540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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Der T-Zell-Wachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2) wird von Antigen-stimulierten T-Zellen sezerniert und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort. Dabei tragen in aktivierten T-Zellen die MAPK-Signalwege, der Calcineurin/NF-AT-Signalweg und der NF-KB-Signalweg kooperativ zur IL-2-lnduktion bei. In den letzten Jahren wurden mehrere Hinweise gefunden, dass IL-2 möglicherweise bei der HIV- und SIV-Pathogenese eine Rolle spielt. Zwei Publikationen konnten bereits eine verstärkte IL-2-Sekretion HIV-1-infizierter T-Zellen nachweisen, die molekularen Mechanismen dieser IL-2-Induktion sind bisher allerdings kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das apathogene simiane Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm3) in suboptimal stimulierten PBMC ebenfalls die Interleukin-2-Sekretion verstärken kann. In der humanen T-Zelllinie A3.01 wurde nach Transfektion des Volllängenplasmids des SIVagm3 eine bis zu 38-fach verstärkte transkriptionelle Aktivierung des IL-2-Promotors beobachtet. Die Untersuchung der beteiligten Signalwege zeigte, dass die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK und p38 für die IL-2-Induktion durch SIVagm3 notwendig sind, während die Inhibition der Calcineurin-Aktivität durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A keinen Einfluss hatte. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigte die Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen des IL-2-Promotors keine Aktivierung der NF-AT-kontrollierten Genexpression durch SIVagm3, womit zum ersten Mal ein Calcineurin/NF-AT-unabhängiger Weg der IL-2-Induktion beschrieben wurde. Dagegen erhöhte SIVagm3 die transkriptionelle Aktivität des NF-KB-responsiven Elements und die Aktivität des CD28/AP-1-responsiven Elements, die auch bei der klassischen T-Zellaktivierung eine Rolle spielen. Eine Aktivierung der CD28/AP-1-kontrollierten Genexpression konnte auch durch Expression des viralen Transaktivator-Proteins Tat induziert werden, das in stimulierten Zellen in der Lage war, die IL-2-Expression zu verstärken. Die Beschränkung dieser Tat-Funktion auf stimulierte Zellen konnte aber nicht auf eine Phosphorylierung von SIVagm3-Tat durch die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK oder p38 zurückgeführt werden. Weitere Analysen zeigten dagegen, dass SIVagm3-Tat durch die Cyclin-abhängige Proteinkinase 9 (CDK9) phosphoryliert wird, die mit Tat koimmunpräzipitiert. Darüberhinaus konnte eine weitere nicht-identifizierte Tat-assoziierte Kinase nachgewiesen werden, die SIVagm3-Tat ebenfalls phosphorylieren kann. Aktuelle Publikationen zeigen, dass das lentivirale Vif-Protein die Degradation von Apobec3G im Proteasom induziert, da dieser zelluläre Faktor die Infektiosität der entstehenden Viruspartikel stark reduziert. Die antivirale Funktion von Apobec3G, die in der Deaminierung der Minusstrang-DNA während der reversen Transkription besteht, ist bereits weitgehend aufgeklärt, aber über die Regulation von Apobec3G ist noch wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der mitogenen Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch den Phorbolester TPA zu einer verstärkten Apobec3G-Expression führt. Dieser Effekt konnte durch den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitor Staurosporin und den MEK-Inhibitor U0126 inhibiert werden, wodurch gezeigt wurde, dass die Aktivität der MAP-Kinase ERK für die Verstärkung der Apobec3G-Expression notwendig ist. Eine Phosphorylierung von Apobec3G durch ERK wurde im Kinase-Assay jedoch nicht beobachtet. Dagegen konnte durch radioaktive in-vivo-Markierung nachgewiesen werden, dass es sich bei Apobec3G nicht um ein Phosphoprotein handelt. Neben den Untersuchungen zur Regulation von Apobec3G, konnten neue Erkenntnisse zu den Apobec3G/Vif-Interaktionen gewonnen werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien wurde die physikalische Interaktion von Vif und Apobec3G nachgewiesen. Zudem konnte gezeigt werden, dass in Gegenwart von Vif der Einbau von Apobec3G in die Viruspartikel gehemmt wird. Damit wurden erste Hinweise gefunden, dass Vif neben der Induktion des proteolytischen Abbaus von Apobec3G weitere Strategien anwendet, um die Inkorporation des antiviralen Faktors zu verhindern.
The hypothesis that oxidative stress plays a role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD) was tested by studying oxidative damage, acitvities of antioxidant enzymes and levels of reactive oxygen species (ROS) in several models. To this end, mouse models transgenic for mutant presenilin (PS1M146L) as well as mutant amyloid precursor protein (APP) and human post mortem brain tissue from sporadic AD patients and age-matched controls were studied. Aging leads to an upregulation of antioxidant enzyme activities of Cu/Zn-superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) in brains from C57BL/6J mice. Simultaneously, levels of lipid peroxidation products malondialdehyde MDA and 4-hydroxynonenal HNE were reduced. Additionally, pronounced gender effects were observed, as female mice display better protection against oxidative damage due to higher activity of GPx. Hence, antioxidant enzymes provide an important contribution to the protection against oxidative damage. In PS1M146L transgenic mice oxidative damage was only detectable in 19-22 months old mice, arguing for an additive effect of aging and the PS1 mutation. Both HNE levels in brain tissue as well as mitochondrial and cytosolic levels of ROS in splenic lymphocytes were increased in PS1M146L mice. Antioxidant defences were unaltered. In PDGF-APP and PDGF-APP/PS1 trangenic mice no changes in any of the parameters studied were observed in any age group. In contrast, Thy1-APP transgenic mice display oxidative damage as assessed by increased HNE levels. Reduced activity of Cu/Zn-SOD may explain this observation. Additionally, gender modified this effect, as female APP transgenic mice display higher b-secretase cleavage of APP and simultaneously increased HNE levels and reduced Cu/Zn-SOD activity earlier than male mice, i.e. from an age of 3 months and before the formation of Ab plaques. Reduced Cu/Zn-SOD activity was also found in another APP transgenic mouse model, in APP23 mice. In post mortem brain tissue from sporadic AD patients activities of Cu/Zn-SOD and GPx were however increased, and changes were most pronounced in temporal cortex. Simultaneously, levels of HNE but not MDA were elevated. Additionally, in vitro stimulation of lipid peroxidation led to increased MDA formation in samples from AD patients, indicating that increased activity of Cu/Zn-SOD and GPx are insufficient to protect against oxidative damage. Furthermore, the observed changes were subject to a gender effect, as samples from female AD patients showed increased activities of Cu/Zn-SOD and GPx as well as increased HNE levels, indicating that brain tissue from females is more sensitive towards oxidative damage. Levels of soluble Ab1-40 were positively correlated with with MDA levels and activities of Cu/Zn-SOD and GPx. Additionally, levels of lipid peroxidation products MDA and HNE are gene-dose-dependently modulated by the Apolipoprotein E4 allele, the most important genetic risk factor for AD known so far. While MDA levels were negatively correlated with MMSE scores, a measure for cognitive function, HNE levels were highest in AD patients with moderate cognitive impairment. Hence, increased HNE levels may play an important role in neurodegenerative events at an early disease stage. In summary, oxidative damage, as assessed by increased HNE levels, could be detected in sporadic AD patients and in different transgenic mouse models. The results of this thesis therefore support the further research of pharmacological targets aiming at augmentation of antioxidant defences for therapy or prophylaxis of Alzheimer’s disease.
The cytochrome bc1 complex is a cornerstone in bioenergetic electron transfer chains, where it carries out tasks as diverse as respiration, photosynthesis, and nitrogen fixation. This homodimeric multisubunit membrane protein has been studied extensively for several decades and the enzyme mechanism is described with the modified protonmotive Q cycle. Still, the molecular and kinetic description of the catalytic cycle is not complete and questions remain regarding the bifurcation of electron transfer at the quinol oxidation (Qo) site, substrate occupancy, pathways of proton conduction, and the nature of the Rieske protein domain movement. We used competitive inhibitors to study the molecular architecture at the Qo site with X-ray crystallography. The structure of the enzyme with the substrate analog 5-n-heptyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazole (HHDBT) bound at the Qo site was determined at 2.5 Å resolution. Spectroscopic studies showed that HHDBT is negatively charged when bound at the active site. Mechanistic interpretations from inhibitor binding are in line with single occupancy model for quinol oxidation and structural analysis supports the proposed proton transfer pathway. For functional insight into the enzyme mechanism, redox-sensitive protonation changes were studied by Fourier transform infrared spectroscopy. The protein purification procedure was optimized for less delipidation and the isolated enzyme was more active. Furthermore, two new phospholipids were identified in the X-ray structures, including a cardiolipin. Strikingly, conserved lipid binding cavities were observed in structural comparison with homologous enzymes. The functional role of tightly bound phospholipids will be discussed. Finally, the Qo site is a target for various compounds of agricultural and pharmaceutical importance. Importantly, the X-ray structures permit detailed analysis of the molecular reasons for acquired resistance to and treatment failure of Qo site inhibitors, such as atovaquone, that is used to treat malaria and pneumonia, as discussed herein.
Ziel der vorliegenden Arbeit war, Arzneistoffformulierungen, wie kationische Nanopartikel, Liposomen und virale Hüllkapside, für den Transport von Antisense-Oligonukleotiden in Zellen zu untersuchen. Der Schwerpunkt lag hierbei auf der in vitro Testung in der Zellkultur. Als Zielstruktur wurde der NMDA-Rezeptor gewählt, dessen Expression durch die Gabe von Antisense-Oligonukleotiden gehemmt wurde. Testobjekt waren murine Fibroblasten, die in einer Vorgängerarbeit von Ralf Steinmetz mit der cDNA für die entsprechenden NMDA-Rezeptorsubtypen transfiziert worden sind und deren Eignung für die Testung von Rezeptorantagonisten schon gezeigt worden ist. Beim NMDA-Rezeptor handelt es sich um einen ligandgesteuerten Ionenkanal, der normalerweise nur in neuronalem Gewebe zu finden ist. Eine Überexpression und anschließende Stimulation des Rezeptors führt über einen massiven Ca2+-Einstrom zum Absterben der Zellen. Dieses Modell erlaubte die Auswertung der Antisense-Wirkung in einem funktionellen Assay über ein reduziertes Absterbeverhalten der Zellen. Die spezifischen Reduktion des Zielproteins wurde mittels Western-Blot-Technik gezeigt. Alle eingesetzten Trägersysteme wurden hinsichtilich ihrer physiko-chemischen Eigenschaften untersucht. Im Mittelpunkt standen dabei die Bestimmung von Größe und Oberflächenladung (Zetapotential), die mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestimmt wurden. Der Schwerpunkt bei der Untersuchung der Drug-Delivery-Systeme lag auf den biodegradierbaren Nanopartikeln auf Basis von Protamin. Im Anschluß an diese physikochemische Charakterisierung wurden diese Partikel in der Zellkultur im Vergleich zu freien, d.h. nicht an ein Trägersystem gebundenen, und zu liposomal (DOTAP) verpackten Oligonukleotiden getestet. Es zeigt sich, dass die Albumin-Protamin-Oligokukleotid-Formulierung gegenüber den freien Oligonukleotiden eine um den Faktor 12 verbesserte zelluläre Aufnahme aufweisen, was mit der liposomen Formulierung vergleichbar ist. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass 100 % der Zellen transfiziert worden sind. Es wurde sowohl im funktionellen Modell über Zelltod, als auch auf Proteinebene (Western-Blot) eine Reduktion des NMDA-Rezeptors von etwa 35 % 24 Stunden nach der Gabe des Oligonukleotide gefunden. Dieses Ergebnis spricht für eine intrazelluläre Freigabe der Oligonukleotide aus den Partikeln. Im Gegensatz zur liposomalen Zubereitung wurden keine zytotoxischen Nebenwirkungen der Nanopartikel gefunden. In einem abschließenden Vergleich wurden rekombinant hergestellte virale Hüllkapside (VP1 Kapside), zwei kationische liposomale Zubereitungen (DOTAP/Lipofectin), zwei kationische Alkylcyanoacrylat Nanopartikelpräparationen (PBCA/PHCA) und zwei auf Protamin basierende Nanopartikelsystme (mit/ohne Albumin-Zusatz) in der Zellkultur getestet. Untersucht wurde die Transfereffizienz für Oligonukleotide mittels einer Fluoreszenzmethode, die intrazelluäre Verteilung wurde im konfokalen Laser-Scan-Mikroskop dargestellt, es wurde eine Antisense-Wirkung im Vergleich zu einer Kontrollsequenz bestimmt (sowohl im funktionellen System, als auch im Western-Blot) und es wurden die zytotoxischen Nebenwirkungen betrachtet. Zusammenfassend ergaben diese Ergebnisse eine um das 2- bis 18-fache Erhöhung der Zellaufnahme im Vergleich zu freien Oligonukleotiden. Die protamin-basierten Nanopartikel zeigten keine nennenswerten zytotoxischen Nebenwirkungen.
The cytochrome bc1 complex or ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (QCR) catalyses electron transfer from ubiquinol to cytochrome c in respiration and photosynthesis coupled to a vectorial proton transport across the membrane, in which the enzyme resides. In both bacteria and eukaryotic organisms, QCR participates in supramolecular assembly of membrane proteins that comprise the respiratory or photosynthetic chain. In the present work, proton transfer pathways, substrate binding and the supramolecular assembly of the respiratory chain in yeast were probed by structure-based site-directed mutagenesis and characterization of the variants. Both active sites centre P, the place of quinol oxidation, and centre N, where quinone reduction takes place, lack direct access to the bulk solvent necessary for proton release and uptake. Based on the X-ray structure, proton transfer pathways were postulated. Analysis at centre P showed, that E272 and Y132 of cytochrome b are important for QCR catalysis as indicated by increased superoxide production and lowered Cyc1p reductase activity in these variants. Pre-steady state heme reduction kinetics in combination with stigmatellin resistance indicated that charge and length of the side chain at position 272 are crucial for efficient docking of the ISP to form the enzyme substrate complex and for electron bifurcation at centre P. Variants of Y312 and F129, both residues of cytochrome b, showed an increased Km indicating participation of these residues in coordination of ubiquinol or the possible intermediate semiquinone anion radical. F129 proved to be crucial for a functional Q-cycle as indicated by respiratory negative growth phenotype and a lowered H+/e- stoichiometry of F129 variants. At centre N, the postulated CL/K and E/R proton transfer pathways are located at opposite sites of the bound ubiquinone. Variants in the surface residues R218 (cytochrome b) and E52 (Qcr7) of the E/R pathway and E82 (Qcr7) of the CL/K pathway showed instability upon purification indicating an important role of these residues for QCR integrity. The slowed down centre N reduction kinetics in H85 (CL/K), R218 and N208 (both E/R) variant was attributed to a destabilised semiquinone anion consistent with the observed decreased sensitivity towards the site-specific inhibitor antimycin and an increased Km. Variants of residues of both pathway, E82Q and R218M, exhibited a decreased H+/e- stoichiometry indicating a crucial role of both residue for maintaining a working Q-cycle and supporting the proposed protonation of the substrate via the Cl/K and the E/R pathway. Long-range interaction between centre N and centre P were observed by altered reduction kinetics of the high potential chain and increased superoxide production in the centre N variants. The role of the cation-pi-interaction between F230 of Cyt1p and R19 of cytochrome c in binding of the redox carrier to QCR was analysed. In F230L hydrophobic interaction were partially lost as was deduced from the ionic strength dependence of Cyc1p reductase activity and Cycp1 binding, as detected by ionic strength sensitive Kd and Km for Cyc1p. The decreased enzymatic rate of F230W could be explained by a disturbed binding of Cyc1p to the variant enzyme. F230 may influence the heme mid point potential and thereby the electron transfer rate to Cyc1p. Reduction of Cobp via both centre P and centre N was disturbed suggesting an interaction between high and low potential chain. Supramolecular association between QCR and cytochrome c oxidase (COX) in yeast mitochondria was probed by affinity chromatography of a his-tagged QCR in the presence of the mild detergent digitonin. In comparison to purification with laurylmaltoside, the presence of both QCR and COX subunits was detected in the elution fractions by SDS-PAGE, Cyc1p reductase and TMPD oxidase activity assays and immunoblot analysis. The CL-dependent formation of the supercomplex between QCR and COX was analysed by replacement variants in the CL-binding site of QCR in CL containing and CL free environment. With an increasing number of replacements of the three lysines the CL-binding pocket supercomplex formation was not abolished, when CL is present as shown by BN-PAGE analysis. This was supported by the synergetic decrease in enzyme activity for both enzymes upon increased number of replacements. In the CL-free environment, no supracomplex formation was observed for a wildtype CL binding site. By replacements of two lysines in the CL-binding pocket, supercomplex formation could be recovered as revealed by BN-PAGE. This indicates, that CL may serve as a charge neutralizer for the lysines near the presumed interaction domain between complex III and complex IV. The obtained results for centre P provide new information of residues critical for stabilisation of ubiquinol and controlling electron short circuit reactions. The observations for centre N variants clearly support the proposed two proton transfer pathways and the role of the bound phospholipids in centre N kinetics. Variants in the Cyc1p binding site suggest a role for F230 both in Cyc1p binding and electron transfer. Clear interaction between the high and low potential chain in both Cyt1p and centre N variants strongly support long-range interactions in the complex. Studies on the supramolecular association of complex III and complex IV indicate a new role of Cl in stabilising a supracomplex.
Es wurden die Herstellung von protaminbasierten Oligonukleotid-Nanopartikel („binäres System“) physikochemisch charakterisiert. Vermischt man Oligonukleotide mit einer wässrigen Protaminlösung entstehen nach wenigen Sekunden sehr kleine Partikel (<20 nm). Der Partikeldurchmesser nimmt mit der Zeit zu und stabilisiert sich nach etwa 30 Minuten. Danach sind die NP für mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur stabil. Die Größe, die Größenverteilung und die Gestalt der Partikel wurden bestimmt. Diese runden Partikel konnten in ihrer Größe durch die Veränderung von Protamin- und ON-Konzentration in ihrer Größe gesteuert werden (etwa 100-1000 nm Durchmesser). Die Veränderung der Kettenlänge der Oligonukleotide (10-25 mer) zeigte einen nur geringen Einfluss auf die Größe und Größenverteilung der Partikel. Auch konnte die Oberflächenladung (Zetapotential) der Partikel durch die Veränderung des Protamin/OligonukleotidVerhältnisses gesteuert werden. Analytische Ultrazentrifugations-Messungen (durchgeführt vom AK Prof. Schubert) mit diesen Partikeln zeigte das diese schon in geringen Salzkonzentrationen (15 mM NaCl) nach wenigen Minuten zur Aggregation neigen. Diese konnte durch 15% Polyethylenglykol 20.000 Lösung gestoppt werden. Dies war ein wichtiger Hinweis, dass man mittels Makromolekülen die Partikelpräparationen stabilisieren kann. Ferner wurde die Zusammensetzung der Partikel, sowohl hinsichtlich der Oligonukleotide und als auch des Protamingehaltes bestimmt. Mehr als 90% des Wirkstoffes konnte in die Nanopartikel eingebunden werden. Da das von uns verwendete Protamin keine aromatische Aminosäure beinhaltet (Absorptionsmaximum kleiner 200 nm) und die Standard-Proteinnachweise wie z.B. BCA-Assay nur ungenügende Nachweisgrenzen aufweisen, wurde eine neue Protamin-Quantifizierungmethode mittels ortho-Phthaldialdehyd (OPA) und N-Acetyl-L-Cystein (NAC) für die Mikrotiterplatten erarbeitet. Damit war es möglich, auch in Anwesenheit von DNA, Protamin und Protaminsalze in einer Konzentration von 250 ng/ml sicher nachzuweisen. Ein weiteres Problem mit diesem binären Partikelsystem, neben der Aggregationsneigung, zeigte sich in verschiedenen Zellmodellen (durchgeführt von Norbert Dinauer, AK von Briesen). Die Partikel wurden zwar im großen Maße von humanen Macrophagen, humanen T-Zellen aufgenommen, aber danach langsam freigegeben. Auch wurden intrazellulär Aggregate gefunden. Humanes Serum Albumin (HSA) zeigte einen positiven Effekt auf die Aggregationsneigung (AlPrO-Nanopartikel). Es fungiert hierbei als ein Schutzkolloid, welches nur zu einem geringen Teil in die Partikelmatrix inkorporiert wird (<10%). Der Großteil des HSA befindet sich in der äußeren wässrigen Phase. Es ist zu vermuten dass es sterische die Partikel an der Sekundäraggregation hindert. Zusätzlich konnten primäre Komplexe vor der Zugabe von HSA aus HSA und Protamin beobachtet werden (Durchmesser 14 nm). Dies führt zu einem veränderten Self-Assembly der Nanopartikel gegenüber dem binären System. AlPrO-Partikel, hergestellt mit 1 mg/ml HSA, waren über Stunden stabilisiert in Zellmedium. Sie sind von runder Gestallt und 200-350 nm im Durchmesser groß. Sie weisen eine leicht negative Oberflächenladung auf, was auf eine Abdeckung der Partikeloberfläche mit HSA hinweist. Nahezu die gesamte eingesetzte Menge des Oligonukleotides wurde in die Partikelmatrix inkorporiert (> 90%). Es war möglich Partikel dieser Qualität mit unmodifizierten-, phosphorothioat modifizierten Oligonukleotiden und doppelsträngiger RNA (siRNA) herzustellen. Die von uns entwickelten AlPrO-Nanopartikel stellen eine neue Möglichkeit der peptidbasierte Transfektion von Oligonukleotiden in Zellen dar.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich die Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von neuen RNA-bindenden Molekülen gerichtet. Grund dafür waren neue Erkenntnisse über die strukturelle und funktionelle Komplexität der RNA. So spielen spezifische RNA-Protein-Wechselwirkungen eine essentielle Rolle bei regulatorischen Prozessen. Die Spezifität dieser Interaktionen wird durch die dreidimensionale RNA-Struktur bestimmt. Somit bieten diese Wechselwirkungen ein attraktives Angriffsziel für die Suche nach niedermolekularen Substanzen, die in die regulatorischen Prozesse pathogener Organismen eingreifen. So gibt es im Replikationszyklus des HI-Virus mehrere essentielle Schritte, die der Interaktion zwischen charakteristischen, viralen RNA-Strukturen und der viralen Proteine bedürfen. Ein prominentes Beispiel ist die Verpackung der viralen RNA. Es handelt sich um einen hochspezifischen Prozess, bei dem aus einer Vielzahl von zellulären, viralen, gespleißten und ungespleißten RNA-Fragmenten, spezifisch die virale genomische RNA in die neu entstehende Partikel verpackt wird. Die Spezifität der Verpackung basiert auf der Erkennung der dreidimensionalen ps-Verpackungsstruktur am 5´-Ende der ungespleißten, viralen RNA durch die NCp7-Domäne des p55Gag- Vorläuferproteins. Die NCp7-Domäne ist durch zwei Zinkfingermotive, die in allen Onko- und Lentiviren mit Ausnahme der Spumaviren konserviert sind, gekennzeichnet. Durch die zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus bietet die ps-NCp7-Interaktion ein potentielles Angriffziel für antivirale Interventionen. Das langfristige Ziel des Projektes war die Identifizierung von Peptidliganden für das HIV-1 ps-Signal mittels der Phage-Display-Methode, welche die Basis für die Entwicklung antiviraler Moleküle liefern sollen. Die Methode des Phage-Display basiert auf der Affinitätsselektion von Peptiden, die als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein an der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert werden. Sie wurde sehr erfolgreich für die Selektion von Peptidliganden für Antikörper oder andere Proteindomänen eingesetzt. Für RNA-Targets gibt es nur gelegentliche Hinweise. Im Vordergrund des Projektes standen strukturelle Erkennungsmerkmale der Ligand-RNAWechselwirkung. Zur Identifizierung von Peptidliganden für das ps-Verpackungssignal sowie deren Teilelement SL3, das ebenfalls Verpackungsaktivitäten aufweist, wurden kommerzielle Phagen-Banken mit zufälliger Aminosäuresequenz eingesetzt. Im Rahmen des ersten Teilabschnitts konnten Phagen selektiert werden, die spezifisch an die Targetstrukturen gebunden haben und die Grundlage für die Ableitung von Peptidmotiven bildeten. Insgesamt konnten neun Motive abgeleitet werden, darunter das tryptophanreiche HXWPWW-Motiv, das Aminosäurehomologien zum nativen Liganden, dem NCp7-Protein, zeigte. Die Spezifität zur Ziel-RNA wurde mittels ELISA, CD-Spektroskopie und Peptidfilter-Bindungsstudien analysiert. Für die tryptophanreichen Peptide wurde die Affinität zur ps- und SL3-RNA ermittelt. Sie lag für das HWWPWWPeptid bei ca. 25 ± 2µM zur ps-RNA und bei ca. 34 ± 2µM zur SL3, also deutlich unter der Affinität des NCp7 (ca. 30nM). Entsprechend ließ sich das HWWPWW-Peptid in einem Kompetitions-ELISA mit ps-RNA als Target durch das native p55Gag- und NCp7-Protein, jedoch nicht durch ein unrelevantes RNA-bindendes Protein, verdrängen. Anschließend wurden mittels der CDspektroskopischen Mutationsanalyse die Bindungseigenschaften der Peptide optimiert, so dass zwei weitere Liganden, das HWWAWW- und HAWPWWPeptid, als potentielle ps-Liganden ermittelt werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die funktionelle Analyse der identifizierten Peptide hinsichtlich ihrer inhibitorischen Eigenschaften. Dazu wurden in HR´YFP-Zellen Pseudoviren, die das verpackbare Konstrukt ps-Yfp, sowie HIV-1 Gag-Pol und das Env des VSV-G enthielten, in Gegenwart des ps-bindenden Peptides, das als Rfp-Vpr-Fusionprotein vorlag, generiert. Eine Hemmung der Peptide auf die Verpackung der viralen RNA sollte dadurch messbar sein, dass die produzierten Pseudoviren weniger von der verpackbaren ps-Yfp-RNA enthielten als die Kontrollviren, die in Gegenwart eines Kontrollpeptids generiert wurden. Die Menge der Virus-RNA in den Partikeln wurde mittels einer quantitativen PCR-Methode, der Real-time-PCR, bestimmt. Einen hemmenden Einfluss auf die Verpackung der ps-Yfp-RNA und somit eine Inhibition der ps-NCp7-Interaktion hatte das HWWAWW-Peptid. Durch den Einsatz von 3 µg der HWWAWW-Rfp-Vpr-Vektors konnte die RNA-Menge um das fast 4000-fache im Vergleich zum Kontrollansatz reduziert werden.
