540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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Die Oberflächenchemie ist mittlerweile in vielen chemischen, biochemischen und anderen Forschungsbereichen präsent und stellt eine interdisziplinäre Forschungsdisziplin dar. Diese Arbeit fokussierte sich auf die Interaktionen von biochemischen Systemen mit Oberflächen, insbesondere auf die Entwicklung von biochemischen Sensoren. Die Optimierung der Sensoroberfläche, insbesondere die Erhöhung der Selektivität durch die Verwendung von Polyglycerol (PG), wurde untersucht. Insgesamt wurden vier Teilprojekte durchgeführt, die sich auf die Unterdrückung unerwünschter Interaktionen, die Einführung von Bioerkennungsstellen, die Stabilisierung von PG-Filmen und die Entwicklung eines leitfähigen Hybridmaterials konzentrierten.
Teilprojekt 1: Stabilisierung von PG-Filmen durch Quervernetzung
Im ersten Abschnitt wurde die Stabilisierung von PG-Filmen durch eine oberflächeninitiierte ringöffnende Polymerisationsreaktion auf SiOx-Substrate realisiert. Dabei wurde die Dicke der Filme (10, 50 und 100 nm) über die Reaktionszeit kontrolliert. Die Quervernetzung erfolgte mit Ethylenglycoldiglycidylether (EGDGE), Divinylsulfon (DVS), Glutaraldehyd (GA), 1,11-Di(mesyl-oxy)-3,6,9-trioxaundecan (TEG-Ms2) und 1,11-Dibrom-3,6,9-trioxaundecan (TEG-Br2). Die Wahl des Quervernetzungsmittels zeigte signifikante Auswirkungen auf die Dicke der Filme und deren Biorepulsivität. Insbesondere die Untersuchungen an PG-EGDGE-Filmen waren vielversprechend, da sie nicht nur Biorepulsivität zeigten, sondern auch eine hohe mechanische Stabilität aufwiesen. Die Erkenntnis, dass dünnere Filme mit einem höheren Elastizitätsmodul gewünscht waren, erforderte eine gezielte Auswahl des Quervernetzungsmittels.
Teilprojekt 2: Einführung einer Bioerkennungsstelle auf einem EGDGE-quervernetzten PG-Film
Im nächsten Abschnitt wurde die Einführung einer Bioerkennungsstelle auf einem EGDGE-quervernetzten PG-Film erforscht. Hierbei kam ein Nitrilotriessigsäure (NTA)-Derivat (NTA4-Cyclen) zum Einsatz, um Histidin (His)-Tag-markierte Proteine selektiv zu binden. Die Modifikation erfolgte durch die Polymerisation von Glycidol auf ein amino-terminiertes Disulfid, gefolgt von einer Quervernetzung mit EGDGE. Die optimierte Synthese des NTA-Derivats ermöglichte nicht nur die erfolgreiche Anbindung von His-markierten Proteinen, sondern auch eine quasi-reversible Anbindung. Diese Erkenntnisse eröffnen neue Möglichkeiten für die Regenerierbarkeit von biochemischen Oberflächen.
Teilprojekt 3: Entwicklung eines leitfähigen und biorepulsiven Hybridmaterials
Das dritte Teilprojekt konzentrierte sich auf die Entwicklung eines leitfähigen und biorepulsiven Hybridmaterials. Ein PG-funktionalisiertes Pyrrol-Derivat (PyPG) wurde elektrochemisch polymerisiert, wodurch Netzwerke aus PG-funktionalisierten Polypyrrol-Strängen (PPG) auf Goldoberflächen entstanden. Die Elektropolymerisation wurde detailliert durch Cyclovoltammetrie (CV) und einer Quarzkristall-Mikrowaage (QCM) charakterisiert. Dabei konnte ein selbstterminierender Mechanismus identifiziert werden, der von der Anwesenheit der verzweigten PG-Gruppen dominiert wird. Mit Hilfe der elektrochemischen Impedanzspektroskopie (EIS) wurde gezeigt, dass dünnere Schichten mit geringerer Schichtdicke hoch leitfähig sind und dass die Veränderungen der Leitfähigkeit tatsächlich nur durch die äußere Oberflächenschicht bestimmt wird. Die Biorepulsivität des Materials wurde durch Proteinadsorptions- und Bakterienadhäsions-Assays nachgewiesen. Der zweite Abschnitt dieses Projekts konzentrierte sich auf die Einführung einer Erkennungsstelle basierend auf Glycosiden, um nicht nur eine Oberflächenbindung, sondern auch eine Quantifizierung von Biomolekülen zu ermöglichen. Die elektrochemische Charakterisierung der Nanoschichtsysteme zeigte eine sehr gute Linearität der Ladungsübertragungsadmittanz (Sct) in Abhängigkeit von der Anbindung der Bakterienstämme. Dies eröffnet Perspektiven für die selektive Quantifizierung von biologischen Analyten mittels elektrochemischer Methoden.
