwirkungen und den starken Einfluss der Polarität oder der ionischen Umgebung.
Auf dem Gebiet der Phytochrome wurde die relative Positionierung der knotenlosen Phytochrome innerhalb der Superfamilie der Phytochrome in Bezug auf ihre Photodynamik und den Effekt von Grundzustandsheterogenität herausgearbeitet. Es wurde anhand von ultraschnellen, zeitaufgelösten Anrege-Abtast-Experimenten der einzelnen GAF-Domäne All2699g1 im Vergleich mit dem vollständigen knotenlosen Phytochrom All2699g1g2 und dem strukturell ähnlichen knotenlosen Phytochrom SynCph2 gezeigt, dass knotenlose Phytochrome in ihrer Vorwärtsdynamik eine komplexe mehrphasige Kinetik mit einem langlebigen angeregten Zustand (~100 ps) aufweisen. Die beobachtete mehrphasige Kinetik konnte einer initialen Chromophordynamik sowie einer nicht exponentiellen Reorganisation der chromophor-umgebenden Proteinmatrix zugeordnet werden. Dies steht im starken Kontrast zur im Gebiet der Phytochrome etablierten Beschreibung derartiger mehrphasiger Kinetiken mittels heterogener Grundzustände. Stattdessen wurde ein konserviertes kinetisches Muster identifiziert, welches die mehrphasige Dynamik beschreibt und in allen in dieser Arbeit untersuchten Phytochrome beobachtet wurde. Zudem konnte dieses Muster in einem Phytochrom der Gruppe I und einem Phytochrom der Gruppe III, die einen ähnlichen Pr Dunkelzustand aufweisen, gezeigt werden, was eine breite Anwendbarkeit des damit verbundenen Mechanismus vermuten lässt. Weiterhin konnte die zentrale Rolle eines konservierten Tyrosins in der Photoisomerisierung anhand von Mutationsstudien in All2699g1 herausgearbeitet werden. Diese konservierte Aminosäure muss im Rahmen der Reorganisation der Proteinmatrix vom Chromophor weggezogen werden, damit die sterische Blockade abgebaut werden kann, die die Isomerisierung des Chromophors zunächst verhindert. Da diese Bewegung von diversen Faktoren in der den Chromophor umgebenden Proteinmatrix abhängt, weist sie eine nicht exponentielle Kinetik auf, die je nach Phytochrom, der spezifischen Flexibilität und dem vorhandenen Raum in der Bindetasche unterschiedliche Lebenszeiten aufweist.
Die Rückreaktion knotenloser Phytochrome konnte ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert werden, welche im Pikosekundenbereich abläuft, und damit signifikant schneller ist als die Vorwärtsreaktion. Im Gegensatz zur Vorwärtsreaktion nimmt Grundzustandsheterogenität in der Rückreaktion eine weitaus bedeutendere Rolle ein. Hier weisen die in All2699g1 vorhandenen heterogenen Grundzustandspopulationen jeweils eine eigene Kinetik ihres angeregten Zustands auf, während die homogenen Grundzustände von All2699g1g2 und SynCph2 jeweils nur einen Zerfall des angeregten Zustands zeigen. Der Ursprung dieser Heterogenität konnte im Wasserstoffbrückennetzwerk des Chromophors lokalisiert und mit dem konservierten Tyrosin und einem konservierten Serin in der PHY-Domäne verknüpft werden. Die Anwesenheit der PHY-Domäne sorgt demnach für eine Verringerung der Grundzustandsheterogenität und des vorhandenen Raums in der Bindetasche, wodurch die Effizienz der Photoreaktion optimiert wird.
Zuletzt konnte die Millisekundendynamik knotenloser Phytochrome und der Einfluss der PHY-Domäne auf diese aufgeklärt werden. Die PHY-Domäne sorgt hierbei durch den verringerten Raum in der Bindetasche dafür, dass die zunächst stattfindende thermische Relaxation des Chromophors signifikant verlangsamt wird, während spätere Änderungen im Photozyklus nur wenig beeinflusst werden.
Auf dem Gebiet der indigoiden Photoschalter konnte, anhand eines sterisch überladenen Hemithioindigo Photoschalters, der Photoisomerisierungsmechanismus des Hula-Twists beobachtet und eine starke Lösungsmittelabhängigkeit der entsprechenden Kinetik aufgezeigt werden. Aus den durchgeführten zeitaufgelösten Anrege-Abtast-Experimenten in verschiedenen Lösungsmitteln konnte ein Modell für die Photodynamik des verwendeten Hemithioindigo Photoschalters entwickelt werden. In unpolaren Lösungsmitteln muss eine hohe Barriere zur produktiven konischen Durchschneidung überwunden werden, was zu Lebenszeiten des angeregten Zustands im Nanosekundenbereich führt. Der Weg zur produktiven konischen Durchschneidung folgt dabei dem Hula-Twist Mechanismus. Dieser Pfad ist in polaren Lösungsmitteln unerreichbar, weshalb eine schnelle Relaxation über eine unproduktive konische Durchschneidung stattfindet.