Bei der in vitro Rückfaltung von entfaltetem, reduziertem Hirudin entstehen neben dem nativen Protein hauptsächlich zwei nicht-nativ gefaltete Konformere. Das Verhältnis von nativem und nicht-nativem Konformer lässt sich während der Rückfaltung durch verschiedene Parameter beeinflussen. Thiole wie reduziertes Glutathion (GSH), N-Acetylcystein (NAC) und Dithioerytritol (DTE) beeinflussten die in dieser Arbeit untersuchten Rückfaltungen auf verschiedene Weise. Während beim Zusatz von GSH sehr verstärkt die Bildung des nativen Konformers auftrat, wurde bei einem Zusatz von NAC und DTE einerseits ein leicht verbessertes Verhältnis von nativem zu nicht-nativem Konformer festgestellt, andererseits wurde aber eine stark vermehrte Oligomerbildung beobachtet. Die aufgestellte Theorie der Oligomerbildung konnte anhand graphischer Auswertung der zusätzlich auftretenden, im Nativgel höher laufenden Banden bestätigt werden. Bei Zusatz von GSH und GSSG (oxid. Glutathion) als Redoxpuffer im Molekülverhältnis 2:1 (10 mM) wurde bei 4°C eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin erreicht. Der Zusatz von 1 mM GSH bewirkte dagegen bei 28°C (höchste gewählte Temperatur) ebenfalls eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin-Konformer. Die Temperaturabhängigkeit der Rückfaltung zeigte sich auch in weiteren Untersuchungen. So ergaben die Rückfaltungen unter Zusatz von 1 mM DTE, NAC und 10 mM GSH bei 4°C eine wesentlich höhere Ausbeute an nativ gefaltetem Hirudin als bei höheren Temperaturen. Der pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 8,0 veränderte das Rückfaltungsmuster von Hirudin in den durchgeführten Untersuchungen nicht, obwohl Literaturdaten auf ein pH-Optimum von 8-9 für erfolgreiche Rückfaltungen hindeuten. Nativ und nicht-nativ gefaltetes Hirudin sowie die ebenfalls während der Rückfaltung entstandenen Oligomere ließen sich HPLC-chromatographisch trennen. Die in den Nativgelen auftretende, sehr übereinanderliegende Doppelbande des nicht-nativen Hirudins konnte per HPLC in zwei verschiedenen Konformere getrennt werden. Eine positive Beeinflussung der in vitro-Rückfaltung von Hirudin durch einen Zusatz der Oxidoreduktase Thioredoxin konnte eindeutig nachgewiesen werden. Bei einem äquivalenten Gehalt an Tioredoxin wurde die Rückfaltung zum nativen Konformer eindeutig begünstigt. Ein katalytischer Gehalt an Thioredoxin (Thioredoxin:Hirudin im Verhältnis 1:10) bewirkte die Rückfaltung ausschließlich zu nativem Hirudin. Auch bei einem Zwanzigstel Äquivalent Thioredoxin war noch eine positive Beeinflussung feststellbar. Bei einer S. lividans-Expression von Hirudin über ein pAX5a-Derivat wurde fast ausschließlich nicht-nativ gefaltetes Hirudin produziert. Die nicht-native Faltung war in einem Nativgel deutlich von der nativen, aktiven Form des Inhibitors zu unterscheiden. Durch Zusätze von reduziertem (GSH) und oxidiertem Glutathion (GSSG) zum Wachstumsmedium konnte der Anteil an nativem Hirudin erhöht werden. Die Zusätze beeinflussten aber stark die Gesamtausbeute des sekretierten Proteins. So wurden unter Zugabe von 1 mM GSH Ausbeuten von 200 mg/L Hirudin erreicht, davon 2 mg/L natives Protein. Die Gegenwart von verschiedenen Verhältnissen von GSH und GSSG (Gesamtkonzentration 1mM Thiol) reduzierte die Hirudinproduktion auf 20 – 32 mg/L, darunter war kein erkennbarer Anteil an nativem Hirudin. Ein Zusatz von gleichen Verhältnissen von GSH und GSSG in höherer Konzentration (10 mM) resultierte in einer Steigerung des Anteils an nativem Inhibitor auf 14 %, die Gesamtausbeute an Hirudin sinkt aber deutlich (15 mg/L insgesamt, 2 mg/L natives Protein). Die Oxidoreduktase Thioredoxin wurde ebenfalls über ein pAX5a-Derivat in S. lividans-Kultivierungen mit einer Ausbeute von 65 mg/L gewonnen. Eine Coexpression von Thioredoxin und Hirudin über ein bicistronisches Gen in einem pAX5a-Derivat resultierte in einer Proteinproduktion von 4 mg/L Thioredoxin und 20 mg/L Hirudin. Obwohl ein Verhältnis von 0,2:1 Moläquivalenten (Thioredoxin:Hirudin) in den in vitro-Rückfaltungen zu 100 % nativ gefaltetem Inhibitor führte, war in den Kultivierungen kein positiver Einfluß des Thioredoxins auf die Hirudinfaltung erkennbar. Die Expression von Thioredoxin setzte zeitlich sehr viel früher als die Hirudin-Expression. Die Produktion von Hirudin über einen integrativen Vektor erzielte 600 - 700 mg/L Protein. Wie in anderen Hirudinkultivierungen ohne Thiolzusatz wurde Hirudin ausschließlich in der inaktiven, nicht-nativen Struktur produziert. Kultivierungen der mit dem integrativen Thioredoxin-Vektor infizierten S. lividans-Zellen erzielten dagegen kein Protein. Die Coexpression von Hirudin und Thioredoxin scheiterte an dem nicht zu generierenden, bicistronischen integrativen Vektor. Um die Isomeraseaktivität des Thioredoxins zu erhöhen und somit eine größere Beeinflussung der Hirudinfaltung zu erzielen, wurden Thioredoxinmutanten hergestellt. Die redoxaktiven CXXC-Zentren der generierten Thioredoxine enthalten die Aminosäuresequenzen der CXXC-Motive von E. coli DsbA und DsbC und humanem PDI. Die Expression aller Mutanten gelang in zwei verschiedenen Medien. Eine Isolierung und Anwendung der gereinigten Mutanten in der Hirudinfaltung wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt. Die Konstrukte stehen für weitere Arbeiten zur Verfügung. In vergleichenden Expressionen mit fünf verschiedenen Signalsequenzen wurden sowohl das homologe Streptomyces-Protein Tendamistat als auch das heterologe Hirudin über jeweils alle Signalpeptide exprimiert. Tendamistat wurde schon zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase exprimiert Innerhalb der verschiedenen Kultivierungen wurden unterschiedlich hohe Expressionswerte erreicht. Eine ausgeprägte Anreicherung von Vorläufer-Proteinen in der Zelle fand nicht statt. Neben dem vorwiegend nativ prozessierten Tendamiastat zeigte eine Analyse der Massendaten eine teilweise falsche Prozessierung der AxeA-, CelB- und SnpA-Signalpeptide. Hirudin konnte ebenfalls über alle fünf Signalpeptide exprimiert werden. Dabei wurde fast quantitativ nicht-nativ gefaltetes Hirudin sekretiert. Die Höhe der Expression über die verschiedenen Signalpeptiden war unterschiedlich hoch, wobei die Unterschiede geringer als bei der Tendamistat-Expression waren. Die Massenanalytik belegte, dass die Prozessierung des heterologen Hirudins wesentlich uneinheitlicher erfolgte als die Prozessierung des homologen Tendamistats. Ein Zusammenhang zwischen der Expressionshöhe beider Proteine und verschiedener Strukturmerkmale der Signalpeptide konnte nicht festgestellt werden. So wurde die in der Literatur aufgestellte These, dass in der n-Domäne mindestens zwei Ladungen enthalten sein müssen, in dieser Arbeit nicht bestätigt. Weder die Struktur noch die unterschiedliche Ladung der n-Domäne der Signalpeptide zeigten einen eindeutigen Zusammenhang mit der Expressionshöhe der Proteine. Auch eine Verknüpfung zwischen der Länge der h-Domäne und der Expressionshöhe konnte weder für die Tendamistat- noch für die Hirudinexpression erstellt werden. Die Positionierung von Glutamin an Position –2 innerhalb der c-Domäne schien in der Tendamistatexpression bezüglich der Proteinausbeute von Vorteil zu sein. Bei der Expression von Hirudin wurde ein ähnlicher Trend nicht gefunden. Die Proteinproduktion über ein Signalpeptid mit enthaltenem TTALeu-Codon war entgegen Literaturaussagen möglich und verminderte - wie in der Hirudinexpression gezeigt - nicht automatisch die Expressionshöhe. Bei den Tendamistatkultivierungen wurde dieser Einfluss jedoch deutlich. Theoretische Betrachtungen zur Prozessierung anhand von Rechenmodellen waren hilfreich, um Beobachtungen zu erklären oder zu deuten. So wurde eine Erklärung der zusätzlichen falschen Prozessierung der Sigalpeptide vom homologen und auch vom heterologen Protein über theoretische Modelle wie z. B. eine Schnittstellenberechnung teilweise möglich. Die Überlegungen zum Transmembran-Bereich der Signalpeptide zeigen im Vergleich der Berechnungen für Tendamisitat und Hirudin, dass die Ladung des N-Terminus des anhängenden Proteins ein Rolle bei die Positionierung des Signalpaptids innerhalb der Membran spielt und somit auch für die Präsentation der Schnittstelle und eine erfolgreiche Prozessierung verantwortlich ist. Die bisher verfügbaren Literaturdaten lassen darauf schließen, dass es allgemeine Richtlinien in Bezug auf Aminosäurezusammensetzung, sowie Ladung und Länge der Signalpeptide gibt, deren Mißachtung eine Verringerung der Expressionshöhe von Proteinen bewirken. Diese Richtlinien scheinen aber hauptsächlich bei einzeln eingefügten Mutationen zu bestehen. Werden, wie in dieser Arbeit vorgestellt, ganze Signalpeptide ausgetauscht und die resultierende Expression beobachtet, können viele dieser Vorgaben nicht verifiziert werden oder stimmen nur in Einzelfällen überein. Trotzdem zeigt diese Arbeit, dass theoretische Betrachtungen für Vorhersagen zur Proteinexpression unabdingbar sind.
Durch anhaltende Entzündungsvorgänge oder Nervenläsionen kommt es zu einem vermehrten nozizeptiven Einstrom ins Rückenmark, was lang anhaltende Sensibilisierungsvorgänge an den zentralen Synapsen zur Folge hat. Auf molekularer Ebene kommt es dabei zur Regulation verschiedenster Proteinsynthesen. Diese plastischen Veränderungen im Zellstoffwechsel der Hinterhornneurone können eine Chronifizierung der zentralen Vorgänge bewirken. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels vergleichender Proteomanalyse Proteine identifiziert, die aufgrund chronischer Entzündungsschmerzen und neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark reguliert werden. In Folge einer durch Zymosan induzierten Pfotenentzündung konnten mittels 2D-Gelelektrophorese des Lumbalmarks der Ratte bei neun Proteinspots eine Regulation festgestellt werden. Diese Proteine sind möglicherweise an Mechanismen der zentralen Sensibilisierung in Hinterhornneuronen beteiligt und könnten als innovative Therapieansatzpunkte von Bedeutung sein. Ein Zusammenhang zwischen den identifizierten Proteinen und Mechanismen der Schmerzentstehung und -verarbeitung wurde bislang nicht beschrieben. Eines der Proteine, bei dem es zu einem deutlichen zeitabhängigen Abbau nach Zymosaninjektion kam, wurde massenspektrometrisch als Neurofilament light (NF-L) identifiziert. NF-L spielt insbesondere für die strukturelle Stabilität der Neurone und den axoplasmatischen Transport eine wichtige Rolle. Ein Abbau von Neurofilamenten im Rahmen von neurodegenerativen Erkrankungen wurde bereits mehrfach beschrieben. Für die Degradierung von NF-L wird hierbei hauptsächlich die Protease Calpain verantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Aktivierung von Calpain nach Zymosaninjektion sowohl im Lumbalmark als auch im entzündeten Pfotengewebe nachgewiesen. Der entzündungsassoziierte Abbau von NF-L im Rückenmark und den Hinterwurzelganglien konnte durch die einmalige Verabreichung eines spezifischen Inhibitors von Calpain verhindert werden. Eine Vorbehandlung der Tiere mit dem Calpain Inhibitor zeigte darüber hinaus antiinflammatorische und antihyperalgetische Effekte im Entzündungsmodell. Die antinozizeptive Wirkung des Inhibitors war dabei unabhängig davon, ob die Substanz systemisch (i.p.) oder am Rückenmark (peridural) appliziert wurde. Zusammenfassend zeigen die bisher genannten Ergebnisse, dass die Hemmung einer pathophysiologischen Aktivierung von Calpain ein neues, bislang nicht beschriebenes Wirkprinzip zur Behandlung von Schmerzen und Entzündungen darstellen könnte. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde das Protein Aldose Reduktase (AR), das ebenfalls nach Induktion einer peripheren Entzündung reguliert wurde, näher beleuchtet. Bislang wurde die AR vorwiegend mit der Entstehung diabetischer Spätschäden in Verbindung gebracht. Im Proteinmuster des Lumbalmarks zeigte sich dieses Protein durch zwei verschiedene Spots, wobei nach der Zymosaninjektion eine Verschiebung in der Intensität zwischen diesen beiden Varianten der AR beobachtet wurde. Da die AR nach der Entzündungsinduktion weder auf Transkriptions- noch auf Translationsebene reguliert wurde, ist von einer posttranslationalen Modifikation des Proteins auszugehen, wobei eine Phosphorylierung naheliegend erscheint. In Zellkulturexperimenten wurde gezeigt, dass die AR nach einer Stimulation der transfizierten Zellen mit proinflammatorischen Zytokinen abgebaut wird, wobei hierfür eine Aktivierung des Proteasoms verantwortlich zu sein scheint. Eine Hemmung des Abbaus konnte dabei nicht nur durch einen Proteasominhibitor sondern zum Teil auch durch Dexamethason erzielt werden. Die AR scheint daher bei Entzündungsprozessen auf verschiedene Arten reguliert zu werden. Weiterhin wurden Änderungen im Lumbalmark nach Induktion von neuropathischen Schmerzen proteomanalytisch untersucht. Beim Vergleich der Proteinexpressionsmuster zeigten sich bei vier Proteinen Regulationen infolge der Nervenläsion. Keines dieser Proteine wurde bislang mit neuropathischen Schmerzen in Verbindung gebracht. Eines der identifizierten Proteine, alpha-Crystallin, wurde sowohl bei neuropathischem Schmerz als auch bei chronischem Entzündungsschmerz herunterreguliert. Dieses Protein scheint daher mit beiden dieser chronischen Schmerzzustände korreliert zu sein. Die ansonsten beobachteten Änderungen waren jedoch spezifisch für das jeweilige Schmerzmodell, so dass davon ausgegangen werden kann, dass deutliche Unterschiede in den spinalen Sensibilisierungsvorgängen infolge einer Entzündung oder einer Nervenläsion bestehen. Mit der Identifizierung und Charakterisierung von schmerz- und entzündungsassoziierten Proteinen im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Beitrag zur Aufklärung bislang unbekannter Mechanismen der zentralen Sensibilisierung geleistet. Diese Erkenntnisse könnten in der Zukunft als Grundlage zur Entwicklung innovativer Therapieansätze für die Schmerztherapie genutzt werden.
Die Reinigung von Siliciumoberflächen verbraucht große Mengen von hochreinen und teueren Chemikalien. Komplexbildner dienen der Maskierung von Metallionen in den Reinigungschemikalien mit dem Ziel, die vorhandenen Reinigungsverfahren zu vereinfachen, den Reinigungsvorgang zu beschleunigen und Chemikalien und Kosten zu sparen. Zur Beurteilung, ob ein Komplexbildner für diese Anwendung geeignet ist, bedarf es eines analytischen Verfahrens zur Bestimmung seiner Stabilität in Halbleitersilicium-Reinigungsbädern. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden ob die HPLC für diese Aufgabe eingesetzt werden kann. Zusätzlich sollte versucht werden, über die Detektion und die Identifizierung von Zersetzungsprodukten Informationen über die Zersetzungsreaktion zu gewinnen. Es wurden Untersuchungen zur Komplexbildnerstabilität in verschiedenen Reinigungsbädern und in 30% H2O2 durchgeführt. Vier strukturell unterschiedliche Komplexbildner wurden untersucht. Pyrinan (N, N´, N´´-Tris (3-hydroxy-6-methyl-2-pyridylmethyl) 1, 4, 7-Triazacyclononan), ABS-BAMTPH (N,N’,N’’-tris [2-(N-hydroxycarbamoyl) propyl]-1,3,5-benzentricarboxamid), Tiron (Dinatrium-1,2-Dihydroxybenzen-3,5-Disulfonsäure) und die Pyridinone (3-Hydroxy-4(1H)-pyridinone). Bei den Pyridinonen handelte es sich um eine Gruppe von Komplexbildnern mit dem gleichen Grundgerüst, welches mit unterschiedlichen Substituenten verbunden war. Das Verhalten der Pyridinone in 30% H2O2 zeigt, dass es möglich ist mit relativ geringen Modifikationen der Molekülstruktur die Stabilität dieser Komplexbildner gegen Zersetzung zu steigern. Die auftretenden Zersetzungsprodukte wurden mit HPLC-MS untersucht. Die Beobachtung, dass in 30% H2O2 und in dem Reinigungsbad APM (H2O2/NH3/H2O-Gemisch) jeweils identische Zersetzungsprodukte auftraten deutet darauf hin, dass in beiden Fällen eine Oxidation durch H2O2 stattfindet. Die in 30% H2O2 beständigsten Komplexbildner waren ESEHP (Sulfoniumsubstituent) und BMHP (Alkylsubstituent). In APM war ECEHP am stabilsten (Carboxylsubstituent). Tiron wurde nur in 30% H2O2 untersucht. Seine Stabilität wird in dieser Lösung nur von 2 der 13 untersuchten Pyridinone, ESEHP und BMHP, übertroffen. Es wurden keine Zersetzungsprodukte detektiert. ABS-BAMTPH hingegen wurde nur in APM untersucht. In APM erwies sich ABS-BAMTPH als der am wenigsten stabile von allen untersuchten Komplexbildnern. Die Brauchbarkeit von ABS-BAMTPH wurde zusätzlich durch einen hohen Anteil an Nebenprodukten eingeschränkt, die bei der Synthese des Komplexbildners entstanden waren. Die Nebenprodukte konnten mittels HPLC-MS und Kenntnis des Syntheseweges identifiziert werden. Über die Zersetzungsreaktion(en) des Pyrinan konnte mit Hilfe von HPLC-MS und MS/MS eine Reihe von Informationen gewonnen werden. Eine Abfolge von Reaktionen wird zur Erklärung der beobachteten Zersetzung vorgeschlagen. Alle Reaktionen laufen an den 3 tertiären Amin-Stickstoffatomen des Pyrinans ab. Diese stellen den Schwachpunkt der Pyrinanstruktur dar. Die Bildung von Aminoxiden leitet die Zersetzung ein. Die Aminoxide reagieren über eine Meisenheimer-Umlagerung weiter. Eine komplexierende Wirkung der Zersetzungsprodukte kann aufgrund der beobachteten Stabilisierung des H2O2 gegen die durch Übergangsmetallionen katalysierte Disproportionierung angenommen werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, das die HPLC zur Untersuchung der Stabilität von Komplexbildnern in Halbleiter-Reinigungschemikalien geeignet ist. Die HPLC-MS und die MS/MS lieferten zusätzliche Informationen über Zersetzungsprodukte und die stattfindenden Zersetzungsreaktionen. Die HPLC-MS ist darin den bisher in der Halbleiterindustrie für diese Fragestellung benutzten analytischen Methoden überlegen.
Wasserstoffbrücken als strukturbildendes Element : Synthese und Berechnung supramolekularer Komplexe
(2004)
Die nicht-kovalente Synthese sowie die Berechnung der supramolekularen Komplexe wurden anhand dreier unterschiedlicher Stoffklassen demonstriert. Ziel war es, supramolekulare Dimere zu kristallisieren, die durch zwei Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden. Die zuerst untersuchten Indol-Derivate waren potentiell selbstkomplementär. Während der Donor im starren Indol-Ring lag, befand sich der Akzeptor in der Seitenkette, was zu konformationell flexiblen Verbindungen führte. Durch Variation des Abstandes von Donor und Akzeptor, was einer Verlängerung der Seitenkette durch zusätzliche CH2-Gruppen entsprach, sollte herausgefunden werden, bei welcher geometrischen Anordnung dimere Komplexe entstehen Die Ergebnisse zeigten, daß die gewünschten Dimere erst bei einer Kettenlänge von drei CH2-Gruppen um Kristall zu beobachten waren. Diese konformationell flexiblen Verbindungen wiesen somit große Unterschiede zwischen berechneter und realer Komplexgeometrie auf, die darauf zurückzuführen sind, daß im Kristall eine Vielzahl von Molekülen wechselwirken, während in der Rechnung mit dem Kraftfeldprogramm MOMO nur zwei Moleküle berücksichtigt werden. Somit führt die „Sandwich“-Form zu einer günstigeren van-der-Waals-Energie als die planare Form. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die Substanzklasse der Acetylhydrazone, welche ebenfalls potentiell selbstkomplementäre Verbindungen darstellen. Im Gegensatz zu den Indol-Derivaten wurde hier der Abstand zwischen Donor und Akzeptor konstant gehalten, um zu untersuchen, wie sich unterschiedliche Reste der Acetylhydrazone auf die Konformation der Moleküle und somit auch auf die Komplexgeometrie auswirken. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Verbindungen mit Resten unterschiedlicher sterischer Hinderung synthetisiert. Ziel war es auch in dieser Verbindungsklasse gezielt Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken zu kristallisieren. Eine Suche in der CSD zeigte schnell, daß Acetylhydrazone zwei Vorzugskonformationen besitzen: eine, in der Donor und Akzeptor eine anti-Anordnung besitzen, was in der Regel zu kettenförmigen Wasserstoffbrücken führt, und eine syn-Anordnung, die zu den gewünschten Dimeren führen sollte. Es galt nun zu untersuchen, welche dieser Reste zur syn-Konformation führt und welches die Vorzugskonformation der Acetylhydrazone ist. Die Untersuchungen zeigten, daß zwei sterisch anspruchsvolle Reste zur syn-Anordnung von Donor und Akzeptor führen und somit zu Dimeren im Kristall. Verbindungen mit zwei sterisch wenig anspruchsvollen Resten lagen hingegen in der anti-Konformation vor und bildeten wie erwartet Polymere. Für die Acetylhydrazone konnte folgende These aufgestellt werden: Die syn-Konformation entsteht, wenn beide Reste drei oder mehr (Kohlenstoff-) Atome besitzen, anderenfalls entsteht die anti-Anordnung. Die Rechnungen lieferten, bis auf eine Ausnahme, supramolekulare Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken. Für jene Verbindungen, die ebenfalls in der syn-Konformation in Dimeren kristallisieren, ist die Übereinstimmung zwischen der berechneten und der realen Komplexgeometrie sehr gut. Im letzten Kapitel dieser Arbeit sollten heteromolekulare Komplexe, also solche, die aus zwei unterschiedlichen Molekülen bestehen, untersucht werden. Die erste der eingesetzten Verbindungen sollte zwei Donor-Gruppen enthalten, während die zweite Verbindung zwei Akzeptoren besitzen sollte. Dabei wurde eine Reihe von Diol-Dion-Komplexen untersucht. Dabei gelang es nur einen dieser Komplexe zu kristallisieren und experimentell zu untersuchen. Leider lagen keine Dimere vor, sondern es bildete sich ein 2:1-Komplex (Diol/Dion), der kettenförmige Wasserstoffbrücken ausbildete. Erfreulich war hingegen, daß eine Konformationänderung des Dions zu beobachten war; denn gegenüber der Kristallstruktur der reinen Verbindung lag 25 im Komplex als planare Verbindung vor. Gleichzeitig wurden die möglichen Komplexgeometrien mit MOMO berechnet. Die meisten der berechneten Komplexe wiesen Dimere mit den gewünschten zwei Wasserstoffbrücken auf.
Monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente gegen sekundäre Arzneipflanzenmetabolite
(2004)
Monoklonale Antikörper sind seit vielen Jahren aus den biochemischen und molekularbiologischen Laboratorien nicht mehr wegzudenken. Sowohl in der Grundlagenforschung, als auch in der angewandten medizinischen Diagnostik und der Therapie spielen sie eine immer wichtigere Rolle. Dennoch konnten sich monoklonale Antikörper als Hilfsmittel im Bereich der Naturstoffanalytik bisher noch nicht durchsetzen. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand daher die Frage, inwieweit sich monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente für die Analytik komplexer Naturstoffgemische eignen. Eine der Zielstrukturen, gegen die monoklonale Antikörper generiert werden sollten, ist das pentazyklische Triterpen Oleanolsäure. Oleanolsäure ist als Aglykon in zahlreichen verschiedenen Triterpensaponinen enthalten. Triterpensaponine bzw. Triterpensaponin-haltige Arzneipflanzen spielen aufgrund ihres breiten Wirkungsspektrums in der Phytotherapie eine wichtige Rolle. Sie zeichnen sich nachweislich durch venentonisierende, antiödematöse, antiphlogistische, diuretische, expektorierende und broncholytische Eigenschaften aus. Da es sich bei den Triterpensaponinen um eine sehr heterogene Stoffgruppe handelt, ist ihre Analytik sehr aufwendig. Monoklonale Antikörper könnten daher bei der Analytik von komplexen Saponingemischen sehr nützlich sein. In Zusammenarbeit mit Frau Dr. Kerstin Brand aus dem Arbeitskreis von PD Dr. Werner Knöss (Universität Bonn) konnten verschiedene monoklonale Antikörper gegen Oleanolsäure etabliert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Bindungseigenschaften dieser Antikörper eingehend charakterisiert. In kompetitiven ELISAs konnten die Molekülepitope, an die die verschiedenen Antikörper binden, bestimmt werden. Außerdem wurden die Immunglobuline auf Kreuzreaktivitäten gegenüber 72 unterschiedlichen sekundären Arzneipflanzenmetaboliten untersucht. Die monoklonalen Antikörper zeigten dabei keine Interaktion mit Steroiden, Phytosterolen und Herzglykosiden – Substanzen die zwar in die Gruppe der Triterpene eingeordnet werden können, sich aber in ihrer Struktur und Stereochemie deutlich von der Oleanolsäure unterscheiden. Gegenüber zahlreichen pentazyklischen Triterpenen, die strukturelle Ähnlichkeiten mit der Oleanolsäure besitzen, zeigten hingegen alle untersuchten Immunglobuline eine ausgeprägte Kreuzreaktivität. Daher eignen sie sich für die Analytik von komplex zusammengesetzten Triterpengemischen, z.B. von Arzneipflanzenextrakten. Dies konnte durch verschiedene direkte und indirekte Kompetitionsversuche mit unterschiedlichen Arzneipflanzenextrakten im Rahmen dieser Arbeit und der Dissertation von Frau Dr. Kerstin Brand gezeigt werden. Mit Hilfe eines kompetitiven ELISAs ist z.B. ein Screening von unbekannten Arzneipflanzen auf Triterpensaponine möglich. Auch eine Wertbestimmung von Arzneipflanzen oder Arzneipflanzenextrakten mit Hilfe der monoklonalen Antikörper ist denkbar, sofern eine Referenz zur Verfügung steht, auf den die Kompetitionsergebnisse bezogen werden können. Der Einsatz der hier vorgestellten Antikörper wird allerdings dadurch eingeschränkt, dass die Immunglobuline eine unvorhersehbare Polyspezifität gegenüber den polyphenolischen Sekundärmetaboliten Quercetin und Ellagsäure zeigten. Bei einem Einsatz der Antikörper im Rahmen der Naturstoffanalytik sind daher Vorversuche erforderlich, um diese Substanzen zu identifizieren und wenn möglich zu entfernen. Einer der untersuchten monoklonalen Antikörper, der Antikörper der Zelllinie 10F10, zeigte eine Kreuzreaktivität gegenüber verschiedenen ß-Boswelliasäuren. Boswelliasäuren sind in der Lage, das Enzym 5-Lipoxygenase zu hemmen und dadurch die Synthese von entzündungsfördernden Leukotrienen zu inhibieren. Daher scheinen Boswelliasäuren viel versprechende Arzneistoffe bei der Therapie der unterschiedlichsten inflammatorischen Erkrankungen, wie z.B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Asthma bronchiale oder rheumatoider Arthritis zu sein. Der Antikörper der Zelllinie 10F10 soll im Arbeitskreis von Prof. Dieter Steinhilber am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Frankfurt unter anderem für eine Immobilisierung der Boswelliasäuren an Immunaffinitätssäulen eingesetzt werden. In diesem Arbeitskreis wird der Einfluss von ß-Boswelliasäuren auf die 5-Lipoxygenase intensiv erforscht. In einem zweiten Projekt wurden rekombinante scFv-Antikörperfragmente gegen das Triterpen Oleanolsäure und gegen das Pyrrolizidinalkaloid Retrorsin generiert. Pyrrolizidinalkaloide sind hepatotoxische Sekundärmetabolite, die in zahlreichen Nutzpflanzen und traditionellen Arzneipflanzen enthalten sind. Insgesamt wurden vier verschiedene scFv-Fragmente konstruiert. Zwei Anti- Oleanolsäure-Antikörperfragmente konnten in E. coli erfolgreich periplasmatisch exprimiert und ihre Funktionalität in verschiedenen Antigenbindungsstudien nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde eine Phagen-Display- und Phagen- Panning-Methode etabliert, mit deren Hilfe es möglich ist, gezielt nach funktionellen Antikörperfragmenten zu suchen. Mit dieser Methode sollte es möglich sein, nach erfolgter Mutation der verschiedenen scFv-Fragmente, Proteine mit neuen Bindungseigenschaften zu identifizieren. Interessant wären dabei z.B. scFv- Fragmente, die mit Pyrrolizidin-N-oxiden interagieren. Gegen diese Substanzen konnten im Arbeitskreis Dingermann mit Hilfe der konventionellen Hybridoma- Technologie bisher noch keine monoklonalen Antikörper generiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich bei monoklonalen Antikörpern und rekombinanten Antikörperfragmenten um interessante Hilfsstoffe für die Naturstoffanalytik handelt, deren Bedeutung für dieses Anwendungsgebiet aber bisher noch deutlich unterbewertet ist. Es wäre daher sehr interessant, die hier vorgestellten Projekte fortzuführen und die Arbeitsmethoden weiter zu optimieren. Mit den im Rahmen dieser Arbeit charakterisierten Anti-Oleanolsäure-Antikörpern stehen bereits drei Immunglobuline für die Arzneipflanzenanalytik zur Verfügung. Von allen drei Antikörpern liegen inzwischen auch scFv-Fragmente vor. Diese Fragmente könnten modifiziert und mit Hilfe der hier vorgestellten Phagen-Display-Methode nach Proteinen mit modifizierten Bindungseigenschaften gesucht werden. Letztendlich wäre auf diese Weise die Generierung eines großen Sortiments von Antikörpern und Antikörperfragmenten für die Analytik der unterschiedlichsten Substanzklassen möglich.
Ziel: Ziel der Untersuchungen war es, selektive und potente P2-Rezeptor-Antagonisten, die sich von Suramin und PPADS ableiten, zu ermitteln sowie die Charakterisierung UTP-sensitiver Rezeptoren in epididymalen Segmenten des Samenleiters der Ratte vorzunehmen. Methoden: Am Samenleiter der Ratte (P2X1-Rezeptoren) und dem Ileum des Meerschweinchens (P2Y1-Rezeptoren) wurden Kontraktions-Inhibitions-Studien durchgeführt. Zur Untersuchung des UTP-sensitiven Rezeptors im Samenleiter der Ratte wurden Kontraktions-, Kontraktions-Inhibitions-Studien und histochemische- bzw. immunzytochemische Studien herangezogen. Ergebnisse: Durch Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Analoga des NF023, Suramin, NF279, PPADS und SB9 konnten symmetrische Suramin-Analoga, wie NF816 (pA2=6,45) und unsymmterische NF279-Analoga, wie NF786 (pA2=6,76), erhalten werden, die potent, selektiv und kompetitiv ADPßS-induzierte Kontraktionen des Meerschweinchen-Ileums antagonisierten. Auch die heterodimer-bivalente Verbindung SB9, erwies sich an nativen P2Y1 -Rezeptoren als potenter, selektiver und kompetitiver Antagonist (P2Y1:pA2=6,91 vs. P2X1: pA2=5,98). Darüber hinaus ist SB9 P2-Rezeptor-spezifisch und schwach wirksam an Ekto-Nukleotidasen von Oozyten des Südafrikanischen Krallenfrosches (IC50 = 40 MikroM). Zur Charakterisierung des UTP-sensitiven Rezeptors des Samenleiters der Ratte wurde Evans Blau verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass Evans Blau die Spaltung von exogenem ATP zu 75 % hemmt. Insbesondere die glatte Muskulatur ist ATPase-aktiv. An epididymalen Segmenten ist UTP (100 MikroM Evans Blau) ein voller Agonist (EC50 = 36 MikroM). Die Kontraktion beruht auf der Aktivierung postsynaptischer Strukturen und wird nicht durch UDP oder Uridin beeinflusst. Mit Agonisten konnte in Anwesenheit von 100 MikroM Evans Blau folgende Reihe der Wirkstärke erhalten werden: natürliche Agonisten, Ap4A > ATP = ADP = UTP > UDP; synthetische Agonisten, 2MeSATP > ATPgammaS > ADPßS. In Anwesenheit von 100 MikroM Evans Blau wurden UTP-induzierte Kontraktionen durch PPADS (IC50 = 20 MikroM) und Reaktiv Blau 2 (IC50 = 43 MikroM) nicht aber durch Suramin und MRS 2179 gehemmt. P2Y2-Rezeptor-spezifische Antikörper ergaben die Expression von P2Y2-Rezeptoren auf der glatten Muskulatur des Samenleiter der Ratte. Schlußfolgerungen: Analoga als auch pharmakophore Gruppen des Suramins und PPADS eignen sich als Ausgangs-Verbindungen bzw. -Strukturen zur Synthese von potenten und Subtyp-selektiven P2-Rezeptor-Antagonisten. Die Wirkungen von UTP sind durch P2u-Rezeptoren vermittelt. Die Ergebnisse deuten auf die Beteiligung von P2Y2- bzw. P2Y4-Rezeptoren in epididymalen Segmenten des Sameneiters der Ratte hin.
A new experimental setup, for pump-probe fs DFWM measurements, which is based on a femtosecond laser system, has been constructed. It allows for the investigation of molecular species in the gas phase at different temperatures, from ~30 K in a seeded supersonic jet up to ~500 K in a heat-pipe oven. In comparison to other RCS methods the employed fs DFWM technique is less complicated and gives much higher signal-to-noise ratio [BFZ86, FeZ95a, CKS89, CCH90, HCF91, WRM02, Rie02]. A general computer code for the simulation of fs DFWM spectra of nonrigid asymmetric top molecules has been developed. This new DFWM code in combination with a non-linear fitting routine allows one to determine rotational and centrifugal distortion constants and obtain information on the polarizability tensor components from the experimental spectra. Fs DFWM spectroscopy was successfully applied to the medium-sized molecules benzene and benzene-d6 in a gas cell and in a supersonic jet. The spectrum from a seeded expansion has been measured up to delay time of 3.9 ns (restricted by the length of the delay stage) with excellent signal-to-noise ratio (102-103). In that way 87 and 72 J-type transients have been recorded for benzene and benzene-d6, correspondingly. A relative accuracy on the order of 10-5 has been achieved for the rotational constant. From the room temperature experiments, precise values of centrifugal distortion constants DJ and DJK have been extracted. The literature data for cyclohexane have been revised and a new precise rotational constant B0 has been obtained, which is (+5.5 MHz) shifted from the one reported in the former Raman investigation by Peters et al. [PWW73]. Additionally, high-level ab initio calculations of cyclohexane have been carried out using a large number of basis sets at several levels of theory. In particular, the vibrational averaging effects have been examined in order to critically compare the experimentally determined and theoretically evaluated rotational constants. The contribution of highly symmetric vibrational modes to vibrational averaging effects was clarified. More structural information could be obtained from fs DFWM measurements of asymmetric top species, since different type of rotational recurrences can appear, and all three rotational constants (A, B, C) can be extracted. On the other hand the analysis of the asymmetric top spectra is no longer trivial. In fact the simple formula for rotational recurrence periods of symmetric top species (Tab. 2.1) can not be applied to asymmetric top molecules. Thus, in order to extract high-resolution data for asymmetric species, a complete fitting of the experimental spectra is necessary. The fs DFWM and (1+2') PPI method have been applied to the asymmetric top molecules pyridine in the ground (S0) and pDFB in the S0 and electronically excited (S1) states. By fitting the measured fs DFWM spectra the rotational and centrifugal distortion constants have been extracted with good precision and the value of the parametrized polarizability angle of pDFB was obtained. In this work, the first application of fs DFWM spectroscopy to a molecular cluster has been reported. Also, the chemical equilibrium between monomeric and dimeric species was studied. In particular formic and acetic acid have been investigated in a gas cell and in a supersonic expansion. Many spectral features have been observed and analized in the fs DFWM spectrum of formic acid vapor in a gas cell at room temperature. Most of them were attributed to rotational recurrences of the formic acid monomer, but also spectral feature originating from the formic acid dimer of O-H×××O/O×××H-O type have been detected and analyzed. From the fitted simulation, the rotational and centrifugal distortion constants, and parametrized polarizability angle were extracted for the dimeric structure of O-H×××O/O×××HO type. With the assumption of unperturbed monomers a center-of-mass distance of R = 2.990 ± 0.001 Å for the monomers within the dimer has been calculated from the spectroscopic results. This distance is 0.028 Å smaller than that reported from electron diffraction [ABM69]. Thus, the centers-of-mass distance was assigned as the main point of disagreement between results of fs DFWM and electron diffraction experiments. In contrast to formic acid, acetic acid shows strong recurrences from dimeric species even in the fs DFWM spectra at room temperature. This is explained in terms of different symmetry of the moments-of-inertia tensor, which modulates the intensity of RRs (the fs DFWM signal is in general stronger from symmetric species). Due to the symmetric nature of the acetic acid dimer, only the sum (B+C) of the rotational constants has been extracted. The changes of geometrical parameters upon dimer formation have been analyzed for, both, formic and acetic acid. A heat-pipe oven has been used in order to overcome the main drawback of fs DFWM spectroscopy – the square dependence of the signal intensity on the sample number density. Two-ring molecules (cyclohexylbenzene, para-cyclohexylaniline and nicotine) with low vapor pressure (<0.1 mbar) at room temperature have been investigated. From the analysis of the experimental and ab-initio results for CHB and pCHA a nearly perpendicular conformation of the aromatic vs. cyclohexane ring for both system is inferred. The enlargement of the benzene ring of CHB in the electronically excited state (S1) has been found to cause the smaller rotational constants in S1. This conclusion has been drawn from the comparison of the ground and electronically excited state experimental rotational constants in combination with ab-initio calculations. The extraction of precise structural information for nicotine was not possible due to it weak fs DFWM signal. However, the fact that fs DFWM technique can be applied to conformational analysis of molecular species in an equilibrium mixture opens other applications for this kind of spectroscopy. In general the results obtained in this work show that the fs DFWM technique, being an experimental implementation of RCS, provides one with an important tool for structural analysis of molecular species in the gas phase in particular for the species to which microwave spectroscopy can not be applied. It gives spectra with excellent signal-to-noise ratio even at low number density samples expanded in a seeded supersonic jet. It provides an alternative and innovative approach towards rotational Raman spectroscopy of large polyatomic molecules applicable under various experimental conditions (broad temperature and pressure range). With the introduction of femtosecond (10-15s) laser pulses (usually picosecond (10-12s) laser pulses were used in RCS) an improvement in time-resolution and therefore in precision for the rotational constants by more than one order of magnitude has been achieved. Molecular systems in the ground electronic state without permanent dipole moment and chromophore can be studied with high precision, providing thereby molecular benchmark systems for the electronic structure theory. As has been shown, the study of molecular clusters by fs DFWM spectroscopy is possible, but its potential are restricted by the square dependence of the fs DFWM signal from the sample number density, which is even more important for supersonic jet expansions. Here, the application of near-resonant and resonant FWM schemes should help in order to compensate for the low sample concentration. With the introduction of the heat pipe oven for fs DFWM experiments, the investigation of large nonvolatile molecules under equilibrium conditions is possible now. In our laboratory the first results on the structural analysis of different conformers of pyrrolidine in the gas phase have been obtained [MaR04]. This method can have even more prospects for the structural investigations of large molecular species in combination with new non-thermal gas phase sources for nonvolatile molecules, like laser desorption [CTL89], laser oblation [MHL83], electrospray [FMM90], laser induced liquid beam ion desorption [KAB96, Sob00] etc. A very recent application of the fs DFWM technique is the investigation of the influence of strong laser fields on molecular gas phase sample, which could range from active alignment [PPB03] over molecular deformation to field ionization [CSD03]. In regards to future development in fs DFWM spectroscopy for more complex molecules one has to take into account, how large amplitude motions such as the van der Waals vibrations or internal rotation (see section 6.4.2) affect the rotational coherences. In any case, femtosecond Degenerate Four-Wave Mixing as experimental implementation of Rotational Coherence Spectroscopy can be considered as an innovative, developing, and powerful method for the structural investigation of the molecular species, which are hard to study by classical frequency-resolved spectroscopy [FeZ95a, Dan01, Rie02].
Nitric oxide (NO) represents a short-lived mediator that pivotally drives keratinocyte movements during cutaneous wound healing. In this study, we have identified p68 DEAD box RNA helicase (p68) from a NO-induced differential keratinocyte cDNA library. Subsequently, we have analyzed regulation of p68 by wound-associated mediators in the human keratinocyte cell line HaCaT. NO, serum, growth factors and pro-inflammatory cytokines were potent inducers of p68 expression in the cells. p68 was constitutively expressed in murine skin, but rapidly down-regulated upon injury. The down-regulation appeared to be transient, as p68 protein expression increased again after the inflammatory phase of repair. However, p68 protein expression did not completely disappear during wound inflammation, as immunohistochemistry and cell fractiona tion analysis revealed a restricted localization of p68 in keratinocyte nuclei of the developing epithelium. In line, cultured human (HaCaT) and murine (PAM 212) keratinocyte cell lines showed a nuclear localization of the helicase. Moreover, confocal microscopy revealed a strong localization of p68 protein within the nucleoli of the keratinocytes. Functional analyses demonstrated that p68 strongly participates in keratinocyte proliferation and gene expression. Keratinocytes that constitutively overexpressed p68 protein were characterized by a marked increase in serum-induced proliferation and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, whereas down-regulation of endogenous p68 using small interfering RNA (siRNA) markedly attenuated serum-induced proliferation and VEGF expression. Altogether, our results suggest a tightly controlled expression and nucleolar localization of p68 in keratinocytes in vitro and during skin repair in vivo that functionally contributes to keratinocyte proliferation and gene expression.
Reliable communication in the central nervous system requires the precise control of the duration and the intensity of neurotransmitter action at specific molecular targets. After their release at the synapse, neurotransmitters activate pre- and/or postsynaptic receptors. To terminate synaptic transmission, neurotransmitters are in turn inactivated by either enzymatic degradation or active uptake into neuronal and/or glial cells by neurotransmitter transporters. In the present study, two types of membrane proteins involved in transcellular signal transduction were investigated, the P2X receptors, which are ATP-gated ion channels and the glutamate transporters of the EAAT family. The first part of this study is concerned with the targeting and anchoring of P2X receptors at specific locations. P2X receptors play a role of fast excitatory neurotransmission to extracellular ATP in both the peripheral and central nervous system. For several ligand-gated ion channel, like glycine receptors or nicotinic acetylcholine receptors, it is known that specific binding proteins exist, which are involved in receptor trafficking and anchoring of the receptors at appropriate sites on the synapse. Within the P2X family, amino acid homology is scattered over the protein sequence excepted of the cytoplasmic C-terminal tails, which do not share significant sequence similarity, indicating that they might provide peculiar properties to the respective receptor isoforms. Using GST fusion proteins containing the C terminal end of the P2X2A, P2X5 and P2X7 subunits as baits, ßIII tubulin was identified by MALDI-TOF mass spectrometry as a direct interacting partner of P2X2A. ßIII tubulin did not interact with P2X5 nor with P2X7. The tubulin binding motif of P2X2A could be confined to a 42 amino acid long region ranging from amino acid 371 to 412 of the complete P2X2A subunit. This domain, which includes a total of six serine residues and twelve proline residues, interestingly overlaps to a significant extent with a 69 amino acid long sequence, which is lacking in P2X2B, a splice variant of P2X2A. P2X2B receptors are known to desensitize - significantly faster than P2X2A receptors. The interaction of the P2X2A receptor with ßIII tubulin may contribute to receptor desensitization as well as tethering of the P2X2A receptor at specialized regions of the cell. In a second part of this work, the oligomeric state of two distantly related glutamate transporters, the human glial glutamate transporter hEAAT2, and the glutamate transporter ecgltP of E.coli was determined. Excitatory amino acid transporters (EAATs) buffer and remove synaptically released L-glutamate and maintain its concentration below neurotoxic levels. Mammalian glutamate transporter subunits are known to form homomultimers, but controversial numbers of subunits per transporter complex have been reported, ranging from 2-5. Both hEAAT2 and ecgltP proteins expressed at high levels in Xenopus laevis oocytes, from which they were purified in a [35S]methionine-labeled form under nondenaturing conditions by metal affinity chromatography. Blue native PAGE analysis revealed that both the hEAAT2 and ecgltP transporters exist exclusively as homogenous populations of homotrimers in Xenopus oocytes. The trimeric structure was corroborated by chemical crosslinking. Also, ecgltP purified as a recombinant protein from its natural host E.coli migrated as a trimeric protein on blue native PAGE gels. The conservation of the quaternary structure from prokaryotes to mammals assigns an important functional role to the trimeric structure. Glutamate transporters are known to exhibit a dual mode of operation by functioning both as glutamate Na+/K+/H+ co-transporters and as anion channels. It is intriguing to speculate that the EAAT monomer is responsible for the secondary active transport of glutamate, whereas a barrel-like arrangement of the three subunits forms a central anion pore mediating anion conductivity.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
The detailed mechanism of the 20 S proteasome from Thermoplasma acidophilum is unknown. Substrates are degraded processively to small fragments without the release of intermediates, but the basis for this unique degradation mode remains obscure. The proteasome is a molecular machine, but how the different nanocompartments interplay and whether more than one substrate can be treated simultaneously has not been elucidated yet. To address these questions we had to disable the functionality of one aperture in order to dissect whether the other pore can compensate for the loss. As it is challenging to introduce mutations solely around one pore aperture of the highly symmetrical construct, we chose a novel approach by unique orientation of the proteasome at interfaces. For this purpose we purified recombinant 20 S proteasomes, where hexahistidine tags were fused either around the entrances or at the sides. According to electron microscopic studies we immobilized these constructs uniformly either end-on or side-on at metal-chelating interfaces (lipid vesicles, lipid monolayers and self-assembled thiol monolayers). Degradation of small fluorogenic peptides and large proteins like casein was analyzed. Small substrates were degraded with comparable activity by free and immobilized proteasomes, irrespective of their orientation. Thus it can be assumed that peptides can pass the sealed entrance of the 'dead-end' proteasome. However, larger substrates like fluorescently labeled casein were processed near the temperature optimum by side-on immobilized and soluble proteasomes with threefold activity compared to end-on immobilized proteasomes. Hence it can be concluded that one pore is sufficient for substrate entry and product release. In other words, the pore and antechamber can fulfil a triple function in the import and unwinding of substrates and the egress of products. With means of surface plasmon resonance the exact substrate/proteasome stoichiometry could be determined to ~1 for 'dead-end' proteasomes and ~2 for side-on immobilized (active and inactive) proteasomes. Most importantly, a fit with the Hill equation revealed positive cooperativity for side-on immobilized (Hill coefficient ~2) in contrast to end-on immobilized proteasomes (Hill coefficient ~1). Thus in case of soluble proteasomes two substrates bind presumably in opposite antechambers with positive cooperativity. The off-rate of casein as substrate is twofold for the active side-on immobilized proteasome in comparison to the end-on immobilized proteasome. The exact 2:1 stoichiometry of the off-rates equals the ratio of exit pathways amenable in case of side-on orientated versus 'dead-end' immobilized proteasomes. Thus crevices along the cylindrical body of the 20 S proteasome seem not to participate in the egress of small products. An inactive proteasome mutant displays a concentration-dependent off-kinetic against casein. Accordingly, the off-rate of the bisubstrate:proteasome complex can be attributed around half the value of the monosubstrate:proteasome complex. Consequently, substrates exit the inactive proteasome via the route of access due to obstruction of the trans side with an entering substrate. Hence the active proteasomes have to chop substrates down to small fragments prior to release through both pores. Thus the processive degradation mode might result from positive binding cooperativity. The on-rate constants for casein suggested that substrate association represents a two-step process comprising a rate-limiting translocation step and a fast binding step. As fluorescence cross-correlation revealed that two substrates can be co-localized in the proteasome and bind successively with increasing affinity (KD,1 = 8 µM versus KD,2 = 700 nM), an allosteric transition in the proteasome can be assumed. Combining our results with the data from other research groups led to a mechanistic model for the 20 S proteasome. Accordingly, the first substrate undergoes a slow translocation step, binds in the antechamber and diffuses subsequently to the catalytic centers, where it is degraded. By switching on the catalytic activity, the pores at both termini are dilated via conformational changes. Hence entry of the second substrate into the proteasome is facilitated due to omission of the rate-determining translocation step. The second substrate is either accommodated in the antechamber before it is processed (alternating degradation) or, most probably, is directly threaded into the central cavity (simultaneous degradation). As effusing peptides compete with entering proteins for binding in the antechamber, the pores are kept in an open state. After finishing digestion the pores are closed and a new degradation cycle can be reinitiated. In summary, substrate association with the proteasome underlies an ordered alternating binding mechanism in contrast to the random mode of degradation. Thus the two-stroke engine offers the advantage of speeding up degradation without enhancing complexity.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Zellzyklusabhängigkeit der CD95- vermittelten Apoptose besteht. Dazu wurde ein ecdysoninduzierbares Genexpressionsystem für die induzierte Überexpression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 in RKO-Zellen (Kolonkarzinomzellen) zur Herbeiführung eines Zellzyklusarrests in der G1-Phase benutzt. Nach Induktion mit dem Ecdysonhomolog Muristeron wurde durch Zugabe von rekombinanten hCD95-Liganden Apoptose ausgelöst und anschließend untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Induktor Muristeron an sich und nicht die p21- bzw. p27-Überexpression die anti-apoptotische Akt-Kinase aktiviert, die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL erhöht, die Caspase-8-Aktivierung (entweder am CD95-DISC oder durch "Feedback"-Aktivierung durch Caspase-3) und die darauf folgenden Ereignisse verhindert und somit die hCD95L-induzierte Apoptose blockiert. Zusätzlich beeinflusst der Induktor auch das Genexpressionsmuster der behandelten Zellen, was ebenfalls für die Hemmung der Apoptose mit verantwortlich sein könnte. Somit ist das ecdysoninduzierbare Genexpressionsystem zur Apoptoseuntersuchung in RKO-Zellen nicht verwendbar. Mit der Untersuchung des Apoptoseverhaltens proliferierender RKO-Zellen konnte gezeigt werden, dass überlebende Zellen nach hCD95L-Behandlung vermehrt in der G0/G1-Zellzyklusphase nachweisbar sind, während apoptotische (Caspase-3-positive) Zellen aus der G2/M-Phase heraus sterben. Allerdings weisen die apoptotischen Zellen kaum Cyclin B1 auf, ein für die G2-Phase wichtiges und typisches Cyclin. Somit bleibt die genaue Verknüpfung von Zellzyklusregulation und Apoptose auch nach diesen Analysen ungeklärt. In einem dritten Ansatz - Zellzyklusarrest durch Dichtearretierung - konnte eine Hemmung der CD95- vermittelten Apoptose in der arretierten Zellpopulation nachgewiesen werden. Allerdings sekretieren RKO-Zellen einen anti-apoptotischen Faktor in ihr Medium, dessen Konzentration und Wirkung mit größerer Zelldichte zunimmt und somit für die Protektion, unabhängig von Zellzyklusarrest oder Proliferation, verantwortlich ist. Konfluente und auch mit konditioniertem Medium behandelte RKO-Zellen zeigen im Vergleich zu dünn ausgesäten RKO-Zellen Veränderungen, die denen sehr ähnlich sind die beim Übergang einer epithelverankerten Zelle zu einer migrierenden Einzelzelle (EMT) auftreten. Beispielsweise verändert sich die Zusammensetzung des Zytoskeletts, die Zellen verlieren den Zell-Zell-Kontakt und lösen sich ab, bleiben aber am Leben. Zusätzlich steigt die Sekretion von Zytokinen an, die Angiogenese, Migration und Invasion positiv beeinflussen. Sowohl konfluente als auch mit konditioniertem Medium behandelte sub-konfluente Zellen sind apoptoseresistent (hCD95L, TRAIL, UV, Staurosporin), woran u.a. die Kinasen PKC und PI3K, aber auch das anti-apoptotische Bcl-xL beteiligt sind. Die Zellen sterben interessanterweise, wenn ein agonistischer anti-CD95-Antikörper statt des rekombinanten CD95-Liganden verwendet wird, was vermuten lässt, dass eine mangelhafte Vernetzung der einzelnen DISC-Komplexe zur Apoptosehemmung führt, welche durch den Antikörper dann aber erzwungen wird. Zwar handelt es sich hierbei um ein reines Zellkulturmodell, dennoch könnte es bedeuten, dass die Umgebung in einer dichten RKO-Zellkultur vergleichbar ist mit der in größeren soliden Tumoren. Die Zellen brauchen Nährstoffe, versuchen über eine Neovaskularisierung Anschluss an ein Blutsystem zu finden und sekretieren Lockstoffe, Wachstumsfaktoren sowie Proteasen, um die Metastasierung zu erleichtern. PI3K, cPKCs und Bcl-xL tragen dabei zu einer Apoptoseresistenz bei, welche die Zellen zum einen resistent gegenüber Anoikis, Nährstoffmangel, aber auch gegen angreifende zytotoxische T-Zellen macht. Eine weitere Aufklärung der hier ablaufenden Prozesse würde es erleichtern, Möglichkeiten zu finden, in diese Signalwege einzugreifen, um die Apoptosesensitivität wieder herzustellen und die Metastasierung zu verhindern. Insbesondere ist die Identifizierung des für die Apoptoseprotektion verantwortlichen Zytokins das nächste wichtige Ziel bei der Fortsetzung dieser Arbeiten.
