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Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein CtaG aus Paracoccus denitrificans eingehend charakterisiert. Es wurde überprüft, ob dieses 21 kDa große Membranprotein als Kupferchaperon und Assemblierungsfaktor für die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase, das heißt für die Biogenese des CuB-Zentrums, in Frage kommt. Eine bioinformatische Analyse zeigte zunächst, dass CtaG, ein Homolog des eukaryotischen Proteins Cox11, zu den am stärksten konservierten Assemblierungsfaktoren der Cytochrom c Oxidase gehört. Interessanterweise sind diese Proteine alle an der Biogenese der redoxaktiven Metallzentren beteiligt, und nur sie sind auch in Paracoccus denitrificans konserviert. Somit stellt Paracoccus ein ideales Modellsystem dar, um die essentiellen Schritte der Biogenese der Cytochrom c Oxidase zu untersuchen. Ein lösliches Fragment von CtaG (CtaGLF) wurde heterolog in E. coli exprimiert und mit Hilfe eines spaltbaren His6-tags aufgereinigt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe die Aggregation des löslichen Fragments minimiert und das Protein in hochreiner, aggregatfreier Form isoliert werden kann. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass CtaGLF ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist. Nach der heterologen Expression in E. coli ist CtaGLF kofaktorfrei. Ein Protokoll zur in vitro Rekonstitution mit Kupferionen wurde entwickelt, mit welchem ein stöchiometrisches Kupfer/Protein-Verhältnis erreicht wird. Gelfiltrations- und ICP-MS-Analysen zeigten, dass CtaGLF Kupferionen ausschließlich als Dimer bindet. Rekonstitutionen bei denen Cu(I), Cu(II), Co(II), Fe(II), Mn(II), Mg(II) und Ni(II) sowohl einzeln als auch simultan angeboten wurden, führten zwar zu wenig reproduzierbaren absoluten Stöchiometrien, bestätigten aber, dass CtaGLF bevorzugt Cu(I) bindet. Mutagenesestudien bewiesen einerseits, dass drei Cysteinreste maßgeblich für die Kupferbindung verantwortlich sind und deuteten andererseits darauf hin, dass zwei identische, punktsymmetrische Bindungsstellen des CtaGLF-Dimers die Kupferionen koordinieren. Mit Hilfe einer Multiseq-Analyse wurden zunächst hochkonservierte Oberflächenreste von CtaG identifiziert. Eine Auswahl dieser Aminosäuren wurde per gerichteter Mutagenese ersetzt und der Effekt dieser Mutationen auf Stöchiometrie, Affinität und Dimerisierung von CtaGLF wurde untersucht. Die Affinitäten wurden dabei mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten mit dem Cu(I)-spezifischen Chelator BCA analysiert. Insgesamt vier mögliche Szenarien für die Kupferbindung von CtaG wurden postuliert und anhand der Datenlage diskutiert. Das Szenario III, welches die Datenlage am besten zu erklären vermag, sieht eine trigonale Koordination der Kupferionen vor, an welcher die Cysteine des hochkonservierten CFCF-Motivs einer Polypeptidkette ein gemeinsames Koordinationsfeld mit dem nahe der Transmembranhelix gelegenen Cystein 38 der jeweils anderen Polypeptidkette bilden. Mit Hilfe von UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurde gezeigt, dass die Bindung von Kupferionen an CtaGLF zu einer Absorption bei 358 nm führt. Diese kann mit einem Extinktionskoeffizienten von E delta 358 nm = 936 M-1cm-1 zur Beobachtung des Kupfertransfers von CtaGLF auf einen Akzeptor verwendet werden. Um eine Beteiligung von CtaG bei der Insertion des CuB-Ions in die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (UE I) zu beweisen, wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt und empirisch untersucht: Die erste Hypothese geht von einer posttranslationalen Kupferinsertion aus. Die UE I wird laut dieser Hypothese zunächst vollständig exprimiert und in die Membran inseriert, bevor das Kupferion über einen Kanal in das 13 Å unterhalb der Membranoberfläche gelegene aktive Zentrum der Oxidase inseriert wird. Drei Ansätze wurden zur empirischen Überprüfung dieser Hypothese verfolgt: Erstens wurde ein in vitro Transferassay etabliert, bei dem heterolog exprimierte, kofaktorfreie UE I als Akzeptor für Kupferionen von CtaGLF diente. Zweitens wurden bioinformatische Analysen durchgeführt um potentielle Interaktionsflächen zwischen CtaG und UE I zu identifizieren. Und drittens wurde mit Hilfe koaffinitätschromatographischer Versuche eine Interaktion zwischen CtaG und kofaktorfreier UE I untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sprechen allesamt gegen eine posttranslationale CtaG-vermittelte Insertion von Kupferionen in die UE I der Cytochrom c Oxidase. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass die prosthetischen Häm- und Kupfergruppen bereits vor der vollständigen Membraninsertion, das heißt kotranslational auf die UE I übertragen werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ebenfalls mehrere Ansätze verfolgt: Erstens wurde die UE I in Gegenwart und Abwesenheit von CtaG heterolog in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. In Abwesenheit weiterer Assemblierungsfaktoren ist CtaG in diesem System nicht dazu in der Lage den Kupfergehalt der UE I zu erhöhen. Zweitens wurde mit Hilfe von Blau-Nativ Gelen und Crosslinking-Versuchen im nativen Wirt Paracoccus denitrificans nach einer Wechselwirkung zwischen CtaG und UE I gesucht. Insbesondere die Ergebnisse der Crosslinking-Versuche deuten auf einen Assemblierungskomplex hin, der sowohl CtaG als auch die UE I der Cytochrom c Oxidase enthält. In einem dritten Ansatz wurde ein zellfreies Expressionssystem etabliert, welches direkten Zugang zu naszierenden Ketten der UE I ermöglicht. Dieses System erscheint vielversprechend und dient derzeit als Basis für weitere Biogenesestudien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass CtaG ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist, das im Zuge der Kupferbindung dimerisiert und in Paraoccus denitrificans in einem hochmolekularen Komplex gemeinsam mit UE I vorliegt. Die gegenwärtige Datenlage spricht dafür, dass CtaG als Kupferchaperon an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt ist und das CuB-Ion in einem kotranslationalen Mechanismus in die UE I der Cytochrom c Oxidase inseriert.
