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Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und der Einkristallzüchtung der beiden Spin-Leiter-Verbindungen SrCu203 und Sr2Cu3O5 unter hohem Druck. Zunächst wird in einer Reihe von Versuchen ein geeignetes Tiegelmaterial ermittelt. Dabei stellen sich eine Doppeltiegelkonstuktion mit einem einkristallinen Magnesiumoxid-Innentiegel und einem verschweißbaren äußeren Platintiegel als beste Materialkombination heraus. Die Standzeit eines Versuchs lässt sich hiermit von den in der Literatur üblichen 30 Minuten um das 50 bis 100-fache verlängern. Durch Verwendung dieser Tiegelkombination können erstmals Züchtungsexperimente von SrCu203 und Sr2Cu305 aus der Schmelze erfolgreich durchgeführt werden. Für beide Zusammensetzungen konnten Kristalle mit Kantenlängen bis zu 2 mm hergestellt werden. Die besten Wachstumsbedingungen für SrCu203 liegen zwischen 3 und 5 GPa und zwischen 1400°C und etwa 1200°C. Diese Bedingungen wurden für stöchiometrische und auf etwa 70% Cu0 erhöhte Einwaagenzusammensetzungen ermittelt. Für Sr2Cu305 gelten ähnliche Züchtungsparameter. Durch die Züchtungsexperimente wurden neue Phasen, wie eine unbekannte Modifikation von Sr2Cu305 und eine nicht näher identifizierte ,243'-Phase gefunden. Das Auftreten der Fremdphase Sr2Cu02(C03) war zunächst überraschend und klärte sich durch den Herstellungsprozess der MgO-Einkristalle auf. Der Einbau des aus dem Tiegel stammenden gelösten Magnesiums wird in der die Cu203-Schichten trennenden Strontiumschicht erwartet. Damit erlangt es keine Wirkung auf die Spin-Leiter-typischen Effekte. Durch zahlreiche Messungen mit wellenlängendispersiver Röntgenanalyse am Rasterelektronenmikroskop wurden die maßgeblichen Reaktionswege aufgeklärt und die besten Wachtumsbedingungen sowie die Fremdphasenreaktionen ermittelt. Die Ergebnisse der Raman- und IR-Spektroskopie bestätigen das Auftreten der Struktur- beziehungsweise verbindungstypischen 2-Magnonen- und 2-Magnonplus-Phonon-Quasiteilchen. Durch Polarisationsmikroskopie und optische Transmissionsuntersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei den Proben um Einkristalle handelt. Die thermische Ausdehnung zeigt eine deutliche Anisotropie. Die Achsen in a- und b-Richtung besitzen niedrige und von der C-Richtung deutliche verschiedene lineare Ausdehnungskoeffizienten.
The present work wishes to contribute with information on two members of the primary active transporter group, which differ both in structure and function: Wilson Disease Protein which uses the energy released by ATP hydrolysis to transport copper across cell membranes, and Proteorhodopsin, which uses the energy of light to build up a proton gradient across the bacterial cell membrane, both heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. The surface detection experiments using HA-tagged WNDP confirm the proposed topology of WNDP. The HA-tag per se does not interfere with the function of WNDP, as shown for WNDP HA56 by ATP-dependent phosphorylation after expression in Sf9 cells. Sequence modifications within the WNDP HA56 template-construct reveal some interesting features: i) the N-terminal domain, which contains the 6 metal binding sites, is not necessary for plasma membrane targeting; ii) elevated surface expression of WNDP was observed when the carboxy terminus containing the tri-Leu motif is missing, which suggests that this motif might be involved in the retrieval of the protein from the plasma membrane; iii) the mutations TGE>AAA (proposed to lock the protein in the E1 conformation and lead to constitutive plasma membrane localisation) and D1027A (phosphorylation deficient) did not interfere with the surface localisation of the protein; iv) the mutations CPC>SPS (copper transport deficient) and H1069Q (phosphorylation deficient, most common mutation in Wilson Disease) reduced plasma membrane expression to less then 50%. Western blot analysis shows that the overall expression level of all constructs is similar to that of the reference construct WNDP HA56. These findings suggest that motifs involved in copper binding and catalytic activity do not interfere with plasma membrane targeting of WNDP in Xenopus oocytes. However, the H1069Q mutation could interfere with the distribution of WNDP protein within the cells. In the case of Proteorhodopsin, data presented in this work support earlier observations according to which proteorhodopsin can operate as an outwardly and inwardly directed light-driven ion pump. The residues proposed to play the roles of proton donor (E108) and acceptor (D97) are important for proton translocation. In the absence of an anionic residue at position 97 no outward pumping takes place, but inward charge translocation may occurs under appropriate conditions. An M-like state similar to that known from BR detectably accumulates under neutral pH conditions or under conditions where reprotonation of the Schiff base from the cytoplasmic side is slowed down, as in case of the mutants at position 108. Under acidic conditions PR pumps inwardly under the concerted action of pH and transmembrane potential. The experiments performed in parallel with PR and BR wild-types brought not only interesting information about similarities and differences between the two retinylidene ion pumps, but also led to the observation that the life-time of the M state in BR wild-type can be extended in addition to hyperpolarising transmembrane potentials also by extracellular acidic pH, when the proton gradient through the cell membrane is directed opposite to the ion transport (i.e. when the electrochemical gradient opposing the direction of proton transport increases). Direct photocurrent measurements of HA-tagged PR and BR have shown that the inserted tag may interfere with the functionality of the protein. Next to E108 and D97 in PR other residues in the vicinity of the retinal binding pocket contribute to the translocation of protons, as exemplified by the mutant L105Q: additionally to changing the absorption maximum of the protein, this mutant is a less effective proton pump than the wild type. The example of PR suggests that transduction of light energy by – and reaction mechanisms of retinylidene ion pumps have not been entirely deciphered by the extensive studies of bacteriorhodopsin.