Im zweiten Projekt auf dem Gebiet der indigoiden Photoschalter wurde anhand der neuartigen Klasse der Iminothioindoxyl Photoschalter ein Schwingungsenergiedonor für Schwingungsenergietransferstudien entwickelt. Das daraus entwickelte Modellsystem, bestehend aus einer künstlichen Aminosäure auf Basis des Iminothioindoxyl Photoschalters und einem daran gekoppelten Schwingungsenergiesensor, wurde charakterisiert und die primäre Photoreaktion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der angeregte Zustand des Modellsystems kurzlebig ist und unter Abgabe von großen Mengen an Schwingungsenergie zerfällt, unabhängig von der Anregungswellenlänge und dem verwendeten Lösungsmittel. Somit zeigt das entwickelte System vorteilhafte Eigenschaften für Schwingungsenergietransferstudien.
Insgesamt konnten somit die Mechanismen der Photoisomerisierungsreaktionen in knotenlosen Phytochromen und indigoiden Photoschaltern aufgeklärt und daraus die Relevanz der Umgebung für derartige Reaktionen herausgearbeitet werden.
This cumulative dissertation examines learning in chemistry laboratories, focusing on the challenges and benefits of problem-based learning (PBL) for novices in the lab. It addresses the lack of consistent understanding about what should be learned in labs and why it's important. The research aims to understand what students learn, how they learn, and how lab learning can be improved.
A central concept in PBL labs is Information Literacy, defined as a sociocultural practice enabling learners to identify and use information sources within a specific context as legitimized by the practice community.
The first publication, Wellhöfer and Lühken (2022a), investigates the relationship between PBL and learner motivation. It identifies factors that can foster students' intrinsic motivation in a PBL lab. Autonomy is found to be a key factor, increasing student motivation and presenting a model of the autonomous scientific process. This model involves four steps: information acquisition, designing and applying experimental procedures, experimental feedback, and autonomous process optimization. The results suggest that intrinsic motivation in PBL labs can be enhanced by enabling students to independently execute these steps.
The second publication, Wellhöfer and Lühken (2022b), examines the information process students undergo during their first PBL lab. Using a sociocultural framework, it explores Information Literacy to understand students' handling of information and their perceptions of the information process. The findings reveal that in PBL labs, developing a practical, applicable experimental procedure is crucial for problem-solving and significantly shapes the information-acquisition process. This process is iterative, influenced by new information, leading to more precise information needs. Students assess information quality based on its usefulness for their problem, implementability (considering cognitive understanding, available equipment, and psychomotor skills), and safety.
Furthermore, the role of privileged knowledge forms in evaluating the quality of text sources is explored. Students viewed non-scientific sources as "poor" and scientific sources as "good," yet used both for information gathering. There were discrepancies between their assessment of source quality and actual use, indicating that perception of source quality doesn't always affect their practical decisions.
The third publication, Wellhöfer, Machleid, and Lühken (2023), investigates students' information practices in the lab, focusing on discourse between novice learners and experienced assistants. It shows that theoretical knowledge isn't sufficient for independent practical action, and students need actionable social information from experienced community members. The results highlight that information literacy in the lab for newcomers to a community of practice has distinctive features, and physical experience and tacit knowledge are crucial for learning the methods and group-specific knowledge of the practice community. The article demonstrates how learning information literacy in a practice community requires a social and physical experience and provides insights on how educators can support this process.
Einfache elektrochemische Methode zur Bestimmung von Chlorit in wässrigen und nicht-wässrigen Systemen Stoffe bzw. Verbindungen, welche nachweislich krebserregend oder fruchtbarkeitsschädigend sind, werden seit Jahren, insbesondere durch die WHO, streng reguliert. Zu diesen Stoffen zählt u. a. Chlorit, welches als Abbauprodukt in Desinfektionsmitteln, Poolwassern und im Rahmen von organischen Oxidationsprozessen vorkommt. Im Rahmen des Projektes sollte eine elektrochemische Methode zu Detektion von Chlorit in wässrigen und organischen Proben entwickelt werden, wobei auf eine Glaskohlenstoffelektrode in Kombination mit Li [NTf]2 im Wässrigen und [Bmpyrr][NTf]2/MeOH im Organischen als Elektrolyten zurückgegriffen wurden.