Die Wunder-Moleküle
(2024)
Wie speichern wir in Zukunft Sonnenenergie? An der Goethe-Universität wird eine ganz neue Technologie erforscht. Am Projekt FORMOST sind neben der Universität Frankfurt noch die Universitäten in Tübingen, Gießen, Heidelberg und Erlangen-Nürnberg beteiligt. Wachtveitls Gruppe erforscht die molekularen Mechanismen der Energiespeicherung und -freisetzung bei MOST-Molekülen. Andere Gruppen kümmern sich um die Synthese der Moleküle oder die Modellierung. Das Projekt läuft von 2023 bis 2027 und wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) mit insgesamt rund 4,8 Millionen Euro gefördert.
The β-barrel assembly machinery (BAM) mediates the folding and insertion of the majority of outer membrane proteins (OMPs) in gram-negative bacteria. BAM is a penta-heterooligomeric complex consisting of the central β-barrel BamA and four interacting lipoproteins BamB, C, D, and E. The conformational switching of BamA between inward-open (IO) and lateral-open (LO) conformations is required for substrate recognition and folding. However, the mechanism for the lateral gating or how the structural details observed in vitro correspond with the cellular environment remains elusive. In this study, we addressed these questions by characterizing the conformational heterogeneity of BamAB, BamACDE, and BamABCDE complexes in detergent micelles and/or Escherichia coli using pulsed dipolar electron spin resonance spectroscopy (PDS). We show that the binding of BamB does not induce any visible changes in BamA, and the BamAB complex exists in the IO conformation. The BamCDE complex induces an IO to LO transition through a coordinated movement along the BamA barrel. However, the extracellular loop 6 (L6) is unaffected by the presence of lipoproteins and exhibits large segmental dynamics extending to the exit pore. PDS experiments with the BamABCDE complex in intact E. coli confirmed the dynamic behavior of both the lateral gate and the L6 in the native environment. Our results demonstrate that the BamCDE complex plays a key role in the function by regulating lateral gating in BamA.
Lipopolysaccharides (LPS) confer resistance against harsh conditions, including antibiotics, in Gram-negative bacteria. The lipopolysaccharide transport (Lpt) complex, consisting of seven proteins (A-G), exports LPS across the cellular envelope. LptB2FG forms an ATP-binding cassette transporter that transfers LPS to LptC. How LptB2FG couples ATP binding and hydrolysis with LPS transport to LptC remains unclear. We observed the conformational heterogeneity of LptB2FG and LptB2FGC in micelles and/or proteoliposomes using pulsed dipolar electron spin resonance spectroscopy. Additionally, we monitored LPS binding and release using laser-induced liquid bead ion desorption mass spectrometry. The β-jellyroll domain of LptF stably interacts with the LptG and LptC β-jellyrolls in both the apo and vanadate-trapped states. ATP binding at the cytoplasmic side is allosterically coupled to the selective opening of the periplasmic LptF β-jellyroll domain. In LptB2FG, ATP binding closes the nucleotide binding domains, causing a collapse of the first lateral gate as observed in structures. However, the second lateral gate, which forms the putative entry site for LPS, exhibits a heterogeneous conformation. LptC binding limits the flexibility of this gate to two conformations, likely representing the helix of LptC as either released from or inserted into the transmembrane domains. Our results reveal the regulation of the LPS entry gate through the dynamic behavior of the LptC transmembrane helix, while its β-jellyroll domain is anchored in the periplasm. This, combined with long-range ATP-dependent allosteric gating of the LptF β-jellyroll domain, may ensure efficient and unidirectional transport of LPS across the periplasm.
In spite of the increasing number of biologics license applications, the development of covalent inhibitors is still a growing field within drug discovery. The successful approval of some covalent protein kinase inhibitors, such as ibrutinib (BTK covalent inhibitor) and dacomitinib (EGFR covalent inhibitor), and the very recent discovery of covalent inhibitors for viral proteases, such as boceprevir, narlaprevir, and nirmatrelvir, represent a new milestone in covalent drug development. Generally, the formation of covalent bonds that target proteins can offer drugs diverse advantages in terms of target selectivity, drug resistance, and administration concentration. The most important factor for covalent inhibitors is the electrophile (warhead), which dictates selectivity, reactivity, and the type of protein binding (i.e., reversible or irreversible) and can be modified/optimized through rational designs. Furthermore, covalent inhibitors are becoming more and more common in proteolysis, targeting chimeras (PROTACs) for degrading proteins, including those that are currently considered to be ‘undruggable’. The aim of this review is to highlight the current state of covalent inhibitor development, including a short historical overview and some examples of applications of PROTAC technologies and treatment of the SARS-CoV-2 virus.
The impact of 2-desaza-annomontine on processes of inflammation and its resolution in leukocytes
(2024)
This present study investigated the effects of the b-carboline derivative C81, also called 2-desaza-annomontine, on the inflammatory response and resolution processes in vivo and in vitro. The study focused on leukocytes and on the elucidation of the underlying pharmacological mode of action. C81 potently reduced the inflammatory response in an imiquimod-induced psoriasis mouse model and additionally resolved the inflammation more quickly. In a CNV model, C81 significantly decreased the microglial infiltration in the inflamed laser lesion in vivo. In vitro experiments revealed that C81 inhibits the migration of macrophages and leukocyte-endothelial cell interaction by reducing the activation of integrins on leukocytes, in particular LFA-1, without affecting the total protein level on the cell surface.