Die Familie der ubiquitären ATP binding cassette (ABC)-Membranproteine katalysiert unter Hydrolyse von ATP die Translokation von Substraten über biologische Membranen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion des osmoprotectant uptake (Opu) Systems A aus B. subtilis untersucht, das aus drei Untereinheiten, der ATPase OpuAA, dem integralen Membranprotein OpuAB und dem Substrat-Bindeprotein OpuAC, besteht und unter hyperosmolaren Bedingungen die kompatiblen Solute Glycin-Betain (GB) und Prolin-Betain (PB) in die Zelle importiert, um eine Plasmolyse zu verhindern. Sämtliche Untereinheiten wurden getrennt oder als OpuAA/AB Komplex in E. coli überproduziert und bis zur Homogenität isoliert. OpuAA zeigte ein dynamisches Monomer-Dimer Gleichgewicht (KD= 6 µM), das durch Nukleotide beeinflusst wurde. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke konnten Monomer und Dimer getrennt isoliert und analysiert werden. Die Affinitäten und Stöchiometrien der OpuAA/Nukleotid Komplexe wurden unter Verwendung des fluoreszierenden TNP-ATP bzw. einer Nukleotid-sensitiven Trp-Mutante des OpuAA untersucht. Das Monomer hatte ein Molekül TNP-ATP gebunden, während zwei Moleküle TNP-ATP in dimerem OpuAA detektiert wurden. Die Affinität von Nukleotiden zu OpuAA nahm in folgender Reihe zu: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Eine Erhöhung der Ionenstärke bewirkte nicht nur eine Erniedrigung der KD-Werte von OpuAA/Nukleotid Komplexen, sondern auch eine Steigerung der ATPase Aktivität. In 1 M NaCl zeigte das Monomer basale ATPase Aktivität, während das Dimer nur sehr geringe Aktivität hatte, jedoch durch Zugabe von OpuAB und OpuAC aktiviert wurde. K+ wurde als ein Modulator der ATPase Aktivität von OpuAA identifiziert. Die Zugabe von TNP-ADP/Mg2+ induzierte in dimeren OpuAA einen konformellen Wechsel, der zu einem Zerfall des Dimers führte. Monomer und Dimer hatten gegenüber Nukleotiden unterschiedliche Affinitäten, was eine unterschiedliche Architektur der Nukleotid-Bindetasche implizierte. Die Architektur des OpuAA Dimers wurde mittels FRET untersucht. Dazu wurde OpuAA ortspezifisch mit Fluorophoren markiert und ein Verfahren etabliert, in dem die intermolekularen Distanzen des Dimers bestimmt werden konnten. Ein Vergleich der Distanzen mit anderen NBD Dimeren zeigte, dass OpuAA eine zu BtuD oder MalKE. coli vergleichbare Dimer Architektur mit einer head-to-tail Orientierung hat. Die Struktur des OpuAC/GB und OpuAC/PB Komplexes wurde durch Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2,7 Å bzw. 2,8 Å aufgeklärt und zeigte zwei globuläre Domänen, die über zwei Peptidsegmente miteinander verbunden waren. Die delokalisierte positive Ladung des Liganden war von einem cluster aus drei Trp-Resten, dem sog. "Tryptophan-Prisma", über kationische-p-Interaktion komplexiert. Nach Ligandenbindung wurden beide Domänen durch eine Wasserstoffbrücke zwischen den konservierten Asp22 und Trp178 überbrückt. Dieser molekulare Schalter wurde von OpuAC genutzt, um Affinitäten von GB und PB zu regulieren.
Die 2-DE-Technik wurde in der Mitte der 70er Jahre von O` Farrelle und Klose vorgestellt, die schon damals die Inhalte ganzer Zellen unter denaturierenden Bedingungen in hunderte bzw. tausende Proteinspots auftrennen konnten. Mangelnde Reproduzierbarkeit und fehlende Auswertungsmöglichkeiten verhinderten jedoch zu diesem Zeitpunkt eine breite Anwendung und damit größeres Interesse an der Methode. In den 80er Jahren erreichte die Methode mit der Einführung immobilisierter pH-Gradienten und der MALDI-Massenspektrometrie einen entscheidenden Wendepunkt. Seit dem Ende der 80er Jahren wird die Methode aufgrund der Möglichkeit der gleichzeitigen Proteinidentifizierung und Quantifizierung auch zunehmend in der Krebsforschung in der Suche nach neuen Markerproteinen eingesetzt. Das Uterusgewebe ist ein Organ, das während der reproduktiven Phase im Leben einer Frau ständig zyklisch verlaufenden physiologischen Änderungen unterworfen ist. Das Leiomyom, ein gutartiger monoklonaler Tumor aus den glatten Muskelzellen des menschlichen Uterus, ist eine der häufigsten gynäkologischen Erkrankung in der westlichen Welt, über deren Ursachen trotz intensiver Forschung nach wie vor fast nichts bekannt ist. Die 2-DE-Technik eignet sich in hervorragender Weise zur Untersuchung derartiger Abweichungen in der Proteinexpression während eines Krankheitsprozesses. Bezüglich der Methodenetablierung und ihrer Reproduzierbarkeit im speziellen Fall des Uterusgewebes bildet der Zellaufschluss der Probe, insbesondre aus harten Geweben, einen zentralen Punkt in der Erarbeitung der Methodik der 2-DE, da ein hohes Risiko besteht, einen großen Teil der Proteine schon während der ersten Probenbearbeitung zu verlieren. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Aufschlussmethode für die Aufarbeitung des zähen Muskelgewebes ohne größere Proteinverluste entwickelt, indem das Uterusgewebe zunächst mechanisch (Ultra-Turrax) und anschließend mit Ultraschall homogenisiert wird. Die Solubilisierung der Proteinprobe bildet den zweiten wichtigen Punkt der 2-DE-Methodik. Die Solubilisierung während der Proteinextraktion und des Eintritts der Proteinprobe in die fokussierende Gel-Matrix, die aufgetragene Proteinmenge, die Fokussierungsparameter und die zweite Dimension wurde so optimiert, dass die Proteinauflösung eine konstant hohe Qualität auf den Gelen erreichte und damit eine semiquantitative Auswertbarkeit gesichert wurde. Bezüglich der Reproduzierbarkeit der Methode wurden die methodeninhärenten Probleme wie Gelfärbung, Probenpräparation und Auswertungsverfahren untersucht. Die Methodenvalidierung bezüglich der Gelfärbung zeigte, inwieweit die Auswertung, insbesondre bei schwachen Spots, beeinflusst werden kann. Im allgemeinen wurde die angewendete 2-DE-Technik für die Proteinanalyse des Uterus für gut reproduzierbar gefunden. Die Bestimmung der HKP lieferte die Grundlage einer gewebetypischen Proteindatenbank und erlaubt es außerdem, über die Gele ein Koordinationssystem zu legen, mit dem nachfolgende Proteinidentifizierungen erleichtert werden können. In dieser Arbeit konnten 48 Spots als HKP identifiziert werden. Als thematischer Schwerpunkt der Dissertation wurden die Abweichungen der Proteinexpression im Fall des Uterus myomatosus im Vergleich zu einem Kollektiv ohne muskuläre Pathologie des Uterus untersucht. Die Analyse der 2-DE von Patientenproben ergab gegenüber einer schwachen Expression bei den Vergleichsproben eine Überexpression von Prohibitin (PHB1), alpha-2-Aktin und human Growth Hormon Rezeptorprotein (hGhRP) im Endometrium bzw. im darunter liegenden subendometrialen Myometrium und eine hohe Expression im Tumorgewebe (Myomgewebe). Weiteres zeigte die 2-DE-Analyse bei Patientenproben eine Downregulation von zwei Proteinen (beta-4-Proteasom und Fibrinogen) im Gegensatz zur Expression bei den Gesunden. Die analytischen Ergebnisse aus Tumorgeweben verglichen mit den SE-und SS-Geweben derselben Patientinnen zeigten eine deutliche Expression von einigen Proteinen (Desmin, F-Actin, Transaldolase, Thioredoxin-Peroxidase und mutative Glutathion-Transferase), deren Expression in den morphologisch unauffälligen Geweben aller Schichten des Uterus nicht zu beobachten war.
Schichten V/Al-Intermetallischer Phasen und Schichten aus V(Al) (Schichtdicken 150- 300 nm) wurden durch Interdiffusion von V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten bei 400-800°C im Vakuum bei 3 x 10-8 mbar hergestellt. Des Weiteren wurden V5Al8-Schichten durch Sputtern einer V5Al8-Legierung erzeugt. Die Gesamtstöchiometrie der Schichten lag zwischen Al0,86V0,14 und Al0,19V0,81. Als Substrat dienten einkristalline (012) Saphirwafer. Die V/Al-Intermetallischen Phasen und V(Al) wurden im RTP-System bei 600-1250°C mit NH 3 umgesetzt. Zum Vergleich der Reaktivität wurden die V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten auch ohne vorherige Vakuumtemperung in NH3 getempert. Die Proben wurden mittels XRD, SNMS, TEM/EFTEM, ESCA, XRR und AFM untersucht. Die V/Al-Mehrfachschichten besaßen eine starke Welligkeit, die von der starken Al-Schichtdickenschwankung herrührte. Trotz dieser Welligkeit zeigten die V- und Al-Schichten der V/Al-Mehrfachschicht eine ausgeprägte Textur. Die V-Schichten waren (110) und die Al-Schichten (111) texturiert. Die Bildung von (112) texturiertem Al3V erfolgte bereits bei 400°C, die Bildung von (110) texturiertem V 5Al8 und V(Al) bei 700°C. In der Nähe der Oberfläche durchmischten sich die V- und Al-Schichten aufgrund von O- und C-Einlagerung während der Vakuumtemperung nicht vollständig, und man beobachtete die Bildung von V-Oxiden. Je größer der V-Gehalt der Intermetallischen Verbindung bzw. V(Al), desto größer war die Reaktivität gegenüber Sauerstoff. Bei der Nitridierung der durch Interdiffusion gewonnen Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 beobachtete man die Bildung von (001) texturiertem AlN an der Oberfläche. Durch die Nitridierung verarmte die Intermetallische Phase an Aluminium und es bildeten sich die V-reicheren Intermetallischen Verbindungen. Weitere Nitridierung führte zur Bildung von (001) texturiertem V2N. Bei der Nitridierung von V0,81(Al)0,19 bildete sich zunächst V(Al)(N), das bei weiterer Nitridierung zunächst in V2N und schließlich in VN und AlN überging. Das Reaktionsverhalten der Intermetallischen Phasen und der V(Al)-Phase stimmte weitestgehend mit dem von Yong Du et al. berechneten ternären Al/V/N-Phasendiagramm überein. Bei der Nitridierung von V0,61(Al)0,39 beobachtete man jedoch ebenfalls die Bildung von V2N. Dies widerspricht dem berechneten V/Al/N-Phasendiagramm, nachdem sich bei dieser Zusammensetzung auch AlN bilden sollte. Möglicherweise ist das Zweiphasengebiet V(Al)(N) + V2N breiter. Die Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 zeigten im Vergleich zu reinem Vanadium eine stark verminderte Reaktivität gegenüber NH3. Dies ist auf die Passivierung der Oberfläche durch die AlN-Bildung zurückzuführen. Die ebenfalls schwächere Reaktivität der V(Al)-Phase lässt sich mit der geringen Löslichkeit an Stickstoff in V(Al) und der sehr wahrscheinlich höheren Aktivierungsenergie für die V2N-Bildung erklären. Die Reaktivität der V/Al-Mehrfachschichten war deutlich größer als die der Intermetallischen Phasen. Hierfür ist mit Sicherheit der höhere Anteil an Korngrenzendiffusion verantwortlich. Zum anderen könnte Vanadium die AlN-Bildung katalysieren. Bei der direkten Nitridierung wurde die oberste V-Schicht zu einer VN-Schicht umgesetzt. Die Nitridierung ist also nahe der Oberfläche schneller als die Interdiffusion der Metalle. In Richtung der Oberfläche beobachtete man eine stark ansteigende Al-Konzentration, wofür die im Vergleich zu VN höhere Freie Enthalpie von AlN verantwortlich ist. Durch das Sputtern einer V5Al8-Legierung konnte das Problem der Oxidbildung bei der Interdiffusion umgangen werden. Eine dünne Aluminiumoxidschicht bildete sich jedoch bereits schon bei der Lagerung an Luft. Die Reaktivität der gesputterten V5Al8-Schichten unterschied sich nicht wesentlich von der interdiffundierter V/Al-Mehrfachschichten vergleichbarer Stöchiometrie. Tiefenprofilanalysen an nitridierten V5Al8-Schichten machten deutlich, dass zwischen 600 und 900°C eine bemerkenswerte Menge an Sauerstoff in die AlN-Schicht eingebaut wurde. Ab 900°C stieg die Dicke der Aluminiumoxinitridschicht stark an. Eine weitere Temperaturerhöhung auf 1250°C führte zu keiner sign ifikanten Zunahme der AlN-Schichtdicke, jedoch zu einer starken Reduktion des O-Gehalts im AlN. Gleichzeitig beobachtete man bei 1250°C eine partielle Ablösung der AlN-Schicht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf dem Gebiet reaktiver Silicium-Spezies folgende apparative und experimentelle Forschungsergebnisse erzielt: Zunächst wurde eine Hochtemperatur-Pyrolyse Anlage entworfen, die mit Hilfe von Hochvakuum-Bedingungen (p< 5x10 hoch -9 mbar) Verdünnungseffekte simuliert, um die in der Gasphase erzeugten Moleküle unter solchen Bedingungen zu studieren, bei denen sie keine Folgereaktionen mit weiteren Partnern eingehen können. In die Apparatur integriert wurde ein Ofen (Tmax ungefähr gleich 1200°C) für die Pyrolyse von Stoffgemischen sowie zur Analyse des erzeugten Molekularstrahls ein Quadrupol-Massenspektrometer (0-300 amu, EI-Quelle, SEV). Es wurden Precursoren synthetisiert, die durch Thermolyse infolge intramolekularer Umlagerungen und Abspaltungen definierter Abgangsgruppen Si=X-Doppelbindungen (X= O, S) ausbilden. Diese Precursoren und ihre Pyrolyseprodukte wurden sowohl in der neuen Anlage als auch mittels eines vorhandenen PE-Spektrometers charakterisiert. Parallel zu den Synthesen wurden quantenmechanische Berechnungen an den Produkten der Pyrolysereaktionen durchgeführt, um ihre Eigenschaften, wie z.B. die Orbitalenergien und ihre Strukturparameter, zu bestimmen. Die Ergebnisse sollten die Interpretation der spektroskopischen Untersuchungen (PE und MS) unterstützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Fragestellungen bearbeitet, die in anderen Teilprojekten der Arbeitsgruppe von essentiellem Interesse sind. Dabei wurden Lösungen zu Fragestellungen der direkten Si-C-Knüpfung und von Silylen-Reaktionen erarbeitet. Eine Versuchsreihe, die durchgeführt wurde, beschäftigte sich mit den Hochtemperaturreaktionen von SiCl4 und SiF4. Die flüchtigen Ausgangssubstanzen wurden im Pyrolyseofen bei ansteigenden Temperaturen mit pulverförmigem elementarem Silicium oder SiO umgesetzt. Hierbei wurden die Bildungsbedingungen von Dihalogensilylenen in der Gasphase optimiert. In einer weiteren Fragestellung wurden die Thermolyseeigenschaften von Si und SiO untersucht. Beide Feststoffe können ab einer Temperatur von ca. 1000°C und einem Druck von 2x10 hoch -6 mbar atomar bzw. molekular in die Gasphase überführt werden. Dort reagieren sie mit Halogensilanen unter Bildung von Silylenen und Chlorsilanen. Weiterhin wurde eine Disproportionierung von SiO zu Silicium und SiO2 unter hohen Temperaturen beobachtet; konsequenterweise wird dabei Sauerstoff freigesetzt. Weiterhin wurde versucht, die Produkte der Halogensilan-Pyrolyse mit Oxidationsmitteln wie Ethylenoxid zur Reaktion zu bringen. Zuletzt wurden Hydrolyse-Versuche mit SiCl4/SiF4 bzw. :SiCl2/:SiF2 und Wasser untersucht.
Die Entwicklung von Wirkstoffträgern für Antisense-Oligdesoxyonukleotide auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln stellt einen interessanten Ansatz für antivirale Strategien dar. So konnte gezeigt werden, dass bereits ab einem 1,5-fachen Massenüberschuss an Protamin eine spontane Komplexbildung mit Antisense-Wirkstoffen stattfindet, die einen Größenbereich von etwa 200 nm aufweisen und durch eine Oberflächenladung von ca. + 20 mV charakterisiert sind. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften besitzen diese Nanopartikel nahezu ideale Eigenschaften, die intrazelluläre Verfügbarkeit von Antisense-Wirkstoffen entscheidend zu verbessern. Eine sehr gute zelluläre Aufnahme von Protamin/Antisense-Nanopartikeln konnte entsprechend in primären humanen Makrophagen als auch in lymphozytären T-Zellen gezeigt werden. Die Anwendung dieser Wirkstoffträger in den beschriebenen Zellen erwies sich dabei als sehr gut verträglich und zeigte keine toxischen Wirkungen in insgesamt drei unterschiedlichen Testverfahren zur Bestimmung der Zelltoxizität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Protamin/Antisense-Nanopartikel mit unmodifizierten Antisense-Oligodesoxynukleotiden ein sehr günstiges intrazelluläres Auflösungsverhalten besitzen, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung des inkorporierten Antisense- Wirkstoffs führte. Dabei wurde deutlich, dass nach spätestens 72 Stunden ein vollständiger Zerfall des Nanopartikels stattfand und der Wirkstoff sich gleichmäßig in intrazellulären Kompartimenten verteilte. Im Gegensatz dazu stellen Protamin/Antisense-Nanopartikel mit modifizierten Phosphorothioat-Wirkstoffen ein äußerst stabiles System dar, das zu keiner merklichen intrazellulären Wirkstofffreisetzung selbst nach 72 Stunden führte. Es konnte gezeigt werden, dass Protamin/AS-ODN-Nanopartikel die Expression eines von einem lentiviralen Vektor exprimierten Reportergens konzentrationsabhängig in primären humanen Makrophagen inhibieren konnte. Die antivirale Wirksamkeit dieser Wirkstoffträger konnte auch gegen das HIV-1-spezifische Transaktivatorprotein Tat in transient transfizierten Zielzellen der HIV-1-Infektion spezifisch demonstriert werden. Hier wurde eine selektive Inhibition der Tat-vermittelten Transaktivierung von 35 % bei einer Konzentration von 2 MikroM in Jurkat-Zellen nachgewiesen. Auch in primären Makrophagen, die mit einem HIV-1-Wildtypisolat infiziert wurden, führte die Anwendung von Protamin/AS-ODN-Nanopartikeln mit spezifischen Sequenzen gegen ein HIV-1-Gen zu einer deutliche Reduktion der Virusausbreitung in der Kultur. Bei einer wiederholten Behandlung von HIV-1-infizierten Makrophagen mit Protamin/AS-ODN-Nanopartikel in einer Konzentration von 2 MikroM zeigten nur einige wenige Zellen eine Infektion mit dem Virus, während sich in unbehandelten Zellen eine komplett durchinfizierte Kultur manifestiert hatte. Entsprechend der ungünstigen Bioverfügbarkeit von AS-PTO-Wirkstoffen nach intrazellulärem Transport in Form von Protamin-Nanopartikeln konnte für diese Formulierungen keine biologische Wirkung in Zellkultursystemen nachgewiesen werden. Die Inkorporation von destabilisierenden Zusätzen in die Nanopartikelmatrix bietet hier Möglichkeiten, die intrazelluläre Dekomplexierung dieser Wirkstoffträger günstig zu beeinflussen. Als Neuentwicklung konnte ein kolloidales Trägersystem für siRNA-Wirkstoffe auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln entwickelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Protaminbase als auch Protaminsulfat siRNA-Wirkstoffe ab einem 2,5-fachen Massenüberschuss komplexieren. Protamin basierte Nanopartikel für siRNA-Wirkstoffe waren durch ein sehr günstiges Zellaufnahmeverhalten und fehlende zytotoxische Wirkung in primären humanen Makrophagen gekennzeichnet. Trotz dieser idealen Ausgangsbedingungen zeigten biologische Wirksamkeitstestungen sowohl gegen das endogene Protein Lamin A/C als auch virale Hemmversuche in HIV-1- infizierten primären Makrophagen nur marginale Effekte. Eine weitere Optimierung der Nanopartikelzusammensetzung und Untersuchungen zur intrazellulären Stabilität sind nötig, um die biologische Aktivität dieser Formulierungen entscheidend zu verbessern. Oberflächenmodifizierte Nanopartikel auf der Basis von Gelatine erwiesen sich in den durchgeführten Experimente als besonders vielversprechend. Hier konnte gezeigt werden, dass ein spezifisches Targeting von T-Zellen mit CD3-Gelatine-Nanopartikel realisiert werden kann, die auf ihrer Oberfläche kovalent einen anti-CD3-Antikörper tragen, der gegen die T-Zell spezifische Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes gerichtet ist. Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie zeigten, dass dabei die Zellaufnahme dieser Wirkstoffträger von der Expression des durch den Antikörper erkannten Zielantigens auf der Oberfläche der Zielzellen ist. In Zellen mit besonders starker Expression des CD3-Epitops wurden Gelatine-Nanopartikel mit oberflächengebundenem anti-CD3-Antikörper zu einem sehr bedeutendem Ausmaß selektiv aufgenommen. In Kompetitionsexperimenten mit freiem anti-CD3-Antikörper konnte diese Aufnahme deutlich reduziert werden, was für die selektive Bindung und Internalisierung der CD3-Gelatine- Nanopartikel über den oberflächengebundenen Antikörper schließen läßt. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD3-Gelatine-Nanopartikel das Potential besitzen, als selektives Wirkstoffträgersystem für T-Zellen eingesetzt zu werden.