Zielsetzung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse der Hirndruckpulsamplitude (ICPAmpl.) als neuen Parameter zur Bestimmung einer für den cerebralen Perfusionsdruck optimalen Oberkörperlagerung. Unter normalen klinischen Konditionen bleiben die die ICPAmpl. bestimmenden Faktoren – Compliance und Herzschlagvolumen – konstant. Daher ist es durch die Untersuchung der ICPAmpl. möglich, Rückschlüsse auf den cerebrovaskulären Gefäßwiderstand (CVR) und damit den cerebralen Perfusionsdruck (CPP) zu ziehen. Methoden Bei 40 neurochirurgischen Patienten wurden prospektiv Alter, Geschlecht, Erkrankung, Glasgow-Coma-Scale, Ort der Hirndrucksonde und die Beatmungsparameter untersucht. Die Veränderungen des intrakraniellen Drucks (ICP), des cerebralen Perfusionsdrucks (CPP), des mittleren arteriellen Drucks (MAP) sowie der Hirndruckpulsamplitude (ICPAmpl.) wurden bei Oberkörperlagerungen von 0°, 30°, 60°, 30°, 0° gemessen und analysiert. Ergebnisse Insgesamt 36 Probanden erfüllten die Studienbedingungen (n=36), aufgeteilt in 21 Frauen und 15 Männer. Das mittlere Alter betrug 55,5 Jahre (± 2,58). Der Glasgow-Coma-Scale-Wert betrug bei allen eingeschlossenen Patienten 3. Bei dem Vergleich der Messwerte von 0°- und 60°-Oberkörperlagerung zeigte sich eine signifikante Verbesserung des ICP (p<0,001), eine Zunahme der ICPAmpl. (p<0,001), eine Verschlechterung des CPP (p<0,001) sowie eine Reduktion des MAP (p<0,001). Schlussfolgerung Die aus den gemessenen Daten einer liegenden Hirndrucksonde relativ einfach bestimmbare ICPAmpl. lässt wichtige Rückschlüsse auf den cerebralen Vasomotorentonus zu. Bisher war jedoch unklar, ob es einen Zusammenhang zwischen der ICPAmpl. und dem CPP gibt, der für die klinische Routine einer Intensivstation nutzbar ist. Diese signifikante Beziehung der beiden Parameter konnten wir finden und darstellen. Unter der Kenntnis der negativen Korrelation zwischen ICPAmpl. und CPP und da sich die ICPAmpl. bei erhaltenem Vasomotorentonus der cerebralen Arteriolen im Vergleich zu den anderen Parametern (ICP, CPP, MAP) gegensätzlich verhält, sollte sie bei der für den CPP optimalen Oberkörperlagerung möglichst gering sein. Wir konnten in Gegenüberstellung der einzelnen Messwerte bei Lagerung von 0°, 30°, 60°, 30°, 0° den kleinsten Mittelwert der ICPAmpl. bei jeweils 30° finden. Somit scheint uns unter den gemessenen Positionen diese Oberkörperlagerung ein guter Kompromiss zwischen einerseits hohem CPP bei erhaltener cerebraler Autoregulation und andererseits niedrigerem ICP zu sein. Da wir wissen, dass zur Vermeidung von sekundären Hirnschäden eine Konstanthaltung des cerebralen Blutflusses (CBF) von Bedeutung ist, bedingt dies eine erhaltene cerebrale Autoregulation. Bei erschöpftem cerebralen Vasomotorentonus kann eine Erhöhung des CPP unter anderem eine Hyperämie, ein vasogenes Ödem und damit eine sekundäre ICP-Anhebung – mit allen daraus resultierenden Komplikationen – triggern. Deshalb wird die regelmäßige, patientenspezifische Suche nach der Grenze zwischen adäquatem und nicht mehr adäquatem CPP gefordert. Die Position der Oberkörperlagerung ist ein denkbar einfach durchzuführender, kostenneutraler und trotzdem bedeutsamer Therapieaspekt in der neurochirurgischen Intensivmedizin. Auf der Suche nach der optimalen, patientenspezifischen Lagerung könnte sich daher in der klinischen Routine eine einfache, komplikationsarme Messung etablieren. Da wir zeigen konnten, dass eine zunehmende ICPAmpl. mit einem abnehmenden CPP verknüpft ist, könnte die im Vergleich der einzelnen Werte niedrigste ICPAmpl. somit einen wichtigen Beitrag zur optimalen, individuellen Oberkörperlagerung leisten.
