610 Medizin und Gesundheit
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In der vorliegenden Arbeit wurde die mögliche Regulation verschiedener Ionenkanalgene bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit Hilfe von Northern Blots, der semiquantitativen RT-PCR- Technik und zum Teil durch elektrophysiologische Untersuchungen analysiert. Ziel war es, solche Gene zu identifizieren, deren mRNA-Spiegel hochreguliert oder herunterreguliert waren, da diese möglicherweise eine wichtige Rolle bei den kardiovaskulären Erkrankungen spielen könnten. Diese Untersuchungen sollten zu einem besseren Verständnis der renalen und kardialen Funktion dieser Ionenkanäle und der Pathogenese der untersuchten Krankheiten beitragen, aber auch helfen, neue Kandidatengene für diese Krankheiten zu identifizieren. Es wurden insgesamt fünf Tiermodelle mit Hypertonie, kardialer Hypertrophie, Herzinsuffizienz, Niereninsuffizienz und Vorhofflimmern untersucht. Ein Schwerpunkt dieser Untersuchungen waren die CLC-Chloridkanäle, deren kardiovaskuläre Funktionen noch wenig untersucht sind. Die Genprofile der Chloridkanäle CLC-2, CLC-3, CLC-4, CLC-5, CLC-6 und CLC-7 sowie CLC-K1 und CLC-K2 wurden in den Herzen und Nieren der folgenden Tiermodelle analysiert: (1) In spontan hypertensiven Ratten (SHR) und (2) in SH-stroke-prone-Ratten, die eine genetisch bedingte Hypertonie und Herzhypertrophie entwickeln. (3) In salz-sensitiven Dahl-Ratten, die Hypertonie und Herzhypertrophie erst nach einer salzhaltigen Diät, und (4) in Aortic-Banding-Ratten, die nach einem operativen Eingriff Bluthochdruck und kardiale Hypertrophie entwickeln. (5) Schließlich wurde noch ein Rattenmodell untersucht, in dem durch die Ligatur der Koronararterie ein Herzinfarkt induziert wurde, der letztlich zur Herzinsuffizienz führte. In keinem dieser Tiermodelle wurde jedoch eine auffällige Veränderung in der mRNA-Expression der acht untersuchten CLC-Chloridkanäle in den erkrankten Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren beobachtet. Die CLC-Chloridkanäle wurden ferner in einem Niereninsuffizienz-Modell untersucht, bei dem in Ratten durch Abklemmen der renalen Arterien und Venen ein akutes Nierenversagen und letztlich eine Niereninsuffizienz hervorgerufen wurde. In diesem Tiermodell war bereits eine Herunterregulation vieler anderer Ionenkanäle und Transporter beschrieben worden. In zwei unabhängigen Tierstudien wurde eine unterschiedlich starke Abnahme der mRNA-Expression für die einzelnen CLC-Chloridkanäle beobachtet. In einer weiteren Studie konnte die Behandlung von niereninsuffizienten Ratten mit einem bei Niereninsuffizienz wirksamen Inhibitor des NHE-3-Transports das Ausmaß der Reduktion einzelner CLC-Gene abschwächen. Weitere Studien mit höheren Dosen oder potenteren Substanzen sind notwendig, um diese vorläufigen Befunde zu bestätigen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der kardialen Ionenkanaldichten bei einem neuen Kaninchenmodell für Vorhofflimmern, die in Zusammenarbeit mit der Universitätsklinik Tübingen durchgeführt wurde. Das Vorhofflimmern ist eine sehr häufige Herzerkrankung bei älteren Menschen, und anhand dieses Tiermodells sollten vor allem frühe Prozesse des elektrischen Remodelings, das für das Auftreten und die Aufrechterhaltung des Vorhofflimmerns von Bedeutung ist, untersucht werden. Mit Hilfe der semiquantitativen RT-PCR-Analyse konnte in diesem Tiermodell erstmals eine Reduktion der mRNA für die Kaliumkanalgene Kv1.4, Kv4.3 und Kv1.5 sowie für die Kalziumkanalgene alpha1, CaB2a, CaB2b und CaB3 im frühem Stadium des Vorhofflimmerns nachgewiesen werden. Diese Befunde konnten die Resultate von Patch-Clamp-Messungen erklären, die gleichzeitig an der Universität Tübingen an isolierten Vorhofzellen durchgeführt wurden. In diesen Studien wurde in Übereinstimmung mit den erzielten mRNA-Daten eine Abnahme des Ito-Kaliumstromes und des ICa,L-Kalziumstromes nachgewiesen. Mit diesen Untersuchungen konnten frühere Resultate, die auch an Patienten mit chronischem Vorhofflimmern erhoben wurden, bestätigt werden. Die gefundene Regulation zeigt, dass diese Ionenkanalgene eine wichtige Rolle bei dem frühen elektrischen Remodeling spielen und dass das Rapid-Pacing- Kaninchenmodell ein geeignetes Tiermodell für das Vorhofflimmern beim Menschen ist.
In einer Verlaufsbeobachtung wurden fünfundzwanzig Patienten der hämatologischen Ambulanz der J. W. v. Goethe-Universität, welche an Hämophilie oder an einer anderen hämatologischen Erkrankung leiden, über einen Zeitraum von November 1992 bis Februar 1995 untersucht. Diese Patienten erhielten nach Aufklärung eine Hirn-SPECT- Untersuchung mit HMPAO oder EDT. Jeweils 3/25 Patienten wurden wegen eines pathologischen Hirn-SPECT Ergebnisses nach 3 Monaten bzw. bei einem auffälligem Befund nach einem halben Jahr nachuntersucht. Bei unauffälligem Ergebnis erhielten die Patienten (13/25) nach einem Jahr eine Kontrolluntersuchung. Insgesamt bekamen achtzehn Patienten eine technisch einwandfreie Zweituntersuchung; eine Patientin erhielt wegen initial deutlicher Befundverbesserung zur Beobachtung fünf Hirn-SPECT Untersuchungen. Vor jeder nuklearmedizinischen Untersuchung wurde ein psychometrischer Test zur Erfassung der Aufmerksamkeit und Vigilanz, der feinmotorischen Fähigkeiten, depressiver Verstimmung und leichter cerebraler Insuffizienzen durchgeführt. Wichtige klinische Daten und immunologische Parameter zur Einteilung in ein CDC-Stadium lagen ebenfalls vor. Die Perfusionsergebnisse wurden visuell nach Filterung und Reorientierung der Daten anhand der orbito-meatalen Linie und der stereotaktischen Transformation und semiquantitativ nach der Methode nach Podreka ausgewertet. In die visuellen Beurteilung flossen die Perfusion des Gehirnes als gesamtes, die Thalamusperfusion und die Defekte in Größe und Lokalisation ein. Die semiquantitative Auswertung bestand aus einer manuellen Einteilung des Gehirns in 18 Regions of Intrest mit anschließender Quantifizierung der Aktivitätsverteilung. Betrachtet wurden hier zum einen ein Abweichen der mean-cts (%) im rechts/links Vergleich >15%, da dies einen cerebralen Defekt anzeigt, zum anderen Gebiete <90% bzw. >110% der mittleren Gesamt-Counts, welche hypo- bzw. hyperperfundierte Regionen darstellten. * Die Daten zeigten im Langzeitverlauf eine Verschlechterung der cerebralen kortikalen Perfusion mit Progredienz der Defekte. Tendenziell bestanden zu Beginn der HIVE vorwiegend fokale cerebrale Minderperfusion mit Betonung der frontalen, im Thalamus gelegenen und der occipitalen Regionen und erst mit Progredienz der Erkrankung diffuse Veränderungen. Bei dem vorliegenden Patientengut lag die stärkste Perfusion occipital gefolgt von temporal und parietal, mit jeweiliger Betonung des Uptake der dominanten Hemisphäre vor. Im Auswertungsverfahren sollten sich Semiquantitative und visuelle Beurteilungen der Ergebnisse ergänzen, um die jeweilige Fehlermöglichkeiten zu minimieren. Die Methode der stereotaktischen Transformation erwies sich hierbei als die zeitaufwendigere aber genauere Methode. Die verwandten Methoden sind jedoch noch nicht robust genug, um sie für Routineuntersuchungen zu benutzen. * Im Vergleich der neuropsychometrischen Test fand sich eine gute Korrelation der kognitiven Leistungstests (ZVT) mit den SPECT-Daten der Thalamusperfusion. Diese Ergebnisse sollten jedoch nur im Zusammenhang mit anderen Studien betrachtet werden, da die Patientenzahl gering war. * Klinische und immunologische Parameter spiegelten eine cerebrale Infektion mit HIV nicht wider. Zusammenfassend ist die Untersuchung der Perfusion des Hirnkortex mit SPECT eine sensitive Methode cerebrale Veränderungen einer HIVE zu diagnostizieren und den Erfolg einer medikamentösen Therapie zu dokumentieren. Gerade aber in der Frühphase der HIVE ist ein solches diagnostisches Verfahren wichtig, da die meisten Patienten asymptomatisch sind und klinische und immunologische Parameter die cerebrale Infektion nicht widerspiegeln. Zudem handelt es sich um ein nicht invasives Verfahren, welches im Bedarfsfall mehrfach angewendet werden kann. Zur Routineanwendung müssten jedoch robustere semiquantitative Auswertverfahren entwickelt werden.
