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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen aufzuklären, die im Rahmen inflammatorischer Erkrankungen zur Expression sogenannter Akute Phase Proteine führen. Der Fokus lag hierbei auf der Untersuchung von Signaltransduktionkaskaden, die aktiviert durch proinflammatorische Zytokine in der Leber die Bildung proatherogener Plasmaproteine wie C-reaktives Protein zur Folge haben. Zu diesem Zweck sollten verschiedene in vitro Zellmodelle etabliert und evaluiert werden. Neben Genexpressionsanalysen in zytokin-stimulierten primären humanen Hepatozyten, sowie in den Hepatoma-Zellinien HepG2 und Hep3B sollte die Manipulation der CRP-Expression durch gezielten Gentransfer und die Anwendung der siRNA-Technologie im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen. Zu diesem Zweck sollten Transkriptionsfaktoren der NFKB-Familie, sowie der Familie der „Signal transducer and activator of transcription“ (STAT) und der CCAAT/Enhancer-bindenden Proteine (C/EBP) überexprimiert werden, bzw. deren Expression durch die Transfektion mit entsprechenden siRNA-Oligonukleotide gehemmt werden. Ein weiteres wichtiges Ziel war es, ein zelluläres Modellsystem zu generieren und zu charakt-erisieren, das zur Identifizierung von Substanzen geeignet ist, die die CRP-Expression modu-lieren oder inhibieren.
Das sympathische Nervensystem entsteht aus Vorläuferzellen der Neuralleiste, die an die dorsalen Aorta gelangen und dort die primären sympathischen Ganglien bilden. Der Entwicklungsverlauf dieser Zellen hängt von den Signalen ab, welche sie während ihrer Wanderung empfangen. Die Differenzierung der Vorläuferzellen wird an der dorsalen Aorta angeregt. Als Signalmoleküle dienen die BMPs, die von der dorsalen Aorta gebildet und sezerniert werden. Die BMPs induzieren in den Vorläuferzellen die Expression der Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, die notwendig für den weiteren Differenzierungsprozess sind. Diese Transkriptionsfaktoren steuern direkt oder indirekt die Expression der terminalen Differenzierungsgene TH, DBH, SCG10 und NF160. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Zink-Finger-Transkriptionsfaktoren Gata2 und Gata3 ebenfalls eine essentielle Funktion in der Entwicklung sympathischer Neurone ausüben. Im Huhnembryo wird, im Gegensatz zur Situation in der Maus, in den sympathischen Vorläuferzellen nur Gata2 exprimiert. Gata2 wird nach den Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, jedoch vor den noradrenergen Markergenen TH und DBH exprimiert. Die Expression von Gata2 ist BMP-abhängig, wie durch BMPÜberexpression und BMP-Funktionsblockierung gezeigt wird. Die Überexpression von Mash1, Phox2b und Hand2 in Vorläuferzellen führt zur Expression von Gata2. In der Phox2b-Nullmutante sind Gata2 und Gata3 nicht exprimiert. Damit ist Gata2/3 unterhalb von Mash1, Phox2b und Hand2 in der BMP-induzieren Signalkaskade einzuordnen. Die Funktionsblockierung von Gata2 im Huhnembryo und die Eliminierung des Gata3-Gens in der Maus ergaben eine starke Reduktion in der Größe der sympathischen Ganglien. Zusätzlich war die Expression des noradrenergen Markergens TH stark reduziert. Die Überexpression von Gata2 in Neuralleistenvorläuferzellen führt vorwiegend zur Entstehung von Neuronen, die keine autonomen Eigenschaften aufweisen und TH-, Phox2b- und Mash1-negativ sind. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Gata2 im Huhn und Gata3 in der Maus Mitglieder des regulatorischen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren sind, das essentiell für die Entwicklung sympathischer Neurone ist. Die Funktion der Gata-Faktoren in der noradrenergen Differenzierung autonomer sympathischer Neurone scheint jedoch von der Interaktion mit Koregulatoren abhängig zu sein, die in sympathischen Vorläuferzellen vorhanden sind. In Vorläuferzellen, welche diese Kofaktoren nicht erhalten, induziert Gata2 nahezu ausschließlich nicht-adrenerge Neurone. Gata2 könnte mit Phox2a/b und Hand2 interagieren, oder mit anderen unbekannten Faktoren die in den sympathischen Vorläuferzellen exprimiert sind. Die Entwicklung sympathischer und parasympathischer Neurone wird von BMPs sowie von den Transkriptionsfaktoren Mash1 und Phox2b gesteuert. Der Differenzierungsprozess in sympathischen und parasympathischen Ganglien führt zu unterschiedlichen Transmitterphänotypen. Sympathische Ganglien bestehen vorwiegend aus noradrenergen, parasympathische Ganglien dagegen aus cholinergen Neuronen. Hand2 wird in sympathischen Neuronen und nicht in parasympathischen Ziliarneuronen exprimiert und gilt als Transkriptionsfaktor der den noradrenergen Transmitterphänotyp spezifiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass auch die Transkriptionsfaktoren Gata2/3 nicht in parasympathischen Ziliarganglien exprimiert werden. Die Expressionsanalysen an mehreren parasympathischen Ganglien zeigte jedoch, dass die Expression von Gata2/3- nicht vollständig mit der noradrenergen Genexpression korreliert. Die Analyse der Gata2/3- Expression im Locus ceoruleus, dem wichtigsten noradrenergen Zentrum im Gehirn ergab, dass Gata2 und Gata3 im LC des Huhnembryos nicht exprimiert werden. Die Expression von Gata2/3 hängt somit nicht zwingend mit den noradrenergen Phänotyp zusammen. Die selektive Funktion von Gata2/3 in der Entwicklung peripherer noradrenerger Neurone zeigt zudem, dass der noradrenerge Phänotyp in den peripheren und zentralen Neuronen unterschiedlich reguliert wird.