Further experiments revealed that C81 inhibited the expression of EPAC-1, required for Rap1 activation. Consequently, C81 reduced the LPS/PMA-induced Rap1 activity, which is responsible for integrin activation. Moreover, C81 potently reduced the LPS-induced formation of pro-inflammatory mediators, including cytokines and eicosanoids, in macrophages. The C81-derived inhibition of eicosanoid release was surprisingly potent, probably due to the C81-evoked inhibition of cPLA2 expression, resulting in less liberated arachidonic acid, the precursor for eicosanoids. At the same time, C81 only delayed COX-2 expression, but completely diminished LPS-induced mPGES-1 expression. In addition to the potent anti-inflammatory effects in vitro, C81-derived impact was complemented with promising pro-resolving effects. Hence, C81 significantly induced neutrophil apoptosis without affecting the cell viability of other leukocytes, such as macrophages. Accordingly, the caspase 3 activity in neutrophils increased upon C81 treatment. The underlying mechanism altered by C81 was the expression of the anti-apoptotic mediator Mcl-1, which is required for the survival of neutrophils, but not macrophages. Furthermore, neutrophils treated with C81 were significantly better efferocytosed by macrophages. Analyzes of the pharmacological mode of action of C81 revealed DYRK1B as the key target kinase in inflammatory processes in leukocytes. Of note, experiments with pharmacological inhibition of DYRK1B by C81 or the ‘selective’ DYRK1B inhibitor AZ-DYRK1B-33, could not completely exclude the involvement of the CLKs and other DYRKs. Therefore, DYRK1B knockdown and overexpression experiments were conducted to elucidate the impact of DYRK1B alone. Pharmacological inhibition of DYRK1B and DYRK1B knockdown phenocopied the inhibitory effect of C81 on leukocyte adhesion. In parallel, DYRK1B overexpression mitigated the C81-evoked effect, supporting the hypothesis that C81 inhibits DYRK1B to mediate its effects on leukocytes. Furthermore, DYRK1B inhibition and DYRK1B knockdown resulted in depletion of STAT3 phosphorylation. In addition, C81-evoked STAT3 inhibition was again mitigated by DYRK1B overexpression, suggesting a link or even an interaction between DYRK1B and STAT3. Indeed, direct interaction between DYRK1B and STAT3 was confirmed by a NanoBRET assay. Importantly, in vitro experiments demonstrated, that C81 did not affect LPS recognition mechanisms, investigated by TLR-4 and CD14 expression, and other important inflammatory signaling pathways. Although C81 inhibited the regeneration of IkBa, this had no effect on the translocation of the NFkB subunit p65. Furthermore, C81 did not alter the activation of MAPK pathways, including p38, JNK and ERK. As a result, the focus was on the potent inhibition of LPS-nduced STAT3 activation mediated by DYRK1B, which was shown to be IL-6 independent. Indeed, direct STAT3 inhibition by Stattic phenocopied all tested C81-derived effects on leukocytes, including migration, adhesion, pro-inflammatory cytokine expression, eicosanoid formation and cell type specific induction of neutrophil apoptosis. The underlying mechanisms altered by Stattic in terms of migration/adhesion and lipid mediator formation were the same as for C81. STAT3 inhibition led to decreased EPAC1 expression and accordingly to reduced Rap1 activation. In addition, inhibited STAT3 phosphorylation resulted in reduced cPLA2 expression and also in attenuated mPGES-1 expression.
Finally, the C81-derived depleted Mcl-1 expression was linked to reduced STAT3 inhibition. As C81 abolished STAT3 phosphorylation, less STAT3 was translocated into the nucleus upon LPS stimulation and less STAT3 enrichment at the MCL1 promoter was observed, leading to reduced gene expression and consequently protein levels.
In summary, using the natural product-derived compound C81, the DYRK1B/STAT3 axis was identified as a novel key regulator of inflammatory processes in human leukocytes. This present study revealed that interfering with the DYRK1B-STAT3 signaling can address essential cell functions including leukocyte extravasation, pro-inflammatory mediator release, neutrophil apoptosis and efferocytosis (Figure 1). Furthermore, two different mouse models demonstrated the in vivo relevance of this signaling axis and highlight DYRK1B as an important kinase modulating inflammation and resolution.
In integrative structural biology/hybrid modeling approaches, we integrate structural models of macromolecules and experimental data to obtain faithful representations of the structures underlying the data. For example, in ensemble refinement by reweighting we first generate structural ensembles of flexible and dynamic biological macromolecules in molecular simulations. In a subsequent reweighting step, we refine the statistical weights of the structures to strike a balance between the information provided by simulations and by experimental data. For the "Bayesian inference of ensembles" approach (BioEn), we present two complementary methods to solve the underlying challenging high-dimensional optimization problem. We systematically investigate reliability, accuracy, and efficiency of these methods and integrate molecular dynamics simulations of the disordered peptide Ala-5 and NMR J-couplings. We provide an open-source library free of charge at https://github.com/bio-phys/BioEn.