Kathetertherapie interatrialer Defekte unter besonderer Berücksichtigung der Septum-Morphologie
(2002)
Zwischen 1/98 und 9/99 wurde bei 50 Patienten mit einem Vorhofseptumdefekt vom Sekundum-Typ (ASD II) und bei 75 Patienten mit persistierendem Foramen ovale und gekreuzten Embolien ein transfemoraler Verschluss durchgeführt. Zum Einsatz kamen der Cardio-Seal-Okkluder, der Cardio-Seal-Starflex-Okkluder, der Amplatzer-ASD-Okkluder, der Amplatzer-PFO-Okkluder und der PFO-Star- Okkluder. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu überprüfen, ob bestimmte morphologisch- anatomische Besonderheiten wie insbesondere das Vorliegen eines Vorhof- septumanuerysmas das Behandlungsergebnis und den Verlauf beeinflussen. Das Alter der 18 männlichen und 32 weiblichen ASD-Patienten betrug 44 ± 17 (13- 77) Jahre, das der 35 männlichen und 40 weiblichen PFO-Patienten 47 ± 13 (21- 73) Jahre. Die Größe des Vorhofseptumdefektes betrug, in der kurzen Achse des transösophagealen Echokardiogramms gemessen, im Mittel 13,2 ± 4,5 mm (6,4 29,4 mm; n = 50). Die mit Hilfe eines Ballonkatheters ermittelte Defektgröße betrug für die Ballonpassage 20 ± 4 mm (6 30 mm; n = 49) und für den Stretched- diameter 19 ± 4 mm (11 29 mm; n = 47). Der PFO-Durchmesser betrug 4 22 mm, im Mittel 12 ± 4 mm (Ballonpassage; n = 73) bzw. 3 16 mm, im Mittel 9 ± 3 mm (Stretched-diameter; n = 71). Die Messwerte von Passage und Stretched-diameter waren bei den PFO-Patienten mit Vorhofseptumaneurysma signifikant größer als bei den Patienten ohne Vorhofseptumaneurysma (p < 0,001). Insgesamt konnte bei den ASD- und PFO- Patienten eine lineare Korrelation zwischen Stretched-diameter und Ballonpassage ermittelt werden. Bei allen 50 ASD- und allen 75 PFO-Patienten war die Schirmimplantation primär erfolgreich. Der Nachuntersuchungszeitraums betrug im Mittel 9 ± 5 Monate (1 28 Monate). Direkt nach Verschluss bestand bei 17,6%, nach 2-4 Wochen bei 1,6% und nach 6 Monaten bei 1,6% der Patienten ein Restshunt. Bei den ASD-Patienten, bei denen vor und nach Verschluss Messungen durchgeführt werden konnten (n = 40), sank das Verhältnis Qp/Qs von 2,0 ± 0,5 signifikant auf 1,1 ± 0,3 (p < 0,0001). Während und nach der Implantation traten bei der Gesamtgruppe der Patienten (n = 125) folgende Komplikationen auf: Koronare und cerebrale Luftembolie mit kurzzeitiger klinischer Symptomatik (0,8%), therapierbare Herzrhythmusstörungen (2,4%), passagere thrombotische Auflagerungen auf den Schirmen (1,6%), geringer Perikarderguss (1,6%) und Schirmarmfrakturen (8%). In der Gruppe der PFO-Patienten erlitten 2 von 75 Patienten ein rezidivierendes cerebrovaskuläres Ereignis. Die Rezidivrate fiel von 54% vor Verschluss auf 3,5% nach Verschluss ab. Morphologische Besonderheiten beeinträchtigten das Ergebnis des Katheter- verschlusses nicht, können aber Indikatoren für bestimmte Risikofaktoren sein. Bei den PFO-Patienten zog eine kürzere Tunnellänge ( 7,8 mm) eine signifikant höhere Ereignisrate vor Verschluss (4,5%) gegenüber den Patienten mit längerer Tunnellänge (> 7,8 mm) (2,9%) nach sich (p < 0,05). Auch die Rezidivrate vor Verschluss war bei den Patienten mit kürzerer Tunnelstrecke (75%) signifikant höher als bei den Patienten mit längerer Tunnelstrecke (31%) (p<0,01). PFO- Patienten mit Vorhofseptumaneurysma (vor Verschluss) wiesen nach Katheterverschluss eine höhere Rezidivrate cerebraler Ereignisse (10,5%) auf als die PFO-Patienten ohne Vorhofseptumaneurysma (0%). Bei den ASD-Patienten mit Vorhofseptumaneurysma (n = 12) ergab sich eine signifikant höhere Eingriffs- und Durchleuchtungszeit gegenüber den ASD- Patienten ohne Vorhofseptumaneurysma (50 ± 21,1 min. / 10,5 ± 6,4 min.) versus (39,1 ± 12,8 min. / 6,5 ± 3,6 min.) (p < 0,01). Bei der gleichen Patientengruppe nahm die Septumauslenkung signifikant von 15 ± 3,5 mm vor Verschluss auf 4,6 ± 2,4 mm 6 Monate danach ab (p < 0,001). Bei den PFO-Patienten mit Vorhofseptumaneurysma (n = 17) verringerte sich die Septumauslenkung von 15,9 ± 2,8 mm vor Verschluss auf 3,8 ± 2,0 mm 6 Monaten später (p < 0,001). Ohne Einfluss auf den postinterventionellen Verlauf war die Zunahme der Septumdicke, die in den ventralen und zentralen Abschnitten nach 6 Monaten beim Amplatzer-ASD-Okkluder am stärksten und beim PFO-Star-Okkluder am geringsten ausgeprägt war. Alle angewendeten Okkludersysteme sind für den Verschluss von Vorhofseptumdefekten (ASD II) und persistierenden Foramina ovalia auch bei Vorliegen von Vorhofseptumaneurysmen geeignet.
Die Messung des T-Wellen-Alternans ist eine neue, vielversprechende Methode zur Erfassung von Patienten mit einem erhöhten Risiko für arrhythmische Ereignisse. Die gute Testeffizienz ist für unterschiedliche kardiale Krankheiten belegt; ebenfalls wurde die Überlegenheit des TWA gegenüber anderen gängigen Parameter zur Risikostratifizierung erwiesen. Schwachpunkte dieses Verfahrens sind der relativ hohe Anteil an falsch positiv Getesteten und die häufig scheiternden Messungen. Nach unserem Wissen haben wir mit dieser Studie anhand eines Patienten- kollektivs mit Myokardinfarkt erstmalig erwiesen, dass das Ergebnis einer TWA- Untersuchung unabhängig ist von dem Alter und dem Geschlecht des Patienten, sowie von verschiedenen Parameter des erlittenen Herzinfarktes, wie der Höhe der CK, der Lokalisation, der Art der Erstintervention und dem Perfusionsstatus. Im Gegensatz zu anderen Studien konnten wir keinen Einfluss der Medikation, insbesondere der antiarrhythmischen, auf den Ausgang des Alternans-Testes feststellen. Schließlich zeigt die vorliegende Untersuchung erstmalig, dass das Wiederholen der Messung zu einem späteren Zeitpunkt, nämlich nach sechs Wochen und nach einem Jahr, zu 80 % das gleiche Ergebnis liefert, und zwar unabhängig von Änderungen in der Medikation, weiteren Maßnahmen zur Reperfusion und erneuten kardialen Ereignissen. Das Ergebnis positiv zeigt sich dabei etwas weniger stabil als das Ergebnis negativ. Insgesamt kann gefolgert werden, dass die Methode eine gute Reproduzierbarkeit aufweist und bei der Mehrzahl der Patienten auch im Langzeitverlauf stabile Ergebnisse liefert.
Für eine zukünftige Gentherapie der Immunschwächekrankheit AIDS ist ein effizienter, spezifischer und sicherer Gentransfer in CD4-positive Zellen des peripheren Blutes erforderlich. Hierzu bieten sich vom murinen Leukämievirus (MLV) abgeleitete retrovirale Pseudotypvektoren an, die das Hüllprotein (Env) des HIV-1 oder des simianen Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm) tragen und daher einen selektiven Gentransfer in CD4-positive Zielzellen bewirken (Transduktion). [MLV(SIVagm)]-Vektoren haben gegenüber [MLV(HIV-1)]-Vektoren den Vorteil, daß sie von Seren HIV-1-positiver Patienten nicht neutralisiert werden und daher auch in HIV-1-infizierten Patienten angewendet werden könnten. Jedoch kann aufgrund des Tropismus von SIVagm mit [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren nur die kleine Subpopulation der CCR5-positiven Zellen innerhalb der humanen CD4-positiven Lymphozyten (3 bis 15%) transduziert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Tropismus des SIVagm Env so zu modifizieren, daß auch die Mehrzahl der CD4-positiven Lymphozyten, die den CXCR4-Korezeptor exprimieren (70 bis 95%), transduziert werden kann. Hierzu wurde die putativ für die Korezeptorbindung verantwortliche V3- Loop-Region im Env des SIVagm durch die homologe Region eines CXCR4-tropen HIV-1-Stammes ersetzt. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [MLV(SIVagm-X4)]- Pseudotypvektoren herzustellen, die spezifisch CD4/CXCR4-positive Zellen transduzieren können. Neben der Bedeutung für die Generation neuer Vektoren für die Gentherapie beweist dieses Ergebnis die bisher nicht gezeigte Äquivalenz der V3- Loops der Hüllproteine von HIV-1 und SIVagm für die Korezeptornutzung. Um die neuen [MLV(SIVagm)]-Vektoren charakterisieren zu können und für eine spätere Anwendung weiterzuentwickeln, wurden stabile Zellinien etabliert, die große Vektormengen mit Titern zwischen 6x103 und 7,6x105 i.E./ml produzierten. Mittels Ultrazentifugation konnten Vektorpräparationen mit Titern bis zu 108 i.E./ml hergestellt werden. Die neu generierten [MLV(SIVagm-X4)]-Vektoren erwiesen sich wie die [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren als resistent gegenüber der Neutralisierung durch Seren HIV-1-infizierter Spender und könnten damit in vivo angewendet werden. In Experimenten zur Bestimmung der Transduktionseffizienz in primären peripheren Blutlymphozyten humaner Spender konnte der selektive Gentransfer mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren in CD4-positive Zellen gezeigt werden, während herkömmliche, amphotrope Vektoren CD4-positive und -negative Lymphozyten gleichermaßen transduzierten. Beide [MLV(SIVagm)]-Vektoren erlaubten im Vergleich zu den eingesetzten amphotropen MLV-Vektoren eine höhere Transduktionseffizienz in CD4-positiven Zellen. Neben Zielzell-Spezifität und Effizienz ist die Sicherheit neuer Vektorsysteme entscheidend für die Anwendbarkeit in der humanen Gentherapie. Eine Übertragung replikationskompetenter Retroviren (RCR) gilt hierbei als das Hauptrisiko bei der Nutzung retroviraler Vektoren. Auch bei der Herstellung von [MLV(HIV-1)]- oder [MLV(SIVagm)]-Pseudotypvektoren könnten durch Rekombinationsereignisse in den Verpackungszellen replikationsfähige Hybridviren entstehen. Bei der Untersuchung dieser Vektorsysteme wurde allerdings bisher keine spontane Bildung von RCR nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, durch molekulare Klonierung gezielt derartige Hybridviren zu generieren, um zu klären, ob solche Onko/Lenti-Hybridviren replikationsfähig sein können, zudem sollte gegebenenfalls das pathogene Potential dieser Viren untersucht werden. Dazu wurden die vollständigen Leserahmen des rev- und des env-Gens des HIV-1 bzw. SIVagm anstelle des MLV env-Gens in das Genom eines infektiösen molekularen Klon des MLV inseriert. Die Klonierungsstrategie wurde dabei so gewählt, daß alle notwendigen mRNAs gebildet werden konnten. Die Hybridvirusklone waren nach Transfektion in 293T-Zellen tatsächlich in der Lage, neben den MLV-Genen auch HIV-1 bzw. SIVagm env und rev funktionell zu exprimieren. Es konnten infektiöse Partikel nachgewiesen werden, die das Hybridvirusgenom auf Zielzellen übertragen konnten. In den infizierten Zielzellen wurde jedoch nur die Expression von MLV/SIVagm nachgewiesen werden. Keines der beiden Hybridviren erwies sich als replikationskompetent. Dies deutet darauf hin, daß die Bildung replikationskompetenter Onko/Lenti-Hybridviren unwahrscheinlich ist. Mit den [MLV(SIVagm)]-Vektoren steht somit ein Vektorsystem zur Verfügung, das sich für In-vivo-Anwendungen im HIV-infizierten Patienten eignet. Es konnte gezeigt werden, daß humane CD4-positive Lymphozyten mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren spezifisch, aber auch effizienter und sicherer transduziert werden als unter Verwendung bisher beschriebener amphotroper MLV-Vektoren.