Sauerstoff wird in vielen prokaryotischen und eukaryotischen Atmungsketten von der Cytochrom c Oxidase zu Wasser reduziert. Dieses Enzym besteht in Paracoccus denitrificans aus vier Untereinheiten, von denen aber nur die ersten zwei für die Funktion essentiell sind. Elektronen werden von einem membrangebundenen Cytochrom c552 zunächst auf das CuA-Zentrum der Untereinheit II der Oxidase übertragen und gelangen von dort zum low-spin Häm a der Untereinheit I. Am binukleären Zentrum, das aus dem high-spin Häm a3 und dem CuB-Atom besteht, erfolgt schließlich die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Bindungsstelle für Cytochrom c durch das gezielte Einführen oder Entfernen negativer Ladungen auf der Oxidase-Oberfläche zu bestimmen. Die Charakterisierung dieser Mutanten erfolgte hauptsächlich durch spektroskopische Analyse der kinetischen Parameter unter Umsatzbedingungen. Zusätzlich wurde der Teilschritt der Susbtratbindung durch die Aufnahme von Assoziationskinetiken untersucht. Als Substrat diente das reduzierte mitochondriale Cytochrom c oder ein lösliches Fragment des Paracoccus-Cytochrom c552. Die eingeführten Mutationen beeinflußten in unterschiedlicher Weise die Bindung der beiden verwendeten Substrate. Hierbei ist der negativ geladene Bereich der Oberfläche von Untereinheit II der Oxidase, der zur Bindung des Paracoccus-eigenen Substrats beiträgt, größer als der für die Wechselwirkung mit dem mitochondrialen Cytochrom c. Erstmals kann somit ein Modell für die Bindung des nativen Substrats an die Paracoccus-Oxidase aufgestellt werden. Die aa3-Oxidase aus Paracoccus zeigte keine Elektronentransfereaktion mit dem Cytochrom c552 aus Thermus thermophilus, da dessen Oberfläche nicht die hierfür erforderlichen Ladungen trägt. Durch Erhöhung der Hydrophobizität auf der Untereinheit II der Paracoccus-Oxidase wurde deren Oberfläche so verändert, dass sie nunmehr auch durch dieses „hydrophobe“ Cytochrom c reduziert werden konnte. Der Aminosäurerest W121 auf der Oberfläche der Untereinheit II wurde in der Vergangenheit als ein möglicher Elektroneneintrittsort in die Cytochrom c Oxidase beschrieben. Die in der vorliegenden Arbeit an dieser Position hergestellten Mutanten zeigten zwar drastische Einbußen in den maximalen Wechselzahlen, aber eine weitgehend unveränderte Affinität zum Cytochrom c. Die exakte Positionierung der Seitengruppe des Tryptophans spielt hierbei gegenüber der Aromatizität die entscheidende Rolle. An benachbarten Positionen eingeführte Mutationen ergaben keine Hinweise auf alternative Elektroneneintrittsorte. Durch ortsspezifische Mutagenese auf dem löslichen Cytochrom c552-Fragment wurden die Lysine auf der Oberfläche entfernt, um zu klären, ob die Wechselwirkung zwischen Cytochrom c und Oxidase auf Ladungspaaren beruht oder über das Gesamtpotential der Bindungsstellen bestimmt wird. Die Lysin-Mutanten zeigten alle im gleichen Maße eine reduzierte Affinität zur Oxidase. Die vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass die Wechselwirkung zwischen Oxidase und Cytochrom c552 über das Gesamt-Oberflächenpotential vermittelt wird. Steady-state-Kinetiken unter Verwendung von Pferdeherz-Cytochrom c oder Paracoccus Cytochrom c552 weichen von den klassichen Michaelis-Menten-Verhalten ab, da zwei separate Phasen für die Kinetik beobachtet werden. Dieses Phänomen bisher wurde mit der Anwesenheit einer zweiten Bindungsstelle oder einer redoxgekoppelten Konformationsänderung der Oxidase erklärt. Durch Untersuchungen von Oxidase-Präparationen mit unterschiedlicher Untereinheiten-Zusammensetzung oder gebundenem Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Biphasizität der Oxidase-Kinetik ! nicht auf der Anwesenheit der Untereinheiten III und IV beruht, ! durch die spezifische Bindung von Antikörpern zu niedrigeren Ionenstärken verschoben wird bei gleichzeitiger Verringerung der Affinität zum Substrat, ! eine intrinsische Eigenschaft aller untersuchten Mutanten ist. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten keine Hinweise auf eine zweite Cytochrom c Bindungsstelle gefunden werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Expression, Reinigung und Charakterisierung des homologe, membrangebundenen Cytochrom c552 aus P. denitrificans. Das Protein wurde mit einem Histidin-Tag versehen und heterolog in E. coli in guter Ausbeute exprimiert und gereinigt. Seine Charakterisierung über steady-state-Messungen ergab ein deutlich verschobenes pH-Optimum mit höherer Affinität zur Oxidase im Vergleich zu seinen verkürzten löslichen Fragmenten.
