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The impact of the incorporation of a non-natural amino acid (NNAA) on protein structure, dynamics, and ligand binding has not been studied rigorously so far. NNAAs are regularly used to modify proteins post-translationally in vivo and in vitro through click chemistry. Herein, structural characterisation of the impact of the incorporation of azidohomoalanine (AZH) into the model protein domain PDZ3 is examined by means of NMR spectroscopy and X-ray crystallography. The structure and dynamics of the apo state of AZH-modified PDZ3 remain mostly unperturbed. Furthermore, the binding of two PDZ3 binding peptides are unchanged upon incorporation of AZH. The interface of the AZH-modified PDZ3 and an azulene-linked peptide for vibrational energy transfer studies has been mapped by means of chemical shift perturbations and NOEs between the unlabelled azulene-linked peptide and the isotopically labelled protein. Co-crystallisation and soaking failed for the peptide-bound holo complex. NMR spectroscopy, however, allowed determination of the protein-ligand interface. Although the incorporation of AZH was minimally invasive for PDZ3, structural analysis of NNAA-modified proteins through the methodology presented herein should be performed to ensure structural integrity of the studied target.
Auxiliar-vermittelte Synthese von nicht-natürlichen Aminosäuren als Bausteine für RNA-Liganden
(2005)
In den letzten Jahren wurde deutlich, daß mRNAs regulatorische Elemente aufweisen.Ein Beispiel hierfür ist z. B. die Transkription des Human Immunodeficiency Virus Typ1 (HIV-1). Die Arginin-reiche Domäne des Tat-Proteins interagiert hierbei mit einer Bindungstelle innerhalb der Bulge-Region der TAR-RNA. Das Vorliegen des hochkonservierten Tat-TAR-Komplexes ist die Voraussetzung für die effiziente Transkription viraler Gene. Eine kompetitive Bindung synthetischer Liganden an die Bulge-Region sollte daher den viralen Vermehrungszyklus unterbrechen. Hochspezifische Liganden mit inhibitorischem Potential sind somit von größtem Interesse. Für eine hohe Liganden-Affinität sind neben ionischen Wechselwirkungen und HBrücken-Interaktionen vor allem auch Stapelwechselwirkungen (stacking) von entscheidender Bedeutung. Die Ligandensuche wurde auf Tripeptide fokussiert. Da die Anzahl natürlich vorkommender aromatischer Aminosäuren sehr limitiert ist,erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst eine stereoselektive Synthese von neuen,nicht-natürlichen Aminosäuren mit heteroaromatischen Seitenketten. Um den generellen Einsatz dieser Bausteine in kombinatorischen Bibliotheken zu demonstrieren,wurden zunächst Tripeptide des Musters Arg-X-Arg hergestellt. Bereits diese Tripeptide zeigten in einem Fluoreszenz-Assay inhibierende Effekte auf den Tat- TAR-Komplex von HIV-1 mit IC50-Werten von 2 - 80 µM. Diese vielversprechenden Liganden wiesen auch in einem Tat-TAR kontrollierten Reportergen-Assay stark inhibierende Wirkung in den Zellkulturen auf. Am Beispiel eines Peptides ließ sich mittels NMR-Spektroskopie eine Komplexkonformation bestimmen, die der des bekannten TAR-Argininamid-Komplexes entspricht. Durch den Einsatz von nichtnatürlichen und Standard-Aminosäuren in kombinatorischen Tripeptidbibliotheken (split and combine-Methode) konnte die Suche von potentiellen Peptid-Liganden um ein Vielfaches erweitert werden. Über ein on-bead-Screening ließen sich weitere vielversprechende TAR-bindende Tripeptide identifizieren. Die RNA-Ligandensuche wurde desweiteren auf die psi-RNA (HIV-1) und auf die mRNA des onkogenen bcr-abl Proteins ausgeweitet. Auch hier konnten einige RNA-bindende Tripeptide isoliert werden.
Protein catabolism should be reduced and protein synthesis promoted with parenteral nutrion (PN). Amino acid (AA) solutions should always be infused with PN. Standard AA solutions are generally used, whereas specially adapted AA solutions may be required in certain conditions such as severe disorders of AA utilisation or in inborn errors of AA metabolism. An AA intake of 0.8 g/kg/day is generally recommended for adult patients with a normal metabolism, which may be increased to 1.2–1.5 g/kg/day, or to 2.0 or 2.5 g/kg/day in exceptional cases. Sufficient non-nitrogen energy sources should be added in order to assure adequate utilisation of AA. A nitrogen calorie ratio of 1:130 to 1:170 (g N/kcal) or 1:21 to 1:27 (g AA/kcal) is recommended under normal metabolic conditions. In critically ill patients glutamine should be administered parenterally if indicated in the form of peptides, for example 0.3–0.4 g glutamine dipeptide/kg body weight/day (=0.2–0.26 g glutamine/kg body weight/day). No recommendation can be made for glutamine supplementation in PN for patients with acute pancreatitis or after bone marrow transplantation (BMT), and in newborns. The application of arginine is currently not warranted as a supplement in PN in adults. N-acetyl AA are only of limited use as alternative AA sources. There is currently no indication for use of AA solutions with an increased content of glycine, branched-chain AAs (BCAA) and ornithine-α-ketoglutarate (OKG) in all patients receiving PN. AA solutions with an increased proportion of BCAA are recommended in the treatment of hepatic encephalopathy (III–IV).