540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Bindung kleiner Moleküle an das Zellzyklusprotein CDC25A
(2010)
Viele verschiedene Funktionen der Zelle werden durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen reguliert. Die reversible Phosphorylierung der OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der Möglichkeiten die Aktivität von Proteinen an- und abzuschalten und Interaktion mit Bindungspartnern zu ermöglichen oder zu verhindern. Die Phosphatase CDC25A übernimmt eine zentrale Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, unterliegt selbst wiederum einer differenzierten Kontrolle durch Änderung des Expressionslevel, Phosphorylierung und Lokalisation innerhalb der Zelle. Da eine Überfunktion von CDC25A mit einer Vielzahl von verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert ist, wird die Entwicklung starker und selektiver Inhibitoren, die auch in vivo wirksam sind, vorangetrieben. Die strukturellen Grundlagen selektiver Inhibition sind allerdings noch unzureichend erforscht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine erfolgreiche Durchführung von NMR-Experimenten gelegt, für die Proteinproben mit hoher Konzentration und Langzeitstabilität benötigt werden. CDC25A kann nicht in der vollen Länge exprimiert werden und wäre als Vollkonstrukt auch zu groß, um effektiv per NMR untersuchbar zu sein. Durch Erzeugung diverser Konstrukte der katalytischen Domäne von CDC25A konnte ein Expressionslevel erreicht werden, der die Erzeugung ausreichender Mengen an Protein praktikabel macht. Neben des oftmals geringen Expressionslevels ist ein weiteres Problem bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen vieler Phosphatasen deren geringe Stabilität während der Aufreinigung und in der endgültigen Probe. Durch Optimierung der Pufferbedingungen für den Zellaufschluss in Bezug auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Kations per „Incomplete Factorial Design“ konnte die Ausbeute an löslichem Protein erheblich gesteigert werden. Die Verwendung dieser Pufferbedingungen während der ersten Aufreinigungsschritte verminderte auch die Tendenz des Proteins während der Chromatografie auszufallen. Die Zusammensetzung des Puffers für die endgültige NMR-Probe wurde schließlich durch das aus der Kristallografie entlehnte Verfahren der Dampfdiffusion ebenso in Hinblick auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Anions optimiert. Unter diesen optimierten Pufferbedingungen wurde die katalytische Aktivität des Proteinkonstrukts anhand der Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Acht Substanzen wurden auf Inhibition dieser katalytischen Aktivität getestet. Das natürliche Substrat Phosphotyrosin zeigte eine kompetitive Hemmung, zwei starke und ein schwacher Inhibitor zeigten entsprechend verminderte Reaktionsraten. Von den restlichen 4 Substanzen (Inhibitoren anderer Protein-Tyrosin-Phosphatasen und strukturelle Verwandte) zeigten 3 weitere eine starke Wirkung. Diese hohe Promiskuität gegenüber Inhibitoren stellt ein großes Problem für die strukturgetriebene Wirkstoffentwicklung bei CDC25A und generell aller Phosphatasen dar. Nach Erhalt der fertigen Proben zeigten erste 2D-NMR-Spektren eine geringer als zu erwartende Zahl von Signalen und starke Überlappungen der sichtbaren Signale. Um auszuschließen, das Dimerisierung oder unspezifische Aggregation hierfür verantwortlich sind, wurden DOSY-Spektren gemessen. Aus der Eigendiffusionsrate ergibt sich ein hydrodynamischer Radius, der mit durch HYDROPRO simulierten Werten übereinstimmt und sich deutlich von dem des putativen Dimers absetzt. Daher wird davon ausgegangen, dass die Signalverluste im NMR nicht durch Dimerisierung oder Aggregation ausgelöst werden. Um die Bindung von Inhibitoren auch durch NMR-Spektroskopie nachzuweisen, wurden Saturation-Transfer-Difference-Experimente (STD) durchgeführt. In diesen war aber sowohl für das natürliche Substrat Phosphotyrosin als auch für alle im Enzymtest aktiven Inhibitoren kein Effekt nachweisbar. Dies weist auf eine sehr hohe koff-Rate der Bindung an das Protein hin oder auf eine irreversible chemische Modifikation des aktiven Zentrums, die bis zum Zeitpunkt der Messung bereits abgeschlossen war. Für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung werden spezifische Interaktionspunkte auf der Proteinoberfläche gesucht. Hierfür wurden 15N-HSQC-Spektren mit und ohne Bindungspartner gemessen und die Veränderungen der chemischen Verschiebung bestimmt („chemical shift perturbation“). Es konnten für Phosphotyrosin und die beiden starken Inhibitoren BN82002 und NSC663284 signifikante Veränderungen nachgewiesen werden. Für alle drei Moleküle gab es sowohl komplett einzigartige Veränderungen als auch paarweise übereinstimmende als auch ein Signal das für alle 3 übereinstimmt. Neben den Inhibitoren wurden drei Peptide auf spezifische Interaktion getestet. Das erste entspricht der Zielsequenz des natürlichen Substrats CDK, die anderen beiden sind Teile der Sequenz von CDK an einer nachgewiesenen als auch einer putativen sekundären Interaktionsfläche der beiden Proteine. Auch für die drei Peptide konnten wie für die Inhibitoren individuelle als auch übereinstimmende Signalveränderungen nachgewiesen werden. Als Voraussetzung für die Bestimmung der Oberflächenkontakte, die für die spezifische Bindung von Substrat, Inhibitoren und Interaktionspeptiden nötig sind, wird eine Zuordnung der Signale des 15N-HSQC-Spektrums zu den Aminosäureresten des Proteins benötigt. Hierzu wurden 3D-Tripelresonanz-NMR-Experimente an 15N, 13C-markierten Proben (zusätzlich auch noch 2H-markierte Proben zur Unterdrückung von Relaxationseffekten) durchgeführt. Um die Zuordnung zu unterstützen wurden außerdem Proben mit individuell 15N-markierten Aminosäuren hergestellt, um einem Signal im HSQC zumindest den Typ der Aminosäure zuordnen zu können. Aufgrund der trotz Pufferoptimierung, Deuterierung des Proteins und verringerter Signalüberlagerung in den Spektren der individuell markierten Proben zu geringen Anzahl an Signalen konnten nur kurze Bereiche der Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Aufgrund dieser Basis konnte kein aussagekräftiges Mapping erzielt werden.