In integrative structural biology/hybrid modeling approaches, we integrate structural models of macromolecules and experimental data to obtain faithful representations of the structures underlying the data. For example, in ensemble refinement by reweighting we first generate structural ensembles of flexible and dynamic biological macromolecules in molecular simulations. In a subsequent reweighting step, we refine the statistical weights of the structures to strike a balance between the information provided by simulations and by experimental data. For the "Bayesian inference of ensembles" approach (BioEn), we present two complementary methods to solve the underlying challenging high-dimensional optimization problem. We systematically investigate reliability, accuracy, and efficiency of these methods and integrate molecular dynamics simulations of the disordered peptide Ala-5 and NMR J-couplings. We provide an open-source library free of charge at https://github.com/bio-phys/BioEn.
Ensemble refinement produces structural ensembles of flexible and dynamic biomolecules by integrating experimental data and molecular simulations. Here we present two efficient numerical methods to solve the computationally challenging maximum-entropy problem arising from a Bayesian formulation of ensemble refinement. Recasting the resulting constrained weight optimization problem into an unconstrained form enables the use of gradient-based algorithms. In two complementary formulations that differ in their dimensionality, we optimize either the log-weights directly or the generalized forces appearing in the explicit analytical form of the solution. We first demonstrate the robustness, accuracy, and efficiency of the two methods using synthetic data. We then use NMR J-couplings to reweight an all-atom molecular dynamics simulation ensemble of the disordered peptide Ala-5 simulated with the AMBER99SB*-ildn-q force field. After reweighting, we find a consistent increase in the population of the polyproline-II conformations and a decrease of α-helical-like conformations. Ensemble refinement makes it possible to infer detailed structural models for biomolecules exhibiting significant dynamics, such as intrinsically disordered proteins, by combining input from experiment and simulation in a balanced manner.
A system of two coumarin-based caging groups is presented – one absorbing in the blue (400–450 nm) and the other absorbing in the green (480–550 nm) part of the visible spectrum. Together they form a pair, which allows to selectively photoactivate the one or the other in oligonucleotides. A numerical characterization defining the term “chromatic selectivity” was proposed, and it was shown how chromatically selective uncaging can literally be titrated in a kinetic reaction scheme.
Four different structural models, which all fit the same X-ray powder pattern, were obtained in the structure determination of 4,11-difluoroquinacridone (C20H10N2O2F2) from unindexed X-ray powder data by a global fit. The models differ in their lattice parameters, space groups, Z, Z′, molecular packing and hydrogen bond patterns. The molecules form a criss-cross pattern in models A and B, a layer structure built from chains in model C and a criss-cross arrangement of dimers in model D. Nevertheless, all models give a good Rietveld fit to the experimental powder pattern with acceptable R-values. All molecular geometries are reliable, except for model D, which is slightly distorted. All structures are crystallochemically plausible, concerning density, hydrogen bonds, intermolecular distances etc. All models passed the checkCIF test without major problems; only in model A a missed symmetry was detected. All structures could have probably been published, although 3 of the 4 structures were wrong. The investigation, which of the four structures is actually the correct one, was challenging. Six methods were used: (1) Rietveld refinements, (2) fit of the crystal structures to the pair distribution function (PDF) including the refinement of lattice parameters and atomic coordinates, (3) evaluation of the colour, (4) lattice-energy minimizations with force fields, (5) lattice-energy minimizations by two dispersion-corrected density functional theory methods, and (6) multinuclear CPMAS solid-state NMR spectroscopy (1H, 13C, 19F) including the comparison of calculated and experimental chemical shifts. All in all, model B (perhaps with some disorder) can probably be considered to be the correct one. This work shows that a structure determination from limited-quality powder data may result in totally different structural models, which all may be correct or wrong, even if they are chemically sensible and give a good Rietveld refinement. Additionally, the work is an excellent example that the refinement of an organic crystal structure can be successfully performed by a fit to the PDF, and the combination of computed and experimental solid-state NMR chemical shifts can provide further information for the selection of the most reliable structure among several possibilities.
Emissions of the potent greenhouse gas perfluorocyclobutane (c-C4F8, PFC-318, octafluorocyclobutane) into the global atmosphere inferred from atmospheric measurements have been increasing sharply since the early 2000s. We find that these inferred emissions are highly correlated with the production of hydrochlorofluorocarbon-22 (HCFC-22, CHClF2) for feedstock (FS) uses, because almost all HCFC-22 FS is pyrolyzed to produce (poly)tetrafluoroethylene ((P)TFE) and hexafluoropropylene (HFP), a process in which c-C4F8 is a known by-product, causing a significant fraction of global c-C4F8 emissions. We find a global emission factor of ∼0.003 kg c-C4F8 per kilogram of HCFC-22 FS pyrolyzed. Mitigation of these c-C4F8 emissions, e.g., through process optimization, abatement, or different manufacturing processes, such as refined methods of electrochemical fluorination and waste recycling, could reduce the climate impact of this industry. While it has been shown that c-C4F8 emissions from developing countries dominate global emissions, more atmospheric measurements and/or detailed process statistics are needed to quantify c-C4F8 emissions at country to facility levels.