Mit der nichtenzymatischen templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA zu Selektionsexperimenten
(2004)
Die vorliegende Dissertation beruht auf der Nichtenzymatischen Templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA. Dazu inkubiert man einen farbstoffmarkierten Primer mit komplementären Templaten und aktivierten Monomeren, den 2-Methyl-Phosphorimidazoliden. Die Verlängerung des Primers wurde durch Gelelektrophorese mit anschließender Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs nachgewiesen. Eine erfolgreiche Primerverlängerung ist an viele Vorraussetzungen gebunden. Wichtig ist, dass der Duplex in der A-Konformation vorliegt. Deshalb ist es nötig, dass wenigstens der Primer oder das Templat aus RNA besteht. Von großem Vorteil ist, wenn die Basenpaare drei Wasserstoffbrücken ausbilden können. Auch die Stapelwechselwirkung ist ebenso wichtig für eine effiziente Kettenverlängerung, der Einbau von Purinen verläuft besser als der Einbau von Pyrimidinen. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Durchführung eines nichtenzymatischen PCR-artigen Experiments möglich ist. Das Verlängerungsprodukt der Hin-Reaktion wurde durch eine präparative Polyacrylamid Gelelektrophorese isoliert. Dieses diente dann als Templat für die Rückreaktion. Das Experiment aus Hin- und Rückreaktion bildete die Grundlage für ein Selektionsexperiment. Die Template wurden dafür um Zufallspositionen erweitert, die zwischen die Primerbindestellen eingefügt wurden. Nach mehrmaligem Durchlaufen des Zyklus aus Hin- und Rückreaktion sollte es sich zeigen, ob sich bestimmte Nucleotide in den Sequenzen angereichert haben. Zur Analyse wurde eine Methode basierend auf einer RP-HPLC entwickelt. Die vollverlängerten Produkte wurden mittels Gelelektrophorese isoliert und durch basische Hydrolyse in Monomere gespalten. Nach anschließender enzymatischer Dephosphorylierung konnte der Anteil der Nucleoside durch RP-HPLC bestimmt werden. Die erste erfolgreiche Anwendung fand diese Methode in der Analyse des Einbaus gegenüber T (U). Hier konkurrieren nämlich D (A) durch Watson/Crick-Paarung und G durch Wobble-Paarung um die Bindestelle. Aus diesem Grund bildeten sich bei Templaten aus C und T und der Inkubation nur mit G-Imidazolid allein die vollverlängerten Produkte zu einem hohen Anteil. Bei Reaktionen mit den Imidazoliden G und D konnte gezeigt werden, dass gegenüber T der Watson/Crick Partner D etwa dreimal häufiger eingebaut wurde als G. Eine weitere wichtige Grundlage für ein Selektionsexperiment bildete die Untersuchung, ob sich gegenüber Zufallspositionen überhaupt eine Kettenverlängerung feststellen lässt. Dazu wurde die Verlängerung unterschiedlicher Primer mit Templaten untersucht, die an einer oder mehreren Stellen Positionen aus [C/T] oder [A/C/G/T] enthielten. Es war deutlich zu sehen, dass die Verlängerung an solchen random-Sequenzen möglich ist. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn man entweder nur mit 2-MeImpG allein oder mit 2-MeImpG und 2-MeImpD inkubierte. Die Verwendung aller vier Imidazolide aus C, D, G und U führte zwar auch zu vollverlängerten Produkten, ihr Anteil war aber deutlich geringer. Eine andere wichtige Aufgabe dieser Dissertation war die Aufklärung der Ursache für die kritische Länge der Template. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von G-Quadrupelsträngen nicht der Grund ist, der den reibungslosen Einbau an längeren "homoC" Templaten verhindert. Zusätze von NaCl oder LiCl beeinflussten die Effizienz dieser Reaktionen kaum. Gute Resultate wurden bei der Verlängerung an Homopyrimidin-Templaten, die aus C und T bestanden, erzielt. Das vollverlängerte Produkt bildete sich bei der Verwendung von 2-MeImpG und 2-MeImpD in hohen Ausbeuten. Interessante Resultate ergaben sich im Fall des Einbaus von C an "homoG" Templaten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn völlig auf Na+-Ionen verzichtet wurde. Die Verwendung von Li-Imidazoliden, die auch in höherer Konzentration eingesetzt werden konnten, steigerte die Effizienz dieser Reaktionen deutlich. Durch das reduzierte stacking liefen alle Reaktionen allerdings langsamer und unvollständiger ab als beim Einbau von G an "homoC" Templaten. Die Stabilisierung des Duplexes durch stacking ist also entscheidend für erfolgreiche Primerverlängerungen. Überraschend schlechte Ergebnisse waren zu beobachten, wenn die Template gleichzeitig aus G und C aufgebaut waren. Die vollständig verlängerten Produkte wurden zu einem sehr geringen Anteil gebildet. Zusätzlich zum geringeren stacking der Pyrimidine, wurden Unregelmäßigkeiten in der Doppelhelixstruktur, die durch das abwechselnde Auftreten von Purinen und Pyrimidinen verursacht worden sind, als Ursache ausgemacht. Als neue Vorrausetzung für eine effiziente Kettenverlängerung hat sich also das Vorliegen einer regelmäßigen Doppelhelixstruktur herausgestellt.
Die 5 Lipoxygenase (5 LO) ist das Schlüsselenzym in der Synthese von Leukotrienen. Sie wird auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene reguliert. Die Differenzierung myeloider Zelllinien mit 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) und transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGFbeta) führt zu einer Erhöhung der 5 LO mRNA-, Protein-Bildung und der zellulären Enzymaktivität. Hier wurde gezeigt, dass dabei reife, nicht jedoch prä-mRNA der 5 LO im Zytosol und im Zellkern stark angereichert wird und dass beide Agentien in die mRNA-Prozessierung eigreifen. Obwohl die Bindung von VDR-Retinoid-X-Rezeptor (RXR)-Heterodimeren an Bindungsstellen im 5 LO-Promotor mittels DNAseI-Footprinting und EMSAs nachgewiesen wurde, konnten Reportergene unter der Kontrolle des 5 LO-Promotors in transienten und stabilen Transfektionen durch 1,25(OH)2D3/TGFbeta nicht stimuliert werden. Offensichtlich wird die Induktion der Expression der 5 LO durch 1,25(OH)2D3/TGFbeta durch Elemente außerhalb des Promotors vermittelt. In transienten Transfektionen führte der Einbau der kodierenden Sequenz der 5 LO in Luziferase-Plasmide bei Cotransfektion von VDR/RXR zu einer 5 fachen Induktion der Reportergen-Aktivität durch 1,25(OH)2D3/TGFbeta, was durch zusätzlichen Einbau der letzten vier Introns auf eine 13-fache Erhöhung gesteigert wurde. Der VDR zeigte einen Ligand-unabhängigen Effekt. Diese Reportergen-Effekte waren promotorunabhängig und von der kodierenden Sequenz gesteuert. RT-PCR-Analyse wies auf eine Deletion von Teilen der kodierenden Sequenz im Laufe der mRNA-Prozessierung hin, was durch 1,25(OH)2D3/TGFbeta verhindert wird. Auch Cotransfektion der TGFbeta-Effektoren Smads 3/4 führte in Abhängigkeit von der kodierenden Sequenz und in geringerem Maße von der 3'-UTR und den Introns J M, aber unabhängig vom Promotor, zu einer starken Erhöhung der Reportergenaktivität. Die 5 LO-Expression wird in den untersuchten Zellen vermutlich durch posttranskriptionelle Prozesse (Splicing, mRNA-Reifung) herunterreguliert, während 1,25(OH)2D3/TGFbeta die Expression der 5 LO durch eine Gegenregulation zu erhöhen, an der Komplexe beteiligt sind, die vermutlich Smads, VDR-RXR-Dimere, andere Transkriptionsfaktoren, Coaktivatoren, RNA-Polymerase II und Splicing-Faktoren enthalten. Hyperacetylierung des 5 LO-Promoters durch Inkubation mit mit dem Histondeacetylase-Inhibitor TsA führte zu einer transkriptionellen Aktivierung. Die kodierende Sequenz (und die Introns) wirkt diesem Effekt vermutlich durch die Rekrutierung von HDACs an VDR oder Smads, die direkt oder indirekt an die kodierende Region binden, entgegen.
Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen sind hochspezialisierte Zellen des Immunsystems, die durch Sekretion der Serin-Protease Granzym B (GrB) und des membranolytischen Proteins Perforin Virusinfizierte, körperfremde oder auch Tumorzellen durch Induktion von apoptotischem Zelltod eliminieren. Während Perforin für die Aufnahme von Granzym B in Zielzellen verantwortlich ist, wirkt Granzym B im Zytosol als aktive Effektor-Caspase und spaltet Caspase-3 und andere zelluläre Caspasen sowie verschiedene zentrale Caspasen-Substrate. Granzym B aktiviert damit wie Caspase-3 Apoptose-Signalwege am unteren Effektorende und umgeht daher die meisten Kontrollmechanismen, die in Tumorzellen häufig dereguliert sind und zur Resistenz gegenüber klassischer Chemo- und Strahlentherapie führen. Beide Proteasen stellen damit vielversprechende Enzymaktivitäten für die Verwendung als Effektorfunktion in Tumorzell-spezifischen zytotoxischen Fusionsproteinen dar. In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinante Formen von Granzym B und Caspase-3 hergestellt und daraufhin untersucht, ob beide Enzyme mit dem ErbB2-spezifischen "single chain" Antikörper scFv (FRP5) als Tumorzell-spezifischer Zellbindungsdomäne fusioniert werden können, ohne dadurch die Faltung der Proteasen zu verhindern, um eine gezielte Applikation in Tumorzellen und Eliminierung der Zellen durch Apoptose zu ermöglichen. Die Herstellung von Granzym B als rekombinantes Protein im präparativen Maßstab war bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. In dieser Arbeit konnte humanes aktives Granzym B in der Hefe Pichia pastoris mit Ausbeuten von 1 bis 4 mg/l Kultur exprimiert werden. Zum Nachweis der enzymatischen Aktivität wurde ein in vitro Assays etabliert, bei dem rekombinante Procaspase-3 als Substrat für Granzym B eingesetzt wurde. Nach intrazellulärer Applikation mit einem synthetischen Transduktionsreagens induziert das gereinigte Protein Apoptose in HeLa Zellen. Wie für endogenes Granzym B in der Literatur beschrieben, wird rekombinantes Granzym B aus Pichia pastoris sehr schnell in HeLa Zellen aufgenommen, lokalisiert aber in vesikulären Strukturen, in denen die enzymatische Aktivität eingeschlossen ist. Aus verschiedenen Expressionskulturen wurden jedoch zwei unterschiedliche Proteine isoliert, die bei vergleichbarer molarer Masse und enzymatischer Aktivität in Zellen aufgenommen wurden bzw. nicht internalisierten, was darauf hinweist, daß eine posttranslationale Modifikation der Protease für die Bindung von Granzym B an Zielzellen verantwortlich ist. Während für die Freisetzung von Granzym B aus den Membranvesikeln und Induktion von Apoptose Perforin erforderlich ist, konnte in dieser Arbeit beobachtet werden, daß Kulturen verschiedener etablierter Tumorzellinien nach Behandlung mit Granzym B auch in Abwesenheit von Perforin-Aktivität auffallende morphologische Veränderungen zeigen, die mit dem partiellen Verlust des Kontakts zum Kultursubstrat verbunden sind. Dies deutet darauf hin, daß Granzym B auch extrazellulär auf Zellen einwirkt, indem es Komponenten der extrazellulären Matrix spaltet, und so indirekt Apoptose durch Anoikis induziert. Dieser Effekt ist jedoch für eine mögliche therapeutische Verwendung von Granzym B nicht von Bedeutung, da relativ hohe Proteinkonzentrationen erforderlich sind. Um Granzym B selektiv gegen Tumorzellen zu richten, wurden verschiedene Fusionen mit dem "single chain" Antikörper scFv(FRP5) sowie einer bakteriellen Translokationsdomäne von Exotoxin A oder Diphtherietoxin konstruiert und in E. coli oder Pichia pastoris exprimiert. Während verschiedene in E. coli hergestellte Fusionsproteine nicht enzymatisch aktiv waren, konnte im Überstand einer Pichia Expressionskultur volle-Länge GrB-scFv(FRP5) sowie Granzym B Aktivität nachgewiesen werden. Die Expressionsrate war allerdings so gering, daß eine präparative Isolierung nicht möglich war. Es konnte damit aber gezeigt werden, daß die Fusion heterologer Proteindomänen an den C-Terminus von Granzym B unter Erhalt der enzymatischen Aktivität prinzipiell möglich ist, während zusätzliche Peptidsequenzen am N-Terminus der Protease zumindest partiell zum Verlust der enzymatischen Aktivität führen. Aktive Caspase-3 besteht aus zwei Peptiden p12 und p17, die im aktiven Enzym ein Tetramer (p12 p17)2 bilden. Um Caspase-3 selektiv in Tumorzellen zu applizieren, wurden ebenfalls Möglichkeiten untersucht, eine der beiden Untereinheiten mit dem scFv(FRP5) als Tumorzell-spezifische Zellbindungsdomäne zu fusionieren. Während aus den beiden separat in E. coli exprimierten p12 und p17 Untereinheiten durch gemeinsame Rückfaltung enzymatisch aktive Caspase-3 rekonstituiert werden konnte, führte die Fusion heterologer Proteindomänen an den N- und C-Terminus der p12 Untereinheit sowie an den C-Terminus der p17 Untereinheit zum Verlust der enzymatischen Aktivität, wahrscheinlich aufgrund der Verhinderung der korrekten Faltung des Protease-Tetramers. Dagegen konnte an den N-Terminus der p17 Untereinheit eine bakterielle Translokationsdomäne unter Erhalt der enzymatischen Aktivität fusioniert werden; ein entsprechendes Konstrukt, das zusätzlich den "single chain" Antikörper scFv(FRP5) enthielt, wurde aber in E. coli vollständig degradiert. Nachdem die Idee, Granzym B oder aktive Caspase-3 zur selektiven Induktion von Apoptose in Tumorzellen für therapeutische Zwecke einzusetzen, bereits seit längerem diskutiert wird, es jedoch bisher praktisch nicht möglich war, entsprechende rekombinante Fusionsproteine in funktionaler Form herzustellen, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit wichtige grundlegende Informationen, wie die weitere Entwicklung solcher Moleküle erfolgreich durchgeführt werden könnte.
The transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immune response against virus-infected or malignantly transformed cells. As member of the ABC transporter family, TAP hydrolyzes ATP to energize the transport of antigenic peptides from the cytosol into the lumen of the endoplasmic reticulum. TAP forms a heterodimeric complex composed of TAP1 and TAP2 (ABCB2/3). Both subunits contain a hydrophobic transmembrane domain and a hydrophilic nucleotide-binding domain. The aim of this work was to study the ATP hydrolysis event of the TAP complex and gain further insights into the mechanism of peptide transport process. To analyze ATP hydrolysis of each subunit I developed a method of trapping 8- azido-nucleotides to TAP in the presence of phosphate transition state analogs followed by photocross-linking, immunoprecipitation, and high-resolution SDS-PAGE. Strikingly, trapping of both TAP subunits by beryllium fluoride is peptide-specific. The peptide concentration required for half-maximal trapping is identical for TAP1 and TAP2 and directly correlates with the peptide-binding affinity. Only background levels of trapping were observed for low affinity peptides or in the presence of the herpes simplex viral protein ICP47, which specifically blocks peptide binding to TAP. Importantly, the peptideinduced trapped state is reached after ATP hydrolysis and not in a backward reaction of ADP binding and trapping. In the trapped state, TAP can neither bind nor exchange nucleotides, whereas peptide binding is not affected. In summary, these data support the model that peptide binding induces a conformation that triggers ATP hydrolysis in both subunits of the TAP complex within the catalytic cycle. The role of the ABC signature motif (C-loop) on the functional non-equivalence of the NBDs was investigated. The C-loops of TAP transporter contain a canonical C-loop (LSGGQ) for TAP1 and a degenerated ABC signature motif (LAAGQ) for TAP2. Mutation of the leucine or glycine (LSGGQ) in TAP1 fully abolished peptide transport. TAP complexes with equivalent mutations in TAP2 showed however still residual peptide transport activity. To elucidate the origin of the asymmetry of the NBDs of TAP, we further examined TAP complexes with exchanged C-loops. Strikingly, the chimera with two canonical C-loops showed the highest transport rate whereas the chimera with two degenerated C-loops had the lowest transport rate, demonstrating that the ABC signature motifs control the peptide transport efficiency. All single-site mutants and chimeras showed similar activities in peptide or ATP binding, implying that these mutations affect the ATPase activity of TAP. In addition, these results prove that the serine of the C-loop is not essential for TAP function, but rather coordinates, together with other residues of the C-loop, the ATP hydrolysis in both nucleotide-binding sites. To study the coupling between the ATP binding/hydrolysis and the peptide binding, the putative catalytic bases of the TAP complex were mutated to generate the so-called EQ mutants. The mutations did not influence the peptide-binding ability. Dimerization of the NBDs of EQ mutants upon ATP binding does not alter the peptide binding property. At 27°C, both ATP and ADP could induce the loss of peptide-binding ability (Bmax) only in the variants bearing a mutated TAP2. Further studies are required to deduce at which stage in the catalytic cycle the peptide-binding site is affected. In addition, mutation of the putative catalytic base of both subunits showed a magnesium-dependent peptide transport activity, demonstrating these mutants did not abolish the ATP hydrolysis. Thus, the function of this acidic residue as the catalytic base is not likely to be universe for all ABC transporters.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
Die Niere stellt im Organismus einen der Hauptangriffspunkte für Toxine dar. Dies liegt zum einen in der Tatsache begründet, dass zahlreiche Substanzen renal eliminiert werden. Eine weitere Funktion der Niere ist die Regulation des Flüssigkeitsund Elektrolythaushaltes durch Rückresorption von Wasser, Ionen, Aminosäuren und Glucose. Dies führt zu einer Aufkonzentrierung des Primärharns und folglich werden für die zu eliminierenden Toxine im Harn normalerweise höhere Konzentrationen erreicht, als beispielsweise im Blutplasma. Ein Portfolio von verschiedenen metabolisierenden Enzymen, die hauptsächlich in der Niere auftreten, sorgt weiterhin dafür, dass einige der gefilterten Substanzen erst in der Niere eine Bioaktivierung zum Toxin erfahren. Es ist somit von grosser Bedeutung, geeignete Testsysteme zu entwickeln, mit denen die Nephrotoxizität von Arzneistoffen, Chemikalien und anderen Substanzen untersucht werden kann. Die globale Analyse der Genexpression mit Hilfe von Mikroarrays bietet die Möglichkeit, die Veränderungen in der Expression von mehreren Tausend Genen gleichzeitig in der Niere oder in renalen Zellkulturen nach der Einwirkung eines potenziellen Nephrotoxins zu untersuchen. Eines der Ziele dieser Arbeit bestand darin, diese vielversprechende Methode für den Einsatz bei der Untersuchung von Nephrotoxizität zu evaluieren. In diesem Zusammenhang sollte geklärt werden, inwiefern sich aus der Literatur bekannte Tatsachen über den Toxizitätsmechanismus bestimmter Nephrotoxine bestätigen lassen und ob Hinweise auf bisher unbekannte Aspekte bezüglich der Vermittlung der Nephrotoxizität der Nephrotoxine gewonnen werden können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war es, ein Zellkulturmodell zu etablieren und zu charakterisieren, das es ermöglicht, Genexpressionsanalysen zur Untersuchung der Nephrotoxizität in vitro durchzuführen und das ausserdem mit in vivo vergleichbare Daten liefert. In verschiedenen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass eine Kultur primärer Zellen etabliert werden konnte, die die funktionellen Eigenschaften von proximalen Tubuluszellen zeigt und keine Verunreinigung mit anderen Zelltypen des Nierencortex aufweist. Weiterhin wurden die optimalen Bedingungen für die Durchführung von Expressionsanalysen mit dieser Zellkultur definiert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden das Expressionsprofil von Ochratoxin A mit Hilfe von cDNA-Mikroarrays, sowie die Profile von Quecksilber-II-chlorid, Paraquat und Puromycin mit Hilfe von Oligonukleotid-Mikroarrays in vivo und in vitro untersucht und bewertet. Ein Vergleich der beiden verfügbaren Plattformen (cDNA-Mikroarrays und Oligonukleotid-Mikroarrays) mit der Echt-Zeit-PCR als unabhängiger Methode lieferte aufschlussreiche Erkenntnisse über ihre Vor- und Nachteile. Die Analyse der Genexpressionsveränderungen nach der Einwirkung von OTA, HgCl2, Paraquat und Puromycin zeigte, dass sich mit Hilfe des Genexpressionsprofils zahlreiche Erkenntnisse über den Toxizitätsmechanismus der Substanzen gewinnen lassen, die sowohl durch die histopathologischen Befunde als auch mit Hilfe der einschlägigen Literatur bestätigt werden konnten. Zum Teil konnten sogar bisher unbekannte Aspekte der nephrotoxischen Wirkungen der untersuchten Modell- Toxine aufgedeckt werden, wie zum Beispiel die verstärkte Induktion von Golgi- Transport-assoziierten Genen im Nierencortex der Ratte nach Behandlung mit Paraquat. Die Analyse des Genexpressionsprofils kann somit vielversprechende Hinweise für das umfassende Verständnis des Toxizitätsmechanismus von Nephrotoxinen liefern. Der Vergleich der Expressionsmuster von HgCl2, Paraquat und Puromycin machte weiterhin deutlich, dass es einerseits transkriptionelle Änderungen gibt, die für das jeweilige Toxin spezifisch waren, andererseits aber auch Expressionsmuster aufgezeigt werden konnten, die allen untersuchten Nephrotoxinen gemeinsam waren. Durch die Identifizierung solcher gemeinsamen Genexpressionsprofile aus einer Datenbank mit zahlreichen bekannten Nephrotoxinen, könnte es in Zukunft sogar möglich sein, die potenzielle Nephrotoxizität unbekannter Arzneistoffe oder Chemikalien mit Hilfe von Mikroarrays vorherzusagen oder beispielsweise aus mehreren Kandidaten für einen neuen Arzneistoff, denjenigen mit dem geringsten nephrotoxischen Potenzial bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung herauszufiltern.
Cytochrome c oxidase is the terminal enzyme in the respiratory chain of mitochondria and aerobic bacteria. This enzyme ultimately couples electron transfer from cytochrome c to an oxygen molecule with proton translocation across the inner mitochondrial and bacterial membrane. This reaction requires complicated chemical processes to occur at the catalytic site of the enzyme in coordination with proton translocation, the exact mechanism of which is not known at present. The mechanisms underlying oxygen activation, electron transfer and coupling of electron transfer to proton translocation are the main questions in the field of bioenergetics. The major goal of this work was to investigate the coupling of electron transfer and proton translocation in cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Different theoretical approaches have been used to investigate the coupling of electron and proton transfer. This thesis presents an internal water prediction scheme in the enzyme and a molecular dynamics study of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans in the fully oxidized state, embedded in a fully hydrated dimyristoylphosphatidylcholine lipid bilayer membrane. Two parallel molecular dynamics simulations with different levels of protein hydration, 1.125 ns each in length, were carried out under conditions of constant temperature and pressure using three-dimensional periodic boundary conditions and full electrostatics to investigate the distribution and dynamics of water molecules and their corresponding hydrogen-bonded networks inside cytochrome c oxidase. The average number of solvent sites in the proton conducting K- and D- pathways was determined. The highly fluctuating hydrogen-bonded networks, combined with the significant diffusion of individual water molecules provide a basis for the transfer of protons in cytochrome c oxidase, therefore leading to a better understanding of the mechanism of proton pumping. The importance of the hydrogen bonding network and the possible coupling of local structural changes to larger scale changes in the cytochrome c oxidase during the catalytic cycle have been shown.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der elektrochemischen und spektroskopischen Eigenschaften der bc1-Komplexe aus dem Bodenbakterium Paracoccus denitrificans und der Hefe Saccharomyces cerevisiae im sichtbaren und infraroten Spektralbereich. Das redoxaktive Protein ist Bestandteil der Atmungskette und trägt entscheidend zum Aufbau eines Protonengradienten bei, der zur Bildung des universellen Energieträgers ATP genutzt wird. Der bakterielle P. denitrificans-Komplex besteht aus den drei katalytischen Untereinheiten Cytochrom b, Cytochrom c1 und Rieske-Protein. Der mitochondriale Hefe-bc1-Komplex besitzt neben diesen drei noch acht weitere Untereinheiten, die anscheinend für die Stabilität des Enzyms bedeutsam sind. Um Konformationsänderungen des Proteins infolge von Elektronen- und daran gekoppelten Protonentransferreaktionen zu dokumentieren, wurde der Komplex elektrochemisch in definierte Redoxzustände versetzt. Aus den in diesen Zuständen aufgenommenen Absorptionsspektren berechnen sich Differenzspektren, deren Banden auf die Redoxreaktion zurückzuführende Veränderungen im Protein widerspiegeln. Durch Vergleiche mit Modellspektren isolierter Proteinbestandteile, Spektren ähnlicher Proteine und Informationen aus Kristallstrukturen konnten Beiträge der verschiedenen Kofaktoren, des Proteinrückgrates und einzelner Aminosäuren zu diesen Banden zugeordnet werden. Die elektrochemisch induzierten FTIR-Differenzspektren des P. denitrificans-bc1-Komplexes zeigten vor allem Beiträge der im Komplex gebundenen Chinone, die durch den Vergleich mit Differenzspektren isolierter Chinone identifiziert werden konnten. Ein wichtiges Ergebnis war die Abschätzung der Chinonkonzentration im Protein anhand einer charakteristische Bande bei 1262 cm-1 resultierend aus Schwingungen der Chinon-Methoxygruppen. Das Ergebnis von durchschnittlich 3 Molekülen Chinon pro Protein-Monomer unterstützt das zur Zeit für die Qo-Bindestelle diskutierte double-occupancy-Modell. Interessanterweise konnte die Protonierung einer Glu/Asp-Aminosäureseitenkette in Abhängigkeit vom Chinongehalt beobachtet und daraus abgeleitet Signale eines an der Qo-Bindestelle gebundenen Chinons differenziert werden. Die Beiträge der Cytochrom b und c-Untereinheiten relativ zum Gesamtspektrum des P. denitrificans-bc1-Komplexes wurden mittels Differenzspektren der einzelnen Kofaktoren unterschieden. Anhand ihrer Mittelpunktpotentiale, die zuvor durch Potentialtitrationen im sichtbaren Spektralbereich bestimmt wurden (Häm bL: Em7=-292 mV vs. Ag/AgCl, Häm bH: -144 mV, Häm c1: 89 mV), konnten die Differenzsignale des jeweiligen Kofaktors und seiner durch die Redoxreaktion beeinflußten Umgebung durch Wahl geeigneter Potentialschritte separiert werden. Die Zuordnungen der Signale des Cytochrom c1 und des Rieske-Proteins, die spektroskopisch nicht getrennt werden können, wurden durch Messungen an wasserlöslichen Fragmenten dieser Untereinheiten abgesichert. In allen Spektren konnten typische Beiträge des Proteingrundgerüstes, Schwingungen der Häme und ihrer Substituenten sowie einzelner Aminosäuren vorläufig zugeordnet werden. Die Bindung von Inhibitoren führte zu deutlichen Veränderungen im FTIR-Differenzspektrum. Der Qi-Inhibitor Antimycin A zeigt eigene Differenzsignale im Bereich oberhalb 1734 cm-1, an denen die Bindung des Inhibitors im Protein nachvollzogen werden konnte. Sie führte zur Abnahme der Signalintensität einer Bande, die die Beeinflussung eines protonierten Hämpropionates oder Arginin-bzw. Asparaginseitenketten vermuten lassen. Die Bindung des Qo-Inhibitors Stigmatellin, der selbst redoxaktiv ist, äußerte sich in Veränderungen im Amid I-Bereich des Differenzspektrums. Die Deprotonierung einer Glu/Asp-Seitenkette infolge der Stigmatellinbindung wurde diskutiert. Die FTIR-Differenzspektren des S. cervisiae-bc1-Komplexes gleichen denen des bakteriellen Komplexes in Bezug auf die Bandenpositionen weitestgehend. Die Signalintensitäten sowie die Größenverhältnisse der Banden zueinander unterscheiden sich jedoch. Dies wird durch den geringeren Chinongehalt des Hefeproteins nach der Präparation bedingt. Der Einfluß fünf verschiedener Inhibitoren der Qi- und Qo-Bindestelle auf die Differenzspektren wurde untersucht. Dabei standen von zwei Substanzen isotopenmarkierte Varianten zur Verfügung, die tieferen Einblick in die genaue Wechselwirkung bei der Inhibitorbindung bringen sollte. Die Bindung der Inhibitoren führte zu Veränderungen in den Spektren. Sie wurden vor dem Hintergrund der Kristallstruktur betrachtet, die aufgrund ihrer Auflösung keine exakten Aussagen über den Protonierungszustand einzelner Proteinbestandteile liefern kann. Der Schwerpunkt der Studien lag auf den Vergleich der Qo- Inhibitoren Stigmatellin und HHDBT. Die Bindung von Stigmatellin führte wie im P. denitrificans-Komplex zur Deprotonierung einer Glu/Asp-Seitenkette. Die Inhibierung mit HHDBT resultierte in der Protonierung vermutlich der gleichen Glu/Asp-Seitenkette. Die Auswirkungen des unterschiedlichen Protonierungszustandes der Aminosäure in Anwesenheit dieser beiden Inhibitoren wurde im Kontext eines vermuteten Chinoloxidations-Mechanismus beleuchtet.