Glycin ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem. Um die glycinerge Erregungsübertragung zu sichern, muss die Glycinkonzentration an Synapsen präzise reguliert werden. Hierfür sind die Glycintransporter, GlyT1 und GlyT2, verantwortlich. Der GlyT2 ist ein präsynaptisches Protein, das in glycinergen Nervenendigungen nahe der aktiven Zone lokalisiert ist. Das über den Transporter aus dem extrazellulären Raum aufgenommene Glycin steht anschließend für die Befüllung der synaptischen Vesikel durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT) zur Verfügung. Die GlyT2-Defizienz führt in Mäusen zu einem letalen Phänotyp und verdeutlicht die Notwendigkeit eines hochaffinen Glycinaufnahmesystems in glycinergen Neuronen. Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die zur präzisen Lokalisation des GlyT2 in der Präsynapse führen, wurde das PDZ-Domänenbindungsmotiv (PDZ-DBM) am extremen C-Terminus bzw. die lange N-terminale Domäne dieses Transporters deletiert. Durch biochemische und pharmakologische Analysen von transfizierten HEKT-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Verlust des PDZ-DBM oder der N-terminalen Domäne die Proteinexpression, die Glykosylierung und die Transportaktivität des GlyT2 nicht beeinflussten. Längere Deletionen des N-Terminus (ΔAA1-184) setzten jedoch die Effizienz der Glycinaufnahme herab und ergaben im Vergleich zum wt-Protein einen um 60% reduzierten vmax-Wert, während die apparente Glycinaffinität (KM-Wert) unverändert blieb. Lokalisationsstudien und Oberflächenbiotinylierungen zeigten GlyT2 wt-Immunreaktivität an der Plasmamembran, die sich qualitativ und quantitativ nicht von denen der N- und C-terminalen Mutanten unterschied. Das PDZDBM und die N-terminale Domäne spielen folglich in der Prozessierung und der Transportfunktion des GlyT2 eine untergeordnete Rolle. Möglicherweise reduziert die fast vollständige Deletion der N-terminalen Domäne jedoch die Stabilität des GlyT2. In transfizierten hippocampalen Neuronen wurde der Einfluss des PDZ-DBM und der N-terminalen Domäne hinsichtlich der GlyT2 Lokalisation analysiert. Die transfizierten Mutantenproteine zeigten eine diffuse Verteilung mit partiellen Anreicherungen von GlyT2-Immunreaktiviät. Das wt-Protein kolokalisierte mit Synaptophysin, exzitatorischen synaptischen Markern wie PSD95 und mit den inhibitorischen Markern Gephyrin und VIAAT. Nach Deletion des PDZ-DBM hingegen zeigte der GlyT2 eine um ca. 50% verminderte Kolokalisation mit allen untersuchten synaptischen Markern. Damit konnte hier erstmals eine Funktion des PDZ-DBM für die Anreicherung von GlyT2 an Synapsen gezeigt werden. Mit N-terminalen Deletionsmutanten transfizierte hippocampale Neurone wiesen kolokalisierende GlyT2ΔN-PSD95-Puncta zumeist in MAP2-positiven Neuriten auf, während das wt-Protein zumeist in MAP2-negativen Neuriten kolokalisierte. MAP2 ist ein mikrotubuli-assoziertes Protein, das in Dendriten, aber nicht in Axonen, auftritt und somit eine Unterscheidung derselben ermöglicht. Aufgrund der Überexpression in transfizierten Neuronen war die GlyT2-Immunreaktivität aber sowohl in axonalen als auch dendritischen Neuriten zu beobachten. Zusätzlich zu der in größeren Clustern gefundenen synaptischen GlyT2ΔN-Immunreaktivität war eine Färbung hauptsächlich in sehr kleinen Strukturen (<= 1 μm) nachzuweisen, die Transportvesikeln entsprechen könnten. Dies ist mit einem längeren Verbleib der Deletionsmutanten in intrazellulären Strukturen erklärbar. Im Hippocampus wird GlyT2 endogen nur sehr schwach in einer Subpopulation von putativ glycinergen Neuronen exprimiert. Um die Lokalisation der N-terminalen GlyT2-Proteine in Zellen zu untersuchen, die eine hohe endogene GlyT2-Expression aufweisen, wie spinalen Neuronen, die sich aber nur schlecht transfizieren lassen und in Kultur keine adulte GlyT2-Lokalisation aufweisen, wurden BAC-transgene Mäuse generiert, die myc-markierte GlyT2ΔN-Proteine unter Kontrolle des GlyT2-Promotors exprimieren. Der Vorteil von BAC-transgenen Mauslinien ist, dass sie aufgrund der Verwendung des endogenen Promotors das Transgen nur schwach überexprimieren. Founder-Mäuse, in denen der jeweilige modifizierte BAC-Klon (mGlyT2 wt, ΔAA14-174 oder ΔAA14-184) integriert wurde, wurden identifiziert und mit C57BL/6J-Mäusen verpaart, um so transgene Mauslinien zu etablieren und die Lokalisation der mutierten GlyT2-Proteine