The evolution of cell-free protein synthesis (CFPS) over recent decades has made it a widely used system for expressing membrane proteins (MPs). Unlike traditional methods, CFPS allows direct and translocon-independent expression of MPs within lipid membranes, such as liposomes or nanodiscs (NDs), without the need for detergent solubilization. This open nature of CF systems enables customization of the experimental environment, including expression conditions, choice of nanoparticles (NPs), lipid composition, and addition of stabilizing molecules.
Membrane scaffold protein (MSP)-based NDs emerged as a gold standard for cotranslational solubilization of MPs using the CF-system. This approach allowed not only biochemical characterization, but also structural studies of MPs and even GPCRs. However, to solubilize MPs inside nanoparticles via the traditional reconstitution route, apart from MSPs other scaffolds were successfully implemented, e.g. the saposin A (commercially known as Salipro) scaffold system or the synthetic styrene maleic acid lipid particles (SMALPs). In this study the potential of saposin A-based nanoparticles (SapNPs) was explored for cotranslational MP solubilization.
Three strategies for applying SapNPs in CF systems were investigated: preassembly, (i) coassembly (ii), and coexpression (iii). (i) Preassembly involved forming SapNPs before CF expression and adding them to the CF reaction. In coassembly mode SapA and lipids were mixed in the CF reaction for spontaneous assembly with the synthesized MP. In coexpression mode lipids were added to the CF reaction while coexpressing SapA with the MP target. Proteorhodopsin (PR) served as a model protein to evaluate these strategies due to its ability to oligomerize and straightforward quantification using the cofactor retinal. Preassembled SapNPs provided homogeneous, aggregate-free particles yielding up to 200 µM solubilized PR inside in the CF reaction. Coassembly was also successfully applied to produce PR/SapNP complexes at slightly lower yields, however the system was prone to produce soluble aggregates at too high PR template concentrations and overall needed more adjustments. Coexpression resulted in PR yields below 20 µM and was not considered viable for MP production. Finally, the preassembled SapNPs were used to produce functional G-protein coupled receptor probes. Despite lower overall performance compared to MSP-based systems, SapNPs showed potential as an alternative in CF systems for specific MPs.
The second optimization approach was directed at the CF lysate itself. CF synthesis for NMR analysis benefits from selective labeling schemes enabled by truncated amino acid (AA) metabolic pathways in lysates, reducing spectral ambiguity. However, residual enzymatic AA conversions persist, leading to label dilution and ambiguous NMR spectra. This study aimed to eliminate these residual activities in the E. coli A19 strain, generating optimized CF lysates for NMR applications.
The approach involved cumulative gene deletions of the most problematic scrambling enzymes. The new strain, “Stablelabel,” included deletions and modifications in genes asnA, ansA, ansB, glnA, aspC, and ilvE, effectively eliminating background activities of L-Asn, L-Asp, and conversions of L-Glu to L-Asp and L-Gln. However, residual conversion of L-Gln to L-Glu persisted due to glutaminase activity of several glutaminases using the inhibitor 6 diazo-5-oxo-L-norleucine (DON). Stablelabel showed a slightly slower growth than A19, and an overall good performance with 2.7 mg/mL GFP expressed in the reaction mixture (RM) compared to the parental A19 strain with 3.5 mg/mL. Furthermore, the strain was successfully applied to demonstrate methyl group labeling of MPs using preconverted L-val and L-leu from their respective precursors 2-ketoisovalerate and 4-methyl-2-oxovalerate.
In this study, lipid nanoparticle particle-and strain engineering vividly demonstrated the potential of CFPS systems and their versatility. While the SapNP system requires further engineering to potentially reach the efficiency of the well-studied MSP NDs, this study provides an example of nanoparticle characterization allowing new insights into NP behavior in CF systems. Furthermore, it was shown that strain engineering is a straightforward solution to tailor CF lysates to the individual requirements. After this thesis was submitted, Stablelabel in fact was successfully applied for backbone assignment of casein kinase 1, thereby demonstrating its suitability to express complex targets for NMR studies.
The archaeal ATP synthase is a multisubunit complex that consists of a catalytic A(1) part and a transmembrane, ion translocation domain A(0). The A(1)A(0) complex from the hyperthermophile Pyrococcus furiosus was isolated. Mass analysis of the complex by laser-induced liquid bead ion desorption (LILBID) indicated a size of 730 +/- 10 kDa. A three-dimensional map was generated by electron microscopy from negatively stained images. The map at a resolution of 2.3 nm shows the A(1) and A(0) domain, connected by a central stalk and two peripheral stalks, one of which is connected to A(0), and both connected to A(1) via prominent knobs. X-ray structures of subunits from related proteins were fitted to the map. On the basis of the fitting and the LILBID analysis, a structural model is presented with the stoichiometry A(3)B(3)CDE(2)FH(2)ac(10).