Die Übergangsmetalle Vanadium und Niob wurden in einer neuartigen Thermowaage bzw. mit dem Rapid Thermal Processing (RTP) unter Verwendung von Ammoniak und Stickstoff als Prozessgas nitridiert. In der Thermowaage, die die in situ Aufzeichnung von Massenänderungen während der Reaktion möglich macht, wurde die Nitridierung hauptsächlich an pulverförmigen Proben durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass sowohl Temperatur- und Druckerhöhung, als auch eine Verlängerung der Temperzeit zu größeren Massenzunahmen führten. Die Bildung der unterschiedlichen Nitridphasen war aber allein von der Temperatur während des Versuches und dem verwendeten Prozessgas abhängig. Die detektierten Massenzunahmen bei der Erhöhung von Temperzeit und Druck wurden nur von der vermehrten Einlagerung von Stickstoff bzw. Sauerstoff in das Metall verursacht, die keine neue Phasenbildung zur Folge hatte. Sauerstoff wurde in allen getemperten Proben gefunden, was die Untersuchung von dünnen Schichten in der Thermowaage verhinderte, da aufgrund des erhöhten Sauerstoffgehaltes die Schichten vollständig oxidierten. Der Sauerstoff wurde hauptsächlich von dem Glasreaktor geliefert. Ein dort abgelagerter Belag, der sich durch Korrosion der Edelstahlgasleitung gebildet hatte, wirkte vermutlich katalytisch. Aus diesem Grund war die Thermowaage in dieser Konfiguration nicht für Nitridierungsversuche geeignet und konnte ihren eigentlichen Zweck, die genaue Untersuchung des Reaktionsmechanismus mit Hilfe der Massenänderung und der anschließenden massenspektrometrischen Untersuchung des Prozessgases nach der Reaktion, nicht erfüllen. 200 nm und 500 nm Vanadium- und Niob-Schichten wurden im RTP nitridiert. Auch hier konnte man eine Bildung von Oxiden bzw. Oxynitriden beobachten, diese bildeten sich aber durch die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat in die Metallschicht, was anhand von SNMS- und TEM/EFTEM/EELS-Untersuchungen eindeutig belegt werden konnte. Um dieses Phänomen zu untersuchen wurden Schichten auch auf Saphir-Substrat, welches gegenüber der Ausdiffusion von Sauerstoff inert sein sollte, aufgebracht. Für die beiden verwendeten Metalle wurden unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Während bei den Vanadium-Schichten nur aus dem SiO2-Substrat Sauerstoff ausdiffundierte, wurde dies bei den Niob-Schichten bei beiden Substraten festgestellt. Die Temperatur während der Versuche (V: 600 und 700°C; Nb: 800°C) scheint also auch einen Einfluss auf die Ausdiffusion von Sauerstoff zu haben. Dabei zeigt Saphir eine etwas größere Temperatur-Stabilität als SiO2. Ein Einfluss des Prozessgases auf die Reaktion an der Grenzfläche Metall/Substrat konnte nicht nachgewiesen werden. Zwar kam es bei der Verwendung von Wasserstoff zur Bildung von mehr und sauerstoffreicheren Phasen, was dafür spricht, dass die Substrate stärker angegriffen werden, aber auch beim Einsatz von Inert-Gas (N2) wurde eine Ausdiffusion von Sauerstoff aus den Substraten beobachtet. Allerdings wirkte sich die Schichtdicke der Probe auf die Ausdiffusion von Sauerstoff und die Bildung der Oxid-Phase aus. Da von der Oberfläche der Schicht eindiffundierender Stickstoff die Diffusion von Sauerstoff behindert, kann Sauerstoff mit zunehmender Schichtdicke weiter in das Metall vordringen. Bei dünneren Schichten wird er eher aufgestaut und es bilden sich Oxide mit höherem Sauerstoffgehalt. Ein Einfluss der unterschiedlichen Herstellungsverfahren (Elektronenstrahlverdampfung / Magnetronsputtern) für die Ausgangsschichten auf die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat konnte, trotz der größeren Kristallinität der gesputterten Proben, nicht nachgewiesen werden.
Entwicklung von Methoden zur Konformationsanalyse supramolekularer Komplexe in Kraftfeldprogrammen
(2003)
Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde mit dem SUPRA-Algorithmus ein Verfahren zur Berechnung der Struktur Supramolekularer Komplexe programmiert und in das Kraftfeldprogramm MOMO implementiert. Bei der Konformationsanalyse Supramolekularer Komplexe ergibt sich das Problem, dass die Anzahl der notwendigen Rechenschritte mit der Größe der zu berechnenden Struktur, genauer mit der Anzahl vorhandener Torsionsfreiheitsgrade, exponentiell ansteigt. Dieses Problem wurde umgangen, indem die Rechnung in drei kleinere Abschnitte aufgeteilt wurde. Es werden nacheinander drei Konformationsanalysen durchgeführt. Zuerst erfolgt jeweils eine Konformationsanalyse für die beiden beteiligten Einzelmoleküle. Deren Strukturen dienen dann wiederum als Eingabe für die dritte, eigentliche Konformationsanalyse des Supramolekularen Komplexes. Ziel dieser Arbeit war dann unter anderem zu überprüfen, ob trotz der Vereinfachungen diese Vorgehensweise effiziente Ergebnisse liefert. Zu Beginn wurden Berechnungen für den Komplex Adenin-Uracil durchgeführt, die Resultate stimmten mit experimentell gefundenen Paarungsmustern (Watson-Crick, reverse Watson- Crick, Hoogsteen, reverse Hoogsteen) überein. Eine weitere Rechnung am Komplex Cytosin- Guanin fand als Ergebnis Watson-Crick- und reverse Watson-Crick-Paarung. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung des Ladungsmodells von Gasteiger und Marsili sowie der Wasserstoffbrücken-Potenzialfunktion von Vedani und Dunitz ohne Berücksichtigung der van-der-Waals-Wechselwirkungen erhalten. Diese Kraftfeldeinstellungen wurden im weiteren Verlauf der Arbeit als die optimalen Parameter für den SUPRA-Algorithmus beibehalten. Anschließend wurden zwei Komplexe fluormodifizierter Basenpaare berechnet, um die in einem RNA-Duplex experimentell aufgefundenen C-H...F-C-Brücken rechnerisch zu reproduzieren. Nur für eines der beiden Basenpaare konnte dieses Wasserstoffbrücken- Bindungsmuster erhalten werden, für das andere Dimer wurde die erwartete Struktur nicht gefunden. Es sollte deshalb der gesamte RNA-Duplex berechnet werden. Hierzu war das Programm MOMO nur sehr bedingt geeignet, und zwar sowohl was den Aufbau des Doppelstranges betraf als auch die Energie- und Geometrieberechnung. Trotz umfangreicher Versuche gelang es nicht, die Doppelhelixstruktur im Verlauf der Energieminimierung beizubehalten. Durch Anpassung der Kraftfeldparameter konnte aber eine stark aufgeweitete Helixstruktur berechnet werden, in welcher die modifizierten Basen nach dem experimentell gefundenen Muster gepaart waren. Außerdem wurde der SUPRA-Algorithmus anhand eines Dipyridon-Komplexes auf seine Fähigkeit getestet, Moleküle mit mehreren Torsionsfreiheitsgraden zu berechnen. Hier ergab sich wegen der konformationellen Flexibilität eine Rechenzeit von über drei Wochen. Das Ergebnis der Rechnung stimmte gut mit der experimentell gefundenen Struktur überein. Am Beispiel zweier Komplexe selbstkomplementärer Diketopiperazine sowie eines Komplexes aus N,N'-Di(tert-butyl)-melamin und 5,5-Dimethylbarbitursäure wurden Rechnungen von Komplexen aus mehr als zwei Molekülen durchgeführt. Es zeigte sich eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse mit den bekannten Kristallstrukturen. Als letztes wurden anhand zweier selbstkomplementärer Acetylhydrazon- und dreier Diketon- Diol-Komplexe fünf unbekannte Strukturen doppelt wasserstoffbrücken-gebundener Dimere vorhergesagt. Anschließend sollte jeweils die Kristallstruktur bestimmt und mit dem Ergebnis der Vorhersage verglichen werden. Im Fall der Diketon-Diol-Komplexe gelang bisher keine Züchtung eines entsprechenden Mischkristalls, sondern die beteiligten Komponenten kristallisierten einzeln aus. Bei den zwei Acetylhydrazonen dagegen konnten Kristalle erhalten werden. Eine der Kristallstrukturen wies das mit dem SUPRA-Algorithmus vorhergesagte Dimer auf. Im Verlauf der Arbeit zeigte sich des Öfteren, dass die gewählte Strategie, die Anzahl der Startstrukturen bei der Konformationsanalyse zu begrenzen, um ein exponentielles Ansteigen der Rechenschritte zu verhindern, erfolgreich war. Mehrmals fanden sich als Ergebnis der Rechnung Strukturen von komplexgebundenen Molekülen, die sich stark von der Startkonformation eines Einzelmoleküls unterschieden, so zum Beispiel im Falle des Dipyridon-Komplexes oder der Diketon-Diol-Komplexe. Für die Zukunft sind weitere Kristallisationsversuche der Acetylhydrazone geplant, um eventuelle Polymorphe aufzufinden, bei denen sich auch eine Übereinstimmung mit der zweiten vorhergesagten Struktur zeigt. Weiterhin ist beabsichtigt, die Packungsenergien der gefundenen Kristallstruktur sowie einer theoretischen Kristallstruktur, die in ihrem Wasserstoffbrückenbindungs-Muster der mit MOMO gemachten Vorhersage entspricht, zu berechnen und zu vergleichen. Durch Einführung verschiedener Liganden in das Acetylhydrazon und Vergleich der daraus resultierenden Packungsmuster sollen Regeln über die den Kristallisationsprozess bestimmenden Einflussfaktoren abgeleitet werden. Weiterhin soll eine Reihe von anderen Verbindungsklassen synthetisiert, strukturell untersucht und berechnet werden, um so weitere Vergleiche zwischen theoretischen Vorhersagen und Kristallstruktur anstellen zu können. Für das Programm MOMO wäre wünschenswert, den Multipol-Ansatz in die Vollversion zu integrieren, um eine exaktere Berechnung von Basenstapelungs- und anderen p-p- Wechselwirkungen zu erreichen. Darüber hinaus sollte eine Parametrisierung des von S. Monz verbesserten Abraham-Ladungsmodells vorgenommen werden. Beides würde zu einer Verbesserung der Beschreibung intermolekularer Wechselwirkungen führen, welche für den SUPRA-Algorithmus relevant sind.
Ausgangslage der Dissertation war die an vielen Universitäten unbefriedigende Lehr- und Lernsituation im Chemiepraktikum für Medizinstudierende. Auf der Basis einer umfassenden Untersuchung der Lernausgangslage sollten Ansätze zu einer Verbesserung der Ausbildung entwickelt und am Beispiel des Praktikums an der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main erprobt werden. In einer Voruntersuchung wurde eine bundesweite Bestandsaufnahme der Chemiepraktika für Medizinstudierende durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten überraschend große Unterschiede in der praktischen Ausbildung bezüglich der Inhalte und des Umfangs. Leider wurde auch deutlich, dass die äußerst wünschenswerten medizinischen Bezüge nur vereinzelt hergestellt wurden. Zentraler Teil der Bestandsaufnahme war die Ermittlung der Lernausgangslage der Medizinstudierenden vor Praktikumsbeginn. Hierzu wurde in einem ersten Schritt ein Fragebogen auf der Grundlage eines für die Gegebenheiten eines Laborpraktikums angepassten Modells der Lehrveranstaltungsqualität entwickelt. Die anschließende Datenerhebung umfasste über 700 Studierende der Human- und Zahnmedizin an drei bundesdeutschen Hochschulen. Die Ergebnisse zeigen u.a., dass die meisten Studierenden nur über wenige chemische Kenntnisse verfügen, insgesamt aber sehr motiviert für die universitäre Ausbildung sind, was auch die Chemie mit einbezieht. Die angenommene negative Einstellung gegenüber dem schulischen oder universitären Chemieunterricht konnte hier nicht bestätigt werden. Die folgende Lehrevaluation während des Praktikums sowie dessen Neukonzeption wurden am Beispiel der Universität Frankfurt durchgeführt. Bei zwei Befragungen im WS 99/00 und 00/01 (N = 231) kristallisierten sich als verbesserungswürdige Punkte der Umfang der medizinischen Bezüge sowie des Übungsmaterials heraus. Auch eine stärkere Verknüpfung von Fachinhalten und den durchzuführenden Versuchen schien wünschenswert, um die im Praktikum erlebte Transparenz zu erhöhen. Die anschließende Neukonzeption des Chemiepraktikums erfolgte aufgrund der gewonnenen Evaluationsergebnisse sowie chemiedidaktischer und lernpsychologischer Erkenntnisse, wobei dem Praktikumskript als (Kurz-)lehrbuch und Arbeitsbuch eine zentrale Rolle zukommt. Bedingt durch die völlige Umstrukturierung des vorklinischen Studienabschnitts an der Universität Frankfurt wurde gleichzeitig die Anpassung an die veränderten Rahmenbedingungen notwendig. Das neu konzipierte Praktikum wurde erstmals im WS 2001/2002 mit über 500 Studierenden erprobt. Es erwies sich mit seinen Versuchen und dem Praktikumkskript als tragfähig und wird, bis auf wenige Änderungen, auch in Zukunft in dieser Form an der Universität Frankfurt durchgeführt werden. Die parallel durchgeführte Evaluierung zeigte, dass vor allem die Lehr- und Praktikumserfahrung der Assistentinnen und Assistenten zu einem wichtigen Kriterium dafür wird, wie die Studierenden die Veranstaltung erleben. In der Schulung und Unterstützung der Assistentinnen und Assistenten liegt demnach das größte Potential im Hinblick auf eine Qualitätssteigerung. Weiterhin wurde deutlich, dass die gegebenen engen zeitlichen und organisatorischen Rahmenbedingungen einem besseren Lernerfolg in der Chemieausbildung der Medizinstudierenden entgegenstehen.
Durch die beiden Ionisationstechniken Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) und Electrospray-Ionization (ESI) sind Biopolymere für die Massenspektrometrie zugänglich geworden und die Zahl der biochemischen Applikationen ist sprunghaft angestiegen. Dagegen sind die zugrundeliegenden Prozesse der Ionenbildung nur zum Teil bekannt. Bei MALDI wird die Laserstrahlung durch die Matrix absorbiert, wodurch es zur explosiven Auflösung der festen Phase unter Bildung von geladenen Molekülen kommt. Der genaue Mechanismus vom Festkörper zum gasförmigen Ion ist nur teilweise aufgeklärt und Gegenstand vieler Diskussionen. Eine wichtige Funktion der Matrix ist die räumliche Separierung und Isolierung der Analyte beim Einbau in die Matrixkristalle. Während der Einschluß von Molekülen in Wirtskristalle schon früh als wesentliches Merkmal von MALDI erkannt wurde, ist bisher noch nicht systematisch untersucht worden, in welcher Form die Analyte im Kristall vorliegen. Genau diese Information ermöglicht jedoch Aussagen über die Relevanz verschiedener Mechanismen der Ionenbildung bei MALDI. Die Bestimmung des Ausgangszustandes des Analyten im Matrixkristall und die Abschätzung möglicher Reaktionen bei der nachfolgenden Freisetzung der Analytionen ist das zentrale Thema der vorliegenden Arbeit. In dieser wurde insbesondere der Ladungszustand der Analyte sowie der Einschluß von Lösungsmittel untersucht. Des weiteren wurden Experimente zur Zahl und Koordination möglicher Gegenionen, zur Neutralisation dieser Ionenpaare und zur Adduktbildung bei MALDI durchgeführt. Die Ergebnisse erlauben Aussagen über primäre und sekundäre Ionisationsreaktionen, die zu einem stimmigen Bild der Ionenbildung bei MALDI zusammengefaßt wurden. Grundlage des vorgestellten Modells sind bereits veröffentlichte Modelle, deren wesentliche Aspekte teilweise schon in den ersten Jahren nach der Einführung von MALDI, zu einem erheblichen Teil aber erst in jüngster Zeit erkannt wurden. Einen erneuten Anstoß für die Diskussion um den Mechanismus von MALDI gab die Hypothese, daß die Ionisation eng mit der Bildung von Clustern verbunden ist und dabei sowohl eine Freisetzung präformierter Ionen als auch nachfolgende Reaktionen unter Transfer von Protonen und Elektronen erfolgen. Der Ausgangspunkt für all diese Prozesse ist der Analyt im Matrixkristall. Die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente zeigen, daß einige wesentliche Postulate des "Cluster-Modells" richtig sind. Insbesondere konnte der Beweis geführt werden, daß Analyte geladen im Matrixkristall existieren und daß die gelöste Form des Analyten weitgehend im Matrixkristall konserviert wird. Als einfache Testsysteme wurden Matrixlösungen mit verschiedenen pH-Indikatoren versetzt und die Farbe der Kristalle dokumentiert. Dabei zeigte sich, daß in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung sowohl Moleküle mit einer positiven oder negativen Nettoladung als auch neutrale Zwitterionen gleichermaßen effizient in Matrixkristalle eingebaut werden. Die Ladung aller sauren und basischen funktionellen Gruppen des Analyten im Kristall ist damit durch den pH-Wert der Matrixlösung bestimmt. Wenn eine Nettoladung vorhanden ist, muß zudem diese Ladung durch Gegenionen kompensiert sein, so daß Ionenpaare entstehen. Aber auch bei Zwitterionen können Gegenionen vorhanden sein. Darüber hinaus gelang durch 1H-NMR-Spektroskopie der Nachweis, daß Lösungsmittel im Kristall eingeschlossen ist und selbst nach Trocknen der Kristalle bei erhöhter Temperatur oder im Vakuum dort verbleibt. Dies führt zu dem anschaulichen Bild, daß Analyte in Abhängigkeit vom pH-Wert als "Multi-Ionenpaare" und partiell solvatisiert im Matrixkristall konserviert werden. Ausgehend von diesen präformierten, solvatisierten Ionenpaaren wird durch den plötzlichen Energieeintrag des Laserpulses die explosive Bildung von Clustern ausgelöst. Für die Bildung von geladenem Clustern gibt es zwei plausible Erklärungsansätze. Durch die Existenz der geladenen Analyte im Kristall ist eine besonders einfache Ionisation unter Freisetzung "präformierter" Ionen durch die Trennung eines Ionenpaares denkbar. Eine zweite Möglichkeit wäre die Photoionisation eines Matrixmoleküls mit nachfolgendem Protonentransfer. Da aber stets negative Ladungen vorhanden sind (entweder im Analyten selbst oder als Gegenion), wird bevorzugt ein Anion neutralisiert. In beiden Fällen entsteht ein Cluster, der durch ein fehlendes oder neutralisiertes Gegenion geladen ist. Die Freisetzung des Analytions erfolgt durch Verdampfen von Neutralmolekülen (Matrix, Lösungsmittel). Ionenpaare werden durch Protonentransfer neutralisiert, so daß kleine Neutralmoleküle abdampfen und mit Ausnahme von Metallkationen keine ionischen Addukte detektiert werden. Der Protonierungsgrad des Analyten beim Einbau hat einen erheblichen Einfluß auf die detektierten Ionen. Sind bereits in Lösung und damit im Kristall positiv geladene Gruppen vorhanden, werden besonders leicht protonierte Molekülionen gebildet. Dagegen entstehen aus deprotonierten Vorläuferionen (in der Regel negativ geladen) verstärkt kationisierte Molekülionen. Dabei ist nicht die Nettoladung entscheidend, sondern die Existenz und Anzahl positiver und negativer Gruppen im Analyten. Die Kationisierung erfolgt bereits im Kristall, da die Ionen eine hohe, MALDI-typische Anfangsgeschwindigkeit zeigen. Die Koordination der Kationen an der negativen Ladung verhindert die Neutralisation durch Protonierung, die wesentlich für die Freisetzung von protonierter Molekülionen ist. Diese Neutralisation von Ionenpaaren ist auch die Ursache dafür, daß Anionenaddukte normalerweise nicht nachgewiesen werden. Durch Zugabe einer sehr starken Säure wird jedoch diese Zwischenstufe stabilisiert und erscheint in Form von Anionenaddukten im Spektrum. Dabei zeigte sich, daß die Anzahl der detektierten Addukte mit der Zahl der basischen Stellen im Analytmolekül korreliert, welches den Einbau von (mehrfach) geladenen Analytionen zusammen mit ihren Gegenionen bestätigt. Neben der Koordination der Anionen an positiv geladenen Stellen des Analyten ist die Energiebilanz des Protonentransfers dafür entscheidend, ob die Anionenaddukte den MALDI-Prozeß überstehen, so daß Anionen mit einer vergleichsweise geringen Gasphasenbasizität zur Adduktbildung neigen. Des weiteren kann die Konkurrenz verschiedener Anionen bei der Bildung der Ionenpaare eine Verschiebung der Adduktverteilung bewirken. Aber auch eine höhere Energiezufuhr (z.B. durch höhere Laserenergie) bewirkt eine verstärkte Neutralisation der Ionenpaare, wobei ein erheblicher Anteil metastabiler Fragmentierungen auftritt. Die Koordination von Gegenionen und die "metastabile Neutralisation" führt bei Verbindungen, die zur Ionenpaarbildung neigen, zur Peakverbreiterung und zu einer begrenzten Auflösung. Darüber hinaus sind bei MALDI weitere Sekundärreaktionen beteiligt. Dazu zählt die Übertragung von Wasserstoffatomen, die wahrscheinlich auch die Ursache für prompte Fragmentierungen ist (in-source decay, ISD). Ob eine Ladungsreduktion mehrfach geladener Vorläuferionen durch Elektronen auch bei Biopolymeren eine wesentliche Rolle spielt, bleibt dagegen weiterhin offen. Durch die in Abhängigkeit von der Nettoladung zunehmende Coulomb- Anziehung der koordinierten Gegenionen werden vermutlich erst gar keine hochgeladenen Ionen in die Gasphase freigesetzt. Die vorgestellten Ergebnisse ergeben ein plausibles, qualitatives Bild der Ionenbildung bei MALDI. Es wurde gezeigt, daß die gelöste Form des Analyten inklusive Ladungen, Gegenionen und Solvathülle bei der Kristallisation weitgehend erhalten bleibt, und daß diese Ausgangssituation entscheidend für die Art der letztendlich gebildeten Gasphasenionen ist. Zudem ist nicht die Protonierung neutraler Analyte, sondern eine Neutralisation von Ionen(paaren) durch Protonentransfer ein zentraler Bestandteil von MALDI.
Im Rahmen der erarbeiteten Dissertation konnte aufbauend auf naßchemischen und Festphasen-Synthesemethoden eine Vielzahl von pharmakologisch interessanten Verbindungen hergestellt werden, die als Liganden an der Polyamin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors wirken. Diese wurden mit Hilfe von Radioligand-Bindungsstudien sowohl als agonistisch, invers-agonistisch und partiell invers-agonistisch wirkende Liganden identifiziert. Durch die iterative Entwicklung kleiner Substanzbibliotheken konnten sowohl Liganden mit gesteigerter Affinität, als auch Verbindungen mit erhöhter Selektivität zur Polyaminbindungsstelle synthetisiert werden. Ausgehend von einer Thiophendialkandiamin-Leitstruktur 1 wurden sowohl Strukturderivate mit verkürzten Alkylseitenketten, als auch Verbindungen mit bioisosteren Substrukturen hergestellt. Hierbei konnte analysiert werden, daß das Vorhandensein einer einfachen p-Donor-Substruktur durchaus für eine ausreichende Ligand-Rezeptor-Interaktion sorgt, während ein vollständiges Fehlen der Substruktur nicht toleriert wird. Aufbauend auf der Basis weiterentwickelter Festphasensynthesetechniken konnten Ligandenbibliotheken durch Insertion amidischer Strukturelemente in die C8-Seitenkette erzeugt werden, wobei die Amidfunktionen durch je zwei Aminosäuren mit unterschiedlichen Seitenresten gebildet wurden. Die pharmakologische Wirkung der Liganden ließ sich mit den Aminosäureresten der gekoppelten Aminosäuren korrelieren. Hierbei konnten sowohl invers-agonistische, partiell invers-agonistische, als auch agonistisch wirkende Liganden identifiziert werden. Einer der potentesten inversen Agonisten, die identifiziert wurden, wird durch die Aminosäurekombination (L)-Tryptophan/(L)-Tryptophan 2 mit einem IC50-Wert von 15 µM und einem Sperminfaktor von 4,66 repräsentiert. Speziell bei der ein- oder zweifachen Anwesenheit der Aminosäure (L)-Tryptophan zeigte sich eine Verschiebung zu niedrigeren IC50-Werten, während Liganden mit insertierter Aminosäure (L)-Histidin einen schwächer ausgeprägten inversen Agonisrnus aufwiesen. Ein starker Agonismus wurde bei Verbindungen beobachtet, die mindestens eine basische Aminosäure in Form von Lysin enthielten. Struktur 3 mit der Kombination (D)-Lysin/(L)-Arg repräsentiert mit einem EC50-Wert von 0,97 µM einen der affinsten agonistisch wirkenden Liganden an der Polyamin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors.