zu analysieren. Zusätzlich wurde eine BAC-transgene Cre-Mauslinie generiert, die die Cre-Rekombinase in GlyT2-positiven Zellen exprimiert. Durch die Verpaarung mit konditionalen oder transgenen Mauslinien soll mit diesen GlyT2/Cre-Mäusen die Funktion einzelner Genprodukte in glycinergen Zellen untersucht werden. In dieser Arbeit wurden außerdem die Glycinrezeptor (GlyR) α-Untereinheiten (UE) in GlyT2-defizienten Mäusen untersucht. GlyT2 -/- Tiere sterben in der zweiten postnatalen Woche nach der Geburt und zeigen einen starken neuromotorischen Phänotyp. Da in demselben Zeitraum ein Austausch der embryonalen α2- durch die adulte α1-UE erfolgt, wurde die Entwicklung der α1- und der Gesamt-α- Immunreaktivität in Rückenmarksschnitten von wt und GlyT2 -/- Tieren analysiert und miteinander verglichen. Die Daten zeigen, dass der α-UE-Austausch in den GlyT2-defizienten Tieren ähnlich wie in wt Tieren erfolgt. In α1-GlyRs ist die Öffnungszeit des aktivierten Kanals kürzer als bei α2-GlyRs. Zusammen mit der geringeren Ausschüttung an Glycin aufgrund der GlyT2-Defizienz lässt sich so das Auftreten des Krampf-Phänotyps der GlyT2 -/- Mäuse nach erfolgtem UE-Austausch erklären.
Der Einfluss von Stress auf einen Organismus führt zur Expression molekularer Chaperone unterschiedlichster Hitzestressprotein-(Hsp)-Familien, die die Zellen vor stressbedingten Schäden schützen. Mitglieder der Hsp2O-Familie (kurz small Hsps, sHsps) besitzen ein Molekulargewicht von 12-43 kDa und sind durch einen zentralen, evolutiv konservierten Bereich, der als alpha-Crystallin-Domäne (ACD) bezeichnet wird, gekennzeichnet. Diese besteht größtenteils aus beta-Strängen, während die flankierenden Bereiche hingegen variabel in Länge, Sequenz sowie Sekundärstrukturen sind. sHsps bilden mit Hilfe der Sekundärstrukturen oligomere Komplexe aus. Darüber hinaus besitzen sie eine ATP-unabhängige Chaperonaktivität und spielen beim Schutz thermosensitiver Proteine eine wichtige Rolle. In Pflanzenzellen führt ein anhaltender Hitzestress zur Ansammlung von sHsps zu so genannten Hitzestressgranula (HSGs), die sich wiederum zu größeren HSG-Komplexen (HSCs) organisieren. Eine mögliche Funktion von HSCs ist der Schutz zellulärer denaturierter Proteine vor einer irreversiblen Aggregation. Durch deren Bindung mittels sHsps und Eingliederung in den HSC-Verband werden die denaturierten Proteine in einem faltungskompetenten Zustand gehalten. Schließlich können die mit den HSCs assoziierten ATP-abhängigen Hsp-Maschinen (z.B. Hsp70/40, Hsp100) die sHsp-gebundenen Substrate renaturieren. Wie in der vorliegenden Arbeit dargestellt, weisen Pflanzen die höchste soweit bekannte Anzahl von sHsp-Genen auf. Die korrespondierenden Proteine werden anhand ihrer Primärsequenz und subzellulären Lokalisation in verschiedene Klassen eingeteilt: sHsps der Klassen CI und CI1 befinden sich im nucleo-cytoplasmatische Raum, sHsps der Klasse M in Mitochondrien, der Klasse P in den Plastiden und der Klasse ER im endoplasmatischen Reticulum sowie im Golgi-Apparat. Da das Genom von Arabidopsis thaliana das erste komplett sequenzierte pflanzliche Genom ist, eignete sich dieser Modelorganismus zur Identifikation aller sHsp kodierenden Gene. Der Einsatz von Protein- und Nukleotidsequenzen bereits bekannter pflanzlicher sHsps als Suchkriterium in der NCBI-Datenbank (BLASTP und BLASTN), ergab die ldentifikation 19 putativer sHsp kodierender Gene, von denen erstaunlicheweise 13 bislang noch nicht bekannt waren. Proteinsequenzvergleiche ergaben, dass 7 der neu entdeckten sHsps nicht den typischen Klassen zugehörig sind. Dies bildete den Ausgangspunkt für deren nähere Analyse und Charakterisierung im Rahmen des ,,Functional Genomics": (1) Lokalisationsstudien I: Myc-Epitop markierte sHsp-Konstrukte wurden transient in Tabak-Mesophyllprotoplasten transformiert. Über Lokalisationsstudien per lmmunfluoreszenz konnten diese Proteine in tatsächlich 7 neu definierte sHsp Klassen eingeteilt werden. Interessanteweise werden die Vertreter dieser neuen Klassen von jeweils nur einem Gen kodiert. Die Vertreter der Klassen CI11 bis CVII lokalisieren im nucleo-cytoplasmatischen Kompartiment. Ferner bewiesen die Kodetektionen von organellären Markerproteinen, dass Klasse MII sHsps in die Mitochondrien und Mitglieder der Klasse Po in die Peroxisomen transportiert werden. Dies stimmte überein mit der Vorhersage von organellären