Übergangsmetallboride und -nitride weisen besondere physikalische und mechanische Eigenschaften auf; sie vereinen dabei sowohl die Merkmale von Metallen als auch von Keramiken. Sie besitzen z. B. große Härten, hohe Schmelzpunkte und hohe Abriebfestigkeiten. Des Weiteren sind sie sehr beständig gegenüber Hitze und Korrosion. Sie zeigen eine hohe elektrische und thermische Leitfähigkeit. In den industriellen Anwendungen kommen oft Übergangsmetallboride und -nitride der 4. und 5. Gruppe zum Einsatz. Die Boride und Nitride des Niobs gelten als potentielle Kandidaten für Baumaterialien, welche hohen Temperaturen standhalten sollen. Niobnitride werden zum Teil schon als Beschichtungen von Turbinenmotoren und in der Raumfahrt eingesetzt. Für den industriellen Einsatz als Beschichtung oder Überzug werden in der Regel dünne Filme benötigt, diese werden oft durch Gasphasenabscheidung aufgebracht. Eine alternative Möglichkeit zur Präparation dünner Filme bietet das Rapid Thermal Processing (RTP). Dabei handelt es sich um einen optischen Schnellheizofen, mit dem Aufheiz- und Abkühlraten bis zu 300 K s-1 erreicht werden können. Im Vergleich zu gängigen Ofenprozessen werden Reaktionszeiten deutlich verkürzt. Durch eine Variation der Reaktionsbedingungen ist es möglich, verschiedene Phasen zu erzeugen und deren Abfolge zu beeinflussen. Zusätzlich können metastabile Phasen und Zwischenstufen abgefangen werden. Als Ausgangsschichten für die in dieser Arbeit untersuchte Darstellung von Niobboriden und -nitriden dienten verschiedene B/Nb- sowie B/Nb2N-Schichtsysteme. Diese wurden mittels Magnetronsputtern bzw. Elektronenstrahlverdampfung auf Si/SiO2-Substraten abgeschieden. Die Ausgangsschichten wurden anschließend in der RTP im Temperaturbereich von 600 °C bis 1200 °C getempert. Die Temperungen wurden in Argon bzw. Ammoniak durchgeführt. Zur Charakterisierung der Proben dienten verschiedene Analyseverfahren (XRD, LM, REM, AFM, SIMS, EPMA). Die folgenden Niobboride sowie -nitride können durch Temperungen in der RTP dargestellt werden. Die hexagonale NbB2-Phase entsteht bei Argon- sowie Ammoniaktemperungen in B/Nb-Schichtsystemen mit einem 1 : 1-Schichtdickenverhältnis. Das NbB2 erweist sich unter den untersuchten Reaktionsbedingungen als effektive Diffusionsbarriere gegenüber Sauerstoff, Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff. Weitere boridische Phasen werden nur bei Argontemperungen gefunden. Das tetragonale Nb3B2 entsteht in Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 sowie mit einem Nb : B : Nb-Verhältnis von 5 : 1 : 5. Die Nb3B2-Phase wird durch Kohlenstoff und Sauerstoff verunreinigt. Die Verunreinigungen stammen sowohl aus den Ausgangsschichten als auch aus anderen Quellen (z. B. Trägermaterial). Durch eine Änderung der Sputter- Methode konnten die in den Ausgangschichten vorhandenen Verunreinigungen reduziert werden. In entsprechend neupräparierten Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 führt dies bei den Argontemperungen zur Ausbildung des orthorhombischen NbB neben dem Nb3B2. Die Bildung der Nitride erfolgt bei den Ammoniaktemperungen der verwendeten Schichtsysteme (außer bei B : Nb im Verhältnis 1 : 1). Welche Phase dabei entsteht ist abhängig von der gewählten Temperatur. Es zeigt sich dabei von niedrigeren zu höheren Temperaturen folgende Phasenabfolge: hexagonales Nb2N -> hexagonales delta‘-NbN -> kubisches NbN. Beim Übergang zwischen den einzelnen Phasen liegen diese nebeneinander vor. Durch die schnellen Aufheiz- und Abkühlraten des RTP-Systems, bildet sich neben dem Nb2N das kinetisch bevorzugte delta‘-NbN. Die Bildung der delta‘-NbN-Phase wird durch die Ähnlichkeit der beiden Elementarzellen unterstützt. Die Nb2N-Phase der B/Nb2N-Bilayer behindert stark die Eindiffusion des Bors, des Stickstoffes und der Verunreinigungen. Damit ist das Nb2N eine relativ gute Diffusionsbarriere. Ein Teil der Nb2N-Schicht weicht dem Druck der Eindiffusion durch Aufstauungseffekte an der Grenzfläche aus. Die aus der Literatur bekannten Phasen Nb3B4 (orthorhombisch), epsilon-NbN (hexagonal) und Nb5N6 (hexagonal) werden bei den untersuchten Reaktionsbedingungen nicht gefunden. Die vorhandenen Verunreinigungen führen vor allem während der Argontemperungen zu verschiedenen Oberflächenphänomenen und zur Ausbildung carbidischer und oxidischer Phasen. Im Zuge der Ammoniaktemperungen spielen die Verunreinigungen eine deutlich geringere Rolle. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass durch Temperungen in der RTP verschiedene Niobboride sowie -nitride innerhalb weniger Minuten dargestellt werden können. Jedoch sollten für weiterführende Arbeiten reinere Ausgangschichten bzw. anderer Trägermaterialien verwendet werden um die Ergebnisse weiter zu verbessern.
Das humane endogene Retrovirus-K: Grundlagenforschung und Nutzen als Tumor-assoziiertes Antigen
(2011)
Fast die Hälfte des humanen Genoms besteht aus Retroelementen, die während der evolutiven Entwicklung des Menschen im Genom fixiert wurden. Im Wesentlichen kann man diese Retroelemente in DNA-Transposons, LINEs, SINEs und humane endogene Retroviren unterteilen, dabei nehmen die humanen endogenen Retroviren (HERV) 8% des humanen Genoms ein. Bei einer Unterfamilie, der HERV-K Familie, sind bis heute alle offenen Leserahmen erhalten geblieben. Nach heutigem Erkenntnisstand wird eine Expression dieser Elemente in somatischen Zellen jedoch strikt unterdrückt, denn eine Expression von Retroelementen könnte zu Insertionsmutagenesen führen und letztlich dem Organismus erheblichen Schaden zufügen.
Im Gegensatz dazu wird eine reaktivierte Expression von HERV-K häufig in einigen Tumorarten beobachtet: allen voran Keimzelltumore, Melanome und Brustkrebs. Außerdem können in Patienten, die an solchen Tumoren erkranken, häufig HERV-K spezifische Antikörper und mitunter auch gegen HERV-K-gerichtete T-Zellen nachgewiesen werden. Die strikte Unterdrückung der HERV-K Expression in gesunden, somatischen und eine reaktivierte Expression in entarteten Zellen machen HERV-K Proteine daher zu idealen Tumor-assoziierten Antigenen.