Die exzessive Bildung und Ablagerung von aggregiertem Amyloid beta-Peptid im Gehirn von Alzheimer Patienten wird allgemein als zentrales Ereignis im Rahmen des Neurodegenerationsprozesses der Alzheimer Demenz betrachtet. Der Amyloid-Stoffwechsel ist dabei in sehr vielfältiger Weise mit dem zellulären Cholesterol-Stoffwechsel verknüpft. Hohe Cholesterolspiegel in spezifischen Membrandomänen wie Lipid-Rafts forcieren sehr wahrscheinlich die zelluläre Produktion als auch die Fibrillogenese von Amyloid beta-Peptid. Umgekehrt schützt ein hoher Membrancholesterol-Gehalt aber auch vor den toxischen Effekten von aggregiertem Aß. Durch Modulation des Cholesterolgehalts von Hirnmembranen mit MßCD und seinen Cholesterol-Komplexverbindungen in vitro sowie mit Statinen in vivo konnten wir zeigen, daß beide Substanzklassen verschiedene membranäre Cholesterol-Pools beeinflussen, die gleichfalls an der Vermittlung zytotoxischer Amyloid- Effekte in unterschiedlicher Weise beteiligt sind. Wir konnten weiterhin erstmals nachweisen, daß sowohl hydrophile als auch lipophile Statine in vivo einen unmittelbaren Einfluß auf die zerebrale Membrancholesterol-Homöostase nehmen und dabei vermutlich membranäre Raft- Strukturen im exofacialen Membranblatt verändern, die favorisierte Orte der zellulären APP-Prozessierung bzw- Amyloidbildung sind. Aus diesem Wirkmechanismus leitet sich womöglich der für bestimmte Statine berichtete neuroprotektive Effekt bei AD in retrospektiven Humanstudien ab, der sich durch eine reine Cholesterolsenkung in spezifischen Bereichen des ZNS nicht erklären läßt. Ob einzelne Statine in ausreichender Konzentration direkt ins Gehirn vordringen und dort teilweise Isoprenoid-abhängige Signalkaskaden induzieren, oder ihre zentralen Effekte indirekt an der BHS vermitteln, ist unklar. Unsere Daten stützen nachhaltig die Hypothese, daß die sporadische Alzheimer Demenz vergleichbar der Niemann-Pick Typ C-Krankheit auf einer Dysregulation der zellulären Cholesterolverteilung beruht, die durch spezifische Risikofaktoren wie das Alter oder den apoE4-Genotyp gefördert wird. Substanzen, die gezielt in Mechanismen der fehlgesteuerten zellulären Lipid-Distribution und Kompartimentierung eingreifen, sind somit potentielle Wirkstoffe in der Therapie der Alzheimer Demenz.
Die Lösung unbekannter Strukturen aus Pulverbeugungsdaten ist keineswegs eine Routineanwendung, und es steht noch einiges an Arbeit an, um die vorhandenen Methoden so weit zu automatisieren, daß sie von Nichtspezialisten, auch solchen mit kristallographischen Kenntnissen, direkt verwendet werden können. In dieser Arbeit konnte überzeugend dargelegt werden, daß die Anwendung des älteren Verfahrens der Fragmentsuche eine sehr gute Möglichkeit bietet, den Schwierigkeiten der Strukturlösung aus Pulverdaten erfolgreich zu begegnen. Durch graduelle Steigerung des Schwierigkeitsgrads bzw. der Komplexität der Strukturlösung von der anfänglichen Verwendung simulierter Pulverbeugungsdaten bekannter Strukturen über die Messung von Pulverbeugungsdiagrammen bekannter Strukturen bis hin zur Lösung unbekannter Strukturen konnte die sinnvolle Anwendbarkeit des Fragmentsuchprogramms PATSEE zweifelsfrei belegt werden. Die in den einzelnen Stadien der Untersuchungen diskutierten Einflüsse, wie die benötigte minimale Fragmentgröße oder die Fragmentqualität, lieferten entscheidende Hinweise für das Aufstellen einer einfachen Strategie zur Strukturlösung aus Pulverdaten mit PATSEE. So konnte gezeigt werden, daß für einen sinnvollen Strukturlösungsversuch in der Regel mehr als 50% des relativen Streubeitrags aller Atome in der asymmetrischen Einheit benötigt werden und daß sich diese Grenze nur durch die Verwendung qualitativ hochwertiger Pulverbeugungsdaten, wie sie an modernen Synchrotronringen erhalten werden können, durchbrechen läßt. Auch die Variation eines Torsionsfreiheitsgrads im Zuge der Rotationssuche kann entscheidende Vorteile verschaffen, wenn zwei für sich genommen zu kleine starre Bereiche miteinander kombiniert werden. Außerdem konnte die prinzipielle Verwendbarkeit sowohl mittels Kraftfeldmethoden berechneter als auch experimentell bestimmter Fragmente, wie sie in der CSD in großer Zahl bereitstehen, bestätigt werden. Die in PATSEE verwendete Vielzahl an Gütekriterien zur Beurteilung einer Lösung konnte auch im Falle von Pulverdaten im wesentlichen überzeugen. Zwar ist die Diskriminierung zwischen richtigen und falschen Lösungen bei weitem nicht so eindeutig in bezug auf alle Gütekriterien, aber zumindest wird eine sehr gute Bewertung hinsichtlich von CFOM - dem Gütekriterium, nach dem die Lösungen sortiert werden - und den beiden R-Werten RE(1) und RE(2) erreicht. Als etwas problematisch hat sich die Rotationssuche erwiesen, die nur auf der Beurteilung eines einzigen Gütekriteriums beruht. Da aber gerade der Rotationssuche als erstem Schritt der Fragmentsuche eine wichtige Bedeutung zukommt, ist der Anwender zu großer Sorgfalt bei deren Durchführung verpflichtet. Eine Grenze für Strukturlösungsversuche mit PATSEE stellen derzeit Strukturen mit mehreren Molekülen in der asymmetrischen Einheit dar. Da im einfachsten Fall (Z'= 2) bereits ein komplettes Molekül als Suchfragment einen relativen Streubeitrag von unter 50% aufweist, wird eine erfolgreiche Orientierung und Positionierung mit PATSEE nur noch für hervorragende Datensätze möglich sein. Für noch schwierigere Fälle (Z'> 2) oder für Verbindungen, bei denen nicht das gesamte Molekülgerüst als Suchfragment verwendet werden kann, bestehen dann praktisch keine Aussichten mehr auf eine erfolgreiche Strukturlösung mit PATSEE. Basierend auf diesen Ergebnissen, konnten PATSEE-Parameter empfohlen werden, die sowohl für große Fragmente als auch für den Grenzbereich der minimal benötigten Fragmentgröße gute Erfolgsaussichten für die Strukturlösung gewährleisteten. Dabei wichen die empfohlenen Parameter nur in geringem Maße von den für Einkristalldaten optimierten Werten ab. Anhand zweier unbekannter Strukturen konnte die empfohlene Strategie verifiziert werden. Zusätzlich wurde für eine der beiden Strukturen eine Einkristallstrukturbestimmung vorgenommen, welche die aus Pulverdaten gelöste Struktur bestätigte. Auch wenn einerseits die prinzipielle Anwendbarkeit der Fragmentsuche mit PATSEE auf Pulverbeugungsdaten bewiesen werden konnte und andererseits eine allgemeine Strategie zur Vorgehensweise geliefert wurde, sind doch noch nicht alle interessanten Fragestellungen geklärt. Hier sind zum einen die unbefriedigenden Möglichkeiten bei Strukturen mit mehreren Molekülen in der asymmetrischen Einheit zu nennen. Eine sinnvolle Erweiterung der Zahl simultan suchbarer Fragmente in PATSEE könnte diesen Schwachpunkt beheben. Zugleich könnte mit dieser Erweiterung die Anwendbarkeit auf flexiblere Molekülgeometrien ausgedehnt werden, so daß im Endeffekt eine Steigerung der einsetzbaren Fragmentgröße erreicht wird. Diese Erweiterung sollte bei der enormen Rechenleistung moderner Computersysteme kein unüberwindliches Hindernis darstellen, so daß die benötigte Zeit für einen PATSEE-Lauf mit mehreren zu suchenden Fragmenten auf maximal einige wenige Stunden ansteigen würde. Alternativ wäre zu überlegen, ob nicht das Aufheben der strikten Trennung von Rotationssuche und Translationssuche, also eine 6-dimensionale Fragmentsuche, die bisweilen zu beobachtenden Probleme der Rotationssuche beheben würde. Auch bei dieser Änderung der Vorgehensweise in PATSEE könnten moderne Computer sinnvoll eingesetzt werden. Vorteilhaft für die Strukturlösung wäre hier die Kombination der sehr erfolgreichen Diskriminierung der Gütekriterien bei der Translationssuche mit der bisher kritischen Bestimmung der Orientierung. Eine zweite Fragestellung, die im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden konnte, betrifft die Anwendbarkeit auf makromolekulare Verbindungen, die über eine große interne Regelmäßigkeit verfügen, wie beispielsweise kleinere Peptide mit alpha-helikaler Struktur oder einer beta-Faltblattstruktur. Verschiedene Testreihen an derartigen Verbindungen belegen die prinzipielle Machbarkeit, und außerdem konnte bereits in mindestens einem ähnlich gelagerten Fall [17] gezeigt werden, daß derartige Strukturlösungsversuche bei sehr großen Verbindungen durchführbar sind. Insbesondere wegen der erheblichen Schwierigkeiten bei der Kristallisation derartiger Verbindungen und dem großen wissenschaftlichen Interesse an ihrer Struktur könnten erfolgversprechende Ansätze zur Strukturlösung aus Pulverdaten einen wichtigen Beitrag in der Pharmazie, der Pharmakologie, der Biologie und nicht zuletzt in der Medizin leisten.
Fourier-Transform Infrarot Differenz Spektroskopie ist eine Methode. die es erlaubt, selbst kleinste konformelle Änderungen in der Umgebung der katalytischen Zentren in Enzymen selektiv und mit hoher Zeitauflösung zu messen. Diese Technik wurde an Oxidasen von Paracoccus denitrificans, Thermus thermophilus und Escherichia coli angewandt, um einen Einblick in strukturelle und molekulare Prozesse der Bindung und Dynamik von Liganden am binuklearen Zentrum zu erhalten. Die pH- und Temperatur-Abhängigkeit von CO Schwingungsmoden sowie deren Verhalten nach der Photolyse konnten zeitaufgelöst untersucht und miteinander verglichen werden. Bei Temperaturen >180K war die Bestimmung von thermodynamischen Parametern wie Enthalpie-Barrieren und Arrhenius-Vorfaktoren möglich. Aus dem Verlauf der Rückbindungskinetiken ließen sich ferner Rückschlüsse über die konformelle Heterogenität der Bindung ziehen. Für Temperaturen um 140K konnte das Protein im "quasistationären" Zustand vermessen werden, da Rückreaktionen des Liganden an die Bindungsstelle des Häm a3 unterbunden waren. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit und analoger Funktion zeigten diese typischen Oxidasen große Unterschiede sowohl im Reaktionszentrum als auch im kinetischen Verhalten des Liganden. Die kinetischen Parameter für alle untersuchten Oxidasen weichen deutlich voneinander ab und spiegeln unter anderem die Stärke der Bindung am CUB wider. Die Temperaturabhängigkeit der Populationen der CO-Konformere und die äquivalente Rückbindungs-Kinetik der unterschiedlichen Konformere in den Oxidasen aus dem thermophilen System weisen auf ein strukturelles Merkmal in der Nähe des binuklearen Zentrums hin, das den Populations-Austausch in anderen Oxidasen unterbindet. Aufgrund der pH-Abhängigkeit der entsprechenden Oxidasen kann man schließen, daß diese Eigenschaft durch eine oder mehrere protonierbare Gruppen bewirkt wird, die die unterschiedlichen Konformere in bestimmten Positionen fixiert hält. Die Rückbindungsraten des Liganden zeigen für die T. thermophilus Oxidasen eine Rückbindung erster Ordnung. was auf eine homogene Verteilung der zwei Konformer-Populationen im Enzym deutet. Hingegen zeigte die Oxidase aus P. denitrificans für die Rückbindung eine Verteilung der Reaktionsraten. Ursache dafür ist ein sehr heterogenes Ensemble an Proteinen, das minimale strukturelle Unterschiede im Konformationsraum des Reaktionszentrums aufweist. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war die Beobachtung von Absorptionsbanden der Hämpropionate an Cytochrome c Oxidase von Paracoccus denitrificans nach CO Rückbindung. Sowohl über 13C-isotopenmarkierte Hämpropionate als auch über ortsgerichtete Mutagenese in deren unmittelbarer Umgebung konnten definierte Banden-Zuordnungen im IR-Differenzspektrum erhalten werden. Experimente am Enzym mit Mutationen an der Stelle Asp 399 zeigten, daß die strukturellen Eigenschaften des Häm a3-CuB Zentrums im wesentlichen von dieser Veränderung nicht beeinflußt werden. Jedoch war die pH-Abhängigkeit der CO Konformere hier unterbunden, was auf deren Einfluß auf eine Protonierbarkeit im Wildtyp-Enzym hinweist. Rückschlüsse anhand der Mutante Asp399Asn zeigten (über den Verlust der pH-Abhängigkeit) ganz klar, daß alle unterschiedlichen CO-Konformere funktionell intakt sind. FT-IR Messungen an einem weiteren Enzym, der isolierten Cytochrom bd Oxidase aus E. coli, zeigten bei einer Untersuchung der CO Rückbindungs-Eigenschaften bei 84K die ausschließliche Rückbindung an das Häm d. der möglichen Sauerstoff-Bindungsstelle. Die Bindungsstelle an Häm b, die zu ca. 5% ebenfalls CO bindet, kann bei diesen Temperaturen nicht wiederbesetzt werden. Im typischen Spektralbereich von 1680 bis 1760 cm hoch minus 1 konnten eindeutig die Absorptionsbanden von Asparagin- oder Glutaminsäure-Seitenketten identifiziert werden. Über einen direkten Vergleich der Spektren, die über Redox-Reaktion und CO Rückbindung erhalten wurden, konnten diese Signale als klar in der direkten Umgebung des binuklearen Zentrums lokalisiert zugeordnet werden. Eine Rolle als vorübergehender Protonen-Akzeptor/Donor auf dem Weg zur Sauerstoff-Bindungsstelle ist naheliegend.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Variation des Oxidationspotentials und der Elektronenkonfiguration ( * gegen n *) auf die zur Löschung von angeregten Triplettzuständen durch O2 führenden Prozesse untersucht. Bei ausreichender Triplettenergie werden neben dem Grundzustand des ursprünglich angeregten Sensibilisators in Konkurrenz O2(1 g ) und O2(1 g) Singulettsauerstoff sowie O2(3 g -) Grundzustandssauerstoff gebildet. Frühere Untersuchungen in diesem Arbeitskreis hatten gezeigt, daß es für * Triplettzustände zwei Desaktivierungskanäle gibt, die beide zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führen. Der eine geht von den bei der Löschung zunächst gebildeten 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen ohne Charge Transfer Stabilisierung aus (nCT). Diese befinden sich in einem vollständig eingestellten spinstatistischen Gleichgewicht, aus dem durch innere Konversion in niedrigere Komplexzustände die Desaktivierung erfolgt. Ein gemeinsames Energielückengesetzt f( E) und damit letztlich die Triplettenergie des Sensibilisators bestimmt die Größe der Geschwindigkeitskonstanten der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse in diesem nCT Kanal. Für Sensibilisatoren mit hohem Oxidationspotential und vernachlässigbaren Charge Transfer Wechselwirkungen ist dies der einzige Desaktivierungsprozeß. Mit zunehmender Charge Transfer Wechselwirkung, also mit abnehmendem Oxidationspotential und/oder zunehmender Triplettenergie, wird ein zweiter Desaktivierungskanal geöffnet, der über 1,3(T1 3 ) Komplexe mit Charge Transfer Stabilisierung (pCT) also über Exciplexe führt. Die Exciplexbildung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im pCT Kanal. Zur Verbreitung der Datenbasis den T1( *) Sensibilisatoren wurde in dieser Arbeit eine Reihe von mit elektronenziehenden bzw. elektronenschiebenden Gruppen substituierten Fluorenen studiert, bei denen im wesentlichen nur das Oxidationspotential variiert, während die Triplettenergien weitgehend konstant bleiben. Die mit den Fluorenen erhaltener Ergebnisse bestätigen das bisher erarbeitet Zweikanal-Desaktivierungsmodell. Insbesondere wird auch das spinstatistische Gewicht von 1:3 für die Bildung von Singulett zu Triplettsauerstoff im Exciplex Kanal gefunden, das nur mit einem relativ langsamen 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) isc Gleichgewicht konsistent ist. Dieses Ergebnis widerspricht der früheren Annahme, wonach ein effizientes isc Gleichgewicht nur zwischen 1,3(T1 3 ) Exciplexen, nicht aber zwischen 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen existieren soll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell für die 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) angeregten Komplexe vorgeschlagen, das in einfacher Weise erklärt, warum das isc zwischen Encounter Komplexen von Sensibilisator und O2 schneller ist, als das zwischen den entsprechenden Exciplexen. Die weitere Analyse der Fluoren Daten zeigt, daß neben dem Oxidationspotential und der Triplettenergie des Sensibilisators auch dessen Struktur die Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen kann, allerdings weitaus schwächer als die beiden ersten Einflußgrößen. Mit den Messungen der Geschwindigkeitskonstanten kT 1 , kT 1 und für kT 3 der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse für die unterschiedlich substituierten Benzophenonderivate wurde erstmals eine quantitative Untersuchung der Löschung von n * angeregten Triplettzuständen durch O2 durchgeführt. Obwohl für die Benzophenone eine stärkere Variation des Oxidationspotentials bei nahezu konstanter Triplettenergie erreicht werden konnte, wurde im Vergleich zu den * Triplettsensibilisatoren eine wesentlich schwächere Variation von kT 1 , kT 1 und für kT 3 beobachtet. Gleichzeitig liegen die Werte von kT 1 , kT 1 und für kT 3 der Benzophenone mit vernachlässigbarer Charge Transfer Wechselwirkung weit von der für * Triplettsensibilisatoren gefundenen Energielückenbeziehung f( E). Offenbar gilt für n * Triplettsensibilisatoren eine andere Energielückenbeziehung f( E), die viel schwächer von E abhängt. Es konnte gezeigt werden, daß die schwächere Überschußenergieabhängigkeit mit der unterschiedlichen Struktur der 1,3(T1.3 ) Komplexe zusammenhängt. Für 1,3(T1(n *) 3 ) ist eine Vierzentren Struktur, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls parallel und benachbart zu den beiden Atomen der angeregten Carbonyl Gruppe liegen, sehr wahrscheinlich. Bei der Desaktivierung der Carbonyleinheit ändern sich die Bindungslängen der Vierzentrenstruktur stark, was einem Übergang zwischen versetzten Potentialkurven mit schwacher Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren entspricht. Für 1,3(T1( *) 3 ) Komplexe ist eine supra-supra Struktur anzunehmen, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls mit gegenüberliegenden Kohlenstoffatomen eines angeregten aromatischen Rings wechselwirken. Bei der Desaktivierung des aromatischen Rings ändern sich die Bindungslängen nur wenig, so daß man von einem Übergang zwischen übereinander liegenden Potentialkurven mit stärkerer Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren sprechen kann. Dies ist der eigentliche Grund für die verschiedenen Energielückenbeziehungen f( E) und f( E) bei der Löschung von * und n * Triplettsensibilsatoren durch O2. Die Variation des Oxidationspotentials und damit der Stärke der Charge Transfer Wechselwirkungen in den 1,3(T1 3 ) Komplexen wird durch unterschiedliche Substitution von aromatischen Ringen mit elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen bewirkt. Da die aromatischen Ringe bei den n * Triplettsensibilisatoren im Gegensatz zu den * Triplettsensibilisatoren nicht Bestandteil des elektronisch angeregten Zentrum sind, fallen die Charge Transfer Effekte bei den n * Triplettsensibilisatoren deutlich schwächer aus als bei den * Triplettsensibilisatoren. Damit konnte in der vorliegende Arbeit erstmals eine konsistente Begründung für das unterschiedliche Verhalten von n * und * Triplettsensibilisatoren bei der Löschung durch O2 gegeben werden.
Mit Hilfe der direkten Nachweismethode von Singulettsauerstoff über die 1O2-Phosphoreszenzemission bei 1270 nm wurden zeitabhängige Messungen durchgeführt, mit denen größtenteils die jeweiligen Reaktionsmechanismen der Perhydrolyse von Nitrilen, Chlorameisensäureestern und Acetamid sowie von Natriumcyanat und teilweise von Benzoylsäurechloriden ermittelt werden konnten. Über den Mechanismus der erstmals von Radziszewski durchgeführten Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Nitrilen (Radziszewski 1885) bestand bis heute noch keine endgültige Gewißheit. Es konnte nun gezeigt werden, daß im Gegensatz zu dem bisher allgemein akzeptierten Mechanismus von Wiberg (Wiberg 1953) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in wäßriger alkalischer Lösung der heterolytische Zerfall der intermediär gebildeten Peroxoiminosäure ist. Diese Zerfallsreaktion läuft nach einer Reaktion zweiter Ordnung ab und ist stark vorn pN-Wert abhängig. Durch die ph-Abhängigkeit konnten erstmals sowohl die pKs-Werte sowie auch die heterolytischen Zerfallskonstanten kZ, der untersuchten Peroxoiminosäuren abgeschätzt werden. In Gegenwart eines Ketons wird diese Reaktion bei Verwendung von Acetonitril stark beschleunigt. Verwendet man reaktivere Ketone wie zum Beispiel Fluoraceton wird das Zeitgesetz so komplex, daß eine quantitative Auswertung allein anhand der Singulettsauerstoffbildung nicht mehr möglich ist. Im Rahmen der Untersuchung der Nitrile wurde auch die Perhydrolyse des anorganischen Natriumcyanats in alkalischer Pufferlösung untersucht. Der hierbei gefundene Mechanismus unterscheidet sich allerdings von dem der Nitrile. In der ersten Reaktion pseudo-erster Ordnung wird die bisher unbekannte Peroxocarbaminsäure (H2N-C(O)OOH) gebildet, die dann unter Bildung von Ammoniak und dem instabilen Kohlenstoffperoxid (C03) zerfällt. Kohlenstoffperoxid (C03) wird als die Verbindung angesehen, deren Zerfall zur Bildung von Kohlenstoffdioxid und Singulettsauerstoff führt. Bei der Perhydrolyse des Acetamids im basischen Bereich konnten nur bei einem großen Überschuß an Wasserstoffperoxid auswertbare 1O2-Phosphoreszenz-Zeit-Kurven gefunden werden. Weiterhin wurde in THF die Perhydrolyse einiger Chlorameisensäureester in Abwesenheit und Gegenwart von Pyridin studiert. Die Perhydrolyse der Ester führte in Abwesenheit von Pyridin überwiegend zur Ausbildung eines konstanten 1O2-Phosphoreszenzsignal, dem Soge nannten "Chloridsignal", das eindeutig auf die in saurer Lösung durch Chloridionen katalysierte Zerfallsreaktion von Wasserstoffperoxid zurückzuführen ist. Die Induktionszeit, das heißt die Zeit nach der ein Singulettsauerstoffsignal beobachtet wird, korreliert mit der Stärke der elektronenziehenden Estergruppe. Wird die Perhydrolyse der genannten Ester in Gegenwart von Pyridin untersucht, wird die Reaktion bei dem Chlorameisensäuremethylester (CAME), dem Chlorameisensäureethylester (CAEE), dem Chlorameisensäurebenzylester (CABE) und dem Chlorameisensäure-4-nitrobenzylester (CANBE) durch Pyridin sehr stark beschleunigt. Nach Zugabe von Pyridin wird ohne lnduktionsperiode ein intensives 1O2-Phosphoreszenzsignal beobachtet, das nach einer Reaktion pseudo-erster Ordnung abklingt. Vermutlich wird bei den genannten Estern intermediär das N-Peroxocarboxylpvridiniumkation gebildet, welches auf Grund des in alpha-Stellung zur Peroxocarhoxylgruppe stehenden positiv geladenen Stickstoffatoms ein starkes Oxidationsmittel ist. Ferner wurde die Umsetzung von Säurechloriden mit Wasserstoffperoxid untersucht, bei der ebenfalls intermediär eine Peroxosäure gebildet wird, Jedoch war es nicht möglich, den Reaktionsmechanismus tatsächlich aufzuklären.