A plethora of modified nucleotides extends the chemical and conformational space for natural occurring RNAs. tRNAs constitute the class of RNAs with the highest modification rate. The extensive modification modulates their overall stability, the fidelity and efficiency of translation. However, the impact of nucleotide modifications on the local structural dynamics is not well characterized. Here we show that the incorporation of the modified nucleotides in tRNAfMet from Escherichia coli leads to an increase in the local conformational dynamics, ultimately resulting in the stabilization of the overall tertiary structure. Through analysis of the local dynamics by NMR spectroscopic methods we find that, although the overall thermal stability of the tRNA is higher for the modified molecule, the conformational fluctuations on the local level are increased in comparison to an unmodified tRNA. In consequence, the melting of individual base pairs in the unmodified tRNA is determined by high entropic penalties compared to the modified. Further, we find that the modifications lead to a stabilization of long-range interactions harmonizing the stability of the tRNA’s secondary and tertiary structure. Our results demonstrate that the increase in chemical space through introduction of modifications enables the population of otherwise inaccessible conformational substates.
Fluorescence microscopy has significantly impacted our understanding of cell biology. The extension of diffraction-unlimited super-resolution microscopy opened an observation window that allows for the scrutiny of cellular organization at a molecular level. The non-invasive nature of visible light in super-resolution microscopy methods renders them suitable for observations in living cells and organisms. Building upon these advancements, a promising synergy between super-resolution fluorescence microscopy and deep learning becomes evident, extending the capabilities of the imaging methods. Tasks such as image modality translation, restoration, single-molecule fitting, virtual labeling, spectral demixing, and molecular counting, are enabled with high precision. The techniques explored in this thesis address three critical facets in advanced microscopy, namely the reduction in image acquisition time, saving photon budget during measurement, and increasing the multiplexing capability. Furthermore, descriptors of protein distributions and their motion on cell membranes were developed.
Die Verwendung von Photoschaltern zur gezielten Kontrolle von Systemen birgt ein hohes Potential hinsichtlich biologischer Fragestellungen, bis hin zu optoelektronischen Anwendungen. Infolge einer Photoanregung kommt es zu Geometrieänderungen, die einen erheblichen Einfluss auf ihr photophysikalisches Verhalten haben. Die Änderungen der photochemischen, wie photophysikalischen Eigenschaften, beruht entweder auf der Isomerisierung von Doppelbindungen oder auf perizyklischen Reaktionen. Durch sorgfältige Modifikationen, wie beispielsweise die Änderung der Konjugation durch unterschiedlich große π-Elektronensysteme, der Molekülgeometrie oder der Veränderung des Dipolmoments, lassen sich intrinsische Funktionen variieren.
Die Kombination dieser Eigenschaften stellt eine komplexe Herausforderung dar, da diese Änderungen einen direkten Einfluss auf wichtige Charakteristika wie die Adressierbarkeit, die Effizienz und die Stabilität der Moleküle haben. Darüber hinaus spielt die thermische Stabilität eine erhebliche Rolle im Hinblick auf die Speicherung von Energie oder Informationen für Anwendungsbereiche in der Energiegewinnung und Datenverarbeitung.
Für die Anwendung solcher photochromen Moleküle ist hinsichtlich der oben genannten Eigenschaften auch das Wissen über den photoinduzierten Reaktionsmechanismus unabdingbar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik organischer Photoschalter durch unterschiedliche Modifikationen mittels stationärer und zeitaufgelöster Spektroskopie untersucht. Im Bereich der Merocyanine konnte ein Derivat vorgestellt werden, das ausschließlich zwischen zwei MC-Formen (trans/cis) isomerisiert. Die interne Methylierung am Phenolatsauerstoff der Chromeneinheit verhindert die Ringschlussreaktion zum SP und somit seinen zwitterionischen Charakter. Die stabilen Grundzustandsisomere TTT und CCT weisen durch den Methylsubstituenten eine hypsochrome Verschiebung ihrer Absorptionsmaxima auf, während TTT das thermodynamisch stabilste Isomer darstellt. Das MeMC wies eine erstaunlich hohe Effizienz seiner Schaltamplituden, insbesondere der TTT → CCT Photoisomerisierung auf, sowie eine überaus hohe Quantenausbeute.
Das MeMC wies zudem eine signifikante Lösungsmittelabhängigkeit auf, die sich insbesondere in der Photostabilität bemerkbar macht. Während das MeMC in MeCN und EtOH photodegradiert, konnte in EtOH/H2O eine konstante Reliabilität festgestellt werden. Diese Zuverlässigkeit impliziert nicht nur eine Stabilisierung durch das Wasser, sondern auch eine Resistenz gegenüber Hydrolysereaktionen. Darüber hinaus konnten kinetische Studien eine hohe thermische Rückkonversion von CCT zu TTT bei Raumtemperatur nachweisen, womit auf schädliche UV-Bestrahlung verzichtet werden könnte.