Bei der Methodenentwicklung wurde auf Differentielle-Puls-Voltammetrie zurückgegriffen, da diese im Vergleich zum Cyclovoltammetrie deutlich empfindlicher ist. Die Methodenvalidierung nach ICH-Guidelines konnte erfolgreich durchgeführt werden Dabei konnte im Wässrigen eine Nachweisgrenze von 0.07 mg L-1 (Organisch: 0.20 mg L-1) erhalten werden. Beide lagen deutlich unter den WHO-Grenzwerten von 0.7 mg L-1. Die Selektivität/Interferenz wurde gegenüber den übrigen Chlor-Spezies getestet; für alle Spezies, außer Hypochlorit, konnten für die Wiederfindungsrate von Chlorit Werte nahe 100% erhalten werden. Die entwickelte Methode konnte erfolgreich auf wässrige (Poolproben, Desinfektionsmittel) und organische Proben (aus Pinnick-Synthesen) angewendet werden. Insbesondere durch die Anwendung im Bereich der Pinnick-Oxidation war der Sensor für mögliche In-Line-Analytik geeignet. Bei den organischen Proben konnte zudem die ionische Flüssigkeit zu 92% zurückgewonnen werden, was den Elektrolyten in Hinblick auf Nachhaltigkeit und Wirtschaftlichkeit noch attraktiver macht.
Entwicklung ionenchromatographischer Methoden zur Detektion von Chloroxo-Spezies
Der Bedarf an schnellen, kostengünstigen Analysemethoden, welche den Vorgaben der einzelnen Behörden weltweit entsprechen, ist in den letzten Jahren enorm gestiegen. Im Rahmen des Projektes sollte eine ionenchromatographische Methode (IC) entwickelt werden, welche neben den Chloroxo-Spezies (Chlorid, Hypochlorit, Chlorit, Chlorat und Perchlorat) auch die bekannten Standardionen (Fluorid, Bromid, Nitrat, Phosphat, Sulfat, Iodid) nachweisbar macht. Zunächst gelang es, die Methodenparameter zu optimieren und so die Chloro-Spezies, außer Hypochlorit, von den übrigen Standardanionen innerhalb von 50 Minuten vollständig zu trennen. Die Methode konnte in der weiteren Entwicklung sogar noch um die Detergenzien-Anionen Acetat, Formiat, Oxalat und Tartrat erweitert werden. (ASupp 7, 45 °C, 0.8 mL min-1, 6 mmol L-1 Na2CO3 / 1 mmol L-1 NaHCO3 + 10% Acetonitril). Auch alle notwendigen Validierungsparameter konnten erfolgreich bestimmt werden. Zuletzt war es möglich, erfolgreich unterschiedliche Realproben zu vermessen.
Da ein Nachweis von Hypochlorit mittels IC nicht möglich war, wurden weitere Anstrengung unternommen, dieses Anion mittels IC-PCR (Nachsäulenderivatisierung) nachzuweisen. Als Detektionsprinzip wurde dabei auf eine Bromat-Nachweis-Methode mittels UV/VIS zurückgegriffen, welche im Rahmen des Projektes angepasst wurde. Da davon ausgegangen werden muss, dass das Hypochlorit mit reaktiven Stellen innerhalb des Säulenmaterials reagiert und somit nicht mehr detektiert werden kann, wurden Passivierungsexperimente an der Vorsäule und Säule für 24 h mit einer Hypochlorit-NaOH-Mischung durchgeführt. Nach 60 Stunden Passivierung konnten erstmals reproduzierbare Ergebnisse bei dem Nachweis von OCl- erhalten werden. Zuletzt konnten erfolgreich fünf unterschiedliche Realproben vermessen und der Hypochlorit-Gehalt mit bisher angewandten Methoden verglichen werden, wobei die erhaltenen Werte in der gleichen Größenordnung lagen.
Entwicklung eines Sensors unter Verwendung der Viologen-Grundstruktur auf metallischen Oberflächen
Früher fanden Viologene und deren Derivate Anwendung im Bereich der Schädlingsbekämpfung und wurden hauptsächlich als Kontaktherbizid verwendet. Mittlerweile hat sich das Anwendungsspektrum der Viologene deutlich verändert, u.a. werden die in organischen Redox-Fluss-Batterien als Elektrolyte eingesetzt. Im Rahmen diesen Projekts wurden mehrere bekannte Viologen-Grundkörper (u. A. Methylviologen (MV)) vollständig elektrochemisch charakterisiert Im Anschluss wurde MV mit unterschiedlichen Ankergruppen (Thiol-, Sulfonat, -Phosphonat-, Carboxylanker) modifiziert und auf metallische Oberfläche (u. A. Gold und Kupfer) abgeschieden mit dem Ziel ein neues Sensor-Motiv für die Analytik zu entwickeln. Der Thiolanker konnte erfolgreich auf Gold, der Carboxylanker erfolgreich auf Kupfer abgeschieden werden. Die anschließenden elektrochemischen Untersuchungen der abgeschiedenen Monolagen ergaben jedoch eine geringe Stabilität der Anker in wässriger und organischer Umgebung, sodass in Zukunft weitere Anstrengungen unternommen werden müssen, die Stabilität des Viologensystems auf der Oberfläche zu verbessern.