Regulation des CFTR
(2002)
In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation des humanen CFTR an isolierten Makropatches von Xenopus-Oozyten untersucht. Die inside-out-Konfiguration ermöglicht den einfachen Zugang zu den zytosolischen Domänen, welche die CFTR- Aktivität steuern. Daher ist es mit dieser bewährten Methode möglich, die Interaktion des CFTR mit Nukleotiden, insbesondere unter dem Einfluss der Phosphorylierung, weitergehend zu charakterisieren. Die Strom-Spannungskennlinie des ATP-induzierten CFTR-Chloridstroms weicht bei zunehmendem Haltepotenzial von dem Verlauf ab, der aufgrund der Goldmann- Hodgkin-Katz-Gleichung zu erwarten ist. Dies weist auf einen hemmenden Einfluss des in der Badlösung vorhandenen Aspartats hin. Die transienten Ströme bei schnellen Chloridkonzentrationswechseln bestätigen diese Hemmung und legen einen inhibitorischen Einfluss auf das CFTR-Gating nahe. Die Koexpression des CFTR mit dem Fusionsprotein Bakteriorhodopsin-PKA katalytische Untereinheit (BR-PKA) erm glicht die Kanalaktivierung durch einfache ATP-Zugabe. Es wurde gezeigt, dass diese Koexpression die apparente Affinität für MgATP erhöhte. Eine naheliegende Vermutung ist, dass diese Affinitätszunahme durch einen erhöhten Phosphorylierungsgrad hervorgerufen wird, was durch die Messungen mit dem Proteinkinaseinhibitor PKI unterstützt wird. Durch die Aktivierung der koexprimierten membrangebundenen cGMP-abhängigen Proteinkinase II (cGKII) kann der CFTR sowohl in Ganzzellmessungen, als auch in Makropatches phosphoryliert werden. Der Vergleich der ATP-Konzentrationsabhängigkeiten des CFTR unter permanenter (KM = 29 µM) und vorübergehender cGKII-Stimulierung (KM = 64 µM) belegt eine Abnahme des apparenten KM bei kontinuierlicher Kinaseaktivität und somit vermutlich erhöhter Phosphorylierung. Die Öffnungs- und Schlieflkinetik des Kanals wird durch diese permanente Kinaseaktivität nicht beeinflusst. Die zeitabhängige Abnahme des CFTR-Chloridstroms, der Rundown, kann nicht durch eine permanente Proteinkinaseaktivität von BR-PKA oder cGKII aufgehoben werden. Die Signalabnahme tritt auch unter Bedingungen auf, bei denen mögliche vorhandene Phosphatasen (v.a. PP2C) inaktiv sind. Daraus folgt, dass der Rundown des CFTR nicht nur durch Dephosphorylierung verursacht wird. Für Einzelkanalmessungen wird eine Verringerung der Offenwahrscheinlichkeit des epithelialen Natriumkanals ENaC durch den aktivierten CFTR beschrieben. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Makropatchmessungen bestätigen diese Inhibition nicht. Die CFTR- und Natriumkanal-vermittelten Ströme sind, unabhängig von dem Verhältnis der Einzelströme und dem anliegenden Haltepotenzial, generell additiv. Der präphosphorylierte CFTR kann auch durch ATP-Zugabe geöffnet werden, wenn die Badlösung kein Magnesium enthält. Da unter diesen Bedingungen keine ATP- Hydrolyse erfolgen kann, muss eine Kanalaktivierung durch einfache ATP-Bindung möglich sein. Es tritt eine Verringerung der apparenten ATP-Affinität, nicht aber des maximalen Chloridstroms auf, wenn das Magnesium aus der Badlösung entfernt wird (KM[MgATP] 70 µM; KM[ATP]> 1 mM). Die Möglichkeit der nichthydrolytischen Aktivierung wird dadurch bestätigt, dass auch mit dem nicht-hydrolysierbaren ATP- Analog AMP-PNP eine Kanalöffnung erfolgt. Magnesium ist nicht nur an der ATP-Hydrolyse beteiligt, sondern beeinflusst darüber hinaus die Kanalaktivität. Aus den Messungen bei unterschiedlichen freien Mg2 - Konzentrationen in der Badlösung geht ein inhibitorischer Einfluss dieses Kations auf den stationären Maximalstrom und ein komplexer Einfluss auf die Öffnungskinetik hervor. Die Walker-A und die Walker-B-Dom nen von Nukleotidbindestellen sind an der Bindung und Hydrolyse von MgATP in ATPasen beteiligt. Mit CFTR- Mutanten, in denen die Walker-A (K1250A), bzw. die Walker-B (D1370N)-Domäne der zweiten Nukleotidbindestelle (NBD2) mutiert sind, kann die Beteiligung der NBD2 an der Kanalöffnung belegt werden. Die langsame K1250A-Mutante öffnet in Abwesenheit von Magnesium nicht. Dagegen ist sowohl die Öffnungs- und Schließkinetik, als auch die ATP-Affinität der D1370N-Mutante mit der des Wildtyps vergleichbar, weist aber im Gegensatz zu diesem keinerlei Magnesiumabhängigkeit auf. Auf Grundlage dieser Daten wird ein Modell vorgeschlagen, in dem alternativ zu dem hydrolytischen Öffnungszyklus, in dem zunächst eine ATP-Hydrolyse an der NBD1 erfolgt, auch die nichthydrolytische Öffnung über die NBD2 möglich ist.
Human epidermal-type fatty acid binding protein (E-FABP) belongs to a family of intracellular non-enzymatic 14-15 kDa lipid binding proteins (LBP) that specifically bind and facilitate the transport of fatty acids, bile acids or retinoids. Their functions have also been associated with fatty acid signalling, cell growth, regulation and differentiation. As a contribution to better understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by NMR spectroscopy are reported here. Both unlabeled and 15N-enriched samples of recombinant human E-FABP were used for multidimensional high-resolution NMR. The sequential backbone as well as side-chain resonance assignments have been completed. They are reported here and are also available at the BioMagResBank under the accession number BMRB-5083. The presence of six cysteines in the amino acid sequence of human E-FABP is highly unusual for LBPs. Four of the six cysteines are unique to the E-FABPs: C43, C47, C67 and C87. In the three-dimensional structure of E-FABP, two cysteine pairs (C67/C87 and C120/C127) were identified by X-ray analysis to be close enough to allow disulfide bridge formation, but a S-S bond was actually found only between C120 and C127 [Hohoff et al., 1999]. Since the exclusion of a disulfide bridge between C67 and C87 improved the Rfree factor of the crystallographic model, the existence of a covalent bond between these two side- chains was considered unlikely. This agrees with the NMR data, where SCH resonances have been observed for the cysteine residues C43, C67 (tentative assignment) and C87, thus excluding the possibility of a second disulfide bridge in solution. Based on the NOE and hydrogen exchange data, an ensemble of 20 energy-minimized conformers representing the solution structure of human E-FABP complexed with stearic acid has been obtained. The analysis of homonuclear 2D NOESY and 15N-edited 3D NOESY spectra led to a total of 2926 NOE-derived distance constraints. Furthermore, 37 slow- exchanging backbone amide protons were identified to be part of the hydrogen-bonding network in the >-sheet and subsequently converted into 74 additional distance constraints. Finally, the disulfide bridge between C120 and C127 was defined by 3 upper and 3 lower distance bounds. The structure calculation program DYANA regarded 998 of these constraints as irrelevant, i.e., they did not restrict the distance between two protons. Out of the remaining 2008 non-trivial distance constraints, 371 were intraresidual (i = j), 508 sequential (|i - j| = 1), 233 medium-range (1 < |i - j| £ 4), and 896 long-range (|i - j| > 4) NOEs. The protein mainly consists of 10 antiparallel -strands forming a >-barrel structure with a large internal cavity. The three-dimensional solution structure of human E-FABP has been determined with a root-mean-square deviation of 0.92 ± 0.11 Å and 1.46 ± 0.10 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the portal region (i.e., for residues 4-26, 40-56, 63-75 and 83-134; the portal region apparently represents the only opening in the protein surface through which the fatty acid ligand can enter and exit the internal binding cavity), an average backbone RMSD of 0.85 ± 0.10 Å was obtained, thus reflecting the higher conformational dispersion in the portal region. Superposition with the X-ray structure of human E-FABP (excluding the terminal residues) yielded average backbone RMSD values of 1.00 ± 0.07 Å for the entire residue range and 0.98 ± 0.06 Å without the portal region. This indicates a close similarity of the crystallographic and the solution structures. The structure coordinates have been deposited at the RCSB data bank under PDB ID code 1JJJ. The measurement of 15N relaxation experiments (T1, T2 and heteronuclear NOE) at three different fields (500, 600 and 800 MHz) provided information on the internal dynamics of the protein backbone. Nearly all non-terminal backbone amide groups showed order parameters S2 > 0.8, with an average value of 0.88 ± 0.04, suggesting a uniformly low backbone mobility in the nanosecond-to-picosecond time range throughout the entire protein sequence. Moreover, hydrogen/deuterium exchange experiments indicated a direct correlation between the stability of the hydrogen-bonding network in the >-sheet structure and the conformational exchange (Rex) in the millisecond-to-microsecond time range. The features of E-FABP backbone dynamics elaborated here differ from those of the phylogenetically closely related heart-type FABP and the more distantly related ileal lipid binding protein. The results on protein dynamics obtained in this work allow to conclude that the different LBP family members E-FABP, H-FABP and ILBP are characterized by varying stabilities in the protein backbone structures. Hydrogen/deuterium exchange experiments displayed significant differences in the chemical exchange with the solvent for the backbone amide protons belonging to the hydrogen-bonding network in the >-sheets. The >-barrel structure of H- FABP appears to be the most rigid, with exchange processes presumably slower than the millisecond-to-microsecond time range. ILBP, on the other hand, shows the fastest hydrogen exchange as well as a significant number of exchange parameters (Rex), implying a decreased stability in the >-sheet structure. E-FABP, finally, appears to rank between these two proteins based on the hydrogen/deuterium exchange, with Rex terms in the >-strands indicating millisecond-to-microsecond exchange processes like in ILBP.