Auf Grundlage dieser Untersuchungen wurden, in dieser Arbeit, zwei potentielle Tumorvakzine, basierend auf dem hoch attenuierten Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) hergestellt. Durch homologe Rekombination wurde ein HERV-K gag-pro-pol transgenes MVAHKcon und ein HERV-K env transgenes MVAHKEnv hergestellt und charakterisiert. Darüber hinaus wurden die rekombinanten Viren in einem neu etablierten, syngenen Maus-Tumor-Modell untersucht. MVAHKcon immunisierte Mäuse zeigten eine starke humorale Immunantwort und waren in der Lage subkutane, HERV-K Gag positive Tumore fast vollständig zu eliminieren. MVAHKEnv immunisierte Mäuse zeigten dagegen eine moderate humorale Immunantwort und eine starke T-Zellantwort. Nach therapeutischer Immunisierung mit MVAHKEnv konnte im Mausmodell eine signifikante Reduktion an HERV-K Env positiven Lungenmetasten beobachtet werden. Außerdem konnte durch eine prophylaktische Immunisierung mit MVAHKEnv ein vollständiger Schutz der Mäuse vor der Ansiedlung HERV-K Env-exprimierender Tumore erreicht werden. Die hier vorgestellten HERV-K rekombinanten MVA könnten daher der erste Schritt zu einer Immuntherapie gegen reaktivierte Retroelemente in malignen Tumoren darstellen.
MVAHKcon infizierte Zellen produzieren und sekretieren große Mengen HERV-K Virus-ähnlicher Partikel (VLP) somit konnten auch grundlegende Fragestellungen der HERV-K Biologie geklärt
Zusammenfassung
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werden. Durch die Kombination massenspektrometrischer Analysen und N-terminaler Sequenzierungen konnten, die noch nicht bekannten Schnittstellen der retroviralen Protease im HERV-K Gag Protein identifiziert werden. Zudem wurde eine späte Domäne von HERV-K identifiziert und darüber hinaus Wechselwirkungen von HERV-K VLPs mit zellulären Restriktionsfaktoren wie APOBEC3G und CD317 studiert.
Ziel dieser Arbeit ist die Identifikation des Einflusses klassischer Labormaterialien und alternativer Experimentiermaterialien auf fachdidaktische Anforderungen an ein gelungenes Experiment im Chemieunterricht. Dabei umfassen alternative Experimentiermaterialien sowohl Materialien aus der alltäglichen Lebenswelt von Schülerinnen und Schülern als auch Materialien aus dem Bereich der Medizintechnik, die anstelle von Materialien des gängigen Laborbetriebs im Chemieunterricht eingesetzt werden. Um den Einfluss des Experimentiermaterials auf entsprechende Anforderungen untersuchen zu können, wurden im Rahmen eines Mixed-Method-Designs zwei aufeinander aufbauende Studien durchgeführt. Bei Studie I handelt es sich um eine qualitative Interviewstudie unter N = 13 Chemielehrkräften, mit denen vor dem theoretischen Hintergrund fachdidaktischer Anforderungen an ein gelungenes Schulexperiment problemorientierte, leit-fadengestützte Interviews zu Vor- und Nachteilen beim Einsatz alternativer Experimentiermaterialien und klassischer Labormaterialien im Chemieunterricht geführt wurden. Anhand des gewonnenen Interviewmaterials wurden anschließend zunächst Eigenschaften identifiziert, in denen sich beide Materialpools voneinander unterscheiden, um davon ausgehend ein Kategoriensystem aufstellen zu können, das in Form einer Matrix den Einfluss dieser Materialeigenschaften auf organisatorische, experimentelle und affektive Anforderungen an ein Schulexperiment im Chemieunterricht darstellt. Dabei konnte in Bezug auf organisatorische Anforderungen insbesondere ein Einfluss des Experimentiermaterials auf zeitliche und finanzielle Rahmenbedingungen sowie auf Anforderungen zur Sicherheit beim Experimentieren im Chemieunterricht festgestellt werden. Ergebnisse zum Einfluss des Experimentiermaterials auf affektive und experimentelle Anforderungen an ein Schulexperiment wurden wiederum genutzt, um anschließend Hypothesen zum Einfluss des Experimentiermaterials auf entsprechende Anforderungen an gelungene Experimente im Chemieunterricht zu generieren, dabei an gelungene Schülerexperimente im Speziellen. Diese Hypothesen wurden in einer zweiten Studie quantitativ getestet. Innerhalb eines experimentellen Untersuchungsdesigns führten dazu insgesamt N = 293 Schülerinnen und Schüler eines von insgesamt fünf betrachteten Schülerexperimenten mit jeweils klassischem Labormaterial oder in einer jeweiligen Variante aus alternativem Experimentiermaterial durch. Im Anschluss beurteilten N = 237 Schülerinnen und Schüler im Rahmen einer Fragebogenerhebung ihre subjektive Wahrnehmung der Experimentiersituation bezüglich der Variablen Grad der Herausforderung, Beobachtbarkeit, Autonomieerleben, Anspannung/ Druck, Kompetenzerleben und Interesse/ Vergnügen. Mit Ausnahme des Kompetenzerlebens und der Beobachtbarkeit konnte zu allen betrachteten Variablen ein signifikanter Einfluss des Experimentiermaterials festgestellt werden. Um diese Ergebnisse der Hypothesentests näher beschreiben und differenzierter erläutern zu können, beantworteten die 237 Schülerinnen und Schüler zusätzlich offene Fragen zu den von ihnen verwendeten Experimentiermaterialien; mit N = 56 weiteren Schülerinnen und Schülern wurden aus diesem Grund außerdem leitfadengestützte Gruppeninterviews geführt. Um folglich auch aus Schülerperspektive möglichst allgemeingültige Einflüsse beider Materialpools auf fachdidaktische Anforderungen an ein gelungenes Schulexperiment zusammenfassen zu können, werden die Ergebnisse dieser qualitativen Datenerhebung ebenfalls in Form einer entsprechenden Matrix dargestellt und dabei von den konkret durchgeführten Experimenten abstrahiert. Neben dem bereits genannten Einfluss des Experimentiermaterials auf den von Schülerinnen und Schülern wahrgenommenen Grad der Herausforderung, das wahrgenommene Autonomieerleben, die/ den wahrgenommene/n Anspannung/ Druck beim Experimentieren sowie das wahrgenommene Interesse/ Vergnügen an der Experimentiersituation konnte dadurch insbesondere ein Materialeinfluss auf die Durchschaubarkeit eines Versuchsaufbaus und deren einzelner Bestandteile sowie auf die wahrgenommene Authentizität einer Experimentiersituation identifiziert werden. Dadurch zeigt die Gesamtuntersuchung auf theoretischer Ebene die Bedeutsamkeit des konkreten Experimentiermaterials als Qualitätsmerkmal des Chemieunterrichts und gibt Lehrkräften auf unterrichtspraktischer Ebene einen Überblick zu Potentialen und Grenzen alternativer Experimentiermaterialien im Vergleich zu etabliertem klassischem Labormaterial.