Übergangsmetallboride und -nitride weisen besondere physikalische und mechanische Eigenschaften auf; sie vereinen dabei sowohl die Merkmale von Metallen als auch von Keramiken. Sie besitzen z. B. große Härten, hohe Schmelzpunkte und hohe Abriebfestigkeiten. Des Weiteren sind sie sehr beständig gegenüber Hitze und Korrosion. Sie zeigen eine hohe elektrische und thermische Leitfähigkeit. In den industriellen Anwendungen kommen oft Übergangsmetallboride und -nitride der 4. und 5. Gruppe zum Einsatz. Die Boride und Nitride des Niobs gelten als potentielle Kandidaten für Baumaterialien, welche hohen Temperaturen standhalten sollen. Niobnitride werden zum Teil schon als Beschichtungen von Turbinenmotoren und in der Raumfahrt eingesetzt. Für den industriellen Einsatz als Beschichtung oder Überzug werden in der Regel dünne Filme benötigt, diese werden oft durch Gasphasenabscheidung aufgebracht. Eine alternative Möglichkeit zur Präparation dünner Filme bietet das Rapid Thermal Processing (RTP). Dabei handelt es sich um einen optischen Schnellheizofen, mit dem Aufheiz- und Abkühlraten bis zu 300 K s-1 erreicht werden können. Im Vergleich zu gängigen Ofenprozessen werden Reaktionszeiten deutlich verkürzt. Durch eine Variation der Reaktionsbedingungen ist es möglich, verschiedene Phasen zu erzeugen und deren Abfolge zu beeinflussen. Zusätzlich können metastabile Phasen und Zwischenstufen abgefangen werden. Als Ausgangsschichten für die in dieser Arbeit untersuchte Darstellung von Niobboriden und -nitriden dienten verschiedene B/Nb- sowie B/Nb2N-Schichtsysteme. Diese wurden mittels Magnetronsputtern bzw. Elektronenstrahlverdampfung auf Si/SiO2-Substraten abgeschieden. Die Ausgangsschichten wurden anschließend in der RTP im Temperaturbereich von 600 °C bis 1200 °C getempert. Die Temperungen wurden in Argon bzw. Ammoniak durchgeführt. Zur Charakterisierung der Proben dienten verschiedene Analyseverfahren (XRD, LM, REM, AFM, SIMS, EPMA). Die folgenden Niobboride sowie -nitride können durch Temperungen in der RTP dargestellt werden. Die hexagonale NbB2-Phase entsteht bei Argon- sowie Ammoniaktemperungen in B/Nb-Schichtsystemen mit einem 1 : 1-Schichtdickenverhältnis. Das NbB2 erweist sich unter den untersuchten Reaktionsbedingungen als effektive Diffusionsbarriere gegenüber Sauerstoff, Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff. Weitere boridische Phasen werden nur bei Argontemperungen gefunden. Das tetragonale Nb3B2 entsteht in Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 sowie mit einem Nb : B : Nb-Verhältnis von 5 : 1 : 5. Die Nb3B2-Phase wird durch Kohlenstoff und Sauerstoff verunreinigt. Die Verunreinigungen stammen sowohl aus den Ausgangsschichten als auch aus anderen Quellen (z. B. Trägermaterial). Durch eine Änderung der Sputter- Methode konnten die in den Ausgangschichten vorhandenen Verunreinigungen reduziert werden. In entsprechend neupräparierten Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 führt dies bei den Argontemperungen zur Ausbildung des orthorhombischen NbB neben dem Nb3B2. Die Bildung der Nitride erfolgt bei den Ammoniaktemperungen der verwendeten Schichtsysteme (außer bei B : Nb im Verhältnis 1 : 1). Welche Phase dabei entsteht ist abhängig von der gewählten Temperatur. Es zeigt sich dabei von niedrigeren zu höheren Temperaturen folgende Phasenabfolge: hexagonales Nb2N -> hexagonales delta‘-NbN -> kubisches NbN. Beim Übergang zwischen den einzelnen Phasen liegen diese nebeneinander vor. Durch die schnellen Aufheiz- und Abkühlraten des RTP-Systems, bildet sich neben dem Nb2N das kinetisch bevorzugte delta‘-NbN. Die Bildung der delta‘-NbN-Phase wird durch die Ähnlichkeit der beiden Elementarzellen unterstützt. Die Nb2N-Phase der B/Nb2N-Bilayer behindert stark die Eindiffusion des Bors, des Stickstoffes und der Verunreinigungen. Damit ist das Nb2N eine relativ gute Diffusionsbarriere. Ein Teil der Nb2N-Schicht weicht dem Druck der Eindiffusion durch Aufstauungseffekte an der Grenzfläche aus. Die aus der Literatur bekannten Phasen Nb3B4 (orthorhombisch), epsilon-NbN (hexagonal) und Nb5N6 (hexagonal) werden bei den untersuchten Reaktionsbedingungen nicht gefunden. Die vorhandenen Verunreinigungen führen vor allem während der Argontemperungen zu verschiedenen Oberflächenphänomenen und zur Ausbildung carbidischer und oxidischer Phasen. Im Zuge der Ammoniaktemperungen spielen die Verunreinigungen eine deutlich geringere Rolle. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass durch Temperungen in der RTP verschiedene Niobboride sowie -nitride innerhalb weniger Minuten dargestellt werden können. Jedoch sollten für weiterführende Arbeiten reinere Ausgangschichten bzw. anderer Trägermaterialien verwendet werden um die Ergebnisse weiter zu verbessern.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung lichtinduzierter Strukturänderungen verschiedener photoschaltbarer Moleküle durch zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie. Hierzu war es notwendig, eine komplexe Messapparatur zu konzipieren, aufzubauen und zu optimieren. Das entwickelte Anreg-/Abtast-Experiment ermöglicht die Messung kleinster transienter Absorptionsänderungen (delta A<1E-5) im Spektralbereich von 1000 cm^-1 bis 2500 cm^-1 mit einer Zeitauflösung von etwa 0,3 ps. Es können Anregungspulse im Bereich von 258nm bis über 600nm generiert werden. Über ein computergesteuertes Wellenplättchen kann die Polarisation des Anregungslichtes während der Datenaufnahme variiert werden, was eine Auswertung hinsichtlich der molekularen Anisotropie ermöglicht. Die eingesetzten Probenzellen gestatten die Untersuchung geringster Probenmengen (V <20µL) bei Temperaturen bis zu 50°C. Nitrophenylacetat (NPA) wurde hinsichtlich seiner Photodecarboxylierungsreaktion untersucht. Für alle drei Konstitutionsisomere konnte nachgewiesen werden, dass die Freisetzung von CO2 innerhalb von 1 ns erfolgt. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Reaktionsverläufen der drei Konstitutionen, wobei die erhaltenen Amplituden der Photoproduktspektren mit den bekannten Decarboxylierungsquantenausbeuten korrelieren. Die globale Analyse ergibt einen multiexponentiellen Aufbau des CO2-Signals. Im Fall von meta- und para-NPA erfolgt die Abspaltung von CO2 über einen dominanten Zerfallskanal mit einer Zeitkonstante von t~200 ps. Quantenchemische Rechnungen legen nahe, dass dieser Hauptreaktionspfad über den Triplettzustand verläuft. Bei ortho- NPA wird dieser Zerfallskanal effektiv gequencht, was mit einer schnellen Deaktivierung des angeregten Singulettzustandes durch einen intramolekularen Protonentransfer erklärt wird. Nach diesen Messungen steht fest, dass meta-Nitrophenylacetat hervorragend als caged compound für CO2 geeignet ist. Die Primärdynamik von solubilisiertem Proteorhodopsin (PR) in D2O wurde im infraroten und sichtbaren Spektralbereich sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pD-Wert untersucht. Dies erlaubt den direkten Vergleich der in beiden Spektralbereichen gemessenen Daten. Der primäre Protonenaktzeptor Asp97 liegt dabei entweder protoniert (pD=6,4) oder deprotoniert (pD=9,2) vor. Die transienten vis-Absorptionsspektren ergaben, wie bei PR in H2O, einen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands und die gleichzeitige Bildung des PRK-Photoproduktes. Die Abweichung der bei PR in D2O ermittelten Werte von den publizierten Zeitkonstanten der H2O-Messung wird als kinetischer Isoptopeneffekt interpretiert. Dieser variiert mit dem pD-Wert, was auf Unterschiede der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke in der Retinalumgebung hinweist. Die Signaturen der transienten Infrarotspektren werden den C=C- und C=N-Moden des Retinals sowie der Amid I-Mode des Proteins zugeordnet. Es konnte ebenfalls die Bildung des PRK-Produktes nachgewiesen werden, wobei die Isomerisierungsquantenausbeute des Retinals unabhängig von der Protonierung von Asp97 ist. Die im IR bestimmten Zeitkonstanten sind dabei unabhängig vom pD-Wert und weichen von den im Sichtbaren ermittelten Werten ab. Dieser Befund wird mit dem Einfluss der molekularen Temperatur auf die transienten IR-Spektren und dem Auftreten von Kühlprozessen erklärt. Zusätzlich zum Wildtyp-Protein wurde die PR-D97N-Mutante als Modellsystem für PR im sauren pH-Bereich ebenfalls im vis- und IR-Bereich untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisherigen Ausführungen. Der geringe kinetische Isotopeneffekt weist auf ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk wie beim Wildtyp unter sauren Bedingungen hin. Als letztes wurde ein synthetisches Modellcollagen untersucht. Die Seitenkettenverbrückung der Peptidsequenz mit einem Azobenzol-basierten, künstlichen Photoschalter sollte eine lichtinduzierte Entfaltung der Tertiärstruktur ermöglichen. Der isolierte Photoschalter und die gekoppelte Sequenz wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen sowohl im UV/vis- als auch im IR -Bereich umfangreich spektroskopisch charakterisiert. Diese Messdaten lagen zum großen Teil bereits vor und wurden in dieser Arbeit einer detaillierten Auswertung unterzogen. Für den isolierten Schalter konnte im IR-Bereich eine umfassende Bandenzuordnung erstellt werden. Dabei wird im photostationären Gleichgewicht eine reversible trans-> cis-Isomerisierung festgestellt, welche keine Temperaturabhängigkeit aufweist. Darüberhinaus wurden polarisationsabhängige, transiente IR-Spektren des isolierten Azoschalters für die trans->cis- und die cis->trans-Isomerisierungsrichtung aufgenommen. Die instantan auftretenden, markanten Differenzsignale können den Amid I- und Amid II-Moden der im Schalter enthaltenen Peptidbindungen sowie den Phenylmoden zugeordnet werden. Die extrahierten kinetischen Parameter sind für beide Isomere nahezu identisch, was durch einen dominanten Beitrag molekularer Kühlprozesse erklärt werden kann. Aufgrund der geringen Isomerisierungsquantenausbeute (< 10 %) können die Differenzspektren der photostationären Gleichgewichte nicht in den Produktspektren dieser Messungen reproduziert werden. Hinsichtlich der ermittelten Anisotropieparameter ergeben sich kleine Unterschiede zwischen beiden Datensätzen. Zusammen mit theoretischen Modellierungen werden diese in Zukunft genauere Aussagen über die Strukturen der Isomere erlauben. Die UV/vis-Absorptionsspektren des gekoppelten Systems zeigen, dass die Absorptionsbanden des Azoschalters durch die Kopplung an das Collagen nicht signifikant beeinflusst werden. Im IR-Absorptionsspektrum konnten wichtige Amid I-, Amid II- und Amid II0-Banden des Azoschalters und der Peptidsequenz sowie eine große Anzahl weiterer Banden zugeordnet werden. Temperaturabhängige Absolut- und Differenzspektren im UV/vis- und IR-Bereich zeigen eine irreversible thermische Denaturierung der Collagentripelhelix ab etwa 50°C. Das verwendete, deuterierte Lösungsmittelgemisch führt zu einem H/D-Austausch. Anhand der Amid II-Bande der in der tripelhelikalen Struktur geschützten Glycine kann die Existenz der Collagenstruktur und ihre Entfaltung nachgewiesen werden. Die Amplituden der photostationären Differenzspektren sind jedoch kleiner als beim isolierten Schalter, was auf eine verringerte Isomerisierungsquantenausbeute hinweist. Die bei Erwärmung beobachtete Vergrößerung der Differenzsignale wird mit einer effizienteren Isomerisierung nach dem Aufschmelzen der Tripelhelix erklärt. Für die trans->cis-Isomerisierungsrichtung wurden transiente IR-Spektren des Azocollagens bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen. Alle instantan auftretenden Differenzsignale können auf die Schwingungsmoden des Azoschalters zurückgeführt werden. Bei einer Temperatur von 50°C lässt sich ein Einfluss der Peptidsequenz auf die transienten Spektren nicht nachweisen, was mit einer aufgeschmolzenen Tertiärstruktur im Einklang ist. Hingegen wird bei 20°C das Ausbleichen von Amid I-Schwingungsbanden der Peptidsequenz beobachtet, was eindeutig einen Energietransfer auf diese Moden zeigt. Bei 35°C sind die Bleichsignale des Collagens in diesem Bereich bereits deutlich abgeschwächt. Die transienten Spektren des isolierten Azoschalters besitzen keine derartige Temperaturabhängigkeit.