Der Fokus der Arbeit liegt auf der Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Molekülen in selbst-anordnenden Monolagen (SAMs) auf Goldoberflächen mittels Rastertunnelmikroskopie und komplementären Methoden wie z.B. Infrarot-Reflektions-Absorptions-Spektro-skopie.
In dieser Arbeit wurde das kürzlich etablierte Konzept von eingebetteten Dipolmomenten in aromatischen, SAM-bildenden Molekülen eingehender untersucht. Das Ausmaß des Dipol-moments und die Größe der SAM-bildenden Moleküle wurden synthetisch variiert und der Einfluss auf die Struktur und elektronischen Eigenschaften der SAMs untersucht. Binäre, gemischte Monolagen aus SAM-bildenden Molekülen mit "entgegen gerichteten", Dipolmomenten wurden hergestellt und charakterisiert. Zur Herstellung der binären, gemischten Monolagen wurden zwei Methoden verwendet: die Monolagen wurden a) aus bereits gemischten Lösungen der Moleküle abgeschieden oder b) eine reine SAM in die Lösung des anderen Moleküls eingelegt, so dass ein Austausch stattfand. Der Vergleich der beiden Methoden ermöglicht Rückschlüsse über die Abscheidungsprozesse. Die Charakterisierung der SAMs dieser Mischungsreihen gab Aufschluss über Eigenschaften wie Packungsdichte, Austrittsarbeit, elektronischen Ladungstransport in Monolagen und Orientierung der Moleküle relativ zur Oberfläche und erlaubte Schlussfolgerungen über die Mischbarkeit und das Ausmaß der Dipolwechselwirkungen der Moleküle in der Monolage. In einem ähnlichen Ansatz zu dem oben beschriebenen Vorgehen wurden Quadrupolwechselwirkungen zwischen SAM-bildenen, Benzol-, Naphtalin- und Anthracenderivaten untersucht. In Mischungsreihen wurden SAMs von nicht- und teilweise (hoch)fluorierten, SAM-bildenden Molekülen auf Goldoberflächen charakterisiert. Die Ergebnisse der Untersuchungen können bei der gezielten Einstellung der elektronischen Eigenschaften in elektronischen Bauteilen wie OFETs Anwendung finden.
In einem weiteren Projekt wurde der Einfluss von polaren Endgruppen auf die in situ Abspaltung von Schutzgruppen an Terphenylthiol-Derivaten untersucht, wobei die Ergebnisse zum Aufbau größerer, aus organischer Elektronik bestehender, Netzwerke verwendet werden können.
Um sich an ändernde Umwelteinflüsse und metabolische Bedürfnisse anpassen zu können, ist es für Zellen essenziell, dass Boten-RNA (engl. messenger RNA, mRNA) stetig und schnell nach der Translation abgebaut wird. In Prokaryoten ist dafür der Proteinkomplex Degradosom verantwortlich, in dem Endo- und Exoribonukleasen RNase E und PNPase das RNA-Transkript in kleinere Fragmente und schließlich einzelne Nukleotide spalten. Die DEAD-Box Helikase RhlB im Komplex dient zusätzlich dazu, mögliche Sekundärstrukturen in der RNA zu entfalten, welche sonst die weitere Degradation behindern würden. Es konnte gezeigt werden, dass RhlB’s sehr geringe katalytische Aktivität – gemessen durch ATP-Verbrauch und Rate an entwundener RNA – signifikant durch die allosterische Bindung an Komplexpartner RNase E erhöht wird. Gleichzeitig deuten andere Studien darauf hin, dass RhlB eine mögliche Selektivität für doppelsträngige RNA-Substrate mit 5‘-Einzelstrang-Überhängen aufweist.
Diese Arbeit liefert neue Erkenntnisse in Bezug auf die Kommunikation zwischen den Degradosom-Komponenten RhlB und RNase E aus E. coli, indem das potenzielle Wechselspiel zwischen RhlBs RNA-Selektivität und der allosterischen Aktivierung durch RNase E untersucht wurde. Der vielseitige Einsatz NMR-spektroskopischer Techniken sowie die Verwendung kurzer RNA-Substrate mit spezifischen Strang-Eigenschaften ermöglicht es, mit einen ungewöhnlichen, RNA-zentrierten Ansatz an diese unzureichend verstandene Protein-Interaktion heranzugehen.