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Variation des Oxidationspotentials und der Elektronenkonfiguration ( * gegen n *) auf die zur Löschung von angeregten Triplettzuständen durch O2 führenden Prozesse untersucht. Bei ausreichender Triplettenergie werden neben dem Grundzustand des ursprünglich angeregten Sensibilisators in Konkurrenz O2(1 g ) und O2(1 g) Singulettsauerstoff sowie O2(3 g -) Grundzustandssauerstoff gebildet. Frühere Untersuchungen in diesem Arbeitskreis hatten gezeigt, daß es für * Triplettzustände zwei Desaktivierungskanäle gibt, die beide zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führen. Der eine geht von den bei der Löschung zunächst gebildeten 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen ohne Charge Transfer Stabilisierung aus (nCT). Diese befinden sich in einem vollständig eingestellten spinstatistischen Gleichgewicht, aus dem durch innere Konversion in niedrigere Komplexzustände die Desaktivierung erfolgt. Ein gemeinsames Energielückengesetzt f( E) und damit letztlich die Triplettenergie des Sensibilisators bestimmt die Größe der Geschwindigkeitskonstanten der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse in diesem nCT Kanal. Für Sensibilisatoren mit hohem Oxidationspotential und vernachlässigbaren Charge Transfer Wechselwirkungen ist dies der einzige Desaktivierungsprozeß. Mit zunehmender Charge Transfer Wechselwirkung, also mit abnehmendem Oxidationspotential und/oder zunehmender Triplettenergie, wird ein zweiter Desaktivierungskanal geöffnet, der über 1,3(T1 3 ) Komplexe mit Charge Transfer Stabilisierung (pCT) also über Exciplexe führt. Die Exciplexbildung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im pCT Kanal. Zur Verbreitung der Datenbasis den T1( *) Sensibilisatoren wurde in dieser Arbeit eine Reihe von mit elektronenziehenden bzw. elektronenschiebenden Gruppen substituierten Fluorenen studiert, bei denen im wesentlichen nur das Oxidationspotential variiert, während die Triplettenergien weitgehend konstant bleiben. Die mit den Fluorenen erhaltener Ergebnisse bestätigen das bisher erarbeitet Zweikanal-Desaktivierungsmodell. Insbesondere wird auch das spinstatistische Gewicht von 1:3 für die Bildung von Singulett zu Triplettsauerstoff im Exciplex Kanal gefunden, das nur mit einem relativ langsamen 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) isc Gleichgewicht konsistent ist. Dieses Ergebnis widerspricht der früheren Annahme, wonach ein effizientes isc Gleichgewicht nur zwischen 1,3(T1 3 ) Exciplexen, nicht aber zwischen 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen existieren soll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell für die 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) angeregten Komplexe vorgeschlagen, das in einfacher Weise erklärt, warum das isc zwischen Encounter Komplexen von Sensibilisator und O2 schneller ist, als das zwischen den entsprechenden Exciplexen. Die weitere Analyse der Fluoren Daten zeigt, daß neben dem Oxidationspotential und der Triplettenergie des Sensibilisators auch dessen Struktur die Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen kann, allerdings weitaus schwächer als die beiden ersten Einflußgrößen. Mit den Messungen der Geschwindigkeitskonstanten kT 1 , kT 1 und für kT 3 der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse für die unterschiedlich substituierten Benzophenonderivate wurde erstmals eine quantitative Untersuchung der Löschung von n * angeregten Triplettzuständen durch O2 durchgeführt. Obwohl für die Benzophenone eine stärkere Variation des Oxidationspotentials bei nahezu konstanter Triplettenergie erreicht werden konnte, wurde im Vergleich zu den * Triplettsensibilisatoren eine wesentlich schwächere Variation von kT 1 , kT 1 und für kT 3 beobachtet. Gleichzeitig liegen die Werte von kT 1 , kT 1 und für kT 3 der Benzophenone mit vernachlässigbarer Charge Transfer Wechselwirkung weit von der für * Triplettsensibilisatoren gefundenen Energielückenbeziehung f( E). Offenbar gilt für n * Triplettsensibilisatoren eine andere Energielückenbeziehung f( E), die viel schwächer von E abhängt. Es konnte gezeigt werden, daß die schwächere Überschußenergieabhängigkeit mit der unterschiedlichen Struktur der 1,3(T1.3 ) Komplexe zusammenhängt. Für 1,3(T1(n *) 3 ) ist eine Vierzentren Struktur, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls parallel und benachbart zu den beiden Atomen der angeregten Carbonyl Gruppe liegen, sehr wahrscheinlich. Bei der Desaktivierung der Carbonyleinheit ändern sich die Bindungslängen der Vierzentrenstruktur stark, was einem Übergang zwischen versetzten Potentialkurven mit schwacher Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren entspricht. Für 1,3(T1( *) 3 ) Komplexe ist eine supra-supra Struktur anzunehmen, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls mit gegenüberliegenden Kohlenstoffatomen eines angeregten aromatischen Rings wechselwirken. Bei der Desaktivierung des aromatischen Rings ändern sich die Bindungslängen nur wenig, so daß man von einem Übergang zwischen übereinander liegenden Potentialkurven mit stärkerer Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren sprechen kann. Dies ist der eigentliche Grund für die verschiedenen Energielückenbeziehungen f( E) und f( E) bei der Löschung von * und n * Triplettsensibilsatoren durch O2. Die Variation des Oxidationspotentials und damit der Stärke der Charge Transfer Wechselwirkungen in den 1,3(T1 3 ) Komplexen wird durch unterschiedliche Substitution von aromatischen Ringen mit elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen bewirkt. Da die aromatischen Ringe bei den n * Triplettsensibilisatoren im Gegensatz zu den * Triplettsensibilisatoren nicht Bestandteil des elektronisch angeregten Zentrum sind, fallen die Charge Transfer Effekte bei den n * Triplettsensibilisatoren deutlich schwächer aus als bei den * Triplettsensibilisatoren. Damit konnte in der vorliegende Arbeit erstmals eine konsistente Begründung für das unterschiedliche Verhalten von n * und * Triplettsensibilisatoren bei der Löschung durch O2 gegeben werden.