Die Beschäftigung mit Muskarinrezeptoren reicht bis in das vergangene Jahrhundert zurück als, in Folge der verschiedenen Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin, einerseits Nikotin- und andererseits Muskarinrezeptoren sowie deren Subtypen entdeckt und charakterisiert werden konnten. Aufgrund der weiten Verbreitung von Muskarinrezeptoren innerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems sowie in entsprechend innervierten Organen sind diese nach wie vor als Target für bestimmte klinische Indikationen von großem Interesse. Besonders im Bereich der chronisch obstruktiven Atemwegserkrankungen (COPD) sind Bronchodilatoren Mittel der Wahl. Obwohl die derzeitige Behandlungsstrategie im wesentlichen auf dem Einsatz des unselektiven muskarinischen Antagonisten Ipratropiumbromid, allein oder in Kombination mit einem kurzwirksamen b2-Sympathomimetikum, beruht, ist ihr Einsatz aufgrund der dabei auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen limitiert. Neben M3- Rezeptoren findet man in der menschlichen Lunge auch präsynaptische M2- Rezeptoren, deren Blockade zu einem Anstieg der Acetylcholinfreisetzung führt. Demzufolge würde die Entwicklung eines hochselektiven und/oder langwirksamen muskarinischen M3-Rezeptorantagonisten einen großen Fortschritt für die Behandlung von Patienten mit COPD und auch Asthma bedeuten. Untersuchung der Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids und der entsprechenden tertiären Analoga: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die vier reinen Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids als auch die entsprechenden vier tertiären Analoga untersucht. Bislang wird das Diastereomerengemisch (RS/SR), das als RobinulÒ im Handel ist, vorwiegend als Antisialagogum in der Prämedikation der Narkose oder als Spasmolytikum therapeutisch eingesetzt. Die molekulare Struktur des Glycopyrroniumbromids weist zwei Chiralitätszentren auf, woraus sich vier stereoisomere Verbindungen ergeben. Die pharmakologische Untersuchung sowohl der quartären als auch der korrespondierenden tertiären Isomere in den funktionellen Standardmodellen, Kaninchen-Vas-deferens für M1-Rezeptoren, linker Vorhof des Meerschweinchenherzens für M2-Rezeptoren und die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum für M3-Rezeptoren, ergab, dass sich alle Verbindungen an den untersuchten Muskarinrezeptorsubtypen als potente Antagonisten verhielten. Ihre Rezeptorselektivität war jedoch relativ gering, wobei im Allgemeinen die niedrigste Affinität zum M2-Rezeptor beobachtet wurde. Innerhalb der Stereoisomeren zeigten die (R/R')- und (S/R')-konfigurierten Verbindungen den stärksten, die (S/S')-konfigurierten Isomere hingegen den geringsten antagonistischen Effekt. Diese Ergebnisse konnten durch Radioligand- Bindungsstudien bestätigt werden. Bemerkenswert war jedoch, dass insbesondere am M3-Rezeptor eine extrem langsame Dissoziation der Substanzen vom Rezeptor festgestellt wurde. Verbunden mit der hohen Affinität und der in Bindungsstudien ermittelten Dissoziationshalbwertszeit von 120 min könnte das quartäre (R/R')-konfigurierte Stereoisomer des Glycopyrroniumbromids eine geeignete Alternative zur Behandlung der COPD darstellen: Die lange Halbwertszeit sollte eine Einmalgabe pro Tag erlauben und somit die Patientencompliance erhöhen, die hohe Affinität eine geringe Dosierung ermöglichen und die kinetische Selektivität' sowie die quartäre Struktur könnten zur Minimierung unerwünschter Nebenwirkungen führen. Aufgrund dieser Vorteile wurde die Substanz patentiert und der pharmazeutischen Industrie für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Untersuchungen an der Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum in Hinblick auf die Verteilung von P2-Rezeptoren: Aufgrund der Pionierarbeit, die Ende der 70er Jahre von Burnstock und seinen Mitarbeitern geleistet wurde, wandelte sich das Bild von ATP als einer Energiequelle der Zelle zu einem Neurotransmitter ubiquitären Vorkommens mit entsprechenden Zielstrukturen, den P2-Rezeptoren. Inzwischen ist allgemein anerkannt, dass zwischen metabotropen P2Y-Rezeptoren und ionotropen P2X- Rezeptoren unterschieden werden kann. Mit Hilfe von Klonierungstechniken konnte diese Klassifizierung validiert und außerdem eine Vielzahl unterschiedlicher Subtypen identifiziert werden. Bis heute wurden sieben P2X- (P2X1-7) und sechs P2Y- Rezeptorsubtypen (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12) kloniert und pharmakologisch charakterisiert. Sie gelten unumstritten als Vertreter der P2-Rezeptorfamilie. Heute besteht eine der größten Herausforderungen auf diesem sich explosionsartig expandierendem Gebiet darin, die geklonten P2-Rezeptoren mit den verschiedenen physiologischen Antworten, die durch native P2-Rezeptoren vermittelt werden, in Einklang zu bringen. Da die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum ein bekanntes Modell, z.B. für Untersuchungen an Muskarinrezeptoren, darstellt, war das Ziel der vorliegenden Arbeit, dieses Modell in Bezug auf die Verteilung von P2-Rezeptoren hin zu untersuchen. Neben Agonisten, die eine Präferenz für entweder ionotrope (a,b-meATP) oder metabotrope (ADPbS) P2-Rezeptoren aufweisen, wurden im wesentlichen eine Reihe gut untersuchter Antagonisten mit zum Teil hoher Affinität für einen Rezeptorsubtyp für die funktionellen Untersuchungen verwendet. Die neuronale Lokalisation des P2X-Rezeptors konnte durch die komplette Aufhebung der durch a,b-meATP-vermittelten Kontraktionen nach Zugabe von TTX charakterisiert werden. Die ebenfalls fast vollständige Hemmung der Kontraktion nach Einsatz von Atropin wies auf einen indirekten, durch Acetylcholin vermittelten Effekt hin. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden sämtliche Versuche mit P2-Antagonisten unter Zusatz von 70 µM Physostigmin in der Nährlösung durchgeführt. Die eingesetzten Antagonisten Suramin, NF023 und NF279 erwiesen sich als kompetitive Antagonisten, während PPADS neben der Rechtsverschiebung einen Maximumabfall der Agonistenkurven bewirkte. Ein Vergleich der funktionell ermittelten pA2-Werte mit den Wirkstärken an rekombinanten P2-Rezeptoren von Ratte und Mensch lässt vermuten, dass es sich hierbei um einen P2X3- Rezeptorsubtyp handelt, der über die Freisetzung von Acetylcholin eine Kontraktion der glatten Muskulatur über einen indirekten Mechanismus auslöst. Da sich P2X-Rezeptoruntereinheiten neben homomeren auch zu heteromeren, funktionell aktiven Kanälen vereinen können, könnte es sich bei dem vorliegenden soma-dendritischen P2X-Rezeptor aber auch um ein Heteromer handeln, bei dem der P2X3-Rezeptor den Phänotyp bestimmt. Solange noch keine eindeutige Identifizierung dieses Rezeptors speziesspezifisch auf molekularer Ebene erfolgt ist, sollte man deshalb die Bezeichnung P2X3(-ähnlicher)-Rezeptor verwenden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des präsynaptischen P2X3(- ähnlichen)-Rezeptors zur Ausschüttung von Acetylcholin führt, das wiederum postsynaptisch einen kontraktionsvermittelnden Muskarinrezeptor aktiviert. Um zu beweisen, dass es sich dabei um denselben Muskarinrezeptorsubtyp handelt, der bereits auf direktem Weg durch APE oder mittels EFS als M3-Rezeptor charakterisiert werden konnte, wurden die Affinitäten muskarinischer Antagonisten als Kriterien herangezogen. Die erhaltenen Korrelationen wiesen eindeutig darauf hin, dass dieser postsynaptisch im GPI lokalisierte Muskarinrezeptor dem nativen und rekombinanten, kontraktionsvermittelnden M3-Rezeptorsubtyp entspricht. Durch Zugabe von ADPbS konnten im GPI Kontraktionen ausgelöst werden, die allerdings mit TTX und Atropin nur zum Teil gehemmt wurden. Diese Beobachtungen führten zu der Erkenntnis, dass postsynaptisch P2Y-Rezeptoren lokalisiert sind. Ihre Subtypcharakterisierung erfolgte unter Zusatz von 0.3 µM Atropin in der Nährlösung, um den Einfluss der neuronalen P2X3-Rezeptoren zu unterbinden. Suramin, NF023 und NF279 zeigten wiederum einen kompetitiven Antagonismus gegen ADPbS, während PPADS auch hier eine Rechtsverschiebung mit Maximumdepression der Agonistenkurve hervorrief. Ein erneuter Vergleich mit beschriebenen Affinitätswerten von rekombinanten P2- Rezeptoren ließ den Schluss zu, dass der im GPI postsynaptisch gefundene P2Y- Rezeptor Eigenschaften des P2Y1-Rezeptorsubtyps aufweist. Eine Bestätigung dafür gaben außerdem die P2Y1-selektiven Bisphosphate A3P5P und MRS2179, obgleich sie geringere pIC50-Werte aufzeigten als in der Literatur beschrieben. Mit der Charakterisierung des neuronalen P2X3-Rezeptors und des postsynaptischen P2Y1-Rezeptors ist das GPI ein bisher einzigartiges funktionelles pharmakologisches Modell, in dem beide P2-Rezeptorsubtypen durch Einsatz des jeweiligen Agonisten, a,b-meATP oder ADPbS, pharmakologisch isoliert werden können. Charakterisierung von P2-Rezeptoren in der Längsmuskulatur des Rattenileum: Eine im Vergleich zum GPI gänzlich andere Situation zeigte sich im RI. Die getesteten P2-Agonisten ADPbS, a,b-meATP, a,b-meADP und ATPgS erzeugten Kontraktionen im untersuchten Gewebe, wobei sich a,b-meATP als effektivster Agonist erwies. Im Unterschied zum GPI führte eine wiederholte Gabe von a,b- meATP allerdings nicht zu einer Desensibilisierung des Rezeptors. Die durch Zugabe von TTX und Atropin erreichte Kontraktionshemmung lässt auf das Vorhandensein von sowohl prä- als auch postsynaptischen P2X-Rezeptoren schließen. Eine Trennung der durch diese Rezeptoren hervorgerufenen Effekte war im funktionellen Experiment jedoch nicht durchführbar. Keinerlei Effekt zeigte allerdings der Zusatz von TTX und Atropin auf die durch ADPbS ausgelösten Kontraktionen. Suramin, NF023 und PPADS erwiesen sich als sehr schwache Antagonisten an diesem Präparat. Auffällig war hingegen, dass die durch den Antagonisten verschobenen Kurven jeweils steiler und im Maximum höher waren als die Kontroll-Agonistenkurve. Man kann also hier nur spekulieren, dass durch die Antagonisten zunächst ein relaxationsvermittelnder Rezeptor geblockt wurde und in Folge nur noch der Effekt des kontraktionsvermittelnden Rezeptors sichtbar war. Obwohl Gewebe der Ratte häufig als funktionelle Modelle in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt werden, konnten auf Grund fehlender subtypselektiver Agonisten und Antagonisten die kontraktionsvermittelnden P2-Rezeptorsubtypen im RI nicht identifiziert werden. Des weiteren zeigt ein Vergleich mit dem GPI, dass bedeutende Unterschiede bei der Verwendung gleichen Gewebes zweier verschiedener Spezies existieren können, die bei der vergleichenden Betrachtung von Affinitätswerten von Agonisten und Antagonisten zur Charakterisierung von Rezeptorsubtypen beachtet werden müssen.