Zunächst wurden hierzu eine Reihe kurzer doppelsträngiger RNA-Konstrukte hergestellt, die sich nicht nur in ihren Einzelstrang-Merkmalen unterscheiden, sondern auch die thermodynamischen Anforderungen eines DEAD-Box Helikase Substrats erfüllen, und gleichzeitig eine ausreichende NMR-spektroskopische Signal-Zuordnung erlauben. Die thermale Stabilität, das Faltungsverhalten sowie die 1H Imino-protonen- und 13C HSQC-Zuordnungen aller geeigneten Konstrukte wurden erfolgreich bestimmt.
Um den Einfluss spezifischer RNA-Substrate sowie die Bindung zweier verschiedener RNase E Fragmente auf RhlBs ATP-Umsatzrate zu untersuchen, wurde sich zunächst eines photometrischen Phosphat-Assays bedient. Damit konnte deutlich gezeigt werden, dass RhlB in Abwesenheit des Komplex-Partners nicht in der Lage ist, signifikante Mengen an ATP umzusetzen, unabhängig davon, welches RNA-Konstrukt eingesetzt wird. Die Bindung der RNase E Fragmente erhöhte signifikant die ATP-Hydrolyse-Rate der Helikase, wobei die größte Aktivierung für den RNA-Duplex mit 5‘-Einzelstrang sowie ein einzelsträngiges Substrat zu beobachten ist. Da diese Ergebnisse deutlich eine RNA-Abhängigkeit beim ATP-Umsatz der Helikase zeigen, wurde untersucht, ob diese Unterschiede ihren Ursprung bereits in der Bindung der spezifischen RNA-Substrate haben. Mittels einer Mischapparatur, die es erlaubt die enzymatische Reaktion direkt im Spektrometer zu initiieren sowie zeitaufgelöster 31P NMR-Experimente konnte die allosterische Aktivierung der ATP-Hydrolyse-Rate von RhlB auch unter NMR-spektroskopischen Messbedingungen nachgewiesen werden.
Da die Ergebnisse des ATPase Assays deutlich eine RNA-Abhängigkeit bei der ATP-Umsatz-Rate der Helikase zeigen, wurde zusätzlich untersucht, ob diese Unterschiede ihren Ursprung in den Affinitäten für die verschiedenen RNA-Substrate haben und ob diese durch die Bindung von RNase E and RhlB beeinflusst werden. Um im gleichen Zuge zu überprüfen, ob die Bindung der RNA an RhlB die RNA-Konformation oder Basenpaarung ändert, werden 1H NMR-Titrationsexperimente durchgeführt. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass RhlB eine inhärente Präferenz für Duplexe mit 5‘-Überhang gegenüber Konstrukten mit 3‘-Überhang oder stumpfen Enden besitzt, was sich in einer erhöhten Affinität zeigt. Zusätzlich offenbaren die Messungen, dass RNase Es allosterische Bindung selektiv die Affinität gegenüber Konstrukten mit Einzelstrang-Überhang erhöht, während die Affinität zu RNA Duplexen ohne Überhang sogar verringert wird. Diese Ergebnisse liefern erstmals einen Nachweis, dass RNase E aktiv Einfluss auf RhlBs RNA-Bindung nimmt. Weder die Bindung der RNA and RhlB noch an den RhlB/RNase E Komplex scheint die Basenpaarung oder Konformation der RNA-Substrate zu beeinflussen, da lediglich eine homogene Peak-Verbreitung aller Imino-Protonen-Signale im 1H NMR-Spektrum beobachtet werden konnte.
Molekulare Werkzeuge können in der Wissenschaft unter anderem dazu verwendet werden, biochemische Prozesse gezielt zu untersuchen, um sie somit besser zu verstehen. Dabei handelt es sich zum Beispiel, um kleine chemische Moleküle, die gezielt für ihr Anwendungsgebiet konzipiert worden sind. Mit Ihnen lassen sich z.B. Interaktionen zwischen (Makro-)Molekülen regulieren, chemische Gleichgewichte lokal verändern oder auch Botenstoffe zielgerichtet freisetzen. Die Effekte dieser temporären Einwirkung auf verschiedenste biologische Systeme können hilfreiche Erkenntnisse struktureller, funktioneller oder systematischer Art für die entsprechenden Forschungsgebiete liefern.