Die Aggregation von Thrombocyten ist ein wichtiger physiologischer Schutzmechanismus zur primären Blutstillung nach Gefäßverletzungen. Dieser Vorgang kann jedoch unter pathologischen Bedingungen zu Herzinfarkten und Schlaganfällen führen. Der Aggregationsprozeß ist durch Ausbildung sogenannter "Fibrinogenbrücken" zwischen verschiedenen Thrombocyten gekennzeichnet. Dies wird durch Bindung von Fibrinogen an das aktivierte Integrin alphaIIbbeta3 auf der Thrombocytenoberfläche ausgelöst. Das kleine G-Protein Rap1B aus der Ras-Superfamilie reguliert den Aktivitätszustand von Integrinen und besitzt damit eine zentrale Rolle bei der Aggregation von Thrombocyten. Die Aktivierung von Rap1B wird durch eine Vielzahl von Plättchenagonisten innerhalb von wenigen Sekunden ausgelöst. Der von Thrombocyten und Gefäßendothelzellen gebildete Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) kann die Thrombocytenaggregation über den NO/cGMP-Signalweg hemmen. Das Signalmolekül NO aktiviert in Thrombocyten die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (sGC), hierdurch wird die Synthese des sekundären Botenstoffes cGMP angeregt. Das cGMP-Molekül aktiviert nachfolgend die cGMP-abhängige Proteinkinase-Ibeta (cGK-Ibeta), welche die aggregationshemmende NO-Wirkung vermittelt. Die verantwortlichen Zielproteine der cGK-Ibeta wurden bis heute jedoch nicht hinreichend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit sollten verschiedene Aspekte der NO-induzierten Hemmung der Thrombocytenaggregation untersucht werden. Dabei wurden neue Mechanismen dieser Inhibition identifiziert. Zum einen konnte eine kinetisch schnelle Hemmung der Rap1B-Aktivierung in Thrombocyten nachgewiesen werden. Zum anderen konnten einer cGK-Ibeta-vermittelten, kinetisch langsamen Rap1B-Phosphorylierung hemmende Effekte auf die Membranlokalisation von Rap1B in MDCK-Zellen und auf die Zellausbreitung von Hela-Zellen zugeordnet werden. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue Proteininteraktion zwischen dem mitochondrialen CGI-51-Protein und Rap1B identifiziert und verifiziert. Zur Aufklärung eines Einflusses des NO/cGMP-Signalweges auf die Aktivierung von Rap1B in Thrombocyten wurde die NO/sGC/cGMP/cGK-Ibeta-Signalkaskade auf verschiedenen Stufen aktiviert oder gehemmt, bevor anschließend die Rap1GTPBildung mit verschiedenen Plättchenagonisten induziert wurde. Das aktive Rap1B wurde unter Verwendung eines Rap1GTP-bindenden Fusionsproteins präzipitiert und nachgewiesen. Durch NO-freisetzende Substanzen konnte eine Hemmung der Rap1BAktivierung erreicht werden. Auch die Aktivierung der sGC mit einem spezifischen Aktivator führte zur Inhibition von Rap1B. Die direkte Aktivierung der cGK-Ibeta konnte Rap1B ebenfalls hemmen, während eine Blockade der cGK-Ibeta die NO-induzierte Hemmung der Rap1-Aktivierung verhinderte. Die genannten Effekte des NO/cGMP-Signalwegs waren unabhängig vom Stimulus, der zur Rap1B-Aktivierung genutzt wurde, sowohl die Aktivierung über verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) als auch die Aktivierung über Tyrosin-Kinasen wurden gehemmt. Eine detailliertere Untersuchung ergab, daß cGK-Ibeta die Ca2+-unabhängige Aktivierung von Rap1B hemmen konnte. Die Rolle der cGK-Ibeta wurde abschließend im unabhängigen Zellsystem der Megakaryocyten abgesichert. Die Hemmung der Rap1B-Aktivierung durch den NO/cGMP-Signalweg stellt einen schnellen Regulationsmechanismus zur Inhibition der Thrombocytenaggregation dar. Aus der Literatur ist eine kinetisch langsame Phosphorylierung von Rap1B an Serin-179 durch cGK-Ibeta bekannt. Zur Ermittlung ihrer Funktion wurden mikroskopische Untersuchungen der subzellulären Rap1B-Lokalisation in lebenden MDCK-Zellen durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, daß eine nicht-phosphorylierbare Rap1BMutante eine ausgeprägte Membranlokalisation aufweist, während eine phosphomimetische Rap1B-Mutante bevorzugt cytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer weiterführenden Studie wurde der Effekt dieser Rap1B-Mutanten auf das Zellausbreitungsverhalten von Hela-Zellen analysiert. Die Expression der nichtphosphorylierbaren Rap1B-Mutante führte dabei zu einer signifikant gesteigerten Zellausbreitung, welche hingegen durch eine phosphomimetische Rap1B-Mutante deutlich abgeschwächt war. Dies impliziert einen zusätzlichen Mechanismus, über den der NO/cGMP-Signalweg die Adhäsion bzw. die Aggregation von Thrombocyten regulieren kann. Zur Identifizierung von neuen Interaktionspartnern, die spezifisch an phosphoryliertes Rap1B binden und dessen subzelluläre Verteilung oder Aktivität regulieren, wurde das Yeast-Two-Hybrid-System eingesetzt. Hierbei konnte das mitochondriale CGI-51-Protein als neuer Bindepartner von Rap1B identifiziert und in Säugerzellen verifiziert werden. Eine phosphospezifische Interaktion konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. Das CGI-51-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Proteinsortierung in der äußeren Mitochondrienmembran. Die Funktion der Interaktion von CGI-51-Protein mit Rap1B wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß in der vorliegenden Arbeit erstmalig neue Erkenntnisse zur Regulation des kleinen G-Proteins Rap1B durch den NO/cGMP-Signalweg dargestellt sind. Dieser Regelmechanismus besitzt eine physioplogische Bedeutung bei der Inhibition der Thrombocytenaggregation.