Hintergrund: Die elektrische Stimulation des Hörnerven durch Cochlea Implantate ist eine mittlerweile weit verbreitete und effiziente Therapiemöglichkeit für Patienten mit profunder sensorineuraler Schwerhörigkeit. Nach entsprechender Adaptationszeit ermöglicht das Cochlea Implantat ein ausreichendes Sprachverständnis in Ruhe. In alltäglichen Situationen, die meist durch das Vorhandensein von Hintergrundgeräuschen gekennzeichnet sind, ist das Sprachverstehen jedoch mangelhaft. Hier liegt die Schwäche von Cochlea Implantaten. Da immer mehr Patienten mit signifikantem Restgehör cochlea-implantiert werden, stellte sich die Frage des Nutzen dieses Restgehörs – welches bei herkömmlichen Implantationen zumeist verloren geht. Die hier vorgestellte Methode der kombinierten elektrisch-akustischen Stimulation kombiniert akustisches Resthörvermögen im Tieffrequenzbereich und Cochlea Implantat auf dem ipsilateralen Ohr. Diese Methode setzt somit einen Erhalt des Resthörvermögens auf dem implantierten Ohr voraus. Ziel dieser Disseration: Das primäre Ziel dieser Dissertation war die Evaluation der Sprachdiskriminationsleistungen von Patienten, die mit der elektrischakustischen Stimulation ipsi- als auch kontralateral versorgt wurden. Außerdem sollten die chirurgischen und audiologischen Daten des Restgehörerhaltes ausgewertet werden. Patienten: Insgesamt wurden an der Frankfurter HNO Universitätsklinik 23 Patienten mit signifikantem Restgehör für die elektrisch-akustische Stimulation implantiert und in die Datenanalyse dieser Dissertation inkludiert. Als Indikationsbereich für die elektrisch-akustische Stimulation war ein Hörverlust von <= 65 dB HL in mindestens zwei Frequenzen im Tieffrequenzbereich (< 1.000 Hz), ein Hörverlust von > 65 dB HL bei 1.000 Hz und >= 75 dB HL in den hohen Frequenzen über 1.000 Hz zu sehen. Das Einsilberverständnis vor der Operation sollte bei <= 45% bei Umgangstonlautstärke liegen. Methodik: Um die Chancen für den Hörerhalt zu erhöhen, wurden limitierte Elektrodeninsertionen mit der Insertionstiefe von nur 360 Grad angestrebt. Der Erhalt von Tieftonrestgehör wurde mittels reintonaudiometrischen Messungen kontrolliert. Das Sprachverständnis der Patienten wurde mittels Freiburger Einsilbertest in Ruhe und mittels des HSM Satztestes ohne und mit Hintergrundrauschen zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Alle Messungen wurden unter rein akustischen Bedingungen, nur mit Cochlea Implantat und mit der Kombination von elektrischer und akustischer Stimulation (ipsilateral und kontralateral) durchgeführt. Ausgewertet und verglichen wurden die präoperativen Ergebnisse mit den ersten postoperativen Ergebnissen sowie den aktuellsten Messergebnissen. Ergebnisse: Bei 26% der Patienten wurde ein kompletter Erhalt des Restgehörs trotz Implantation erreicht. Partiell konnte bei 65% der Patienten das Restgehör geschont werden. Neun Prozent ertaubten durch die Implantation. Fünf weitere Patienten mit zunächst partiellem Hörerhalt (33,3 %) ertaubten im weiteren zeitlichen Verlauf. Insgesamt zeigte sich in den Sprachverständnistests eine Überlegenheit der simultanen elektrischen und akustischen Stimulation gegenüber der alleinigen elektrischen Stimulation. Dies machte sich vor allem im Störschall bemerkbar. Patienten die durch die Implantation ertaubten oder im zeitlichen Verlauf danach ihr Restgehör verloren, konnten durch das Cochlea Implantat alleine überdurchschnittliche Sprachdiskiminationswerte verzeichnen und diese durch die zusätzliche kontralaterale Hörgeräte-Nutzung nochmals verbessern. Schlussfolgerungen: Insgesamt konnte in dieser Dissertation gezeigt werden, dass der chirurgische Erhalt von Tieftonrestgehör durch die hier angewandte Implantationsmethode gut realisiert werden kann. Alle bimodal versorgte Patienten (ipsilateral und kontralateral) zeigten bezüglich des Sprachverstehens einen deutlichen Benefit von der zusätzlichen akustischen Stimulation. Dieser Benefit machte sich besonders in alltäglichen Hörsituationen mit Hintergrundrauschen bemerkbar. Demnach ist der Erhalt von signifikantem Tieftonrestgehör bei sorgfältig selektieren Patienten immer anzustreben, um durch die simultane ipsilaterale akustische und elektrische Stimulation ein bestmögliches Sprachverständnis zu ermöglichen.
In der vorliegenden Untersuchung sollte geklärt werden, inwieweit sich Veränderungen des Vokaltraktes nach der Eingliederung neuer Totalprothesen auf die /s/-Lautbildung auswirken und ob in einem Untersuchungszeitraum von 8 Wochen eine Rückkehr zur gewohnten Lautbildung stattfindet. Hierzu wurden Sprechproben mit Hilfe von zwei Testsätzen von 35 Patienten der klinischen Behandlungskurse der Zahnersatzkunde der Poliklinik für Zahnärztliche Prothetik über die Soundkarte eines Computers direkt aufgezeichnet. Zunächst wurden Aufnahmen mit der „alten“ Prothese angefertigt. Die Nachuntersuchungen wurden direkt nach Eingliederung der „neuen“ Prothesen sowie 2 beziehungsweise 8 Wochen später durchgeführt. Zu dem letzten Untersuchungstermin wurden noch 19 Probanden vorstellig. Aus den so gewonnenen Datensätzen wurden 4 /s/-Laute („s“ aus „Eisen“[= /z/ im IPA], „ß“ aus „heiß“ [=/s/ im IPA], „z“ aus „Holz“ [= /ts/ im IPA] und „sch“ aus „Unterschied“ [= /../ im IPA]) ausgewählt und der instrumentalphonetischen Analyse zugeführt. Mit Hilfe der Sprachanalysesoftware PRAAT (Amsterdam) wurde der Center of Gravity des jeweiligen Lautes errechnet und in eine Excel-Tabelle zur statistischen Auswertung übertragen. Des Weiteren wurden subjektive Einschätzungen der Sprachqualität durch die Probanden selbst zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten in Form von visuellen Analogskalen (VAS) erhoben und ebenfalls statistisch ausgewertet. Nach Auswertung der gewonnenen Daten stellte sich heraus, dass die stärkste relative Veränderung bezüglich der mittleren Frequenz zum Zeitpunkt der Eingliederung der „neuen“ Prothese im Bereich des stimmhaften „s“ (= /z/ nach IPA) zu finden waren. Die Veränderungen waren jedoch aufgrund der großen Schwankungen der Messwerte statistisch nicht signifikant. Signifikante Veränderungen konnten nur zwischen der „alten“ Prothese im Vergleich mit der „neuen“ Prothese in der 2. und 8. Woche nach Eingliederung bei den Messungen des /s/ aus „heiß“ und des /ts/ aus „Holz“ festgestellt werden. Die visuelle Analogskala (VAS) ergab signifikant höhere Werte (schlechtere Sprache) für die „neue“ Prothese direkt nach Eingliederung im Vergleich zur „alten“ Prothese. Nach 8 Wochen kehrten die Werte der VAS auf das Ausgangslevel zurück, obwohl zu diesem Zeitpunkt signifikante Veränderungen der Sprache nachweisbar waren. Daraus folgt, dass eine Beurteilung der Sprache direkt nach Eingliederung einer neuen Totalprothese nur sehr begrenzt möglich ist. Auch führt nicht jeder messtechnisch nachweisbare Unterschied der /s/-Lautbildung zu einer Unzufriedenheit des Patienten.