Um die interdisziplinären Problemstellungen zielgerichtet mit den entsprechend zugeschnittenen Werkzeugen zu adressieren, ist es dabei jedoch absolut notwendig, dass ein umfassendes und über die Grenzen der jeweiligen Fachgebiete hinaus gehendes Verständnis der jeweiligen Fragestellungen entwickelt wird.
Viele der bisher bekannten Werkzeuge benötigen für ihren Einsatz bis heute noch relativ harsche Reaktionsbedingungen, haben ein eingeschränktes Anwendungsfeld oder lassen sich nicht ausreichend Zeit- & Ortsaufgelöst „aktivieren“. Die Möglichkeit Licht als externes Trigger-Signal zu verwenden, um die entsprechenden molekularen Werkzeuge zu aktivieren (oder auch zu deaktivieren), überwindet genau diese Defizite und bringt neben der hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung noch viele weitere Vorteile mit sich. Im Rahmen meiner Doktorarbeit ist es mir gelungen gemeinsam mit meinen Kooperationspartnern neue lichtaktivierbare molekulare Werkzeuge von Grund auf zu designen, zu synthetisieren, sie auf ihre photochemischen Eigenschaften zu untersuchen und sie anzuwenden. Durch die interdisziplinäre Zusammenarbeit mit Doktoranden aus der Organischen, Theoretischen und Physikalischen Chemie, konnte ein umfassendes Bild dieser neuen Substanzklassen aufgezeigt werden. Die verschiedenen Arten lichtaktivierbarer Werkzeuge sollen im Verlauf dieser Arbeit genauer herausgearbeitet werden. Generell kann man in drei grundlegenden Klassen von lichtaktivierbaren Werkzeugen unterscheiden: 1. irreversibel photolabile Schutzgruppen, 2. photoaktivierbare Label und 3. reversibel lichtschaltbare Photoschalter.
Auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen, auch photoaktivierbare Schutzgruppen oder Photocages genannt, ist es uns gelungen eine neue Spezies von Molekülen zu identifizieren, die dazu in der Lage sind, nach photochemischer Anregung eine spezifische Bindung innerhalb ihres molekularen Gerüsts zu spalten. Möglich gemacht wurde dies, indem wir den sog. „uncaging Prozess ganz neu gedacht“ haben und mit der Unterstützung von Theorie und Spektroskopie unsere Ergebnisse in einer Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie (SAR) festhalten konnten. Aus einer Substanzbibliothek von diversen theoretisch berechneten Kandidaten, wurden die vielversprechendsten Verbindungen anschließend synthetisiert und photochemisch charakterisiert. Nach initialen Untersuchungen und den daraus hervorgehenden Erkenntnissen, wurden weitere molekulare Struktur auf die Optimierungen der photochemischen Eigenschaften hin theoretisch berechnet und anschließend im Labor realisiert. Daraus resultierend entwickelten wir einen Photocage, der mit einer hohen Quantenausbeute mit Licht von über 450 nm photolysierbar ist und ebenfalls dazu in der Lage ist Neurotransmitter wie z.B. Glutamat zielgerichtet und lichtaktiviert freizusetzen. Eine weitere Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie wurde im Rahmen dieser Arbeit mit dem Isatin-Gerüst als potentiell neue photolabile Schutzgruppe durchgeführt.
Ebenfalls konnten in einer dritten Studie auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen Untersuchungen am Coumarin-Grundgerüst zeigen, dass eine systematische Einschränkung der Relaxationspfade im Molekül eine Verbesserung der photochemischen Eigenschaften mit sich bringen kann.
Photoaktivierbare Label werden in den verschiedensten Bereichen der Wissenschaft angewendet. Meist erlauben jedoch die chemischen Moleküle nur eine begrenzte „Beobachtungszeit“ der biochemischen Prozesse aufgrund der effizienten und damit schnellen Relaxationspfade zurück in den Grundzustand. Zu Beginn der durchgeführten Untersuchungen, bestand unsere Idee darin, die selektive Prä-IR-Anregung mit Hilfe eines UV/vis-Pulses (entsprechend der VIPER-Spektrokopie) in ein langlebiges Triplett-Signal eines geeigneten Chromophors zu überführen, welches anschließend für die Beobachtung vergleichsweise lang-lebiger biochemischer Prozesse verwendet werden könnte. Aus dieser Idee heraus entwickelten wir einen Chromophor, der neben einer Absorption im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, zusätzlich eine IR-adressierbare funktionelle Gruppe, sowie die Eigenschaft, ein effizientes Inter-System-Crossing (ISC) nach photochemischer Anregung durchzuführen, besaß. Zu unserem Erstaunen zeigte dieses Derivat jedoch nach erfolgreicher Synthese nicht das erwartete Verhalten. Ein weiteres Beispiel für die hochgradige Komplexität der Photochemie.
Mit Hilfe von theoretischen und spektroskopischen Methoden konnten dennoch viele hilfreiche Erkenntnisse aus dieser Studie für zukünftige Untersuchungen aufgedeckt werden.
Ebenso war es während meiner Promotion eines der Ziele, den Schaltprozess des sog. Fulgid-Photoschalters genauer zu untersuchen und somit besser zu verstehen. Hierbei handelt es sich um ein ausgesprochen beständiges, photochemisch reversibel schaltbares Molekül, auch wenn dies vielleicht auf den ersten Blick ein Widerspruch in sich zu sein scheint. Es gelang uns diesen Photoschalter, genauer gesagt seine Photo-Isomere, auf dem Gebiet der chemischen Aktinometrie zu etablieren.
Dafür waren zahlreiche Messungen diverser Reaktivitäten (photochemische Reaktions-Quantenausbeuten) in verschiedenste Wellenlängenbereiche vom Nah-UV-Bereich bis hin zur 700 nm Grenze erforderlich. Außerdem wurden alle Werte mit der Referenzmessung einer Photodiode bzw. je nach Wellenlängenbereich auch mit der klassischen Ferri-Oxalat-Aktinometrie verglichen. Im Anschluss daran fokussierte ich mich weiter auf die einzelnen Photo-Isomere und ihre einzigartige chemische Struktur. Mit Hilfe der chiralen HPLC gelang es uns die einzelnen Photo-Isomere voneinander zu isolieren und diese mit verschiedensten photochemischen und theoretischen Methoden „genauer unter die Lupe“ zu nehmen. Die aus dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse bereiten den Weg für diverse, zukünftige spektroskopische Anwendungen dieses Photoschalters.
Large international airports were identified as sources of ultrafine particles (UFPs) (Hu et al., 2009; Yu et al., 2012; Hsu et al., 2013; Keuken et al., 2015; Hudda and Fruin, 2016). Since September 2017 UFP emissions originating from the Frankfurt International Airport, Germany are monitored by the Hessian Agency for Nature Conservation, Environment and Geology (HLNUG) showing elevated UFP concentrations during airport operating hours (05:00–23:00 CET) (Ditas et al., 2022). Referring to that, the organic chemical composition of aviation-related UFPs emerging from the Frankfurt Airport was analysed by performing a comprehensive non-target screening of UFP filter samples.
Aluminium-filter samples were collected at an air quality monitoring station 4 km north of the Frankfurt Airport, using a 13-stage impactor system (Nano-MOUDI). The chemical
characterization of UFPs in the size range of 10-18 nm, 18-32 nm and 32-56 nm was accomplished by ultra-high-performance liquid chromatography, heated electrospray ionisation and mass analysis using an Orbitrap high-resolution mass spectrometer. Non-target screening revealed that the majority of detected compounds belong to homologous series of two different types of organic esters, which are base stocks of aircraft lubrication oils.
In reference to five different jet engine lubrication oils of various manufacturers, the corresponding lubricant base stocks and their additives, two amines and one organophosphate, were identified in the UFPs by the use of matching retention time, exact mass and MS/MS fragmentation pattern of single organic molecules. The quantitative analysis of the jet engine oil constituents in the aviation-related UFPs with diameters < 56 nm was accomplished by standard addition. By characterizing the Nano-MOUDI, loss factors for each size stage were determined and used for correction accordingly. Particle-number size distribution measurements, conducted parallel to the filter sampling, enabled the determination of the jet engine oil contribution to the UFP mass.
Furthermore, the nucleation and particle formation potential of a commonly used synthetic jet engine lubrication oil was investigated in the laboratory. Thermodenuder experiments at 20 °C and 300 °C were carried out to monitor the gas-to-particle partitioning behaviour of jet engine oils. At 300 °C a significantly higher number of particles with a mean diameter of ~10 nm are formed, leading to a more than fivefold increase in total particle numbers compared to 20 °C. Particle diameters of the newly formed oil particles in the laboratory experiment appeared in the same size region as UFPs emerging from Frankfurt Airport. Particles originating from the Frankfurt city centre direction showed larger diameters.