Die vorgelegte Arbeit beschäftigte sich zunächst mit der Synthese von neuen 3'- und basenmodifizierten Nukleotiden und deren Markierung mit Fluoresceinisithiocyanat. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Überprüfung der synthetisierten Verbindungen auf ihre Eignung als Terminatoren für die enzymatische DNA-Sequenzierung. Die Synthese des neuen Thioamidtriphosphats 3'- [[6-Amino- 1 -thioxohexyl) amino] -3'-konnte in 10 Schritten ausgehend vom Thymidin erfolgreich durchgeführt werden. Zunächst erfolgte die Umsetzung zum 3'-Amino-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3'-desoxythymidin, an dessen 3'-Aminofunktion ein Aminocapronsäurelinker angekuppelt wurde. Der Schlüsselschritt der Synthese war die Beschwefelung der so generierten 3'-Amidfunktion mittels Lawesson's Reagenz. Dabei konnte durch Optimierung der Synthesebedingungen die Ausbeute der Beschwefelungsreaktion um 30 % gesteigert werden. Das Thioamid 3' -Desoxy-5 '-0- (4,4'-dimethoxytrityl) -3'- {{6-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)-carbonyl] -amino}-1-thioxohexyl}amino}thymidin wurde zum Triphosphat umgesetzt und anschliessend FITC markiert. Für die Synthese des N2-modifizierten 2-Pentylamin-2',3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphats 43 wurden Synthesewege beschritten. Schliesslich führte der Trick des Ausnutzens von Desmethylwyosin als Schutzgruppe zum Erfolg. Ausgehend vom 2'-Desoxyguanosin konnte die Synthese der unmarkierte Verbindung 2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 41 in 8 Schritten und die des Triphosphats 2-Pentylamin-2'3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 43 und dessen FITCMarkierung in 12 Schritten erfolgreich durchgeführt werden. Die 5'-entschützte Verbindung 2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin wurde erfolgreich zum Triphosphat umgesetzt. Die Verbindung 5'-0- (tert-Butyldimethylsilyl)-2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin wurde Azid überführt. Das anschliessend synthetisierte Triphosphat 2-Pentylazid-2',3-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 42 wurde reduziert und über die entstandene freie Aminofunktion mit FITC markiert. Alle neuen Triphosphate konnten durch optimierte Aufreinigungsbedingungen in hochreinem, salzreien Zustand isoliert werden. Vor dem Einsatz als Terminatoren für die DNA-Sequenzierung wurden alle Triphosphate als Na-Salze gefällt. Die synthetisierten Thioamidtriphosphate sind im Laufe dieser Arbeit als neue Verbindungen synthetisiert und veröffentlicht worden. Die hergestellten N2 - modifizierten Didesoxyguanosintriphosphate sind bisher nicht beschrieben und neue Vertreter ihrer Verbindungsklasse. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die neuen, modifizierten Triphosphate 39, 40, 41, 43 und 44 auf ihre Eignung als Terminatoren für die Sanger-DANN-Sequenzierung getestet. Dabei wurden fünf verschiedene Polymerasen eingesetzt: Die thermostabilen Polymerasen AmpliTaq, Taq(exo-), Vent(exo-), Bst und die nicht thermostabile T7 Polymerase. Die besten Ergebnisse konnten mit der T7 Polymerase erreicht werden. Alle getesteten Terminatoren wurden als Terminatoren von der T7 Polymerase akzeptiert. Die entsprechenden Sanger-Abbruchfragmente konnten mittels des Cy5-markierten Primers detektiert werden. Die Verbindung 39 wurde auch von der AmpliTaq und der Taq(exo-) Polymerase akzeptiert. Die Terminatoren 41 und 43 wurden von der Taq(exo-) Polymerase eingebaut. Entsprechende Abbruchfragmente konnten in schwacher Konzentration detektiert werden. Mit der Bst- und der Vent(exo-)-Polymerase konnten keine positiven Ergebnisse erzielt werden. Mit Sicherheit können alle getesteten Triphosphate als Substrate zumindest für die positiv getesteten Polymerasen T7, AmpliTaq und Taq(exo-) bezeichnet werden. In Zukunft sollten mit beiden FITC-markierten Nukleotiden Sequenzierversuche mit einem geeigneten Laser durchgeführt werden, um Klarheit darüber zu bekommen, ob der Farbstoff nach dem enzymatischen Einbau am Terminator verbleibt und zur Dye-TerminatorSequenzierung eingesetzt werden kann. Ausserdem ist mit der Synthese des N2 -modifizierten ddG's die Grundlage für ein Sequenziersystem mit den bereits existierenden modifizierten ddA- und ddC-Terminatoren geschaffen.
Die vorliegende Arbeit befasst sich im Wesentlichen mit zwei Zielen. Zum einen sollte durch den selektiven Einbau von modifizierten Nukleosiden der UUCG-Tetraloop untersucht werden, um seine ungewöhnlich hohe Stabilität besser zu verstehen. In einem zweiten Projekt stand die Entwicklung einer neuen Methode für das Spin-Labeling von Oligonukleotiden für die ESR-Spektroskopie im Mittelpunkt. Die einzigartige hohe Stabilität des UUCG-Tetraloops beruht auf der Ausnutzung der drei stabilisierenden Faktoren: Wasserstoffbrücken, Basenstapelung und Solvatation. Für die Untersuchung des UUCG-Tetraloops wurden 2´-Fluorpyrimidine 22a/b, 23a/b und 27a/b, 2´- Desoxyuridin 26a/b sowie ein dem Uridin isosterer Baustein 28a/b eingesetzt (Abb. 10.1). Während die Bausteine 27a/b und 28a/b vorlagen, sind die Bausteine 22a/b, 23a/b und 26a/b synthetisiert worden. 2´-Fluorpyrimidine können durch die fehlende 2´-OH-Funktion nicht als Wasserstoffbrückendonor dienen. Weiterhin verschiebt die Fluorierung in ribo- bzw. arabino- Stellung das C3´-endo/C2´-endo Gleichgewicht. Im Vergleich mit dem Einbau von 2´- Desoxyuridin lassen sich Aussagen über Vorzugskonformation und Beteiligung an Wasserstoffbrücken einzelner Nukleotide im Loop machen. Ein Schlüsselmolekül für die Synthese der 2´-Fluor modifizierten Bausteine 22a/b und 23a/b ist 2,2´-Anhydro-1-( -D-arabinofuranosyl)uracil 19 welches durch die Umsetzung von Uridin 18 mit Diphenylcarbonat und Natriumhydrogencarbonat in HMPT erhalten werden kann. Dieses ermöglicht die selektive Einführung eines Fluor-Atoms. Die 2´-Fluornukleoside wurden nach Standardbedingungen in Phosphoramidite überführt. Die Darstellung des Cytidinbausteins 23a/b gelang durch direkte Umsetzung der Verbindung 22a/b mit 1,2,4-Triazol und POCl3. Diese Reaktion erspart einen gesonderten mehrstufigen Syntheseweg für die Verbindung 23a/b ausgehend vom Cytidin. Die Bausteine wurden selektiv an verschiedenen Positionen im Loop- und Stembereich der UUCG-Haarnadelschlaufe mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten eingebaut. Die Aufreinigung der erhaltenen RNA-Stränge erfolgte durch Anionenaustausch-HPLC. Nach der Charakterisierung durch MALDI-TOF Massenspektrometrie wurden die Stränge mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Neben den Tm-Werten wurden auch die thermodynamischen Parameter bestimmt. Aus den gemessenen Daten konnten im Wesentlichen folgende Ergebnisse erzielt werden: * Der Einbau aller Bausteine im Loopbereich führte zu einer Destabilisierung im Vergleich zum nativen Loop. Die Inkorporation von UF im Stembereich hatte eine beachtliche Stabilisierung der Struktur zur Folge, im Fall des Stranges HP19 von 8°C (siehe Tab. 7.1, Seite 79) * Der Einbau von UF an der Position U4 führte erwartungsgemäß zu einer Destabilisierung, da die durch NMR-Daten belegte Wasserstoffbrücke zu G7 nicht ausgebildet wird. * An der Position U4 liegt bevorzugt eine C2´-endo Konformation vor. * Von besonderer Bedeutung für die Stabilität des Loops ist die Position C6. Die Inkorporation von CF hat eine besonders deutliche Destabilisierung zur Folge, woraus auf eine bevorzugte C2´-endo Konformation geschlossen werden kann. Zum anderen spielen hier Solvatationseffekte eine Rolle, da die 2´-OH-Funktion des nativen Loops Kontakt zum Lösungsmittel hat. * Der Einbau des isosteren Bausteins 28a/b führte an keiner Position zu einer Stabilisierung, obwohl durch das ausgeprägte -System eine bessere Basenstapelung zu erwarten wäre. Im Gegenteil wir durch die modifizierte Base der Tetraloop nachhaltig destabilisiert (12°C). * Auffällig ist eine Abflachung der erhaltenen Schmelzkurven, die auf eine Abnahme der Kooperativität oder das Vorhandensein verschiedener Zwischenstufen schließen lässt. Auch NMR-Ergebnisse belegen, dass der Tetraloop ein hohes Maß an Flexibilität zeigt. Die erhaltenen Daten sind in Übereinstimmung mit einer auf NMR-Daten beruhenden simulierten Struktur, die Williams et al, 2001 vorgeschlagen haben. * Die Mehrfacheinbauten zeigen, dass die stabilisierenden Kräfte dieses Tetraloops synergetisch scheinbar optimal zusammenwirken und nur schwer getrennt voneinander betrachtet werden können. Im zweiten Projekt sollten Oligonukleotide durch das Anbringen von Spin-Labeln für die ESR-Spektroskopie zugänglich gemacht werden. Zunächst ist der durch seine Starrheit geeignete Label 29 in einer 8-stufigen Synthese ausgehend von 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-4-on 41 synthetisiert worden. Nach der Bromierung in und ´-Position wird durch eine Favorskii-Umlagerung der Fünfring aufgebaut. Die Oxidation des Amins wurde mit H2O2/Natriumwolframat durchgeführt. Nach der basischen Hydrolyse wird die Seitenkette über ein Weinrebamid zum Aldehyd reduziert. Eine direkte Reduktion war nicht möglich. Das terminale Alkin des Labels 29 wir durch Seitenkettenverlängerung durch eine Wittig- Reaktion mit anschließender Dehydrochlorierung erhalten. Ein alternativer Syntheseweg, der die Oxidation des Amins zum Nitroxid auf einer späteren Stufe vorsieht, war nicht erfolgreich. Da die Ankupplung des Labels an die 5-Position eines Uridin- oder Desoxyuridin- Bausteins während der Festphasensynthese am Syntheseautomaten erfolgen soll, ist der entsprechende 5-Ioduridinphosphoramidit- bzw. 2´-Desoxy-5-Ioduridinphosphoramidit- baustein synthetisiert worden. Nach der Schützung der freien Hydroxylgruppen mit der Acetylschutzgruppe ist die Iodierung der 5-Position mit Iod und Cerammoniumnitrat durchgeführt worden. Nach der Entschützung der Hydroxylgruppen wurden die Phosphoramidite nach Standardmethoden synthetisiert. Im Gegensatz zu bisherigen Arbeiten, die ein gelabletes Phosphoramidit am Synthesizer eingebaut haben, wurde die Kupplung des Labels in dieser Arbeit während der Festphasensynthese durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass im Gegensatz zu dem gelabelten Amidit pro Kupplung nur geringe Mengen des Spin-Labels verbraucht werden. An der zu markierenden Position wird ein 5-Ioduridin oder 2´-Desoxy-5-ioduridinbaustein eingebaut und danach die Säule vom Synthesizer entfernt. Nun wird mit Hilfe von Spritzen eine Mischung des Labels, des Palladium(0)-Katalysators und CuI in DMF/Triethylamin auf die Säule aufgegeben. Nach der erfolgten Kupplung wird die Säule wieder am Synthesizer installiert und die Synthese fortgesetzt. Es hat sich aus Gründen der einfacheren Handhabbarkeit als günstiger erwiesen, als Katalysator nicht Tetrakis-(triphenylophosphin)-palladium(0) 66 sondern Bis- (triphenylphospin)-palladium(II)-dichlorid 68 einzusetzen. Die Kupplungsausbeuten des Labels lagen nach HPLC-Daten bei über 90% für die Stränge SG1 bis SG4 (siehe Tab. 9.2, Seite 132). Die Ausbeuten lagen damit genauso hoch wie die Kupplung des als Vergleichsverbindung eingesetzten Hexins. Während die HPLC-Aufreinigung bei den kurzen Strängen erfolgreich war, waren bei den längeren Strängen SG7 bis SG9 die Unterschiede in den Retentionszeiten geringer, sodass es bei noch längeren Strängen nötig werden könnte, die Stränge mittels Gelelektrophorese aufzureinigen. Die Analytik erfolgte durch ESR-Spektroskopie, enzymatischen Verdau und Massenspektrometrie. Jedoch habe sich sowohl die MALDI-TOF als auch die ESI- Massenspektrometrie als problematisch erwiesen. Die Spektren waren oft nicht aussagekräftig und wenig reproduzierbar. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten ausgehend von dieser Arbeit werden folgende Untersuchungen angeregt: * Die Untersuchung, ob FPLC oder Gelelektrophorese geeignete Methoden darstellen, um längere gelabelte Stränge aufzureinigen. * Darstellung von iodierten Purinnukleosiden, um beliebige Positionen innerhalb eines Oligonukleotids mit einem Spin-Label markieren zu können. * Den Mehrfacheinbau von Spin-Labeln um Abstände in kleinen RNA-Strukturen, z.B. Ribozymen zu bestimmen. Hier können auch Wechselwirkungen mit anderen paramagnetischen Sonden wie Manganionen ausgenutzt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Fluorbenzol- und Fluorbenzimidazol- Nukleoside synthetisiert. Mit 1´-Desoxy-1´-(4-fluor-1-N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose 32 handelt es sich um einen zum natürlichen Inosin isosteren Baustein. Die Carbonylsauerstoffe wurden durch Fluoratome und die Stickstoffatome des Sechsringes durch sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome ersetzt. Mit den Bausteinen 1´-Desoxy-1´-(4,6-difluor-1- N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose 33 und 1´-Desoxy-1´-benzimidazolyl-beta-D-ribofuranose 37 wurden zwei weitere Benzimidazol-Nukleoside mit zwei Fluoratomen bzw. ohne Fluor synthetisiert. Als isosteren Baustein für das natürliche Uridin wurde 1´-Desoxy-1´-(2,4- difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 30 synthetisiert. Auch hier wurden die Carbonylsauerstoffe durch Fluoratome und die Stickstoffatome durch sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome ersetzt. Um den Einfluß der Fluorsubstitution untersuchen zu können, wurden noch 1´-Desoxy-1´- (2,4,6-trifluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 86, 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34, 1´-Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35, 1´-Desoxy-1´-(2-fluorphenyl)-beta-D- ribofuranose 36 und 1´-Desoxy-1´-phenyl-beta-D-ribofuranose 38 synthetisiert. Die einfach fluorierten Bausteine wurden so ausgewählt, daß das Fluoratom an jeder möglichen Position des Aromaten einmal vorkommt. Schließlich wurden noch Inosin 31 und 1-Desoxy-D- ribofuranose 39 als abasischer Baustein synthetisiert. Die Fluorbenzimidazole wurden ausgehend von den entsprechenden Fluoracetaniliden dargestellt. Die Glykosylierung erfolgte nach der Silyl-Hilbert-Johnson Reaktion mit anschließender Deacetylierung der Hydroxylfunktionen mit ammoniakalischem Methanol. Für die C-Glykosylierung der C-Nukleoside wurde 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribono-gamma-lacton 85 benötigt. Dies wurde über vier Stufen aus D-Ribose dargestellt. Nach der C-Glykosylierung mit dem entsprechenden Fluorbrombenzol wurde den Nukleosiden die entstandene C1´- Hydroxylfunktion entfernt. Anschließend wurden die C-Nukleoside mit Palladiumhydroxid auf Kohle und Cyclohexen in einer Transfer-Katalyse entschützt. Die Ausnahme bildete 1´- Desoxy-1´-phenyl-beta-D-ribofuranose 38, das mit Bortribromid entschützt wurde. Der abasische Baustein 39 wurde aus 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose 84 durch Dehydroxylierung und anschließender Entschützung gewonnen. Von allen Fluorbenzol-Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorbenzol-Nukleoside mit Ausnahme von 1´- Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35 zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der sich die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34 kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 255 pm. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 230 pm ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs C sp² -F...H-C sp² . Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auch in den Kristallstrukturen von 1´-Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 30 und 1´-Desoxy- 1´-(2-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 36 werden Fluor-Wasserstoff-Abstände von 255 pm und damit genau der Summe der van-der-Waals Radien gefunden. Nur die Kristallstruktur von 1´- Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35 zeigt keine F...H Wasserstoffbrücken. Diese Struktur weist auch als einzige eine Fischgräten-Struktur auf. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten und HPLC-Retentionszeiten der einzelnen Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Die entschützten Nukleoside wurden nach Standardmethoden für RNA Bausteine in ihre Phosphoramidite überführt. Dabei stellte sich heraus, daß durch eine starke Wanderungstendenz der TBDMS-Gruppe in Richtung 3´-Hydroxylfunktion bei allen fluormodifizierten Nukleosiden das gewünschte 2´-geschützte Isomer nur in niedrigen Ausbeuten erhalten werden konnte. Es konnte gezeigt werden, daß bei Verwendung der neuen TOM-Schutzgruppe dieses Problem gelöst werden kann. Die erhaltenen Phosphoramiditbausteine wurden mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten in Ribonukleinsäure (RNA) eingebaut. Dazu wurden RNA Stränge aus zwölf Nukleotiden mit einer Modifikation in der Mitte synthetisiert und aufgereinigt. Um festzustellen, ob die modifizierten Bausteine Wasserstoffbrücken zu den natürlichen Nukleobasen ausbilden oder nicht, wurden sie mit allen vier natürlichen Basen gepaart und die erhaltenen 12mer RNA Duplexe mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt und die thermodynamischen Daten errechnet. Dabei stellte sich heraus, daß mehrere der modifizierten Nukleoside kaum zwischen den natürlichen Nukleosiden differenzieren, d.h. das die erhaltenen Schmelzpunkte der RNA Duplexe sich kaum unterscheiden egal mit welcher natürlichen Base die modifizierten Basen gepaart sind. Als beste universelle Basen mit der geringsten Differenzierung und den geringsten Stabilitätsverlusten des resultierenden RNA Duplex haben sich 1´-Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose (B) und 1´-Desoxy-1´-(4,6- difluor-1-N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose (E) herausgestellt. Für weitere Untersuchungen wurden die modifizierten Nukleoside gegeneinander und mit dem abasischen Baustein gepaart. Aus den erhaltenen Daten wurden die Beiträge der Solvatation und der Basenstapelungswechselwirkung aller modifizierten Nukleoside bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß ein Einbau einer modifizierten Nukleobase die RNA-Doppelhelix durch fehlende Wasserstoffbrücken zu den natürlichen Nukleobasen und durch geringere Solvatation destabilisiert. In Gegenzug wird die RNA-Doppelhelix durch verstärkte Basenstapelungswechselwirkungen der modifizierten Nukleobasen stabilisiert. Über alle Effekte betrachtet wird die Doppelhelix durch den Einbau einer der untersuchten Nukleoside destabilisiert. Letztendlich wurden Basenpaare aus zwei modifizierten Nukleotiden gebildet, und zwar immer aus einer Purin analogen und einer Pyrimidin analogen Nukleobase (z.B. 4- Fluorbenzimidazol (D) und 2,4-Difluorbenzol (B)). Aus den berechneten Beiträgen für Solvatation und Basenstapelungswechselwirkungen konnten die erwartenden Schmelzpunkte und freien Enthalpien (betaG 0 ) für diese Basenpaare errechnet werden. Im Falle des Benzimidazol (O)-Benzol (M) Basenpaares war dieser Wert mit dem gemessenen fast identisch (±0,1°C). Für das 4-Fluorbenzimidazol-(D)-2,4-Difluorbenzol-(B) und das 4,6- Difluorbenzimidazol-(E)-2,4-Difluorbenzol-(B) Basenpaar sind die gemessenen Werte allerdings um 0,6°C (0,4 kcal/mol) bzw. 0,9°C (0,6 kcal/mol) höher als die errechneten. Da sich diese Basenpaare von dem Benzimidazol-(O)-Benzol-(M) Basenpaar nur durch die Fluoratome unterscheiden, muß diese Stabilisierung der RNA Duplexe durch Wechselwirkungen des Fluors zustande kommen. Bei dieser Wechselwirkung zwischen zwei modifizierten Nukleobasen könnte es sich um F...H-Wasserstoffbrücken handeln, wie sie auch schon in den Kristallen von 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34 und 1´- Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribo-furanose 30 nachgewiesen werden konnten. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet ausgehend von den in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse werden folgende Untersuchungen angeregt: - Messung von Fluor-NMR-Spektren zur Untersuchung, ob es sich bei den ermittelten Duplex stabilisierenden Kräften um F...H Wasserstoffbrücken handelt. - Verifizierung der ermittelten Beiträge der Solvatation und der Basenstapelungswechsel- wirkungen durch Einbau der modifizierten Nukleoside in RNA einer anderen Sequenz. - Synthese der Triphosphate der fluormodifizierten Nukleoside mit enzymatischen Einbauversuchen. - Einbau der als universellen Basen erkannten Nukleoside in Ribozyme mit Test der Enzymselektivität und Enzymaktivität.
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die initialen Bewegungsparameter von Ionen bei matrixunterstützter Laserdesorption zu bestimmen, um mit deren Kenntnis das Verständnis des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI zu verbessern. Die Etablierung einer Meßmethode der initialen Geschwindigkeit von Analytionen sowie die Überprüfung verschiedener experimenteller Parameter führten zur Bestimmung einer großen Zahl von Meßwerten der Startgeschwindigkeit von Ionen unterschiedlicher Masse, Ladung und Substanzklasse bei verschiedenen Matrizes und Präparationsbedingungen (siehe Kapitel 5 und 7). Durch Vergleich dieser Meßwerte ist eine Charakterisierung des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI möglich. Aufbauend auf diesen Untersuchungen der Startgeschwindigkeit von Ionen wurde ein Desorptions/Ionisationmodell für MALDI entwickelt (siehe Kapitel 6 und 8). Aus der festen Matrix/Analytpräparation werden durch den Laserimpuls oberhalb einer kritischen Laserbestrahlung geladene Bruchstücke ("Cluster") freigesetzt. Aus diesen Clustern resultiert nach Abdampfen von ungeladenenen Teilchen, wie zum Beispiel Matrixmolekülen, die Freisetzung von Ionen in der Gasphase. Hierbei kann das Modell der Clusterbildung sehr gut mit dem Desorptionsmodell nach Zhigilei (siehe Kapitel 2.4.1.5) verknüpft werden [Zhi97]. Die Cluster verschiedener Größe werden in der sich ausdehnenden Teilchenwolke transportiert. Sie bewegen sich mit der initialen Geschwindigkeit der expandierenden Teilchenwolke. Dieser Vorgang kann mit dem "Mitgerissen werden" der Biomoleküle (entrainment) [Bea91] bei MALDI korreliert werden: So wird beispielsweise beobachtet, daß die mittlere initiale Geschwindigkeit v 0 der Analytmoleküle im Mittel nie höher ist als die der Matrixmoleküle. Die Schwellbestrahlungsabhängigkeit der Ionisation kann weiterhin mit der Schwellbestrahlung der Ablation, d.h. der kollektiven Ablation von großen Partikeln aus der Matrix/Analytpräparation, wie sie von Zhigilei in molekulardynamischen Simulationen gefunden wurde, verknüpft werden. Desorption und Ionisation sind somit nicht getrennt voneinander zu betrachten, da während der Desorption die Freisetzung von Ionen erfolgt. Wenn Peptide und Proteine aus Clustern stammen, besitzen die freigesetzten Biomolekülionen die gleiche mittlere Analytionengeschwindigkeit wie die Matrixneutralen [Dre94]. Für kleine Oligosaccharide werden niedrigere Startgeschwindigkeiten detektiert als für Peptide und Proteine. Das kann darauf zurückgeführt werden, daß diese Ionen nicht als vorgeformte Ionen aus Clustern freigesetzt werden. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten neutralen Oligosaccharide kationisiert und (im wesentlichen) nicht protoniert im MALDIMassenspektrum auftreten und bei höheren Verzögerungszeiten eine verstärkte Kationisierung von Oligosacchariden zu beobachten ist, werden diese Teilchen voraussichtlich nach der Desorption in der Gasphase ionisiert (siehe Kapitel 7 und 8). Da Oligosaccharide in die Matrix DHB eingebaut werden, jedoch Kationen zur Ionisation nicht in den Matrixkristallen zur Verfügung stehen, ist anzunehmen, daß neutrale Oligosaccharide aus Clustern mit der gleichen Startgeschwindigkeit wie Peptide und Proteine in der desorbierten Teilchenwolke vorkommen; ihre Ionisation und damit ihre Detektion ist aufgrund der fehlenden Ladung jedoch nicht möglich. Die Ergebnisse der Startgeschwindigkeit von Ionen bei verschiedenen Präparationen verdeutlichen, daß Gasphasenionisation einer der möglichen Wege der Ionisation neben der Freisetzung von Analytionen aus geladenen Clustern ist. Da auch für Peptide und Proteine Kationisierung in der Gasphase auftreten kann, lassen sich auch langsame Molekülionenspezies experimentell feststellen, was mehrere initiale Geschwindigkeits komponenten und damit auch ein Ionensignal mit unterschiedlichen Komponenten der Startgeschwindigkeit zur Folge hat. Weiterhin sollte auch unterhalb der Schwelle des Analytionennachweises (und damit der kollektiven Ablationsschwelle gemäß dem breathing sphereModell) bei MALDI aufgrund von Verdampfung einzelner Moleküle gefolgt von Ionisation in der Gasphase ein Ionensignal feststellbar sein. Die beobachtete mittlere Startgeschwindigkeit von Analytionen wäre somit eine Mischung aus schnellen, aus Clustern stammenden, und aus langsamen, in der Gasphase ionisierten Teilchen. Eine Komponente kann als prompt ionisierte Komponente mit im wesentlichen massenunabhängiger, konstanter (hoher) initialer Geschwindigkeit verstanden werden. Die zweite Komponente kann durch verzögert auftretende Gasphasenionisation innerhalb des expandierenden Materials erklärt werden, wobei die Analytionen eine geringere Startgeschwindigkeit zeigen. Zusammenfassend (siehe Kapitel 8) wird eine kollektive Ablation von Partikeln und vorgeformten Ionen beim MALDIDesorptionsprozeß gefolgt von Sekundärreaktionen innerhalb der dichten Teilchenwolke in der Gasphase in der selvedgeRegion durch Ionen Molekülreaktionen vorgeschlagen, wie es bereits bei dem precursorModell für Sekundärionenmassenspektrometrie formuliert wurde [Sun88], [Pac85], [Ben83]. Bezogen auf die Auswahl potentieller Matrizes besitzt das Modell nach wie vor nur eine geringe "Voraussagekraft": Ob eine Substanz als Matrix geeignet ist oder ob sie einen hohen bzw. geringen Grad an metastabiler Fragmentierung für zum Beispiel Peptide oder Proteine zeigt, kann weiterhin nur experimentell bestimmt werden, wobei jedoch eine Charakterisierung mit Hilfe der Startgeschwindigkeit möglich ist. Der Zusammenhang eines ClusterDesorptions/Ionisationsmodells mit molekulardynamischen Simulationen nach Zhigilei ermöglicht jedoch eine Beschreibung vieler experimenteller Ergebnisse bei MALDI. Weiterführende Experimente sollen die Verifikation des "ClusterModells" der Ionisation zum Ziel haben. Hier ist insbesondere die Untersuchung des Ladungszustandes von Analytmolekülen in festen Matrix/Analytpräparationen von Bedeutung. Weitere Untersuchungen zur Spektrenqualität bei Matrizes, die keinen Einbau der Analytmoleküle in die Matrixkristalle zeigen, sowie eine eingehende Untersuchung der verschiedenen alternativen Präparationstechniken aus Kapitel 7 sind hierbei geplant.