Die Untersuchung der Kurzzeitdynamiken beider Grundzustandsisomere gab Aufschluss über die Beteiligung anderer möglicher MC-Intermediate und den Einfluss der Methylgruppe auf das System. Mittels quantenchemischer Berechnungen konnte eine erste Initiierung um die zentrale Doppelbindung beider Isomere bestimmt werden, die jeweils zu einem heißen Grundzustandsintermediat führt, bis nach einer zweiten Isomerisierung der endgültige Grundzustand der Photoprodukte populiert wird. Dies bedeutet, dass die trans/cis-Isomerisierung über TTT-TCT-CCT und die Rückkonversion über CCT-CTT-TTT erfolgt.
Im Bereich der Hydrazon-Photoschalter konnten unterschiedlich substituierte Derivate mittels statischer und zeitaufgelösten UV/Vis-Studien untersucht werden. Da ESIPT Prozesse eine wichtige Funktion bei der Kontrolle von biologischen Systemen spielen, wurden verschiedene Hydrazonderivate hinsichtlich ihrer Reaktionsmechanismen untersucht. Als Rotoreinheit diente zum einen eine Benzothiazolkomponente, die die interne H-Bindung des angeregten Z-Hydrazons schwächen sollte und zum anderen wurde ein Chinolinsubstituent eingesetzt, der als Elektronenakzeptor diente und den H-Transfer begünstigt. Der Einsatz der Benzothiazolkomponente bewirkte die gewünschte Vergrößerung der bathochromen Verschiebung des E-Isomers, sowie eine deutliche Erhöhung der thermischen Stabilität des metastabilen
Zustands. Dies bestätigten die zeitaufgelösten Studien der Z zu E Isomerisierung, bei denen die Isomere im Vergleich zum Chinolinhydrazonderivat, in beiden ausgewählten Lösungsmitteln metastabile Z-Intermediate zeigten und eine Lebenszeit bis in den µs-Zeitbereich aufwiesen. Die Rückreaktion beider Derivate (HCN) und (HBN) hingegen zeigte eine barrierelose Umwandlung in die beteiligten Photoprodukte. Trotz der Verwendung des Chinolinsubstituenten zusammen mit Naphthalin als Rotoreinheit (HCN), konnte kein ESIPT Prozess beobachtet werden. HCB mit einer Kombination aus einem Chinolinrotor und eines Benzothiazolsubstituenten, wies eine Hydrazon-Azobenzol-Tautomerie auf, die ein prototropes Gleichgewicht zwischen dem E-Hydrazon und der E-Azobenzolform (E-AB) ausbildete. Die Reaktionsdynamiken des Z-Hydrazons zum E-AB wiesen eine ultraschnelle Bildung des Photoproduktes auf, während die Rückreaktion über einen ESIPT im sub-ps-Bereich erfolgte. Dieser H-Transfer hat die Bildung des angeregten E-Hydrazons zur Folge. Interessanterweise wurde kein Rückprotonentransfer nachgewiesen, sondern die mögliche Formation eines Z-AB gefunden. Damit unterscheidet sich dieser Reaktionsmechanismus erheblich von den typischen ESIPT Prozessen, die normalerweise zu ihrem Ausgangsmolekül zurückrelaxieren. Des Weiteren konnte ein Pyridinoxid und Benzoylpyridin-substituiertes Hydrazon charakterisiert werden, bei denen die stationären Studien kein Schaltverhalten, sondern Photodegradation aufwiesen. Die zeitaufgelösten Daten ergaben ebenfalls keine Photoproduktbildung, was die These der Photozersetzung unterstützt. Die Verwendung von zusätzlich substituierten Rotoreinheiten, wie beispielsweise Pyridinoxid und Benzoylpyridin, die aufgrund fehlender Protonenakzeptormöglichkeit keine interne H-Bindung ausbilden, erlaubt keine Bildung des Z-Hydrazon Isomers.
Optimierung der Synthese eines neuen photolabil geschützten Nitroxid-Spin-Labels für RNA und DNA
(2023)
Im Rahmen dieser Arbeit konnte, ausgehend von den günstigen Ausgangsverbindungen Desoxyadenosin und Phthalsäureanhydrid, ein neues photolabil geschütztes Nukleotid 1 und sein Dummypartner 2 synthetisiert werden. Positiv zu bemerken ist, dass einige Schritte im Vergleich zu ähnlichen literaturbekannten Reaktionen in Einfachheit, Reinheit oder Ausbeute verbessert wurden. So konnte die Ausbeute der wichtigen Umwandlung des Amins 46 zum Iodid 47 durch den Ersatz des vorherigen DCM/DIM Gemisches durch reines DIM von 15 % auf akzeptable 50 % erhöht werden, was nicht nur Zeit, sondern auch zukünftige Chemikalienmengen einspart. Nicht nur hierbei, sondern auch bei der Nitrierung zu 61 oder auch der Oxidierung zu 63 war es von äußerster Wichtigkeit eine korrekte Temperaturkontrolle durchzuführen, da es sonst zu hohen Ausbeuteverlusten durch ungewollte Nebenreaktionen kommen konnte. Eine sehr interessante Beobachtung war die Kontrolle der Suzuki Miyaura-Kreuzkupplung durch die Anwendung verschieden starker Basen. Während schwache Basen wie KOAc nur zur Miyaura-Borilierung führten, begünstigten starke Basen wie K3PO4 die Suzuki Miyaura-Kreuzkupplung. Die Zusammenführung des Zucker Bausteins 36 und des Isoindolin-Bausteins 37 funktionierte sehr gut, sodass das Nukleotid 1 durch die Schützung der exozyklischen Amingruppe und Phosphorylierung des 3´-OH dargestellt werden konnte.