Results indicate that aircraft emissions strongly influence the total mass of 10-18 nm particles. The jet oil fraction decreases for bigger particles (e.g., 18-56 nm), implying that these oils form new particles in the cooling exhaust gases of aircraft engines. In addition, non-target screening and in vitro bioassays on aviation-related PM2.5 filter samples were combined to provide indications for potential toxicologically relevant compounds in dependence of different wind directions and airport operations. Most recently, the applied non-target screening method was also used to identify seasonal variations in the organic aerosol composition in Beijing.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die schnelle Energietransfer- (EET) und Elektronentransfer (ET)-Dynamik unterschiedlichster Quantenpunkte (QD) spektroskopisch untersucht. Die untersuchten Systeme bestanden in den meisten Fällen aus Donor-Akzeptor-Paaren, bei denen die Halbleiternanokristalle als Donor fungierten. Der Fokus lag dabei auf der gezielten Anpassung des Donors, um die optimale Funktionalität zu erreichen. Die Untersuchung der Nanokristalle erstreckte sich daher von einfachen Kernen über verschiedene Kern-Schale-Partikel bis hin zu völlig anderen Strukturen wie Nanoplatelets (NPL). Als Akzeptor wurden eine Vielzahl von Molekülen verwendet, die sich als Elektronen- und/oder Energieakzeptoren für die verschiedenen QDs eignen.
Protein kinases are key signalling molecules and transduce intracellular signals via the post-translational phosphorylation of substrate proteins, often other protein kinases. Dysregulation of this protein family has been linked to many diseases including neurodegenerative diseases, inflammation and cancer and amplifications of kinases play important roles as diagnostic biomarkers in a variety of cancers. Various strategies have been developed to treat dysregulated protein kinases. Most commonly, chemical small molecule inhibitors are used to modulate protein kinase activity in cancer cells. Many inhibitor and general research efforts have focused only on a small subset of protein kinases, resulting in a large portion of the kinome, the so-called “dark” kinome, remaining largely unexplored. As part of the strategy to develop inhibitors, it is crucial to understand the structure-activity-relationships (SAR) of small molecules to the activity towards the targets based on understanding small molecule-target affinities as determined by biophysical, biochemical, and cellular methods. However, not always do in vitro determined affinities, which are frequently used as basis for SAR considerations, correlate with the cellular affinity. For protein kinases in particular, it has been shown that the cellular concentration of the natural substrate adenosine-triphosphate (ATP) plays a critical role for the resulting small molecule affinity, as substrate and inhibitor frequently compete for the same binding site of the protein kinase. The cellular target engagement assay NanoBRET is a versatile assay that overcomes this problem and can be used to assess binding of a compound to the full-length protein kinase, in the presence of natural binding partners. Another important factor in inhibitor optimization is the selectivity of the molecule within the family of protein kinases. When comparing the selectivity profiles of small molecule kinase inhibitors in vitro and in cells, different profiles can be observed. Frequently, a compound, binds fewer protein kinases with high affinity in cells, indicating that cellular profiling of protein kinase inhibitors is necessary to understand the selectivity profile of an inhibitor.
The goal of this work was to understand cellular SARs of inhibitors for kinases and dark kinases in medicinal chemistry projects, and to understand the selectivity profiles of existing small molecules in cells, including already approved drugs and clinically used kinases inhibitors. The cellular potency and selectivity aspects guided optimization of the inhibitors towards selective small molecules ‘chemical probes’ or highly validated inhibitors with a narrow selectivity profile as part of ‘chemogenomic libraries’. One strategy to improve selectivity has been to use sterically restricted cyclic small molecules, called macrocycles, that allow fewer conformations of the molecule than their non-cyclic parent compound. In this thesis the dark kinase STK17A was investigated. Macrocyclization was used to develop a selective chemical probe molecule that is also selective in the cellular context. For another kinase, SIK2, a rational design approach was used to exclude off-targets bound by the lead structure, resulting in a chemical probe that selectively targets the SIK1/2/3 proteins. Assessing cellular potency of another series of inhibitors, a probe was developed for the PCTAIRE subfamily of the CDK kinases. This required co-expression of the binding partners of CDKs, the cyclins, in cells to obtain a functional assay. To identify new candidates for the neglected family of splicing kinases comprising the CLK, SRPK, DYRK and HIPK protein kinase subfamilies, a literature review was conducted, and the best small molecule candidates were compared for their target engagement in cells. This led to a series of small molecule inhibitors that may be used as a set or single agents to target the CLK proteins and SRPK proteins or in combination to target the remaining proteins. In search of new starting points for this subfamily of kinases, an initial screen with NanoBRET technology was performed using a library of over 2000 inhibitors, and new starting points were identified. Additionally, a set of clinical and approved small molecule kinase inhibitors was assessed for their selectivity in cells. Several highly selective molecules were identified that were much less selective in in vitro approaches. The set of data allowed for a comprehensive comparison of cellular potencies with published data using in vitro binding, in vitro activity and data obtained from cell lysates and identified several protein kinases that would need to be investigated in cells...