Die enorme genetische Variabilität von HIV-1[14],[50] und die mangelnde Korrelation zwischen genetisch definierten Subtypen einerseits und antigener Variation[51]-[56] andererseits verhindern bisher die Entwicklung eines effizienten, breit neutralisierenden Impfstoffes. Neueren Ansätzen liegt daher das Konzept einer serologischen Klassifikation zu Grunde[61],[62], die verschiedene HIV-Subtypen nach ihrer serologischen Reaktivität und nicht nach ihrem genetischen Ursprung klassifiziert. Diese Ansätzen beruhten allerdings auf der Verwendung ausgewählter Consensus-Modellpeptide der immunodominanten V3-Region des viralen Hüllproteins gp120 und monoklonaler Antikörper weniger HIV-1-Subtypen[61]. Somit ist nicht auszuschließen, dass aus dem Einsatz weiterer Peptide und anderer Antikörper bislang unidentifizierte Serotypen resultieren. Es lag nahe, den ursprünglichen Ansatz auf eine wesentlich breitere Basis von Antikörpern und Peptiden zu stellen. Als Antikörperquelle kamen hierbei die polyklonalen Seren HIV-1-positiver Patienten in Betracht; man machte sich dabei das native HIV-spezifische Antikörperreservoir zu Nutze. Seitens der Peptide als Zielmoleküle einer Ermittlung serologischer Reaktivität bot sich ein kombinatorischer Zugang an. Ziel der vorliegenden Arbeit war demnach die Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das Screening humaner HIV-positiver Seren gegen kombinatorisch erzeugte Peptide mit dem Hintergrund, einen minimalen Satz reaktiver Peptide zu identifizieren, die eine serologisch basierte Charakterisierung der Reaktivität verschiedener HIV-1-Subtypen erlaubt. Um Reaktivitätsmuster zwischen Seren verschiedener Subtypen ermitteln und ausschließlich signifikante, hochreaktive Sequenzen finden zu können, sollte dieses Assay zudem die Möglichkeit der mehrfachen Wiederholbarkeit mit derselben Peptidbibliothek bieten. Diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit umgesetzten Ziele lassen sich somit wie folgt zusammenfassen: Entwicklung eines Verfahrens zur schnellen und eindeutigen massenspektrometrischen Sequenzierung von Peptiden aus kombinatorischen Bibliotheken, Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das iterative Screening HIV-positiver Seren gegen festphasengebundene Peptide, Screening von Serenpools verschiedener genetisch bestimmter Subtypen von HIV-1 gegen eine kombinatorische Peptidbibliothek, die die genetische Variation der V3-Region von gp120 reflektiert, und Multivariate Analyse der gefundenen Peptidsequenzen mit dem Ziel einer serologischen Interpretation derselben. Das Verfahren zur schnellen und im Vergleich zum herkömmlichen Kettenabbauverfahren nach Edman weniger aufwändigen massenspektrometrischen Sequenzierung als reaktiv bestimmter Peptide basiert auf der adaptiven Einführung Kettenabbruch erzeugender Sequenzen während der Synthese der kombinatorischen Peptidbibliothek nach einer modifizierten One Bead One Peptide"-Synthese[118],[119]. Diese Codierung wird sequenztreu durch den Einsatz von Mischungen aus der Fmoc-geschützten Aminosäure, die für diese Sequenzposition vorgesehen ist, und ihres N-terminal permanent blockierten Derivats eingeführt. Das Programm Biblio optimiert das Codierungsmuster hinsichtlich minimaler Einführung von Terminationssequenzen und minimalem Einsatz Kettenabbruch erzeugender Reagenzien, um den Anteil des Hauptpeptids pro Bead nur so gering wie möglich zu vermindern. Eine MALDI-massenspektrometrische Analyse der Peptide eines betreffenden Beads liefert somit neben dem Signal des Hauptpeptids auch die Sequenz des Peptide codierenden Signale. Diese werden von Biblio zur gesuchten Peptidsequenz decodiert. Des weiteren konnte ein immunologisches Testsystem für das iterative Screening festphasengebundener Peptide entwickelt werden. Dieses beruht auf der Detektion der Bindung des Serumantikörpers an das Peptid durch einen Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet und mit einem fluoreszenten Farbstoff markiert ist. Eine Bindung ließ sich somit fluoreszenzmikroskopisch nachweisen. Um eine Wiederholbarkeit des Screenings zu gewährleisten, wurde die Peptidbibliothek mittels eines Epoxidharzklebstoffs auf der Probenunterlage fixiert. Eine Entfernung des Immunkomplexes gelingt durch mehrfache Behandlung mit pH 1. Eine 80640 Spezies umfassende Decapeptidbibliothek, die die genetische Variabilität der immunodominanten V3-Schleife der viralen Hüllproteins gp120 von HIV-1 wiedergibt, wurde gegen Serenpools verschiedener HIV-1-Subtypen gemäß diesem Verfahren iterativ gescreent. Insgesamt 36 Peptide konnten aufgrund ihrer intensiven Fluoreszenz als hochreaktiv erkannt werden; sie wurden mit MALDI-Massenspektroskopie und anschließender Decodierung durch Biblio sequenziert. Eine Auswahl von vier der 36 ermittelten Sequenzen erwies sich als ausreichend für eine Differenzierung der zugrunde liegenden HIV-1-Subtypen. Eine anschließende multivariate Analyse der gefundenen Sequenzen in bezug auf ihr Seroreaktivitätsmuster ermöglichte die Bestimmung neuer, konservierter Epitope der Bindung polyklonaler Serenantikörper von HIV-1 und die Identifikation der für diese Bindung kritischen Aminosäurepositionen der betrachteten Decapeptide. Diese Epitope könnten in nachfolgenden Studien auf ihre Bedeutung hinsichtlich ihres Neutralisationspotentials bezüglich primärer HIV-Isolate getestet werden. Das hier entwickelte Verfahren zum iterativen Screening codierter Peptidbibliotheken jedoch ist nicht auf das HIV-System beschränkt, es bietet vielmehr einen universellen Zugang zur reaktivitätsbasierten Evaluation festphasengebundener Substanzbibliotheken, die die volle genetische Variabilität ihrer biologischen Zielregion abbilden. Eine dieser Regionen könnte beispielsweise der Antigenrezeptor von B-Lymphocyten darstellen, der die B-Zellen durch Kontakt mit einem Antigen aktiviert. Diese regen die B-Zelle zur Proliferation und deren Nachkommen zur Differenzierung zu antikörpersezernierenden Zellen gegen diese Antigene an. Sie bilden damit ein interessantes Ziel, auf diesem Wege eine effektive Immunantwort hervorzurufen[146],[150].
Zum Schutz von Umwelt und Bevölkerung vor unerwünschten Nebenwirkungen wird vielfach der Einsatz von Chemikalien auf ein notwendiges Minimum reduziert. Gerade in der Trinkwasseraufbereitung muss deren Wirkung sorgfältig und zuverlässig kontrolliert werden, da es bei einer Unterdosierung leicht zur Kontamination mit Mikroorganismen kommt. Ein Verfahren mag zum Nachweis solcher Mikroorganismen als geeignet erscheinen, wenn es intakte Keime anzeigt. Gerade in vorbehandelten Proben können jedoch nach einer unvollständigen Desinfektion geschädigte Zellen enthalten sein, die sich unter günstigen Bedingungen erholen (Resuscitation), d. h. ihre Vermehrungsfähigkeit wiedererlangen und dadurch Infektionen auslösen können. Also sollten dafür verwendete Medien auch solche Erreger erfassen, da ansonsten falsch negative Ergebnisse die Folge sind. Im mehrstufigen Nachweis von Escherichia coli nach den Deutschen Einheitsverfahren zur Wasser, Abwasser und Schlammuntersuchung (DEV) wird eine Lactose-Pepton-Lösung als Primärkulturmedium beschrieben, die schon für das Membranfilter-Verfahren als nicht optimal eingestuft wurde. Diese Problematik hatte sich in der vorliegenden Arbeit auch für die Flüssig- keitsanreicherung, das zweite Verfahren nach den DEV, gezeigt. Als Ursache für die verminderten Angehraten im DEV-Medium konnte das darin in einer Kon- zentration von 20 µg/l enthaltene Bromkresolpurpur identifiziert werden. Um das Wachstum bestimmter Mikroorganismen anhand ihrer spezifischen Stoffwechselleistungen anzuzeigen, werden geeignete Substrate in Kombination mit entsprechenden pH-Indikatoren verwendet, zu denen auch das Bromkresolpurpur zählt. Für ungeschädigte Keime hatte letzteres im Vergleich mit anderen, Selektionsmitteln enthaltenden Nährmedien besser abgeschnitten und wurde als weniger giftig" bezeichnet. Bei den in dieser Arbeit untersuchten chlorungsvorgeschädigten Zellen bewirkte es eine signifikante Wachstumshemmung. Im Zuge der weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Verminderung der Bromkresolpurpur-Konzentration auf 10 µg/l nur noch bei einem Teil und auf 5 µg/l bei keinem der verwendeten Stämme mehr eine signifikante Veränderung der Angehrate bewirkte. Die Funktion als Farbindikator wurde dadurch nicht beeinträchtigt.
Oft wurden Aeromonas aus Trinkwassersystemen isoliert und ihre Eigenschaften beschrieben. Mit Hilfe der vorliegenden Arbeit wurden ihre Existenz und ihre Artendiversität in den Biofilmen von Trinkwasserverteilungssystemen in Nordrhein-Westfalen (Deutschland) näher beleuchtet. Hierzu wurden vermehrungsfähige Aeromonas-Arten aus Rohrinkrustationen und Belägen der Rohrinnenoberflächen von Grauguss- und PVC-Trinkwasserrohren isoliert und auf ihre phänotypischen Eigenschaften untersucht. Anhand zahlreicher biochemischer Tests wurden die isolierten Aeromonas-Arten in Unterarten und Biovare unterteilt und mittels Hierarchischer Clusteranalyse weiter klassifiziert. Insgesamt wurden aus fünf der 7 Proben Aeromonas isoliert. Für die Besiedlungsdichte wurden Werte zwischen 24 und 746 KBE/cm2 ermittelt. Eine Abhängigkeit zwischen dem Rohrmaterial (PVC, Grauguss) bzw. dem pH-Wert und der Kolonieanzahl von isolierten Aeromonas konnte nicht festgestellt werden. Während der warmen Jahreszeit wurde in den Belägen eine höhere Koloniezahl von Aeromonas ermittelt. 502 Aeromonas-Kolonien wurden weiter untersucht. Bei 94% der nachgewiesenen Aeromonas-Keime handelte es sich um Aeromonas hydrophila. Außerdem wurden Aeromonas caviae (5%) und Aeromonas sobria (1%) in den Belagssuspensionen identifiziert. Aeromonas caviae nahm in einem System sogar die dominante Rolle ein. Je Probe wurden 120 Aeromonas-Kolonien weiter klassifiziert. Dabei wurden teilweise 35 bzw. 64 Biovare mit unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften identifiziert. Bei einigen Proben war die Unterteilung von Aeromonas-lsolaten in weitere Biovare kaum ausgeprägt. Die niedrige Besiedlungsrate und die hohe Anzahl von Biovaren schließen eine Massenvermehrung einzelner Aeromonas innerhalb des Biofilms aus. Vielmehr hat Aeromonas hier nur einen Überlebensraum gefunden. Die hohe Anzahl der Biovare ist auf eine zeitlich versetzte Besiedlung von Aeromonas in den Belagsinkrustationen zurückzuführen.