Die Synthese der 14mer DNA bzw. RNA Sequenzen mit den neuen Nukleotiden 1 und 2 funktionierten mit zufriedenstellenden Ausbeuten, nur die Abspaltung der Pac-Gruppe benötigte etwas harschere Bedingungen von 50 °C in 32 % Ammoniak über Nacht. Die photolabile Schutzgruppe in Strang (V) mDNA-Tetramethyl konnte nun abgespalten und das Nitroxid an Luft reoxidiert werden. Anhand von EPR-Spektren und einer HPLC Analyse ergab sich jedoch eine Abspalteffizienz von nur 70 %. Dies bedeutet, dass für künftige PELDOR Messungen eine Aufreinigung des Spaltgemisches zur Isolierung des Radikal-Strangs von Nöten ist.
Anhand des Schmelzpunkts der verschiedenen Duplexe wurde anschließend die mögliche Anwendung des Nukleotids weiter analysiert. Hierbei stellte sich heraus, dass der Benzolring sowohl in 2 als auch in 1 eine erhebliche Destabilisierung des Duplex erzeugte. Somit ist das neue photolabil geschützte Nukleotid als EPR Sonde in der Mitte von Sequenzen nur bedingt geeignet. Zukünftige Experimente könnten das neue Spin Label nicht in der Mitte, sondern an den Enden der Sequenzen ähnlich anderer Arbeiten[92,94,164] einbauen, wo die Destabilisierung eine geringere Auswirkung hat, oder die Sequenz für eine bessere Stabilisierung verlängern.[164] Bei ausreichenden Duplexstabilitäten könnten hiermit dann PELDOR Messungen durchgeführt werden. Ähnlich starre, sterisch anspruchsvolle Nukleotide zeigten auch ähnliche Schmelzpunkte für ihre Duplexe[120], dennoch wurden sie für weitere Markierungsexperimente verwendet. Hierbei handelte es sich jedoch nicht um EPR Sonden, sondern um Fluoreszenzmarker. Da auch das neue Spin-Label 1 ein großes π-System besitzt, könnte eine komplett neue Herangehensweise die Anwendung als Fluoreszenzmarker sein. Genaue Absorptionsmessungen müssten noch durchgeführt werden, jedoch zeigte das Spin Label sehr stark fluoreszierende Eigenschaften unter der UV-Lampe während der Säulenchromatographie. Hierbei würde die Synthese um einiges kürzer ausfallen, da das EPR-aktive Nitroxid nicht mehr benötigt wird und geschützt werden muss, was Zeit und Chemikalien spart.
Zusammenfassend wurde über eine 22-stufige Synthese ein neues photolabil geschütztes Spin-Label synthetisiert, in ein 14mer integriert, erfolgreich entschützt und mittels EPR-Spektroskopie vermessen. Schmelzpunktmessungen zeigten jedoch eine große Destabilisierung und deuten darauf hin, dass 1 und Nukleotide mit ähnlich Benzolringen nur eingeschränkt als EPR-aktive Nukleotide geeignet sind.
Thermally stable and highly conductive SAMs on Ag substrate — the impact of the anchoring group
(2021)
Self-assembled monolayers (SAMs) on metal substrates are an important part of modern interfacial chemistry and nanotechnology. The robustness of SAMs strongly depends on their thermal stability, which, together with electric conductivity, crucial for their applications in molecular/organic electronics. In this context, using a multidisciplinary approach, the structure, stability, and conductivity properties of conjugated aromatic SAMs featuring the naphthalene backbone and S, Se, or COO group, mediating bonding to the Ag substrate are addressed. Whereas thermal stability of these SAMs exhibits a strong dependence on anchoring group, their conductivity is similar, which is rationalized by tentative model considering redistribution of charge density along the molecular framework. The thermal stability of model naphthalenethiol SAM, emphasized by desorption energy of ≈1.69 eV, is better than that of typical N-heterocyclic carbene (NHC) monolayers considered currently as the most stable SAMs on metal substrates. However, in contrast to NHC SAMs, which are highly insulating, the naphtalene-based SAM, with S, Se or COO anchoring groups, are highly conductive, even in comparison with analogous oligophenyl SAMs (by a factor of 10). A unique combination of the ultimate thermal stability and superior conductivity for the naphthalenethiol SAM on Ag makes it highly attractive for applications.