Nach Implantation einer Totalendoprothese kommt es zu einer veränderten Krafteinleitung in das Femur und zu Knochenumbauprozessen ( Bone Remodeling ). Viele Faktoren, wie z. B: Geschlecht, Alter, Gewicht, Knochenqualität, Design beeinflussen die Menge des Remodelings. Hauptursache des postoperativen Knochendichteverlustes ist jedoch das sogenannte Stress Shielding. Aufgrund der veränderten Krafteinleitung kann es zu proximaler Atrophie und zu distaler Hypertrophie kommen. Dank ihrer hohen Präzision und Reproduzierbarkeit bietet sich die DEXA Technik an, um periprothetische Knochendichteänderungen zu untersuchen. In der vorliegenden Studie wurden osteodensitometrische Untersuchungen des proximalen Femurs nach Implantation einer zementfreien anatomischen CTX-Prothese gemacht. Die Studie umfasste 34 zufällig ausgewählte PatientInnen. Die CTX-Prothese ist aus einer Titanlegierung gefertigt und zeichnet sich durch ihre Antetorsion und ihre relativ kurze Länge aus. Sie ist zu 85 % Hydroxyapatit beschichtet, wobei die Spitze frei ist. Die periprothetische Knochendichtemessungen begannen in der ersten Woche postoperativ und erfolgten dann im Abstand von je 2 Monaten im ersten halben Jahr. Die Abschlussuntersuchung erfolgte 1 Jahr nach der Operation. Die BMD wurde in 7 ROI´s ( Region of interest ) nach Gruen gemessen. Es wurden Doppelmessungen durchgeführt und das arithmetische Mittel für die Statistik verwendet. Postoperativ und nach einem Jahr wurden ebenfalls die LWS und die kontralaterale Hüfte mitgemessen. Während des ersten Jahres nach der Implantaion der CTX-Prothese kam es vor allem im proximalen Teil zu Knochenatrophie, welche sich hauptsächlich im Calcarbereich zeigte ( - 22.3 % nach einem Jahr ). Im mittleren Teil der Prothese wurde nur lateral eine Atrophie von bis zu – 2,7 % gefunden. Medial war während des ganzen Jahres keine statistisch Signifikante Änderung zu beobachten. Im distalen Drittel kam es zu einer leichten Hypertrohie von bis zu + 1,70 %. Die gesamte periprothetische Dichte zeigte jedoch keine Veränderung, so dass man annahmen kann, dass sich proximale Atrophie und distale Hypertrophie kompensieren. Als Ursache des proximalen Verlustes ist das sogenannte Stress shielding aufgrund der fehlenden Krafteinleitung und der postoperativen Entlastungsphase zu nennen. Die distale Zunahme lässt sich mit ungünstiger Krafteinleitung erklären. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen dem T-Score der Lendenwirbelsäule, als Mass der systemischen Mineralisierung, bzw. dem T-Score der kontralateralen Hüfte, als Mass für den peripheren Mineralisierungsgrad, und der periprothetischen Knochendichteänderung. Die Korrelation bestand hauptsächlich in ROI 7, das auch die grösste Abnahme erfuhr. Die anderen Korrelationskoeffizienten waren insgesamt schwächer ausgebildet oder sogar negativ. Patienten mit einem T-Score > 0 an der Wirbelsäule zeigten einen geringeren periprothetischen Dichteverlust als Patienten mit einem T-Score < 0: - 14,3 % im Gegensatz zu – 24,6 % in ROI 7. Bei Patienten mit Werten < - 2,5 SD war der Verlust sogar noch grösser: bis zu – 40 % der ursprünglichen Knochendichte. Daraus lässt sich schliessen, dass fester Knochen wesentlich stabiler und ausgeglichener auf eine Prothesenimplantation reagiert als osteopenischer Knochen. Der Vergleich mit Daten nach implantierter Geradschaftprothese (PPF) zeigte praktisch keinen Unterschied des periprothteischen Knochenverlustes in den verschiedenen ROI´s. Es zeigt sich lediglich eine geringere distale Hypertrophie während des ersten postoperativen Jahres. Somit weist ein anatomisch-adaptierter CTX-Schaft weder Schutz vor Verlust der Knochendichte auf noch kommt es zu einer Verhinderung des „stess shieldings“. Über den Langzeitverlauf der CTX-Prothese lässt sich zum jetzigen Zeitpunkt noch keine Aussage machen. Ebenso bleibt abzuwarten welchen Stellenwert die Bisphosphonate in der Therapie der Hüftendoprothetik haben werden.