In dieser Arbeit wurden die Periventrikuläre Leukomalazie und die Perinatale Telenzephale Leukoenzephalopathie analysiert. Aus neuropathologischer Sicht sind diese beiden Krankheitsbilder deutlich voneinander abgrenzbar. Die PVL zeigt nekrotische Veränderungen, Axonauftreibungen, Astrogliose, Gitterzellen und ausschließlich eine Begrenzung auf die weiße Marksubstanz. Da die Veränderungen so deutlich und massiv sind, sich gut durch bildgebende Verfahren darstellen und mit klinischer Symptomatik korrelieren lassen, hat die PVL in der Klinik die größere Bedeutung. Dies wird in Zukunft auch so bleiben, und durch die Verbesserung der bildgebenden Verfahren in Kombination mit indirekten diagnostischen Möglichkeiten (EEG, Doppler, Sehtests) wird die Erkennung der PVL eine immer größere Rolle spielen. Die Neuropathologie wird sich wohl in Zukunft mit der terminologischen Unterscheidung zurechtfinden und diese beiden Krankheitsbilder genauer voneinander differenzieren müssen. Da durch die Autopsie das Gehirn viel genauer untersucht werden kann als mit bildgebenden Verfahren, ist eine genauere Differenzierung der einzelnen Fälle möglich. Wie in dieser Arbeit zu sehen, sind die PVL-Fälle nicht so häufig anzutreffen, wie die als PTL bezeichnete Gliose mit hypertrophen Astrozyten, akut geschädigten Gliazellen oder Amphophilen Globuli, oder auch nur mit einer dieser vergleichsweise milden Veränderungen. Wie der Fall John J. NI: 7611 Kapitel 11.10 (PTL) veranschaulicht, können auch bei diesen relativ geringen Hirngewebsveränderungen klinische Auffälligkeiten vorliegen, die nicht durch konventionelle diagnostische Maßnahmen zu erklären und zu erkennen ist. Den in der Literatur erwähnten klinischen Studien gelang es nicht, die klinischen Symptome der PVL 100 %ig mit den morphologischen Veränderungen in Einklang zu bringen. Hierbei werden nur Wahrscheinlichkeiten angegeben (siehe Kapitel 6 Diagnostik und Kapitel 7 Klinik), die den Einzelfall vernachlässigen. Es können also auch mildere pathologische Veränderungen als eine PVL zu einer klinischen Symptomatik führen. Natürlich gilt das auch umgekehrt, denn nicht jede PVL-Läsion muß zur klinischen Auffälligkeit führen. Die Wahrscheinlichkeiten einer gut diagnostizierbaren PVL mit Zysten lassen darauf schließen, daß sich klinische Auffälligkeiten manifestieren. Die Klinik ist also recht uneinheitlich und läßt für den Neuropathologen keine Rückschlüsse auf die zugrundeliegende Erkrankung zu. Wie ja bereits in Kapitel 6.7 Klinische Untersuchung erwähnt, ist die Früherkennung der Symptome von Bedeutung, um rechtzeitig fördernde Maßnahme (Physiotherapie, Mund- Eßtherapie, Sprachtherapie, psychosoziale Betreuung, Funktionstraining und Hilfsmittelversorgung) einzuleiten. Dabei kann die Diagnostik mit den verschiedenen Mitteln die Erklärung der Symptome plausibel machen, aber sie sind nicht immer korrelierbar. Selbstverständlich ist dann die klinische Symptomatik von größerer Bedeutung als die bildgebenden Verfahren. Die PTL, wie sie von Leviton und Gilles (1983) definiert ist, zeigt sich für den Neuropathologen deutlicher als für den Kliniker. Auch wenn die Autoren einen Oberbegriff schaffen wollten, legen sie sich in ihrer eigenen Arbeit von 1983 erneut fest und beschreiben die Veränderungen mit hypertrophen Astrozyten und Amphophilen Globuli als die Perinatale Telenzephale Leukoenzephalopathie (Leviton
In der vorliegenden Arbeit wurden die pharmakologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften des Kaliumkanals KCNQ1 und des KCNQ1/MinK (IKs) untersucht. Hierzu wurden die Kanäle in Xenopus-laevis-Oozyten und der KCNQ1/MinK (IKs) in CHO-Zellen exprimiert und in Voltage-Clamp-Experimenten untersucht. Die Blockwirkung des Chromanol-293B-Razemates und die der beiden Enantiomere wurden am KCNQ1- und KCNQ1/MinK-Kanal untersucht. Eine Enantiomerenselektivität der Chromanol 293B-Enantiomere wurde nachgewiesen. Beide Enantiomere wirken abhängig vom Zustand der KCNQ1- und IKs-Kanäle. Das 3S,4R-293B blockierte nur geschlossene Kanäle, während das andere Enantiomer 3R,4S-293B auf geschlossene und auf geöffnete Kanäle wirkte. Als Grundlage dieser Aussagen wurden kinetische Analysen der Kanalkinetiken ohne Blocker und bei partieller Blockade der Kanäle durchgeführt. Die Inhibiton des IKs
Das hemmende Umfeld von Ganglienzellen in der Netzhaut des Auges Der Bereich auf der Netzhaut, aus dem Ganglienzellen Lichtsignale erhalten, wird rezeptives Feld genannt. Er umfaßt einen erregenden, zentralen Teil, das rezeptive Feldzentrum, und einen hemmenden, peripheren Teil, das Umfeld. Die antagonistische Organisation (erregendes Zentrum/hemmendes Umfeld) des rezeptiven Feldes verbessert die Signalverarbeitung, indem Kontraste verstärkt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen der Umfeldhemmung an der isolierten, intakten Kaninchennetzhaut zu untersuchen. Das rezeptive Feldzentrum wird durch den erregenden Kontakt zwischen Photorezeptor Þ Bipolarzelle Þ Ganglienzelle erzeugt. Visuelle Stimulation des rezeptiven Feldzentrums erhöht die Entladungsrate (Anzahl der Aktionspotentiale pro Zeiteinheit) der Ganglienzelle. Die Erhöhung der Entladungsrate wird durch die Freisetzung des erregenden Transmitters Glutamat aus präsynaptischen Bipolarzellen bewirkt. Eine Belichtung des Umfeldes hat den entgegengesetzten Effekt: die Entladungsrate der Ganglienzelle wird verringert. Die Umfeldantwort der Ganglienzelle wird durch die laterale Hemmung in der OPL (äußere Synpsenschicht) und der IPL (innere Synapsenschicht) erzeugt. In der OPL wird die Signalübertragung von GABAergen Horizontalzellen moduliert, indem sie Photorezeptoren und/oder Bipolarzellen hemmen. In der IPL modulieren Amakrinzellen, die entweder GABAerg oder glyzinerg sein können, die Signalübertragung, indem sie Bipolarzellen und/oder Ganglienzellen hemmen. Die Entladungsrate von retinalen Ganglienzellen wird bei Belichtung des Umfeldes somit auf zwei Arten verringert: entweder werden präsynaptische Zellen (Photorezeptoren, Bipolarzellen) gehemmt oder die Ganglienzelle wird direkt durch Amakrinzellen gehemmt. Im ersten Fall schütten Bipolarzellen weniger Glutamat aus (indirekte laterale Hemmung), im zweiten Fall wird durch hemmende Neurotransmitter (GABA oder Glyzin) ein Einstrom von Chloridionen in die Dendriten der Ganglienzellen hervorgerufen (direkte laterale Hemmung). Es ist bisher noch unklar, zu welchem Anteil direkte und indirekte laterale Hemmung an der Umfeldantwort beteiligt sind. Weiterhin ist nicht bekannt, welche Neurotransmitterrezeptoren bei der Erzeugung des hemmenden Umfeldes eine Rolle spielen. Um dies zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit lichtinduzierte, synaptische Ströme von retinalen Ganglienzellen an der isolierten, intakten Kaninchenetzhaut gemessen. Dabei wurde die Netzhaut von vorher eingeschläferten Kaninchen freipräpariert und anschließend in einer mit Sauerstoff angereicherten Extrazellulärlösung aufbewahrt. An diesem isolierten, intakten NetzhautPräparat (in vitro Retina) konnten bis zu acht Stunden Lichtantworten gemessen werden. Die lichtinduzierten Ströme wurden in der Ganzzellkonfiguration der PatchClampTechnik in der Spannungsklemme gemessen. Die Meßkammer mit der flach ausgebreiteten Netzhaut befand sich auf einem Mikroskoptisch. Das Mikroskop war mit einer InfrarotDifferentialinterferenzOptik (NomarskiOptik) ausgestattet und die Mikroelektroden konnten unter Sichtkontrolle mit Hilfe eines Mikromanipulators an die Zellkörper herangefahren werden. Kreisförmige und ringförmige Lichtmuster mit verschiedenen Durchmessern, wurden auf einem Computerbildschirm erzeugt und durch den Mikrsokopkondenser auf den Boden der Meßkammer projiziert. Erregende Ströme retinaler Ganglienzellen konnten isoliert werden, indem das Membranpotential der Zelle auf das Umkehrpotential für Chloridionen eingestellt wurde. Die erregenden Ströme wurden durch Belichtung des Umfeldes stark verringert. Dies wird durch die verminderte Freisetzung von Glutamat durch Bipolarzellen verursacht und ist ein Hinweise auf eine indirekte, laterale Hemmung der Ganglienzelle. Durch die Zugabe des GABARezeptorblockers Picrotoxinin in die Nährlösung (Badapplikation) konnte die Umfeldhemmung der meisten Ganglienzellen nahezu vollständig aufgehoben werden. Dieses Ergebnis zeigt, daß präsynaptische GABA A und GABA C Rezeptoren eine wichtige Rolle bei der Umfeldhemmung spielen. Direkte hemmende Chloridionenströme konnten isoliert werden, indem das Membranpotential der Zelle auf das Umkehrpotential für erregende Ströme eingestellt wurde. Durch Beleuchtung des Umfeldes wurden Chloridionenströme in Ganglienzellen ausgelöst. Dies ist ein Hinweis auf eine direkte, laterale Hemmung der Ganglienzelle durch Amakrinzellen, die zusätzlich zur indirekten Hemmung erfolgt. Bei Anwendung der Stromklemme der PatchClampTechnik konnte nachgewiesen werden, daß Chloridionenströme die Entladungsrate der Zelle beeinflussen. Durch die Badapplikation von Picrotoxinin und durch die Überströmung mit dem GABA A Rezeptorhemmer Bicucullin wurden die Chloridionenströme deutlich verringert. Durch den Glyzinrezeptorblocker Strychnin konnten die hemmenden Ströme nur bei wenigen Zellen verringert werden. Dies ist ein Hinweis auf eine direkte Hemmung der Ganglienzelle über GABA A Rezeptoren. In den meisten Ganglienzellen konnten direkte und indirekte Hemmung durch die Badapplikation von Tetrodotoxin verringert werden. Tetrodotoxin hemmt das Entstehen von Aktionspotentialen und das Ergebnis zeigt, daß 'widefield Amakrinzellen, die über Aktionspotentiale kommunizieren zur Umfeldhemmung beitragen. Bisherige Modelle gingen davon aus, daß Interaktionen zwischen Horizontalzellen, Photorezeptoren und Bipolarzellen in der OPL die Hauptursache für die Umfeldhemmung sind. Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, daß Interaktionen zwischen Amakrinzellen, Bipolarzellen und Ganglienzellen wesentlich zur Umfeldhemmung beitragen. In der Netzhaut gibt es zwischen 12 und 15 Ganglienzelltypen, die auf unterschiedliche Mustermerkmale wie z. B. Farbe, Kontrast oder Bewegung reagieren. Alle bisher untersuchten Ganglienzelltypen verringern bei einer Reizung des Umfeldes ihre Entladungsrate. Ist bei allen Ganglienzelltypen der Beitrag von Horizontal und Amakrinzellen zur Umfeldhemmung sowie der Anteil von direkter und indirekter lateralen Hemmung gleich? Oder gibt es für jeden Ganglienzelltyp aufgrund seiner physiologischen und morphologischen Ausprägung verschiedene Mechanismen der lateralen Hemmung? Diese Fragen könnten durch die Entwicklung von Pharmaka, welche selektiv Horizontalzellen bzw. Amakrinzellen hemmen, untersucht werden. Die Anwendung dieser Substanzen könnte den Beitrag dieser Zellen zur Umfeldhemmung eines bestimmten Ganglienzelltyps nachweisen. Gleichzeitig könnte die indirekte Hemmung von retinalen Ganglienzellen durch intrazelluläre Applikation von Chloridionenkanalblockern viel genauer als bisher gemessen werden, da auf diese Weise erregende synaptische Ströme besser isoliert werden können. Durch die Kombination dieser beiden Methoden könnte für jeden Ganglienzelltyp der Netzhaut die zellulären und synaptischen Mechanismen der Umfeldhemmung detailliert beschrieben werden.