Signalsequenzen. (2) Lokalisationsstudien II: Frühere Studien zeigten, dass sHsps der Klassen CI und CII unter Hitzestressbedingungen HSCs ausbilden. Wahrscheinlich fungieren Klasse CII sHsps als Grundgerüst für die HSC-Bildung und rekrutieren sHsps der Klasse CI in diese Multichaperonkomplexe. Die Proteine (Myc-markiert) Hsp17.4-CIII, Hsp15.4-CIV, Hsp18.5-CVI und Hsp14.7-CVII wurden unter Hitzestressbedingungen in endogene HSCs von Tabak-Mesophyllprotoplasten eingegliedert. Dieses Phänomen bleibt auf die genannten sHsp Klassen beschränkt, da weder Hsp21.7-CV, noch die organellären Proteine Hsp26.5-MI1 sowie Hsp15.7-Po in HSCs detektiert wurden. (3) Das sHsp-lnteraktom: Im Gegensatz zu früheren Studien, konnte in der vorliegenden Arbeit eine lnteraktion zwischen sHsps verschiedener Klassen zum ersten Mal im Hefe-Zwei-Hybrid-System sowie über Pull-down und nativer SDS-Gelelektrophorese detektiert werden. Am Beispiel eines Klasse CIII sHsps wurde gezeigt, dass die lnteraktion mit sHsps anderer Klassen zu einer Heterooligomerisierung führt. Dies wiederum hat eine nachhaltige Beeinflussung der intrazellulären Lokalisation der sHsps zur Folge. (4) Darüber hinaus ist für sHsps der Klasse CIII typisch, dass sie aufgrund einer Kernlokalisationssequenz innerhalb der ACD in den Nukleus transportiert werden. Im Vergleich zu sHsps der Klassen CI und CII, die Oligomere Strukturen von 220-230 kDa ausbilden, assemblieren sHsp-Monomere der Klasse CIII zu hochmolekularen Komplexen im Bereich von 1 MDa. (5) Das sHsp-Transkriptom: Durch RT-PCR-Analysen und Auswertung der öffentlich zugänglichen Microarray-Daten des AtGenExpress Konsortiums, konnte die Expression aller sHsps kodierenden Gene im Arabidopsis Genom auf transkriptioneller Ebene analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben Hitzestress auch der Einfluss anderer abiotischer Stressoren, wie U. a. oxidativer stress und UV-B Bestrahlung, zu einer Akkumulation von sHsp-Transkripten führt. Ferner werden einige sHsps in bestimmten Entwicklungsstufen bzw. Organen, wie z.B. Blüten, Blättern und Samen, unabhängig von Stresseinflüssen exprimiert. (6) Funktionelle Analysen: Ein seminatives in vitro Chaperontestsystem, in dem Luciferase als thermosensitives Modelsubstrat eingesetzt wird, wurde herangezogen, um ausgesuchte sHsps bezüglich ihrer möglichen Chaperonfunktion zu testen. In Abhängigkeit der rekombinant hergestellten Proteine Hsp18.5-CVI, Hsp26.5-MII und Hsp15.7-Po konnte eine verminderte Aggregation der Luciferase unter Hitzestresseinwirkung und eine darauf folgende erhöhte Renaturierung durch ATP-abhängige Chaperonmaschinen während einer Erholungsphase beobachtet werden. (7) Peroxisomale sHsps: Da nie zuvor über peroxisomale sHsps berichtet wurde, nahm Hsp15.7-Po eine besondere Rolle bei den Untersuchungen ein. Dieses Protein besitzt eine putative peroxisomale Lokalisationssequenz (PTS) am C-Terminus, bestehend aus der Abfolge der Aminosäurereste SKL (PTS1). Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Studien und lmmunfluoreszenzanalysen (in Tabak-Mesophyllprotoplasten und Säugerzellen) sowie den Einsatz von Mutanten wurde demonstriert, dass die PTS1 tatsächlich für die lnteraktion von Hsp15.7-Po mit den TPR-Domänen des peroxisomalen Importrezeptors Pex5 und für die peroxisomale Lokalisation des sHsps verantwortlich ist. Ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening nach möglichen lnteraktionspartnern von Hsp15.7-Po lieferte den ersten Anhaltspunkt für die lnteraktion mit cytoplasmatischen sHsps (Hspl7.7-CII). Dies ließ sich durch Pull-down-Analysen bestätigten und auf Hsp17.6-CII erweitern. Diese Interaktionen beeinflussten jedoch nicht die subzelluläre Lokalisation der jeweiligen Proteine bei Koexpression in Tabak-Mesophyllprotoplasten. All die hier dargestellten Ergebnisse weisen auf diverse Funktionen der einzelnen neu identifizierten sHsps der unterschiedlichen Klassen hin und bilden die Grundlage für zukünftige, detaillierte in planta Untersuchungen, die hierdurch erleichtert werden können.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes, converting arachidonic acid to 5-HPETE, and in a second step 5-HPETE to leukotriene A4. Although the 5-LO promoter possesses characteristics of so called housekeeping genes, such as lack of TATA/CCAAT boxes and existence of several Sp1 binding sites, the 5 -LO gene is tissue specifically expressed in primarily immune competent cells of myeloid origin including granulocytes, monocytes, macrophages, mast cells and B-lymphocytes. 5-LO gene expression in MM6 and HL-60 cells is strongly induced after differentiation of the cells with TGF-beta and 1,25(OH)2D3. In some monocytic cancer cell lines, such as HL-60 TB and U937, TGF-beta and 1,25(OH)2D3 treatment are not able to activate 5-LO gene transcription. It was demonstrated, that in these cell lines the 5-LO core promoter is heavily methylated and that only demethylation by the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2 deoxycytidine (Adc) upregulated the 5-LO mRNA levels. It was also shown that the histone deacetylase inhibitor TsA could induce 5-LO mRNA levels, but only in 1,25(OH)2D3/TGF-beta inducible MM6 cells. Interestingly the 1,25(OH)2D3/TGF-beta effect on 5-LO expression is reduced, when combined with TsA. Reporter gene assays revealed that 5-LO promoter activity is strongly induced after 24 h treatment with 330 nM TsA (construct N10 up to 35 fold in HeLa cells). The effect is dependent on the presence of the proximal Sp1 binding site GC4 (-53 bp to –48 bp in relation to the major TIS) in both HeLa and MM6 cells. In vitro binding of the transcription factor Sp1 to this site has been demonstrated in gel shift assays and DNase I footprints. Mutation of the binding site resulted in a loss of basal promoter activity in both 5-LO negative HeLa cells and in 5-LO positive MM6 cells, as well as in the loss of TsA inducibility. The mutational study of different Sp1 binding sites in a larger promoter context revealed the interaction or respectively the additive effect of the multiple Sp1 binding sites of the 5-LO promoter on basal as well as on TsA upregulated promoter activity. However, GC4 seems to be of special relevance for both the basal promoter activity, possibly recruiting the basal transcription machinery, as well as for the TsA induced upregulation of 5-LO promoter activity. TsA does not alter the protein expression levels of Sp1 and Sp3 as investigated in Western blot analysis, neither in HeLa nor in MM6 cells. DNA affinity purification assays revealed that TsA had no effect on the DNA affinity of Sp1 or Sp3. In vitro binding of both Sp1 and Sp3 to the 5-fold GC box, GC4 and GC5 was demonstrated by DAPA analysis, but histone deacetylase inhibition did not change the associated protein amounts. Finally, in vivo binding of Sp1 and Sp3 was investigated in chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) in MM6 cells. TsA clearly induced the association of both proteins to the promoter area surrounding the TIS. Upon TsA treatment also RNA polymerase II binding to the area surrounding the TIS (-318 to +52 bp) was increased and even initiated in the more distal promoter parts –1049 to –292 bp, which are negatively regulated in reporter gene assays. Interestingly histone H4 is already highly acetylated without TsA treatment and the acetylation status of H4 remains unchanged after histone deacetylase inhibition, indicating an open chromatin structure of the 5-LO gene in MM6 cells. In a cotransfection study with Sp1 and Sp3, the transactivating potential of factors was investigated and in accordance with the ChIP data, Sp1 and Sp3 increased the promoter activity, but only after TsA treatment. In gel shift assays, the influence of DNA methylation on Sp1 binding was investigated. The results indicate different roles for the three proximal promoter sites. Whereas Sp1 binding to the 5-fold GC box and GC4 is impaired by DNA methylation, binding to GC5 is even increased. A cotransfection study with methylated 5-LO promoter constructs and the murine methyl-CpG binding proteins suggest MBD1 involvement in the regulation of the 5-LO promoter. Since in gel shifts Sp1 binding is inhibited by DNA methylation, at least to the 5-fold GC box and the activating element GC4, and similarly the mutation/deletion of the same sites strongly reduces or inhibits promoter activity, it is likely to assume, that the loss of promoter activity after in vitro methylation is in the first place due to impaired Sp1/Sp3 binding. Together the data underline the importance and complexity of Sp1/Sp3 binding to the GC rich sites in the regulation of 5-LO promoter activity in response to the histone deacetylase inhibitor TsA as well as in respect to DNA methylation.
Das Ziel dieser Arbeit war, Unterschiede bezüglich der Körperbautypen an Elitekarateka zu eruieren. Hierzu wurden die Konstitutionstypologien nach Conrad, Knußmann, Parnell sowie Heath und Carter, Proportionsfiguren, und das Phantom stratagem verwendet, ebenso wie die Hautfettfalten-Dickenmessungen, die Bioelektrische-Impedanz-Analyse (BIA) und der Body-Mass-Index (BMI). Unter der Annahme Großmeisters Funakoshis, dass es durch ständiges Karatetraining zu körperbaulichen Konstitutionstypusänderungen kommt, wurde diese sportanthropologische Studie durchgeführt. Es sollte geklärt werden, ob innerhalb der Karatewettkampfdisziplinen Kata und Kumite unterschiedliche Körperbautypen, unter Einbeziehung des Sexualdimorphismus, zu finden sind. Die 80 untersuchten männlichen und weiblichen Karateka kamen aus den Disziplinen Kata (Schattenboxen) und Kumite (Freikampf). Im Vergleich dazu wurden 62 und 66 Breitensportkarateka als Kontrollgruppe gegenübergestellt. Das Vergleichskollektiv wurde aus zwei Fitnessstudios rekrutiert, in denen die Probanden 2 - 4 mal pro Woche trainierten. Die Messungen wurden unter standardisierten Bedingungen vom Verfasser dieser Arbeit (und einer Kollegin) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden statistisch geprüft. Die Konstitutionstypognosen von Conrad, die durch die Betrachtungen der Somatocharts von Parnell bzw. Heath und Carter bestätigt wurden, zeigten Unterschiede der Leistungssportler gegenüber den Kontrollgruppen. Demnach ist der typische Kata- und Kumiteathlet kleiner und wiegt weniger als die Sportler des Vergleichskollektivs der Fitnessprobanden. Er ist athletischer gebaut und weist ein günstiges Verhältnis von aktiver und passiver Körpermasse auf. Des Weiteren sind innerhalb der Karatedisziplinen die Katasportler endomorpher als ihre Kollegen. Die Kumiteathleten nehmen mehr ektomorphe Positionen in den Somatocharts (Parnell, Heath und Carter) ein. Anhand der Ergebnisse lässt sich die ursprüngliche Vermutung Funakoshis nach differenzierten Konstitutionstypen sowohl für die beiden Untersuchungskollektive als auch innerhalb des Karate für die Wettkampfdisziplinen Kata und Kumite bestätigen. Die vorliegende Studie lässt den Schluss zu, dass es sowohl den Kata- als auch den Kumite-Konstitutionstypus im Karate gibt. Weiterer Forschungsbedarf besteht hinsichtlich longitudinaler Datenerhebungen des Konstitutionswandels jugendlicher Karateka im Laufe ihrer Wettkampfkarriere. Die Karriere beeinflussende Faktoren wie Trainingshäufigkeit, „Trainingsalter“ und Verletzungshäufigkeit, bezogen auf das Leistungsniveau, lassen Spielraum für weiterführende Untersuchungen. Dies gilt auch für eventuelle ethnische Körperbauunterschiede und das Leistungsniveau der Athleten.
Die vorliegende prospektive Studie untersucht 66 retrograde und 4 antegrade geschlossene Marknagelungen bei Humerusschaftfrakturen mit einem ab dem 22. Patienten modifizierten Russell-Taylor-Nagel in einem Untersuchungszeitraum von 5 Jahren (1995 bis 2000). Behandelt wurden 52 frische Verletzungen, davon 2 offene Frakturen, 17 pathologische Frakturen und eine verzögerte Knochenbruchheilung. Nach der AO-Klassifikation waren außer C2 und C3 Frakturen alle Frakturtypen vertreten. Das durchschnittliche Patientenalter betrug 54 Jahre. Als schwerwiegendste intraoperative Komplikation sahen wir in 4 Fällen (5,7%) eine iatrogene Humerusfraktur, die eine zusätzliche Plattenosteosynthese erforderte. 6 distale Fissuren bedurften keiner weiteren Therapie. Eine posttraumatische Osteitis trat in keinem Fall auf. Ein Verfahrenswechsel war nicht notwendig. Bei 88% der Patienten ergab sich nach einem Jahr ein Punktestand von gut oder sehr gut nach dem Score nach Kwasny, wo neben der klinischen und radiologischen Untersuchung auch subjektive Befunde und die Kosmetik miteinbezogen wurden. Zusammenfassend beurteilen wir den von retrograd eingebrachten Russell-Taylor-Nagel mit seiner von uns vorgenommenen Modifizierung als ein geeignetes Implantat zur Stabilisierung von Humerusschaftfrakturen. Wesentliche Komplikationen des Verfahrens können unter Beachtung bestimmter technischer Regeln vermieden werden.
Der mitochondriale Apoptose-Signalübertragungsweg spielt nicht nur bei der Death Rezeptor-induzierten Apoptose in Typ II-Zellen eine Rolle, sondern z.B. auch bei Bestrahlung und Behandlung mit Chemotherapeutika. Über Cytochrom-c Freisetzung, Apoptosombildung und Caspase-9 Aktivierung kommt es zur Spaltung und Aktivierung der Effektorcaspase-3. Die durch Bindung von dATP und zytosolischem Cyt-c induzierte Konformationsänderung von APAF-1 führt nach anschließender ATP-Hydrolyse zur Oligomerisierung von insgesamt sieben APAF-1-Molekülen unter gleichzeitiger Rekrutierung von Caspase-9 über die in beiden Molekülen vorhandene N-terminale Caspase-Rekrutierungsdomänen (CARD). Es entsteht der so genannte Apoptosomkomplex. Die autoproteolytische Prozessierung und Aktivierung von Caspase-9 mit anschließender Spaltung von Caspase-3 im Apoptosomkomplex führt zum Auslösen der apoptotischen Caspasekaskade und zur Spaltung wichtige zellulärer Substrate. Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Apoptosom-vermittelten Caspase-9-Aktivierung spielen u.a. die Mitglieder der Bcl-2 Proteinfamilie, die IAPs und Hitzeschockproteine. Die Blockade des intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweges führt in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Chemo- und Strahlentherapie. Deshalb wurde mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid Systems ein Screen nach neuen regulatorischen Proteinen, die an der Apoptosomkomplex-Bildung beteiligt sind, durchgeführt und dabei ein neuer APAF-1 Interaktionspartner entdeckt, den wir CABY („CED-4 and APAF-1 binding protein found in yeast“) genannt haben. CABY ist ein 160 Aminosäuren großes, pro-apoptotisches Protein, das eine so genannte DUF59 Domäne enthält, für die bisher noch keine Funktion beschrieben wurde. Es konnte nachgewiesen werden, daß CABY ein evolutionär hoch konserviertes Protein darstellt und daß die humane CABY cDNA zwei alternative Translations-Initiationsregionen enthält, die zu der Expression der CABYL bzw. der um 32 Aminosäuren verkürzten CABYS Isoformen führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte darüber hinaus eine detaillierte molekulare und funktionelle Analyse von CABY durchgeführt werden. Als Hilfsmittel für die molekularbiologische Analyse wurden sowohl CABY-spezifische polyklonale Antiseren als auch Hybridoma-Zelllinien hergestellt, die monoklonale anti-CABY Antikörper produzieren. Mit biochemischen Untersuchungen wie in vitro GST Pulldown und in vivo Ko-Immunpräzipitationsexperimenten, sowie durch Ko-Lokalisationsstudien mit überexprimierten und endogenen Proteinmengen konnte die Bindung von CABY an APAF-1 verifiziert werden. Mit Hilfe von APAF-1-Deletionsmutanten wurden die Aminosäuren 412-420 der zentralen Linkerdomäne als verantwortlicher Bereich für die Interaktion mit CABY identifiziert. Interessanterweise bindet CABY in vitro zusätzlich sowohl an die N-terminale CARD Domäne von APAF-1 als auch an Pro-Caspase-9. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit endogenen Proteinen konnten zeigen, daß CABY in gesunden Zellen nicht nur mit dem vollständigen APAF-1 Protein, sondern auch mit der verkürzten 84 kDa großen APAF-1-Isoform in einem Komplex assoziiert vorliegt. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß CABY-Proteine homophile Interaktionen eingehen und Dimere ausbilden können. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CABY mit APAF-1 wurden auch funktionelle Analysen mit Hilfe dominant negativer CABY Deletionsmutanten sowie mit siRNA Zellkulturexperimenten durchgeführt, um die Bedeutung von CABY für den intrinsischen mitochondrialen Apoptose Signalübertragungsweg untersuchen zu können. Es wurde festgestellt, daß bei Überexpression von CABY die Zellen für Mitomycin C-induzierte Apoptose sensitisiert werden. Die Überexpression einer C-terminal um 20 Aminosäuren deletierten CABY Mutante wie auch der N-terminal verkürzten CABYS Isoform inhibieren jedoch Mitomycin C-induzierte Apoptose. Die Ergebnisse aus CABY siRNA-Knockdown-Experimenten lassen vermuten, daß CABY-ähnliche funktionell redundante Proteine existieren. In den mit CABY siRNA stabil transfizierten K562- und RKO-Zelllinien konnte festgestellt werden, daß der Verlust endogener CABY-Expression in diesen Zelllinien nur einen geringen Einfluss auf das Apoptoseverhalten ausübt, und zwar unabhängig von der Art des eingesetzten apoptotischen Stimulus. Einen Hinweis auf einen möglichen kompensatorischen Mechanismus liefert die Existenz des ribosomalen Proteins S28e, dessen DUF59-Domäne zu über 90% identisch ist mit der CABY-DUF59-Domäne. S28e könnte potentiell CABY-Funktionen ausüben. Ausgehend von mit der pro-apoptotischen Funktion von CABY wurde nach Tumortypen gesucht, in denen die CABY-Expression im Vergleich zum Normalgewebe signifikant herunterreguliert wird. Die Analyse endogener CABY Expressionsmengen in humanen Tumoren konnte dabei einen Verlust an CABY Expression in GIST-Tumoren nachweisen. Dieses Ergebnis weist auf eine mögliche Rolle von CABY als Tumorsuppressorprotein hin.
Reinigung, biochemische Charakterisierung und Struktur der A1AO-ATPase aus Methanococcus jannaschii
(2006)
Die A1AO-ATPase wurde aus Membranen von M. jannaschii unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, eine Anionenaustauschchromato-graphie an DEAE und eine Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. Alle 9 aus der Operon-Struktur vorhergesagten Untereinheiten konnten mittels Western-Blot-Analyse oder einer N-terminalen Sequenzierung identifiziert werden. Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD nachgewiesen. Das gereinigte Enzym hatte eine Masse von 670 kDa. Die ATP-Hydrolyseaktivität war bei einer Temperatur von 80°C und einem pH-Wert von 6 optimal. Der KM-Wert für MgATP wurde zu 1,2±0,2 mM bestimmt. Bei den Versuchen zur Entwicklung eines Na+-freien Tespuffers trat die strikte Abhängikeit des Enzyms von Hydrogensulfit oder Sulfit als Problem zu Tage. Aus Membranen von M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, aus denen dann Liposomen hergestellt wurden. Die A1AO-ATPase aus M. jannaschii wurde in diese Liposomen erfolgreich rekonstituiert, eine ATP-Synthese konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die elektronenmikroskopischen Analysen zeigten einen für ATPasen charakteristischen Aufbau, aus einer hydrophilen Domäne, die durch mindestens zwei Stiele mit der Membrandomäne verbunden ist. Anhand der Bildrekonstruktion von 17.238 Einzelpartikeln konnten zwei Klassen von ATPase-Molekülen unterschieden werden, die entweder über einen oder zwei periphere Stiele verfügten. Aus verschiedenen Einzelprojektionen wurden Summenbilder generiert, anhand dieser 2D- Rekonstruktion wurde die ATPase vermessen. Der Kopfteil, die Membrandomäne und der zentrale Stiel haben eine Größe von 11,5 x 9,4 nm, 10,6 x 6,4 nm und 8 x 3,9 nm (Länge x Breite). Die Gesamtlänge des Enzyms betrug 25,9 nm. Der zentrale Stiel der ATPase ist über der Membran von einer Kragen-ähnlichen Struktur umgeben, die wiederum mit den peripheren Stielen in Kontakt steht. Scheinbar steht nur einer der peripheren Stiele in direktem Kontakt mit der AO-Domäne. Die Überlagerung der 3D-Rekonstruktion eines A1-Subkomplexes aus Methanosarcina mazei mit der 2D-Rekonstruktion der A1AO-ATPase aus M. jannaschii zeigen deutlich, dass die peripheren Stiele mit dem oberen Ende der A1-Domäne in Kontakt stehen. Durch diese Analysen konnte erstmals die Struktur einer A1AO-ATPase mit einer Auflösung von 1,8 nm dargestellt werden. Sequenzanalysen haben gezeigt, dass das Proteolipid-Gen von Methanopyrus kandleri verdreizehnfacht ist. Das Gen wurde mittels PCR vervielfacht und in einen TOPO®-Vektor kloniert. Versuche das Gen in einen Expressionsvektor umzuklonieren, waren noch nicht erfolgreich.