Apoptose ist für grundlegende Prozesse des Lebens wie die Embryonalentwicklung und die Infektabwehr unentbehrlich. Defekte im Apoptoseprozess haben ernste Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Folge. Ein charakteristisches Kennzeichen von Krebszellen ist deren Apoptoseresistenz, die verhindert, dass Krebszellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Die Tumorzellen reagieren im allgemeine nicht mehr auf Zelltod-Signale, die z. B. bei Nähr- und Sauerstoffmangel oder einem Angriff durch Effektorzellen des Immnunsystems empfangen werden. Ein wesentlicher Grund dafür sind Mutationen im Signalweg der Apoptose. Häufig wird in Tumoren die Überaktivierung von antiapoptotischen Proteinen beobachtet. Die Aufklärung der Apoptose-Signalwege und die Charakterisierung der ihnen zu Grunde liegenden molekularen Interaktionsmechanismen sind wichtig für die Erklärung der Pathogenesse vieler Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, neue anti-apoptotische Proteine zu identifizieren, die als Targets zur Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien benutzt werden können. Ein wichtiger Bestandteil des Apoptoseweges ist das Mitochondrium. Ausgangspunkt für den mitochondrialen oder intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweg ist die Freisetzung von Cytochrom c (Cyt c) und anderen apoptogenen Faktoren aus dem Mitochondrien. Zytoplasmatisches Cytochrom c bindet zusammen mit ATP oder dATP an das Adaptorprotein Apaf-1 und induziert daraufhin eine Konformationsänderung sowie die Oligomerisation von Apaf-1. Die Selbstassoziation von Apaf-1 führt zur zusätzlichen Rekrutierung von Caspase-9, die in diesem des sogenannten Apoptosomskomplexes durch die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration autokatalytisch aktiviert wird. Aktive Caspase-9 wiederum spaltet und aktiviert Effektorcaspasen wie Caspase-3, die zelluläre Targetproteine spalten und damit den Zelltod verursachen. Viele apoptotische Stimuli aktivieren den mitochondrialen Apoptoseweg. Defekte im intrinsischen Signalweg finden sich häufig im Tumoren und sind oft mit Resistenzen gegen apoptoseauslösende Krebstherapien assoziert. Anti-apoptotische Proteine, die mit dem apoptotischen Programm an dieser Stelle interferieren und in Tumoren überexprimiert werden, stellen attraktive Targets für Tumortherapien dar. In der Arbeitsgruppe von Dr. Martin Zörnig am Georg-Speyer-Haus wurde ein S. pombe Hefesystem etabliert, um in einem funktionellen „Survival-Screen“ neue anti-apoptotische Säugergene aus Tumor-cDNA-Banken zu identifizieren. Hefen können durch die Expression bestimmter pro-apoptotischer Säugerproteine abgetötet werden. Dieser Hefezelltod weist äusserliche Gemeinsamkeiten mit apoptotischen Zellen multizelluläre Organismen auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe dieses Screens tatsächlich anti-apoptosische Säugerproteine zu identifizieren, die den induzierten Hefezelltod inhibieren können. In einem Screen, bei dem das Apaf-1 Homolog in C.elegans, CED-4, als Killerprotein verwendet wurde, konnte unter anderem das Gen Aven isoliert werden, das nicht nur CED-4-induzierten Zelltod in Hefe, sondern auch Apaf-1/Casp-9-vermittelte Apoptose in Säugerzellen inhibiert. Dabei wurde ein unvollständiges ΔAven-cDNA-Plasmid isoliert, dem das 5´-Ende fehlte. Diese Verkürzung ist vermutlich auf ein vorzeitiges Abbrechen der cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase zurückzuführen. Die vollständige humane Aven cDNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. J. M. Hardwick (J. Hopkins University, Baltimore USA) bereitgestellt, zusammen mit zwei polyklonalen anti-Aven Antiseren. Die Antisera erkennen die N-terminalen Aminosäuren 98-112 (anti-Aven A) sowie am C-terminus aa 256-268 (anti-Aven B). In der AG Zörnig wurde ein zusätzliches Antiserum (anti-Aven C) gegen ein Peptid generiert, das die letzten 17 Aminosäuren des humanen und des Maus-Aven-Proteins erkennt. Aven wurde in der Gruppe von M. Hardwick als anti-apoptotisches Protein beschrieben, das an das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xL und Apaf-1 bindet (Chau et al., 2000). Aven wurde mit Hilfe eines „Hefe-2-Hybrid Screens“ mit Bcl-xL als Köder („bait“) isoliert. Es wurde publiziert, dass Aven die Apaf-1 Selbstassoziation (und damit Caspase-9-Aktivierung) verhindert. Das humane Aven Gen kodiert für insgesamt 362 Aminosäuren. Die Sequenz ist in zahlreichen Spezies hoch konserviert. Aven mRNA Expression wurde in vielen Geweben (Herz, Nieren, Pankreas, Testis und Skelet-Muskulatur) und in mehreren Zelllinien gefunden. Dies deutet auf eine ubiquitäre Expression hin. In der Zelle ist Aven hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Immunfluoreszenzanalysen der Arbeitsgruppe Hardwick zeigten zusätzlich eine schwache Expression des Proteins im Nukleus. In der Arbeitsgruppe Zörnig konnte gezeigt werden, dass die isolierte Deletionsmutante ΔAven (aa 180-362) CED-4-induzierten Zelltod in Hefen inhibiert (Doktorarbeit M.L. Brezniceanu, unpublizierte Daten). Eine anti-apoptotische Wirkung konnte für ΔAven zusätzlich im Säugersystem verifiziert werden. Durch Überexpressionsstudien eines ΔAven- GFP-Fusionskonstruktes wurde Apaf-1/Caspase-9-induzierte Apoptose in der humanen Kolonkarzinomzelllinie RKO inhibiert. Weitere Experimente zeigten, dass sich in Tumoren des Kolons, der Niere und der Schilddrüse erhöhte Aven mRNA-Mengen nachweisen lassen und dass Aven auf mRNA-Ebene während der Entwicklung der Brustdrüse reguliert wird (unpublizierte Daten). Im Rahmen dieser Arbeit wurde Aven biochemisch und genetisch näher charakterisiert. Dabei wurden sowohl das volle-Länge-Aven sowie die artifizielle ΔAven Deletionsmutante untersucht. Zunächst wurde ein Teil der publizierten Daten verifiziert. Beschrieben ist eine Bindung zwischen Aven und Bcl-xL, die durch die N-terminale Domäne von Aven (Aminosäure 74-108) vermittelt wird. ΔAven, das den N-Terminus nicht enthält, sollte daher nicht an Bcl-xL binden können. In einem Immunpräzipitations-Experiment mit dem anti-Aven B Antiserum wurde entsprechend einer Interaktion mit Bcl-xL nur für das volle-Länge-Aven-Protein, nicht aber für ΔAven nachgewiesen. Den Publizierten Daten zufolge bindet Aven mit den Aminosäuren 180 bis 300 an Apaf-1, und diese Interaktion konnte in einem weiteren Ko-Immunpräzipitations-Experiment bestätigt werden. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluß von Aven auf die Bildung des Apoptosoms zu untersuchen. Dafür wurden Apoptosom-Immunpräzipitations-Experimente mit 293T Zelllysaten etabliert, in denen man endogene Apaf-1/Caspase-9-Komplexe nachweisen konnte. Durch Zugabe von Cytochrom c und dATP direkt zu den Zelllysaten wurde die Bildung des Apoptosoms induziert, das anschließend mit einem monoklonalen anti-Caspase-9 Antiköper immunpräzipitiert werden konnte. Bei gleichzeitiger Überexpression von ΔAven wurde weniger Apaf-1 mit Caspase-9 ko-immunpräzipitiert, ein Hinweis darauf, dass die Apoptosombildung unterdrückt wurde. Das Ergebnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass Caspase-9-Spaltung und -Aktivierung durch ΔAven vermindert wurde. Interessanterweise konnte eine Überexpression des volle-Längen Aven-Proteins die Bildung des Apoptosoms nicht verhindert. Apaf-1 wurde wie bei den Lysaten nichttransfizierter Zellen mit Caspase-9 Ko-immunopräzipitiert, und die Caspase-9 Spaltprodukte p35 und p37, die bei Aktivierung des Apoptosoms entstehen, wurden unverändert detektiert. Bei den beschriebenen Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch eine Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 (und nicht nur an Apaf-1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der C-Terminus von Aven für die Bindung an Caspase-9 wichtig ist. Interessanterweise nahm die Bindung von ΔAven an Caspase-9 nach Apoptosominduktion ab, während kein Unterschied in der Bindung des vollständigen Aven-Proteins an Caspase-9 vor oder nach Apoptosominduktion beobachtet werden konnte. Wegen der Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 konnte mit diesen Experimenten nicht festgestellt werden, ob Aven bzw. ΔAven Teil des gebildeten Apoptosomkomplexes sind, d. h. ob sie auch nach Apoptosombildung an Apaf-1 binden. Eine Hemmung der Apoptosomsbildung führt zur Inhibierung der Caspase-Aktivierungskaskade und damit zu verringerter Caspase-3 Aktivität. Entsprechend wurde die Caspase-3-Aktivität nach in vitro Apoptosominduktion bei Überexpression von ΔAven inhibiert, während das volle-Länge Aven keinen Einfluß auf die Caspase-3-Aktivität hatte. In weiteren Verlauf des Projektes wurden funktionelle Apoptoseexperimente mit transfizierten RKO-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Protektion durch Aven und ΔAven nach Staurosporin- und UV- Behandlungen. Dabei zeigte ΔAven einen stärkeren anti-apoptotischen Effekt als das volle-Länge-Aven in vivo. Die Tatsache, dass ΔAven ein höheres anti-apoptotisches Potential als das volle-Länge-Aven-Protein aufweist, deutet auf eine mögliche Spaltung oder Konformationsänderung von Aven in vivo hin, die zur Entstehung eines aktiven anti-apoptotischen C-terminalen Proteins führt. Um dies nachzuweisen, wurden einzel- und doppel-getaggte Fusionskonstrukte kloniert. Western Blot Analysen mit dem anti-Aven B Antiserum zeigten zusätzlich zu der volle-Längen-Aven- Bande (50 kDa) eine kleinere immunreaktive Bande mit einer Größe von ca. 35 kDa. Nach Apoptoseinduktion nahm die relative Menge dieser kleineren Bande zu. Das 35 kDa Aven-Spaltprodukt wurde nicht nur nach Überexpression, sondern auch auf endogener Proteinebene detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Spaltung Caspasen-abhängig ist. Eine Behandlung der Aven-überexprimierenden Zellen vor Apoptoseinduktion mit dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk blockierte die Spaltung von Aven vollständig. Gleiche Ergebnisse konnten mit dem endogenen Protein gezeigt werden. Obwohl die Aven-Sequenz keine in silico vorausgesagten Spaltstellen für Caspasen enthält, zeigten in vitro Experimente mit rekombinanter Caspase-3, dass Aven von Caspase-3 direkt prozessiert wird. In vivo Experimente mit Wildtyp-MCF-7-Zellen, die keine endogene Caspase-3 exprimieren, sowie mit transfizierten MCF-7-Zellen, die Caspase-3 stabil exprimieren, bestätigten dies. Aven wurde nur in den mit Caspase-3 transfizierten MCF-7-Zellen nach Staurosporin-Behandlung in das 35 kDa Fragment gespalten. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die das N-terminale Ende von Aven erkennen (anti-Flag oder anti-Aven A) zeigten eine zusätzliche kleinere Bande. Dieses Spaltprodukt ist ungefähr 30 kDa groß, und im Vergleich mit dem 35 kDa Aven-Peptid veränderte sich seine Expression kaum unter apoptotischen Bedingungen. Dieses Aven-Fragment ist jedoch nicht das Ergebnis einer Caspase-Spaltung, weil seine Entstehung nicht durch z-VAD-fmk inhibiert wurde. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch Serin-Proteasen nicht für diese Spaltung verantwortlich sind. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus von Aven gerichtet sind, zeigten erstaunlicherweise kein zusätzlichen Aven-Spaltprodukte, sondern nur das volle Länge-Aven-Protein. Offensichtlich ist das entstehende C-terminale Fragment nach Spaltung durch Caspase-3 instabil und kann nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche, nicht näher identifizierte 40 und 45 kDa große Aven Spaltprodukte wurden in MCF7-Zellen detektiert, die jedoch nicht in RKO-, HeLa-, oder 293T-Zellen beobachtet wurden. Mit Hilfe einer frei verfügbaren Software (GrabCas; ein Programm, das auch Granzyme Bund Caspase-Spaltstellen voraussagt, die sich von den Konsensusspaltsequenzen unterscheiden) sowie mit Western Blot Analysen von verschiedenen Aven-Deletionsmutante sollten potenzielle Schnittstellen näher charakterisiert werden. Dabei wurde die Spaltung durch Caspase-3 bei D293 (oder D287) bestätigt. Außerdem wurden zusätzliche mögliche Spaltstellen bei aa 240 oder zwischen aa 142-175 in Aven gefunden. Eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 142 und 175 würde zu einem ähnlichen C-terminalen Aven-Peptid führen wie das artifizielle ΔAven und sollte von daher potente anti-apoptotische Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Spaltstelle wurde ungefähr bei aa 100 kartiert. Die Isolierung von Aven Spaltprodukten aus eindimensionalen SDS-PA Gelen für eine nachfolgende massenspektrometische Analyse war aus technischen Gründe leider nicht erfolgreich. Die vorausgesagte Aven-Prozessierungsstellen sowie die in Western Blot Analysen beobachteten Aven-Fragmente lassen die Schlussfolgerung zu, dass Aven nach proteolytischer Aktivierung (d. h. nach Abspaltung inhibierender N-terminaler Sequenzen) anti-apoptotische Eigenschaften annimmt. Das generierte C-terminale Peptid wird dann möglicherweise durch Caspase-3-Spaltung bei D293 inaktiviert, wenn ein starker apoptotischer Stimulus auftritt. Zu Aufklärung der physiologischen Funktion von Aven in Normalgewebe und um zu untersuchen, ob Aven bei der Tumorentstehung eine Rolle spielt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Dazu wurde die humane Aven-cDNA zum einen unter der Kontrolle eines Hühner-ß-Aktin-Promotors und eines CMV-Enhancers kloniert. Diese Kombination regulatorischer Elemente sollte zu einer hohen und ubiquitären Expression des Transgens führen. Zusätzlich wurde die humane Aven-cDNA in den Vektor p1017 unter die Kontrolle des proximalen lck-Promotors kloniert, der eine Expression in unreifen T Zellen erlaubt. Die Etablierung der Mauslinien wurde in Kollaboration mit dem GSF-Institut für Experimentelle Genetik (AG Prof. M. Hrabé de Angelis) in München durchgeführt. Bei einer Untersuchung der Organe zeigte sich, dass in der ß-Aktin Aven-transgenen Maus eine starke Überexpression von Aven nur im Herz nachgewiesen wurde. Diese transgenen Mäuse werden zurzeit in Kollaboration mit Dr. S. Barrère-Lemaire (Institut of Functional Genomics, Montpellier, Frankreich) analysiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine lck Aven-Maus Linie untersucht. Western Blot Analyse zeigten eine starke Proteinexpression des Transgens im Thymus und auch in reifen T-Zellen (Milz). Mit Hilfe des anti-Aven C Antiserums konnte im Western Blot ein weiteres, vorher nicht beobachtetes Aven-Spaltprodukt in Thymozyten und aufgereinigten periphären T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Überexpression von Aven in Thymozyten und gereinigten T-Zellen hatte jedoch keine messbare Inhibition von Apoptose zur Folge. Dagegen wurde eine Inhibition der aktivierungsinduzierten Proliferation von T-Zellen in transgenen Aven-Mäuse beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten die transgenen Aven-Mäuse keine spontane Tumorentwicklung obwohl eine Korrelation zwischen Aven-Expression und einer schlechten Prognose in Kinderleukämien publiziert worden ist. Um zu untersuchen, ob Aven in Kombination mit anderen Onkogenen in Tumorentstehung oder Progression kooperieren kann, sollen transgene Aven-Mäuse mit anderen transonkogenen Mausstämmen (z.B. p53-/- Mäusen) gekreuzt werden.
Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen Behandlung mit der Verapamil - Injektionen und der ESWT Behandlung bei der Induratio penis plastica festgestellt. Bei der Analyse von Zusammenhaengen der Symptome vor der Behandlung wurde es statistisch bewiesen, dass eine Abhaengigkeit zwischen Schmerzen und Kohabitationsfaehigkeit existiert. Beide Therapieverfahren zeigten gute Ergebnisse bei Wirkung auf das Schmerzsymptom. Schmerzlinderung konnte durch ESWT Verfahren schneller als durch Verapamil Injektionen erfolgen. Der Schmerzrueckgang fuehrte automatisch zur einer verbesserten sexuellen Funktion. Im Bezug auf objektive Parameter der Plaquegroesse und der Deviation wurde keine signifikanten Effekte beobachtet, deswegen erscheint der Behandlungserfolg der IPP mit ESWT oder Verapamil - Therapie fragwuerdig. Moeglicherweise wird ESWT, wie schon die Verapamil Therapieverfahren zuvor, ihren Platz im historischen Kapitel der IPP finden.
Characterisation of cytosolic prion protein-mediated putative cytotoxicity in neuronal cell lines
(2006)
Prion diseases are a complex group of fatal neurodegenerative disorders with a broad host spectrum, which are characterised by strong neuronal cell loss, spongiform vacuolation and astrocytic proliferation. The molecular mechanisms of prion-mediated neurodegeneration are not yet fully understood. Recently, it has been proposed that neuronal cell death might be triggered by cytosolic accumulation of misfolded cellular prion protein (PrPC) due to impairment of proteasomal degradation. Cytosolic PrPC could result from either retro-translocation via the endoplasmatic reticulum-associated degradation system (ERAD) or abortive translocation of PrPC into the ER. Indeed, expression of cytosolic PrP (Cy-PrP) was shown to be neurotoxic both in vivo and in vitro. However, contradicting results on cytosolic PrP-mediated neurotoxicity in cultured cells have been reported. Cytosolic PrP–mediated cytotoxicity may play a central role in the pathogenesis of prion diseases. In order to investigate the molecular mechanisms of this process, a detailed analysis of N2a cells conditionally expressing cytosolic PrP (Cy-PrP) was performed in this study. The following results were obtained: First, Cy-PrP expression is not per se sufficient to trigger cytotoxicity in N2a cells independently of proteasome inhibition. Second, Cy-PrP is degraded with kinetics resembling the degradation of cell membrane-anchored full-length PM-PrP. In this process, the 20/26S proteasome was responsible for Cy-PrP degradation while the proteolysis of matured full length PM-PrP is not affected by the proteasomal system. Third, Cy-PrP accumulates in fine foci when expressed at high levels and co-localises with the cytosolic chaperone Hsc70 in EEA-1 positive endocytic vesicles. From these data it was proposed that the chaperone Hsc70 acts as a regulator for the controlled formation of amorphous Cy-PrP aggregates and their transport to endosomal vesicles. This Hsc70-dependent mechanism may confer protection to N2a cells against toxic accumulation of Cy-PrP in the cytosol.
Ziel der Arbeit war die Verifizierung der MR-Thermometrie mit verschiedenen MR Sequenzen für die laserinduzierte Thermotherapie mittels fluoroptischer Temperaturmessung bei 0,2 und 1,5 Tesla, bei Temperaturen bis 80 Grad Celsius. Bei ex-vivo Schweineleber und Agarose-Phantomen wurde unter MR-Bildgebung eine laserinduzierte Thermotherapie (LITT) durchgeführt. Die Messungen erfolgten pro Tomograph mit zwei verschiedenen Empfangsspulen. Die Temperaturdarstellung basierte auf der Änderung der Protonenresonanzfrequenz (PRF) und der longitudinalen Relaxationszeit (T1). Die PRF wurde mit vier verschiedenen MR-Sequenzen gemessen: zwei Gradientenecho-Sequenzen (FLASH), einer TurboFLASH- und einer Multiecho-TRUFI-Sequenz. Bei der T1-Methode wurden ebenfalls vier verschiedene MR-Sequenzen eingesetzt: eine konventionelle Gradientenecho-Sequenz (FLASH), eine TrueFISP-Sequenz (TRUFI), eine Saturation Recovery Turbo-FLASH-Sequenz (SRTF) und eine Inversion Recovery Turbo-FLASH-Sequenz (IRTF). Die Temperatur wurde mit einem faseroptischen Thermometer kontrolliert und mit der MRT-Temperatur korreliert. Es wurde eine gute lineare Korrelation zwischen der am MRT geschätzten und der faseroptisch gemessenen Temperatur erreicht. Bei 1,5 Tesla unter Einsatz einer Kopfspule erwies sich bei Messungen an der Schweineleberprobe PRF-FLASH von Siemens mit einer mittleren Temperaturabweichung von 5,09°C als optimal. Mit einem Bodyarray ergab hier IRTF die präzisesten Temperaturbestimmungen mit einer mittleren Abweichung von 8,02°C. Die Genauigkeiten und die Linearitäten von SRTF und PRF-TFL unterschieden sich davon nur geringfügig, sie können also als gleichwertig betrachtet werden. Bei 0,2 Tesla mit einer Kopfspule ergab die Messung mit SRTF mit 6,4°C die geringste mittlere Temperaturabweichung, mit einer Multipurpose-Coil erwiesen sich TRUFI und FLASH als optimal mit einer mittleren Temperaturabweichung von 15,62°C. bzw. 14,48°C. Mit den erreichten Temperaturgenauigkeiten kann der Thermoeffekt der LITT in Echtzeitnähe kontrolliert werden. Bei 1,5 T sind PRF-FLASH oder TFL aufgrund der Exaktheit und der Gewebeunabhängigkeit vorzuziehen. PRF-TRUFI mit einer Akquisitionszeit von 1,09 s ist die schnellste implementierte Sequenz. Bei 0,2 T sind die T1-Sequenzen genauer.