In den vergangenen Jahren wurden in der AntisenseTechnologie grundlegende Hürden genommen, die eine Arzneimittelentwicklung auf Nukleinsäurebasis ermöglichen. Hierzu zählt vor allem die Gewährleistung einer ausreichenden metabolischen Stabilität und die Synthese im technischen Maßstab. In zahlreichen klinischen Studien wurde der Wirksamkeitsnachweis am Menschen erbracht. Als sequenzspezifische Therapeutika zeichnen sich Antisense Oligonukleotide im Vergleich zu vielen anderen Wirkstoffen dadurch aus, daß sie spezifisch mit einer RNAZielsequenz hybridisieren, ohne dabei wichtige zelluläre Funktionen zu beeinträchtigen. Neben krankheitsauslösenden Genen können Antisense Oligonukleotide auch virale Gene blockieren und nach Aktivierung der Ribonuklease H hydrolysieren. Das erste Präparat auf Oligonukleotidbasis wurde 1998 zugelassen und hemmt erfolgreich die Vermehrung des Cytomegalievirus. Hepatitis C ist eine Virusinfektion, die momentan nur unzureichend therapiert werden kann. Seit Mitte der neunziger Jahre wird nach geeigneten Antisense Oligonukleotiden und Ribozymen gesucht, um die Heilungschancen bei einer chronischen HCVInfektion zu verbessern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch experimentelles Screening eine potente Zielsequenz (tS13) im Bereich der internen ribosomalen Angriffsstelle (IRES) und des Startcodons für die Proteinbiosynthese des HCV gefunden (Nukleotide 326342 des HCV Genoms). Hierzu wurde die Sequenz eines bereits bekannten 23mer Antisense Oligonukleotids durch systematisches Verkürzen auf 17 Nukleotide reduziert, ohne in vitro an Inhibitionspotential einzubüßen. Erst weitere Verkürzungen führten zu einer deutlichen Abnahme der Antisense Wirkung. Eine Schwierigkeit bei der therapeutischen Anwendung von polyanionischen Antisense Oligonukleotiden ist deren begrenzte zelluläre Aufnahme. Wie in Kapitel 3 dargelegt, wurden bislang zahlreiche Methoden zur Verbesserung der Membrangängigkeit dieser Wirkstoffklasse entwickelt. Zur Evaluierung eines leberselektiven Transports (engl.: drug targeting) und zur Steigerung der hepatozellulären Aufnahme (engl.: cell uptake) wurde das antiviral wirkende 17mer Antisense Oligonukleotid tS13 mit Biomolekülen wie den Gallensäuren, die im enterohepatischen Kreislauf das Zielorgan Leber passieren, kovalent verknüpft. Die Kupplung erfolgte dabei über die für die zelluläre Aufnahme nicht essentielle 3aHydroxylgruppe der Cholsäure und Taurocholsäure. Die Gallensäuren wurden entsprechend geschützt, in die Phosphoramidite 22a/b und 27a/b überführt und im letzten Kupplungsschritt der Festphasensynthese an das 5
1. Die Arbeit soll den Beitrag von Ionenleitfähigkeiten an der Funktionsweise der Vogelhaarzelle weiter aufklären. 2. Dazu werden zwei Ionenkanalmodulatoren sowohl in die Scala media, wie auch in Scala tympani appliziert. Amilorid ist ein Blocker v.a. von Natriumabhängigen Ionleitfähigkeiten; Diazoxid ist ein Öffner ATPabhängiger Kaliumleitfähigkeiten. 3. Amilorid hat bei Applikation in die Scala media keinen Effekt auf das endocochleäre Potential. Diazoxid senkt das endocochleäre Potential nach Applikation in die Scala media signifikant um 2,42mV ± 2,31. Da Diazoxid auf die Aktivität auditorischer Neurone keinerlei Einfluß hat, muß davon ausgegangen werden, daß Diazoxid das EP durch Beeinflussung anderer Ionkanäle unabhängig von der Haarzelle absenkt. Mögliche Kandidaten sind Ionkanäle im Bereich des Tegmentum vasculosum, das für die Generation des EP mit verantwortlich ist. 4. Eine endolymphatische AmiloridApplikation erhöht frequenzabhängig und dosisabhängig die CAPSchwelle, wobei die Schwellenanhebung mit Anstieg der Frequenz steigt (gemessener Bereich 1252000Hz). Bis zu einer Frequenz von 400Hz hat Amilorid kaum einen Effekt auf das CAP, oberhalb 400Hz steigt die Schwelle mit einem Gradienten von 11 dB/Okt an. 5. Diazoxid hat bei Applikation in die Scala media keinen Einfluß auf das CAP. 6. Die endolymphatische Applikation von Amilorid erniedrigt die akustisch evozierte Entladungsrate und erhöht die spontane Entladungsrate afferenter Neurone aus dem Ganglion cochleare. Diese Veränderungen sind abhängig von der charakteristischen Frequenz und der applizierten Menge, wobei der Frequenzbereich der charakteristischen Frequenz der nicht reagierenden Einzelfaserableitungen. zwischen 126632 Hz lag, der der reagierenden zwischen 704 und 1200 Hz. 7. Bei den afferenten Neuronen, bei der die akustisch evozierte Aktivität nach endolymphatischer Applikation von Amilorid ansteigt, kommt es auch zu einer Veränderung der von der evozierten Aktivität abhängigen Parameter Q10dB, Tief und Hochfrequenzflanke und charakteristischer Frequenz. Die endolymphatische AmiloridKonzentration bei diesen Einzelfaserableitungen lag zwischen 91µM und 269 µM. 8. Die charakteristische Frequenz wird durch Amilorid erniedrigt, allerdings kommt dies durch eine stärkere Abnahme der evozierten Rate oberhalb der charakteristischen Frequenz zustande. 9. Die Gruppeneinteilung ist bis auf ein Neuron bei Veränderungen spontaner und akustisch evozierter Entladungsrate gleich. Bei einem kam es zu einem Anstieg der spontanen Entladungsrate, aber nicht zu einer Abnahme der akustisch evozierten Entladungsrate. Dies legt nahe, daß 1. die Veränderungen auf Beeinflussung unterschiedlicher Ionleitfähigkeiten beruht , und 2. die Ionleitfähigkeit, welche für die Veränderung der spontanen Entladungsrate verantwortlich ist, etwas sensibler für Amilorid ist, als jene, welche für die Veränderung der evozierten Entladungsrate verantwortlich ist. 10. Der Anstieg der evozierten Rate steht in guten Einklang mit den Ergebnissen von Jørgensen und Ohmori (1988), die zeigen konnten, daß Amilorid den mechanoelektrischen Transduktionskanal von Vogelhaarzellen mit einem IC 50 von 50µM blockiert. Der Anstieg der spontanen Entladungsrate kann mit einem Block des Transduktionskanals nicht erklärt werden. Es muß also noch eine andere Leitfähigkeit in dem Innenohr der Taube durch Amilorid blockiert werden. 11. Zusammen mit den Ergebnissen anderer Studien legen die Ergebnisse nahe, daß es sich hierbei um eine Ionleitfähigkeit im Bereich der apikalen Membran handeln muß. Mögliche Kandidaten wären Ca 2 Kanäle, welche an Ca 2 abhängigen Prozessen zur Regulierung der Ciliensteifigkeit bzw. Cilienmotilität beteiligt sind. 12. Diazoxid hat bei Applikation in die Scala media keinen Einfluß auf die Aktivität auditorischer Neurone. 13. Bei Applikation in die Scala tympani hat weder Amilorid noch Diazoxid Einfluß auf das CAP.
28 Kinder mit Pierre-Robin-Sequenz, die erstmals im Humangenetischen Institut der Universitätsklink in Frankfurt am Main im Alter von drei Monaten bis acht Jahre untersucht wurden, wurden im Alter von acht bis 16 Jahren nachuntersucht. Die Kinder wurden unterteilt in eine Gruppe mit isolierter und eine Gruppe mit syndromatischer PierreRobinSequenz. Sie wurden hinsichtlich ihrer physischen, psychomotorischen, audiologischen und sprachlichen Entwicklung untersucht. Die Gruppen unterschieden sich bezüglich des körperlichen Wachstums, der Häufigkeit von mentaler und sprachlicher Retardierung. Die Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz waren durchschnittlich kleiner und leichter bei Geburt und im Verlauf. 19 % der Kinder mit syndromatischer Form waren kleinwüchsig. Eine mentale Retardierung fand sich nur in der Gruppe mit syndromatischer PierreRobinSequenz, in der 31 % betroffen waren. 8,3 % der Kinder mit isolierter Pierre-Robin-Sequenz waren in ihrer sprachlichen Entwicklung retardiert, während dies bei 38 % der Kinder mit syndromatischer Form der Fall war. Schwere Artikulationsstörungen, die zu einer sehr undeutlichen Aussprache führten, fanden sich bei 17 % der Kinder mit isolierter und bei 29 % der Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz. Zwei Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz hatten überhaupt keine Expressivsprache entwickelt. Es konnte ein Zusammenhang dieser Unterschiede in der Entwicklung mit der Schwere der respiratorischen und ernährungsbezogenen Probleme in den ersten beiden Lebensjahren gesehen werden. Respiratorische Probleme traten etwas häufiger in der Gruppe mit syndromatischer Pierre-Robin-Sequenz auf. Gemessen an der Häufigkeit und Dauer der Nahrungssondierung waren die Ernährungsprobleme ebenfalls deutlich ausgeprägter in der Gruppe mit syndromatischer Pierre-RobinSequenz. Eine Schallleitungsschwerhörigkeit fand sich insgesamt bei 39 % der 28 Probanden ohne wesentliche Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Eine Schallempfindungsschwerhörigkeit trat nur in der Gruppe der Patienten mit syndromatischer PierreRobinSequenz auf. Diese Ergebnisse waren vereinbar mit den Resultaten früherer Untersuchungen, die darauf hin deuteten, dass Kinder mit isolierter PierreRobinSequenz bei optimaler Therapie im Neugeborenen und Säuglingsalter eine gute Prognose bezüglich ihrer physischen und mentalen Entwicklung haben, während bei Vorliegen eines übergeordneten Syndroms häufiger mit Wachstumsdefiziten und mentaler Retardierung zu rechnen ist. Bezüglich der genetischen Beratung läßt sich feststellen, dass das Wiederholungsrisiko bei isolierter Pierre-Robin-Sequenz klein ist.
Im Rahmen einer klinische Studie wurden bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf/Halsbereich LymphozytenSubpopulationen phänotypisch und funktionell charakteri- siert sowie deren Aktivierungszustand anhand der Bestimmung des Interleukin2Titers und der Konzentration von löslichem Interleukin2Rezeptor a (sIL2Ra) im Plasma gemessen. Hierbei interessierte der Einfluß des Tumors bzw. der Therapieformen wie Operation, Che mo, Bestrahlungstherapie und kombinierte RadioChemotherapie auf diese immunologischen Parameter. Die Zusammensetzung der Populationen peripherer Blutlymphozyten wird durch die Größe und Malignität des Primärtumors sowie durch Lymphknotenmetastasen beeinflußt. In der An fangsphase, bei einer Tumormalignität G1, ist eine starke Reduzierung der LAKZellaktivität zu sehen, was mit suppressiven Faktoren, wie zum Beipiel ProstaglandinE2, abgesondert von Monozyten, in Verbindung gebracht werden könnte. Der Anteil CD3positiver Zellen ist im G3Stadium sehr stark erniedrigt und deutet auf eine Herunterregulierung der zu dem CD3 Komplex gehörenden eKette hin. Weiterhin war bei den HNOTumorpatienten der Anteil der CD4Lymphozyten auffällig erniedrigt, während die Zahl der doppeltpositiven CD4 CD8 Zellen sowie die HLADRWerte erhöht war. Einen Monat nach einem operativen Eingriff ließ sich eine starke Zunahme der CD25 Expression, besonders auf TLymphozyten erkennen. Die Chemotherapie mit Cisplatin, Fo linsäure, 5FU, Fortecortin eine sogenannte Polychemotherapie bewirkte eine starke Erhö hung der NKZellpopulation und eine höhere Expression des CD25Markers auf NKZellen sowie eine Zunahme der LAKZellfunktion. Die Veränderung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf den Einsatz von Cisplatin und 5FU zurückzuführen. Die Bestrahlungsthe rapie bewirkte eine signifikante Abnahme der TLymphozyten, besonders der CD4T Helferzellen, bei gleichzeitiger Zunahme der CD4 CD8 positiven Zellen. BZellen sind gStrahlen sensitiv, so daß unter Bestrahlung ihr Anteil vermindert wird. Die Erhöhung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf eine Radioresistenz dieser Lymphozytensubpopula tion zurückzuführen. Die RadioChemotherapie beinhaltet drei Zyklen mit einem Zytostatika gemisch: Cisplatin, 5FU, Folinsäure, Dexametason, Rescuvolin und Fortecortin und an schließender Behandlung mit gStrahlen. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen deutlich, daß es unter dieser RadioChemotherapie zu einem signifikanten Abfall der CD3 und CD2positiven Zellen, besonders der zytotoxi schen TZellpopulation, sowie zu einer Erhöhung der CD25exprimierenden Zellen kommt. Die Beziehungen der Zellen untereinander sind unter Operation, Betrahlung und Radio Chemotherapie nicht verändert, die Chemotherapie verursacht jedoch vermutlich ein Un gleichgewicht zwischen THelferzellen und Makrophagen bezüglich der Vermehrung von NKZellen. Bei Patienten ohne Therapie kam es zu einer Abnahme der CD3positiven Zellen. Dies unterstützt die Hypothese der Herunterregulierung der eKette des CD3Komplexes unter Tumoreinwirkung. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß die alleinige Bestimmung des Interleukin2 Proteins keine Auskunft über die Wirkung des Tumors auf die Sezernierung dieses Peptids bei einer Tumorlokalisation im Gaumen und Zungenbereich gibt. Erst im Verlauf der Erkrankung können Änderungen durch virale Infektionen und der Einfluß verschiedener Therapiemodali täten beobachtet werden. Die Konzentration von sIL2Ra verhielt sich proportional zur Tumorgröße. Dies unterstützt die Hypothese, daß dieser Rezeptor eher vom Tumor abstammt und nicht von den infiltrierten Lymphozyten. Die Konzentration von sIL2Ra im Plasma war abhängig von der Therapieart. Sie erreichte wesentlich höhere Werte bei Tumorpatienten im Vergleich zu den Probanden. Der niedrigste Spiegel bei Patienten fand sich bei Bestrahlungstherapie (Median = 840 U/ml), die höchsten Werte bei Patienten mit Chemotherapie (Median = 1400 U/ml). Infiltrierende CD3 Lymphozyten im Primärtumor, identifiziert mit einen Antikörper gegen die eKetten, sind im Vergleich zu metastasierten Lymphknoten signifikant erniedrigt. Unter suchungen der peripheren Blutlymphozyten bei Patienten mit Primärtumor ergaben eine signi fikante Erhöhung der CD3Populationen bei gleichzeitiger Erniedrigung des Anteils CD45 positiver Zellen. Es bestand für CD45positive Zellen ein signifikanter Zusammenhang zwi schen peripheren Blutlymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten.
Thema der vorliegenden Arbeit war der Austausch der retroviralen Integrase von HSRV gegen die Integrase von HTLV1. Mit diesem Austausch sollte eine Steigerung der Integrationsrate von HSRV erreicht werden, um ihn als Vektor für die Gentherapie zu optimieren. Zunächst wurde dazu die HTLV1Integrase im Austausch gegen die HSRV Integrase in HSRV eingebracht. Dieses rekombinante Plasmid war jedoch replikationsdefizient und hatte nach der Transfektion in eukaryonte Zellen keinen Virustiter. Dies führte zu der Überlegung, auch die für die Erkennung des Virus durch die Integrase wichtigen ersten 15 Nukleotide der LTREnden von HSRV an die Sequenz von HTLV1 anzugleichen. Da auch der daraus resultierende Klon keine Infektiösität aufwies, konnte die Replikationsdefizienz eventuell weitreichendere Gründe haben als eine reine Integrationsdefizienz. Ein cisElement am CTerminus der HSRVIntegrase welches zur Stabilisierung und Verpackung der RNA in Partikel wichtige Funktionen hat, wurde daher in dem Klon mit der HTLV1Integrase regeneriert. Dazu wurde eine chimäre Integrase bestehend aus dem Nterminalen und dem Mittelteil der HTLV1Integrase mit dem Cterminalen Teil der HSRV Integrase fusioniert und in das HSRV Provirus mit und ohne die HTLV1LTREnden eingebracht. Da diese Klone ebenfalls nichtinfektiös waren, sollte Expressionsanalyse der rekombinanten Plasmide zur Klärung der Ursache ihrer Replikationsdefizienz beitragen. Als Kontrollen dienten dabei ein HSRVKlon ohne Integrase, ein HSRVKlon mit wiedereingeführter HSRVIntegrase und ein Konstrukt mit den HTLV1LTREnden aber mit der HSRVIntegrase. Die Untersuchung der chimären Klone ergab, daß virale genomische RNA zumindest kurze Zeit nach der Transfektion in den Zellen vorhanden war, aber eventuell nicht in Viruspartikel verpackt wurde, da vor der HTLV1Integrase ein weiteres ca. 114 Nt langes cisElement fehlte. Dieses fehlende cisElement war möglicherweise auch die Ursache für eine gestörte GagProzessierung der Klone in 293TZellen. Da Gag Prozessierung für den Zusammenbau intakter Viruspartikel essentiell ist, konnte hier ein Grund für die Replikationsdefizienz der chimären Klone liegen. Alle weiteren viralen Proteine wurden von den chimären Klonen exprimiert und normal prozessiert. Die virale Protease war also enzymatisch aktiv. Weiterhin wurde die korrekte Aktivität der reversen Transkriptase nachgewiesen. Durch eine Kotransfektion der chimären Plasmide mit dem HTLV1GagProtein sollte das im Preintegrationskompex vorkommende GagProtein für die øTLV1 Integrase ersetzt werden. Auch dieser Versuchsansatz erwies sich als ungeeignet, die Integration bzw. Replikation der chimären Klone zu verbessern. Durch die Einklonierung eines Resistenzgens in die viralen Klone sollten Zellen mit integrierter viraler DNA gezielt selektioniert werden. Das Resistenzgen wurde in drei der viralen Konstrukte eingebracht, in wtpHSRV13, in den Klon mit den HTLV1 LTREnden und der HTLV1Integrase sowie in das virale Plasmid mit den HTLV1 LTREnden und der chimären Integrase. Nach der Einzelzellselektion der mit wt Zeocin transfizierten BHKZellen hatte von sechs Klonen nur einer einen geringen Virustiter, dieser exprimierte als einziger virale Gene. Durch Southernblotanalyse dieser Einzelzellklone konnte die Anzahl der Integrate auf fünf bis acht pro Einzelzellklon ermittelt werden. Die Einzelzellklone aus der Transfektion mit den rekombinanten Klonen besaßen keine Infektiösität. Die Expression der viralen Gene war bei den Einzelzellklonen aus der Transfektion des Klons mit den HTLV1LTR Enden und der HTLV1Integrase nachweisbar.
Das Chromanol 293B stellt die Leitsubstanz einer möglicherweise neuen Kategorie von KlasseIIIAntiarrhythmika dar. Im Herzen inhibiert es potent und spezifisch den Kaliumkanal I Ks , der an der Repolarisation der Membran bei Ablauf eines Aktionspotentials beteiligt ist. Er ist aus der AlphaUntereinheit KCNQ1 und der BetaUntereinheit MinK aufgebaut. Es bestehen deutliche biophysikalische Unterschiede zwischen den Strömen homomerer KCNQ1 und heteromerer I Ks (KCNQ1/MinK)Kanäle. Die Koexpression mit MinK verändert aber auch die Pharmakologie von KCNQ1. In der vorliegenden Arbeit trugen zwei unabhängige Lösungsansätze dazu bei, die Interaktion der beiden Untereinheiten molekular besser zu verstehen. Dabei wurden als Methoden die zielgerichtete Mutagenese, die Expression der WildTypProteine und der Mutanten in XenopusOozyten und deren elektrophysiologische Analyse angewendet. Im ersten Teil wurde die Bindungsstelle des I Ks Inhibitors 293B molekular identifiziert, während im zweiten Teil der Mechanismus der Inaktivierung der AlphaUntereinheit KCNQ1 untersucht wurde. In den beiden Ansätzen wurde ausgenutzt, dass die zu KCNQ1 eng verwandten KCNQ2 Kanäle weder sensitiv gegenüber 293B waren noch eine Inaktivierung zeigten. Die Expression von MinKMutanten, die alle veränderbaren Regionen des Proteins abdeckten, ergab, dass keine dieser Mutationen die Affinität des I Ks Kanals gegenüber 293B wesentlich beeinflusste. Das war erstaunlich, da homomere KCNQ1Kanäle durch das Chromanol 293B um den Faktor 45 schwächer zu blockieren sind als I Ks Kanäle und da zusätzlich gezeigt wurde, dass sich auch das Ausmaß der Stereoselektivität von 293B und anderer verwandter I Ks Inhibitoren in Bezug auf KCNQ1 und I Ks stark unterscheidet. Es konnte aus den Ergebnissen indirekt vermutet werden, dass MinK offensichtlich auf allosterische Art die Affinität des Inhibitors erhöht. Um einen Hinweis auf die I Ks Spezifität des Blocks durch 293B auch innerhalb der KCNQ Familie zu erhalten, wurde zunächst die Inhibition der verwandten KCNQ2 und KCNQ3Kanäle getestet, die sich als kaum signifikant erwies. In diesem Zusammenhang wurde auch ein neues Mitglied der KCNQFamilie kloniert, KCNQ5, das schwach sensitiv gegen 293B war, nicht im Herzen vorkommt aber wahrscheinlich zusammen mit KCNQ2/KCNQ3 zum neurona len MStrom beiträgt. Dies ergab Hinweise darauf, dass von anderen KCNQKanälen differente Proteinsequenzen die hohe Sensitivität des KCNQ1Kanals gegenüber 293B determinieren. Die Bindungsstelle an der AlphaUntereinheit KCNQ1 wurde anschließend durch KCNQ1/KCNQ2 Chimären auf die innere Porenregion eingegrenzt. Durch detaillierte Untersuchung mithilfe von Punktmutationen identifizierten wir Aminosäuren in der Transmembranregion S6 (I337) und der Porenschleife H5(V307), deren Austausch gegen die entsprechenden KCNQ2 Aminosäuren die Affinität von 293B zu KCNQ1 sowie zu I Ks Kanälen um den Faktor 420 herabsetzten. Durch Analogiemodellierung mithilfe der bekannten Kristallstruktur des KcsA Kaliumkanals konnte ein 3DModell der KCNQ1Porenregion erstellt werden, aus dem sich ergab, dass die Seitenketten der Aminosäure Isoleucin 337 in das Lumen der inneren Pore gerichtet sind. Aus dem Modell konnte weiterhin das Phenylalanin 340 als in das Lumen gerichtet identifiziert werden. Dieses Ergebnis konnte durch weitere MutageneseExperimente evaluiert werden, aus denen hervorging, dass Veränderungen an dieser und benachbarten Positionen die Sensitivität sowohl von KCNQ1 als auch von I Ks Kanälen gegenüber 293B um den Faktor 10100 verminderten. Das 293BMolekül konnte so in das Modell integriert werden, dass sich attraktive Interaktionen mit diesen beiden Resten (F340 und I337) ausbilden. Die innere Porenregion stellt auch für viele Inhibitoren anderer Kaliumkanäle eine wichtige Determinante für hohe Affinität dar. Die in H5 gelegene Aminosäure V307 schien nach dem Modell nicht an einer 293BInteraktion direkt beteiligt zu sein. Es fiel aber bei der Charakterisierung auf, dass das veränderte Protein nicht mehr inaktivierte. Daher sollte ein Zusammenhang zwischen dem 293B Wirkmechanismus und der intrinsischen KCNQ1Inaktivierung untersucht werden. Es wurden wiederum durch einen Chimärenansatz zunächst die Regionen identifiziert, die für eine KCNQ1Inaktivierung notwendig sind. Anschließend wurde nach punktuellem Austausch von KCNQ1Aminosäuren gegen analoge KCNQ2Reste für eine weitere Position im Transmembransegment S5 (G272) ein Verlust der Inaktivierung festgestellt. Die zweite nicht inaktivierende Mutante G272C war WildTypgleich 293Bempfindlich, woraus sich vermuten ließ, dass die schwache Empfindlichkeit gegenüber 293B und der Verlust der Inaktivierung der KCNQ1Mutante V307L nicht in Zusammenhang stehen. Die Ergebnisse machten aber molekular den Unterschied der KCNQ1Inaktivierung zu den beiden klassischen Inaktivierungsarten von Kaliumkanälen, N und CTyp, deutlich. Zuvor war dies nur anhand unterschiedlicher biophysikalischer Eigenschaften gezeigt worden. Das zuvor erstellte KCNQ1 Modell unterstützte die Resultate, da sich in ihm die beiden Regionen S5 und die Porenhelix H5 etwa auf Höhe der beiden Aminosäuren V307 und G272 kreuzen, was eine Interaktion dieser Regionen suggeriert. Zudem ist bei der ein LongQTSyndrom verursachenden KCNQ1Mutation L273F die mutierte Stelle unmittelbar neben dem Valinrest 307 lokalisiert. Diese besonders stark inaktivierende LQT1Mutante erhielt auch unter der Einwirkung von MinK eine nachweisbare Inaktivierung aufrecht. Da die KCNQ1Inaktivierung durch MinKKoexpression normalerweise aufgehoben wird, spricht dies für eine pathophysiologische Relevanz der KCNQ1Inaktivierung.