Die Na,K-Pumpe ist ein integrales Membranenzym und gehört zur Gattung der P-Typ-ATPasen. Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von ATP die resultierende freie Energie in aktiven Transport zur Errichtung eines Na+/K+-Konzentrationsgradienten über der jeweiligen Plasmamembran um. Diese Funktion wird mit einer strukturellen Alternierung zwischen zwei Hauptkonformationen E1 und E2 des Enzyms in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von Sekundärstruktur- und Proteinmikroumgebungsänderungen bei Teilreaktionen der Na,K-ATPase mittels reaktionsinduzierter und zeitaufgelöster FTIR-Differenzspektroskopie. Die hier verwendete IR-Durchlichttechnik setzt voraus, daß das zu untersuchende Enzym in hochreiner, hochkonzentrierter (1 mM) und aktiver Form in einen Proteinfilm in Gegenwart eines geschützten, photolytisch spaltbaren ATP-Derivats (caged ATP) überführt werden kann. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende IR-spektroskopische Beschreibung von einzelnen Teilreaktionen innerhalb des E1/E2-Reaktionsmodells der Na,K-ATPase durchgeführt. Die Untersuchung des Enzyms in Form eines Proteinfilms mit einer Schichtdicke von etwa 5 µm ist aufgrund der hohen Hintergrundabsorption des Wassers und der geringen Extinktionskoeffizienten der Proteinschwingungsmoden erforderlich. Der überwiegende Teil der Messungen wurde mit (1-(2-nitrophenyl)ethyl)-caged ATP und Schweinenierenenzym bei 5° und 15°C durchgeführt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe mittels eines UV-Blitzes und somit der Freisetzung von ATP wurden zeitabhängig (Millisekunden bis Sekunden) die Differenzspektren verschiedener Teilreaktionen im Bereich von 2000 bis 950 cm-1 ermittelt. Der große Vorteil dieser Technik besteht in der Möglichkeit der Registrierung von Zustandsänderungen einzelner Aminosäuren des Proteins, in Bezug auf die Sekundärstruktur, Phosphorylierung, Protonierung und Kationenkoordination. Besonders gut können Änderungen an den Seitenketten der Aminosäuren Aspartat und Glutamat detektiert werden. Die enzymatische ATP-Hydrolyseaktivität der Na,K-ATPase wurde in den Proteinfilmen IR-spektroskopisch anhand der V as (PO2-) bei 1246 cm-1 bestimmt. Die Messungen der spezifischen Aktivität von Schweinenierenenzym ergab bei 15°C einen Wert von 34 nmol Pi mg-1 min-1. Vergleichsmessungen, die mit einem Standardaktivitätstest in Annäherung an die Protein-filmbedingungen durchgeführt wurden, ergaben Ergebnisse von der gleichen Größenordnung. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des kationischen Mediums konnten nach der photochemischen Freisetzung von ATP IR-Differenzspektren von drei verschiedenen Teilreaktionen untersucht werden: (1) ATP-Bindung, (2) Bildung des Phosphoenzyms E1P, (3) Bildung des Phosphoenzyms E2P. Des weiteren wurden Differenzspektren der AMPPNP-Bindung, der ADP-Bindung und der Ammoniumbindung, die mit der K+-Bindung vergleichbar ist, ermittelt. Alle Teilreaktionen führten zu unterschiedlichen Differenzspektren, die charakteristisch für die jeweiligen Zustandsänderungen sind. Durch geeignete Differenzbildung konnten ebenfalls die Differenzspektren der Phosphorylierung (EATP -> E1P) und der Phosphoenzym-Konversion (E1P -> E2P) berechnet werden. Sekundärstrukturänderungen können bei der IR-Spektroskopie innerhalb des Amid I-Bereichs zwischen 1700 und 1610 cm-1 detektiert werden. Die Ergebnisse der IR-Differenzspektroskopie zeigen, daß die Sekundärstruktur der Na,K-ATPase bei allen untersuchten Teilreak-tionen weitgehend konserviert bleibt. Unter den ermittelten Differenzspektren der Teilreaktionen resultiert die größte Netto-Sekundärstrukturänderung in einer Größenordnung von etwa 0,2 % (~3 Aminosäuren/Protomer) bei der E2P-Bildung. Als Folge der Bindung von ATP und ADP an das Enzym gibt es Evidenzen für die Beteiligung von Arginin. Die Bindung von AMPPNP an die Na,K-ATPase hingegen zeichnet sich klar durch andere molekulare Wechselwirkungen unter Beteiligung von Asp und/oder Glu aus. Die Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 1,2 M Na+ (E1P-Bildung) kann anhand von zwei Signalen der V (C=O) bei 1739 und 1709 cm-1, wobei eines der phosphorylierten Seitenkette Asp 369 zugeordnet wird, detektiert werden. Das zweite Signal wird der Protonierung eines Seitenkettenrestes Asp oder Glu zugerechnet, welches in Verbindung mit der Na+-Okklusion bei der E1P-Bildung stehen dürfte. Weitere Signale, die in Zusammenhang mit den molekularen Vorgängen bei der Phosphorylierung und Na+-Koordination stehen, können in der spektralen Region um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) detektiert werden. Das Differenzspektrum der Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 130 mM Na+ (E2P-Bildung) enthält keine Beiträge der Kationenokklusion oder -deokklusion. Dennoch enthält das Differenzspektrum der E2P-Bildung die Information über die Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2. Während E1 den Na+-affinen Zustand darstellt, repräsentiert E2 den K+-affinen Zustand der Na,K-ATPase. Das Signalprofil der Differenzspektren der E2P-Bildung unterscheidet sich stark von dem der E1P-Bildung. Neben der Phosphorylierung an Asp 369, die auch hier oberhalb von 1700 cm-1 anhand eines V (C=O)-Signals detektiert wird, können weitere positive und negative Signale sowohl oberhalb von 1700 cm-1 als auch im Bereich um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) nachgewiesen werden. Bei der Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2 können somit starke Änderungen an den Seitenketten von Asp und/oder Glu detektiert werden, die auf eine Neuorganisation