The various OPE mixtures were also tested on sSOI material which consists of a thin strained silicon layer on top of an insulator like silicon dioxide. The OPE A, B and F are able to reveal threading dislocations (TD) in the strained silicon film (chapter 5.11). The TD densities determined for the OPE A correspond very well with those obtained with the Secco diluted reference. The tested OPE mixtures are not able to delineate other crystal defects like stacking faults, pile ups or twins, which also appear in the strained silicon. Some Organic Peracid Etches were also tested on wafers with an epitaxial silicon layer and on silicon substrates. Epitaxially produced silicon layers are nearly defect-free. Etching times were chosen such that only a part of the epitaxial layer was removed. Nevertheless, after very long etching times (> 16 h) isolated pits were found, with defect densities ranging from 104/cm3 to 106/cm3 depending on the etching solution used. No etch pits were found in the remaining epitaxial layer when OPE F was used. Longer etching times appear to favour the formation of artefects. These artefacts could be caused by the formation of gas bubbles, particles or micro scratches at the crystal surface. The OPE C and D are able to reveal vacancy agglomerates (D-defects) in silicon substrates (see under 5.5, 5.6 and 5.11in chapter 5). Due to their low removal rates and the long etching times which favour the formation of artifacts, these solutions are less suited to the delineation of defects in silicon substrates. In the second part of this study the different etch formulations have been compared with each other in respect of their physical properties like removal rates, activation energies, standard potentials and selectivities (chapter 6). The selectivity was determined at etch pits caused by dislocations. The depth of the etch pits, determined by atomic force microscopy (AFM), should be dependent on the selectivity of the corresponding etching solution used. The higher the selectivity of the solution the deeper the etch pit should be. It was assumed that a low removal rate and a high activation energy for the etching process should correspond to a high selectivity. However, the experimental results have shown that it is not possible to predict the selectivity of an etching solution from experimental parameters like removal rate or activation energy. One must bear in mind that selectivity was only determined on one particular type of crystal defect, namely on dislocations. Values for selectivity in the etching solutions can differ for other defect types. Besides the etching solutions used in this study differ considerably from each other in respect of their chemical and physical roperties. They can be divided into three completely different etching systems. The original Secco solution and the diluted variations thereof are hydrofluoric acid-dichromate mixtures with the Cr6+ species as the oxidizing agent. The Jeita and MEMC solutions contain nitric acid, hydrofluoric acid and, as diluents, acetic acid and water. Here the oxidizing agents are various N(III) species which are formed autocatalytically during the etching process. The concentration of acetic acid also plays an important role as it lowers the degree of dissociation of HF and of HNO3. This has an influence on the pH and the standard potential of the etching solution. The Organic Peracid Etches are mixtures of hydrogen peroxide and a short-chain alkanoic acid like acetic acid. Such systems are strictly speaking not aqueous solutions, the reactive species is the peracid formed.Within each system, however, a certain relationship is perceived between the selectivity of the etching solution on the one hand, and the and the activation energy or the removal rate on the other. The decreased activation energy for the etching process of silicon at a dislocation can be calculated from experimental data by using the Arrhenius equation (chapter 6.3). It was found that the strain inside the crystal lattice caused by a dislocation loop leads to an increase of the potential energy of ~ 5 % and, hence, a decrease of the activation energy of ~ 5 % and an increase in the removal rate of ~ 100 %.
In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt, mit denen das Auflösungsverhalten schwer wasserlöslicher schwacher Säuren verbessert werden kann. Als Modellwirkstoffe wurden drei Vertreter der Sulfonylharnstoff-Gruppe (Glibenclamid, Glipizid und Glimepirid) gewählt. Diese Wirkstoffe, werden zur oralen Standardtherapie des Typ 2 Diabetes eingesetzt. Die Ergebnisse aus den Löslichkeits- und Freisetzungsuntersuchungen der reinen Arzneistoffe bildeten in dieser Arbeit den Ausgangspunkt der Entwicklungsarbeit. Um den Einfluss der galenischen Methoden auf das Freisetzungsverhalten der entwickelten Formulierungen besser zu beurteilen, wurden ebenfalls entsprechende Handelspräparate (Euglucon N 3,5 mg, Luditec 5 mg und Amaryl 4 mg) untersucht. Zunächst wurden mit Glibenclamid und dem natürlichen ?-CD sowie verschieden Cyclodextrin-Derivaten (M-?-CD und HP-?-CD) binäre Komplexe im molaren Verhältnis von 1:2 (Glibenclamid:CD) hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurden feste Lösungen aus Glibenclamid und Kollicoat(r) IR bzw. PVP K30 entwickelt. Bei den nachfolgenden Freisetzungsuntersuchungen zeichnete sich im Falle der binären Cyclodextrin-Komplexe ab, dass der Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex das beste Freisetzungsverhalten von Glibenclamid in den untersuchten Medien erreichte. Bei den festen Lösungen von Glibenclamid gab es zwischen den beiden untersuchten Polymeren keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Glibenclamidfreisetzung. Im nächsten Schritt wurden ternäre Komplexe (Glibenclamid-HP-?-CD-Polymer) entwickelt, eine Kombination aus binären CD- Komplexen und festen Lösungen. Als dritte Komponente wurden Kollicoat(r) IR, PVP K30 und PEG 6000 in unterschiedlichen Zusätzen, 5, 10 und 20% bezogen auf den zugrunde liegenden binären Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex eingearbeitet. Die Charakterisierung der verschiedenen ternären Komplexe ergab, dass das beste Freisetzungsverhalten bei den Komplexen, welche einen 10%igen Kollicoat(r) IR- bzw. 20%igen PVP K30-Zusatz enthielten, generiert werden konnte. Bei den drei verwendeten Methoden (binäre-, ternäre Komplexe und feste Lösungen) erhielt man während der Freisetzungsuntersuchungen in den Medien mit einem pH-Wert unterhalb des pKs-Wertes von Glibenclamid (5,4) eine übersättigte Wirkstofflösung, was zum Teil innerhalb kürzester Zeit zum Präzipitieren des Wirkstoffes führte. Initiale DSC-Untersuchungen hatten gezeigt, dass Glibenclamid in den beschriebenen Präformulierungen in amorpher Form vorlag, was der Grund für die rasche Freisetzung war. Anschließend wurde versucht, das Präzipitieren zu verlangsamen und im besten Fall zu verhindern. Hierfür wurde HPMC in verschiedenen Formen verwendet. Das einfache Hinzumischen von HPMC in eine Gelatine-Kapsel zu der Glibenclamid-Formulierung führte aufgrund von Agglomeratbildungen zu einer deutlichen Verzögerung der Wirkstofffreisetzung. Pankreatin als Zusatz zum Freisetzungsmedium konnte die Bildung eines Agglomerates nicht verhindern, was darauf schließen ließ, dass dieses nicht durch sogenanntes "Cross-linking" der Gelatine entstanden war. In einem nächsten Schritt wurden HPMC-Kapseln eingesetzt. Die Glibenclamidfreisetzung konnte durch einfaches Austauschen der Gelatine-Kapseln gegen Vcaps(r) Plus-Kapseln in allen untersuchten Medien deutlich gesteigert werden, was auf die durch die Anwesenheit von HPMC verzögerte Präzipitation des Wirkstoffes im Freisetzungsmedium zurückzuführen war. Im nächsten Schritt wurde, die Formulierungsmethode von Glibenclamid, auf Glipizid übertragen. Es wurde analog zu Glibenclamid ein binärer Glipizid-HP-?-CD-Komplex im molaren Verhältnis von 1:2 (Glipizid:HP-?-CD) hergestellt. Dieser Komplex führte zu einer deutlichen Verbesserung des Auflösungsverhaltens von Glipizid, was zu einer annähernd 100%igen Wirkstofffreisetzung in allen untersuchten Medien führte. Weiterhin wurden die mit Glibenclamid entwickelten Methoden auch auf Glimepirid übertragen. Die Formulierung von Glimepirid zu einem binären Glimepirid-HP-?-CD-Komplex führte zu einer höheren Wirkstofffreisetzung, verglichen mit der kristallinen Reinsubstanz und des Handelspräparates. Durch die Verarbeitung von Glimepirid in ternären Komplexen erhöhte sich das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung deutlich. Mit Kollicoat(r) IR konnte eine Wirkstofffreisetzung von ca. 60% der Dosis und mit PVP K30 als dritter Komponente sogar ca. 85% Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF erzielt werden. Das Präzipitieren des Wirkstoffes nach initialer Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF konnte durch den Einsatz von Vcaps(r) Plus-Kapseln deutlich reduziert werden. Stabilitätsuntersuchungen, welche mit den in dieser Arbeit verwendeten Präformulierungen durchgeführt wurden zeigten, dass der jeweilige Wirkstoff auch nach einem Jahr der Lagerung bei Raumtemperatur und < 30% rel. Luftfeuchte, in amorpher Form in den entsprechenden Präformulierungen vorlag. All diese Untersuchungen zeigten eindrucksvoll, dass sich Cyclodextrin-Derivate in Kombination mit hydrophilen Polymeren, dazu eigneten, die Verfügbarkeit schwer löslicher Wirkstoffe im Dünndarm für deren Resorption zu verbessern. Es wurde gezeigt, dass die Herstellungsmethodik der Cyclodextrin-Komplexe einen wesentlichen Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung hatte.
Im Hinterhorn des Rückenmarks werden aus der Peripherie kommende nozizeptive Reize auf zentrale Neurone umgeschaltet. Sphingosin-1-Phosphat ist ein potentieller Modulator dieser spinalen nozizeptiven Transmission. Vorarbeiten zeigten, dass die intrathekale Applikation von S1P zu einer Verringerung des nozizeptiven Verhaltens führt. Aus diesem Grund sind sowohl Enzymsysteme, welche die spinale S1P-Konzentration regulieren, als auch spezifische S1P-Rezeptoren und deren Aktivatoren und Inhibitoren potentielle ‚Targets’ und ‚Tools’ für eine suffiziente Schmerztherapie. Zur Charakterisierung der dem antinozizeptiven Effekt von S1P zugrunde liegenden Mechanismen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die S1P-Rezeptoren S1P1 und S1P2 in den für die Schmerzverarbeitung wichtigen äußeren Laminae I-III des dorsalen Hinterhorns des Rückenmarks exprimiert werden. S1P verringert über Aktivierung Gi-Protein-gekoppelter Rezeptoren die Hemmung der cAMP-Synthese in exzitatorischen Rückenmarksneuronen dieser Laminae, was die antinozizeptive Wirkung von S1P erklären könnte. Zur Aufklärung der Regulation der S1P-Konzentration im Rückenmark nach peripherer nozizeptiver Stimulation sollte die Aktivität S1P metabolisierender Enzyme näher betrachtet werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass es nach peripherer nozizeptiver Stimulierung in vitro und in vivo zu einer negativen Rückkopplung durch S1P kommt, basierend auf einer anfänglichen Aktivierung beider SPHKs. Das durch SPHK-1 gebildete S1P vermittelt extrazellulär über den S1P1-Rezeptor die Hemmung der SPHK-1, während es über den S1P2-Rezeptor die SPHK-2 hemmt und dadurch zu einer Absenkung der S1P-Konzentration führt. Das durch SPHK-2 gebildete S1P hingegen wird nicht sezerniert, bedingt demnach keine Hemmung der S1P-Synthese und übt keinen direkten Einfluss auf die akute spinale Schmerzverarbeitung aus. Bei dem antinozizeptiv wirkenden S1P handelt es sich um von SPHK-1 gebildetes und anschließend sezerniertes S1P. Auch in nicht-neuronalen Zellen konnte die negative Rückkopplung detektiert werden und stellt daher einen allgemeinen regulatorischen Mechanismus dar. Des Weiteren sollte die Untersuchung von neu synthetisierten S1P-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten weitere Grundlagen für eine neuartige, pharmakologische Schmerztherapie liefern. Vorarbeiten zeigten, dass die intraperitoneale oder intrathekale Gabe des strukturellen S1P-Analogons FTY720 das Schmerzverhalten von Tieren reduziert. Die hemmende Wirkung des FTY720 auf die Eicosanoidsynthese durch direkte Hemmung der cPLA2 kann zur Vermittlung des antinozizeptiven Effekts von FTY720 beitragen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass FTY720-Analoga die PGE2-Synthese in vivo und in vitro hemmen können. Die strukturelle Vorraussetzung für die hemmende Wirkung dieser S1P-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten ist der Besitz eines basischen Zentrums und darüber hinaus die Freiheitsgrade der Substanzen eine Rolle für die Bindung an die cPLA2 spielen. Die Verwendung von FTY720-Analoga, welche keine Aktivierung der für Nebenwirkungen verantwortlichen S1P-Rezeptoren bedingen und dennoch eine Reduktion der Prostaglandin- und cAMP-Synthese vermitteln, wären viel versprechende neue Substanzen zur Behandlung chronischer Schmerzen.
Es wurden mit phys. Verfahren hergestellte 200 und 500 nm dicke Niobfilme auf oxidiertem Si thermischen Kurzzeitprozessen (RTP) unterzogen, um Oxynitride zu synthetisieren. Die Filme wurden mit verschiedenen Methoden untersucht, um einen Überblick über die entstandenen Produkte und ihre Position im Film zu erlangen. Die Reaktionen wurden in N2 oder NH3 zur Nitridierung mit anschließender Oxidation in O2 durchgeführt. Um eine mögliche direkte Einstufensynthese von Oxynitriden des Niobs zu finden, wurde N2O eingesetzt. Der einfachste Ansatz zur Präparation von Oxynitriden bestand in der Verwendung des N2 und NH3, mit denen die Metallfilme zwischen 600 und 1200 °C umgesetzt wurden. Die Nitridierung mit N2 verlief von der Bildung einer festen Stickstofflösung in Niob bei tiefen Temperaturen über Nb2N zwischen 700 und 1000 °C bis zum Nb4N3 oberhalb 1000 °C. Aus dem Substrat diffundierte Sauerstoff aus, der am Interface Nb/SiO2 zur Bildung einer Oxidzone führte. Der O-Gehalt der Oxide stieg mit steigender Reaktionstemp. Unterhalb 1000 °C wurde NbO gefunden, oberhalb 1000 °C bildete sich NbO2. Eine TEM-Untersuchung gekoppelt mit EEL-Spektrometrie ergab Hinweise auf die Bildung einzelner stickstoffreicher NbOxNy-Kristallite im Bulk der mit N2 umgesetzten Filme. Auch die Nitridierung mit NH3 ergab eine Abhängigkeit des N-Gehaltes der Produkte von der Rkt.-Temperatur. Es erfolgte die Bildung der festen Lösung und Nb2N bei tiefen und mittleren Temperaturen. Ab 900 °C bildete sich NbN, oberhalb 1100 °C wurde vermutlich Nb4N5 detektiert. Im Gegensatz zur Umsetzung mit N2 ergaben genauere Untersuchungen der in NH3 nitridierten Filme keine Hinweise auf die Bildung von Oxynitriden. Die Erstellung von Tiefenprofilen zeigte, dass sich Nitridphasen mit höchstem N-Gehalt an der Oberfläche befanden und der Anteil des Stickstoffs in den Produkten mit zunehmender Tiefe abnahm. Mit Oxiden verhielt es sich umgekehrt: Sobald höhere Oxide gebildet wurden, befanden sie sich am Interface, wo die Sauerstoffkonzentration am höchsten ist. Oxide mit niedrigerem O-Gehalt wurden in der Filmmitte gefunden, wo der Sauerstoff durch die gebildeten Nitride an der Diffusion in Richtung Filmoberfläche gehindert wurde. Die 200-nm-Filme waren formal reaktiver als die 500-nm-Filme. Sie bildeten bereits bei tieferen Temperaturen Phasen mit höherem N- oder O-Gehalt, wofür das geringere zur Verfügung stehende Volumen ursächlich ist. Die Reinheit der Filme führte zu Unterschieden in der Reaktivität: Gesputterte Filme waren reiner als aufgedampfte Filme, die auf Grund der Einlagerung einer geringen Sauerstoffmenge während der Präparation passiviert waren. Dadurch wurde die Diffusion des Stickstoffs eingeschränkt zur Bildung abweichender Phasen zwischen aufgedampften und gesputterten Filmen. Eine Variante der Nitridierung in N2 bzw. NH3 bestand in der Verwendung von O2 als Kühlgas. Die Zugabe des O2 wurde bei unterschiedlichen Temperaturen untersucht. Statt der Einlagerung von Sauerstoff in das Oberflächennitrid unter Oxynitridbildung kam es zur Bildung einer oxidischen Deckschicht. Die Bildung der Schicht erforderte eine Zugabetemperatur höher als 700 °C, bei tieferen Temperaturen war der Film durch das bereits gebildete Nitrid soweit passiviert, dass keine chemische Veränderung stattfand. Die im Nitridierungsschritt gebildeten Produkte wurden als Auswirkung des sog. Schneepflugeffektes unter Kompression in tiefere Filmregionen verschoben. Dies führte zur Bildung von Produkten höherer Stöchiometrie (Nb2N zu NbN oder NbO zu NbO2). Der Einsatz von Lachgas, der zur Einlagerung von N2O-Einheiten in den Metallfilm führen sollte, verlief ergebnislos. Bei Prozesstemperaturen unterhalb 450 °C wurde lediglich die Bildung einer festen Lösung von Sauerstoff im Niob nachgewiesen. Oberhalb 450 °C zersetzte sich N2O unter O-Bildung wodurch der Film oxidiert wurde. Die Umsetzung nitridierter Filme mit N2O und auch dessen Verwendung als Kühlgas brachte keine Veränderung. Die Oberflächennitride waren stabil gegenüber dem N2O. Die Nitridierung der Filme im N2-Strom wurde durch die stoßweise Zugabe von O2 bzw. N2O nach definierten Zeiten variiert. Die Filme bilden nach kurzen Nitridierungszeiten von maximal 20 s gefolgt von einem 10-sek. Sauerstoffstoß eine komplizierte Filmstruktur aus, wie das elementare Tiefenprofil zeigt, das in denselben Filmzonen sowohl Stickstoff als auch Sauerstoff nachweist. Da die Röntgendaten lediglich die Bildung von NbO2 nachweisen, jedoch mit einer leichten Verschiebung der Reflexe zu kleineren Winkeln aufgrund der Einlagerung der größeren Nitridionen in das Oxidgitter, muss es sich bei dem präparierten Film um ein Oxynitrid der Form NbO(2-x)Nx handeln, in dem das Verhältnis von N zu O auf der sauerstoffreichen Seite liegt.
Das Auftreten von plötzlichem Herztod, das häufig durch ventrikuläre Tachyarrhythmien ausgelöst wird, stellt bis heute eine Herausforderung bei der Therapie der Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz dar. Derartige Arrhythmien werden bei über 85% der Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz beschrieben und über 50% der Todesursachen werden dabei auf das Auftreten von plötzlichem Herztod zurückgeführt. Es wird vermutet, dass das elektrische Remodeling als Teil der gesamten kardialen Umbauvorgänge bei der Entstehung einer Herzinsuffizienz die pathophysiologische Grundlage dieser Arrhythmien darstellt. Das Renin-Angiotensin-Aldosteron System spielt eine zentrale Rolle bei der Ausbildung des elektrischen Remodeling und insbesondere erhöhte Aldosteronkonzentrationen korrelieren mit dem Risiko kardiovaskulärer Zwischenfälle. Darüberhinaus konnte in zwei klinischen Studien (RALES und EPHESUS) gezeigt werden, dass die Therapie herzinsuffizienter Patienten mit den Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon die Mortalität und Morbidität und insbesondere auch das Auftreten von plötzlichem Herztod signifikant senken konnte. Weitere Studien zeigen eine Verbindung zwischen dem Auftreten einer Herzinsuffizienz und Veränderungen in der Funktion und Expression kardiospezifischer repolarisierender K+-Kanäle. Neben den klinischen Daten, die einen protektiven Effekt der Aldosteronantagonisten bei plötzlichem Herztod belegen, ist wenig über die Auswirkungen von Aldosteron auf das elektrische Remodeling des Herzens bekannt. In dieser Arbeit sollte daher die Auswirkung einer chronischen Aldosteronexposition in Ratten auf die elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzens untersucht werden. Dazu wurde Wistar-Ratten Aldosteron verabreicht und einigen Tieren die Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon, um die Effekte der unspezifischen (Spironolacton) und spezifischen (Eplerenon) MR Blockade auf die elektrischen Eigenschaften der Kardiomyozyten zu untersuchen. Die Aldosteron exponierten Tiere entwickelten eine linksventrikuläre Hypertrophie, die sich unabhängig von Blutdruckveränderungen entwickelte, sowie ein signifikant verlängertes QT-Intervall, vermehrt auftretende ventrikuläre Extrasystolen und ventrikuläre Tachykardien. Die Elektrolytwerte (K+, Na+, Cl-) waren dabei nicht verändert. Die Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon waren in der Lage, die unter Aldosteron auftretenden Veränderungen zu verhindern. Die Transkription der Untereinheiten kardiospezifischer K+-Kanäle (Ito, IKur, IK1) und des L-Typ Ca2+-Kanals war unter Aldosteronstimulation im linken Ventrikel signifikant erniedrigt. Auf Proteinebene konnte dies für die Kanaluntereinheiten Kv1.5 (IKur), Kir2.3 (IK1) und Cav1.2 (L-Typ Ca2+-Kanal) bestätigt werden. Die Untersuchung eventuell zugrunde liegender Signaltransduktionswege lieferte erniedrigte mRNA Expressionslevel der kardiospezifischen Proteinkinase C Isoformen PKC-α und PKC-ε, wohingegen die mRNA-Expression von PKC-δ unter Aldosteronstimulation unverändert war. Diese Veränderungen in der Transkription der PKC Isoformen wurden durch Behandlung der Tiere mit den Aldosteronantagonisten inhibiert, was für einen MR vermittelten Effekt spricht. Weiterhin zeigte eine chronische Aldosteronstimulation eine erniedrigte mRNA Expression von Calcineurin Aß (PPP3CB) sowie Calcineurinaktivität in linksventrikulärem Gewebe der Tiere. Dieser Effekt konnte durch die Aldosteronantagonisten nicht aufgehoben werden, so dass ein Signaltransduktionsweg, der nicht über den MR vermittelt wird, zugrunde liegen könnte. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass chronisch erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Rattenherz blutdruckunabhängig zu strukturellen und elektrischen Veränderungen führen, die das Auftreten maligner ventrikulärer Arrhythmien begünstigen. Beide Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon sind in der Lage, die durch Aldosteron vermittelten Effekte in gleicher Weise zu inhibieren. Die Ergebnisse zeigen pathophysiologische Zusammenhänge auf, die die Bedeutung von Aldosteron und der Therapie mit Aldosteronantagonisten für die Behandlung der Herzinsuffizienz und in Zukunft möglicherweise der Hypertrophie unterstreichen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine Variante des Anti-Thrombin-Aptamers HD1 entwickelt, die vor Belichten aktiv war und sich durch Belichten deaktivieren ließ. Dazu wurde das Wildtyp-Aptamer am 5'-Ende um eine GAAA-Schleife und eine Gegenstrangregion, bestehend aus vier Nukleotiden, erweitert. Dies reichte für eine vollständige Inaktivierung des Aptamers aus. In die Gegenstrangregion wurde ein photolabil geschütztes Nukleotid eingebaut, das die Bildung einer Haarnadelstruktur vorübergehend verhindert. Dazu wurde ein Desoxycytidin-Derivat synthetisiert, das an seiner N4-Position mit einer 1-(2-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe modifiziert war. Durch die Maskierung der Antisense-Region wies das Aptamer vor Belichtung blutgerinnungshemmende Aktivität auf, allerdings in geringerem Maße als das Wildtyp-Aptamer. Durch Belichten wurde die Gegenstrangregion freigesetzt und dadurch die aktive Konformation des Aptamers zerstört, sodass es keine blutgerinnungshemmende Wirkung mehr besaß. In einem daran anknüpfenden Projekt sollte eine mit Licht ausschaltbare HD1-Variante mit verbessertem Schaltverhalten entwickelt werden, deren Aktivität vor dem Belichten mit der des Wildtyp-Aptamers vergleichbar ist. Tests zeigten, dass eine 5'-Erweiterung des Aptamers stets einen Aktivitätsverlust zur Folge hatte. Getestet wurden verschiedene Linker-Sequenzen, D-Spacer (Abasic Sites) und nicht nukleotidische Linker wie Glykollinker oder alkylische Linker. Eine Erweiterung am 3'-Ende brachte dagegen fast immer Aptamervarianten hervor, deren Aktivität die des Wildtypaptamers überstiegen. Um diese verbesserten Aptamervarianten zu deaktivieren, war eine Antisense-Region bestehend aus bis zu neun Nukleotiden nötig. Für eine photolabil geschützte Variante wurde zusätzlich ein Desoxyadenosinderivat mit N6-1-(2-Nitrophenyl)ethylmodifikation synthetisiert. Es zeigte sich, dass eine photolabile Schutzgruppe nicht ausreichte um die Antisense- Region zu neutralisieren. Aptamervarianten mit vier oder fünf photolabilen Schutzgruppen in der Antisenseregion waren vor dem Belichten aktiver als das Wildtyp-Aptamer HD1 und konnten durch Belichten vollständig deaktiviert werden. In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine photolabil geschützte Glukosamin-6- phosphat-Variante synthetisiert, um eine lichtabhängige Spaltung des glmS-Ribozyms aus Bacillus subtilis zu induzieren. Dazu wurde GlcN6P an der Aminofunktion über eine Carbonyllinker mit einer 2-(2-Nitrophenyl) propylgruppe modifiziert. In vitro konnte gezeigt werden, dass mit dieser Verbindung durch Belichten die Spaltung eines glmS-EGFP-mRNA-Konstrukts induziert werden konnte. In HeLa-Zellen wurde untersucht, ob sich dieses System zur Regulation der EGFP-Expression eignet. Da erste Versuche erfolglos blieben, wurde eine lipophile, zellgängige Variante des photolabil geschützten GlcN6Ps synthetisiert. Versuche, in denen dieses Derivat getestet wird, werden zur Zeit von unseren Kooperationspartnern durchgeführt. In einem weiteren Projekt wurden Desoxyguanosinderivate für die DNA-Festphasensynthese synthetisiert, die an ihrer O6-Position mit einer p-Hydroxyphenacylgruppe bzw. mit einer 1-(3-Nitrodibenzofuran-2-yl)ethylgruppe modifiziert wurden. Diese wurden in ein Desoxyoligonukleotid eingebaut und es konnte gezeigt werden, dass die photolabilen Schutzgruppen durch Belichten abgespalten werden. Beide photolabilen Modifikationen waren allerdings unter den basischen DNA-Abspaltbedingungen zu instabil, als dass sie sich für den routinemäßigen Einsatz zur Herstellung lichtaktivierbarer Nukleinsäuren eignen würden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine photolabile Schutzgruppe entwickelt, die über einen zusätzlichen Aminolinker verfügt [2-(4-(Aminomethyl)-2-nitrophenyl)-propanol]. Die Aminofunktionalität war für die Dauer der DNA/RNA-Festphasensynthese mit einer Trifluoracetylgruppe geschützt, die unter den basischen Abspaltbedingungen ebenfalls entfernt wird. Mit dieser photolabilen Schutzgruppe wurden ein Thymidinderivat an der O4-Position und ein Desoxyguanosinderivat an der O6-Position modifiziert. Das Desoxyguanosinderivat wurde erfolgreich in der Oligonukleotidfestphasensynthese eingesetzt. Die photolabile Schutzgruppe konnte durch Belichten vollständig von der synthetisierten Nukleinsäure abgespalten werden. Darüber hinaus gelang es, über die Aminofunktionalität die heterobifunktionalen Crosslinker SMCC und SMPB mit der Nukleinsäure zu verknüpfen. Auf diese Weise ist eine reversible Vernküpfung der Nukleinsäure mit einem nahezu beliebigen Bindungspartner möglich. Durch Belichten kann die Nukleinsäure in ihrer ursprünglichen Form wiederhergestellt werden.