der Kationenbindungsstellen der Na,K-ATPase schließen lassen. An dieser Neuorganisation sind sowohl Ände-rungen des Protonierungszustandes als auch Änderungen in der Koordinationssphäre der kationenkoordinierenden Gruppen Asp und/oder Glu beteiligt. Da von der Na,K-ATPase keine hochauflösenden Kristallstrukturen existieren, wurden die Kristallstrukturen der Ca-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums, ebenfalls eine P-Typ-ATPase, zur Erläuterung des Mechanismus der Kationenbindung herangezogen (Toyoshima et al., 2004b). Zur Ca-ATPase existieren bereits analoge IR-Differenzuntersuchungen. Dies bot die Möglich-keit des direkten Vergleichs gleicher Teilreaktionen innerhalb des gemeinsamen E1/E2-Reaktionsmodells. Dieser Vergleich zeigt, daß die Sekundärstrukturen beider Enzyme bei den jeweiligen Teilreaktionen weitgehend konserviert bleiben. Bei der Ca-ATPase können die größten Netto-Sekundärstrukturänderungen von etwa 0,3 % des Enzyms (~3 Aminosäuren/Enzym) als Folge der ATP-Bindung beobachtet werden (Barth et al., 1996). Bei dieser Teilreaktion werden bei der Na,K-ATPase die kleinsten Sekundärstrukturänderungen detektiert. Beim Vergleich der Signalprofile beider Enzyme weist der sekundärstrukturrelevante Amid I-Bereich bei der Phosphoenzym-Konversion auf konträre Strukturrelaxationen hin. Die Differenzspektren der Ca-ATPase im Vergleich zur Na,K-ATPase deuten auf eine sich unterscheidende Kationenkoordination hin. Durch eine Kombination der Resultate von IR-Differenz- und Fluoreszenzspektroskopie der FITC-Na,K-ATPase zur Charakterisierung von Enzymzuständen, konnte ein Modell zum Mechanismus der Inhibierung der Na,K-ATPase durch das Herzglucosid Ouabain postuliert werden. Durch Fluoreszenzmessungen an der FITC-Na,K-ATPase konnte gezeigt werden, daß Ouabain in Gegenwart von 20 mM Na+ an das Enzym bindet, was bei 130 mM Na+ nicht mehr der Fall ist. Aufgrund von IR-Differenzsignalen der E2P-Bildung, aufgenommen bei 20 mM Na+, ist es möglich, oberhalb von 1700 cm-1 (ν(C=O)), bei 1554 cm-1 (V as(COO-)) und bei 1408 cm-1 (V s(COO-)) zwischen der an Asp 369 phosphorylierten und unphosphorylierten Na,K-ATPase zu unterscheiden. Nach Ouabain-Zugabe hingegen konnten diese Signale nicht mehr detektiert werden. Bezüglich der Inaktivierung des Enzyms im Standardaktivitätstest, für dessen Ablauf Na+-Konzentrationen von um die 130 mM eingesetzt werden, kann gefolgert werden, daß Ouabain nicht an das freie, sondern an das phosphorylierte Enzym bindet und somit die Inaktivierung der Na,K-ATPase nach sich zieht.
In den letzten zwei Dekaden wurde die Rolle der RNA in biologischen Prozessen intensiv untersucht. Man erkannte immer deutlicher, dass ihre Funktion über die einfache Vermittlung von Information von der DNA hin zum Protein weit hinausgeht. So spielt sie eine entscheidende Rolle bei der Genexpression und besitzt darüber hinaus auch katalytische Eigenschaften. Die Entdeckung der reversen Transcriptase beim HI-Virus konnte zeigen, dass genetische Informationen nicht nur in Richtung von DNA zu RNA, sondern auch in Entgegengesetzter Richtung übertragen werden kann. Diese Schlüsselrolle in vielen wichtigen biochemischen Prozessen macht die RNA zu einem viel versprechenden Ziel für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, um in diese Prozesse eingreifen zu können. RNA bildet eine Vielzahl von stabilen Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die es Proteinen und Antibiotika ermöglicht, sie zu adressieren. Die bis heute wohl mit Ausnahme des Ribosoms und der tRNAs am besten aufgeklärte Struktur einer RNA ist die der HIV TAR-RNA (transaktivierende Region). Ein essentieller Bestandteil für die virale Genexpression ist die so genannte TAR-RNA. Diese befindet sich am 5-Ende aller viraler Transcripte und bildet eine aus 59 Basen bestehende stem-bulge-loop hairpin Struktur. Diese tritt in Wechselwirkung mit dem tat-Protein. Die Grundlage für die Erkennung des hierbei entstehenden Komplexes ist eine Wechselwirkung von tat mit der bulge- und loop-Region von TAR. Durch Interaktion mit der loop- Region kommt es zur Ausbildung eines CyclinT1/tat Komplexes, der im weiteren dafür verantwortlich ist, dass sich die Rate der Transkription um das mehrere hundertfache erhöht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Liganden zu synthetisieren, die spezifische Bindungen mit der TAR-RNA aus HIV-1 eingehen. Durch eine solche Bindung ist es möglich, den viralen Replikationszyklus zu unterbrechen. Ausgehend von einem relativ rudimentären Design, basierend auf dem Arginin-Fork-Model von Frankel, gelang es, mit Triaminopyrazol und verschiedenen seiner Derivaten dieses Ziel zu erreichen. Nach erfolgreicher Synthese der Zielstrukturen wurden diese in einem FRET-Assay im Hinblick auf ihre Affinität zu der TAR-RNA getestet. 3,4,5-Triaminopyrazol übertraf trotz seiner geringen Größe und Ladung mit einem IC50-Wert von 30 µM die Werte vieler tetrakationischer Tripeptide (FRET). Nach erfolgreicher Bestimmung der TAR-Affinität von Triaminopyrazol wurde seine Wirkung auf HIV-infizierte Hela P4-Zellen untersucht, die ein Tat-TAR-kontrolliertes Reportergen exprimierten. Dabei zeigte Triaminopyrazol eine Inhibierung mit IC50 = 50 µM. Bis zu einer Konzentration von 500 µM traten hierbei keine toxischen Effekte auf. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich bei Triaminopyrazol tatsächlich um einen tat- Antagonisten handelt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Triaminopyrazol nicht die eines Entryinhibitors ist, sondern dass die Verbindung in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen.