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Die thermische Zersetzung von Vitriolen MIISO4 H2O (M = Fe, Mn, Co, Ni, Zn und Mg) und von anderen Sulfathydraten wurde untersucht, um zu klären, ob sie für die Entdeckung der Schwefelsäure und deren Gewinnung nach dem früher üblichen Verfahren der Vitriolbrennerei in Betracht kommen. Eisenvitriol wird beim Erhitzen entwässert, durch Luft oxidiert und zerfällt bei etwa 550°C in ein Eisen(III)-oxidsulfat der wahrscheinlichen Zusammensetzung Fe16O9(SO4)15, aus dem bis 650°C alles Schwefeltrioxid abgespalten wird. Bei diesen Temperaturen zerfällt nur ein kleiner Teil des Schwefeltrioxids in Schwefeldioxid und Sauerstoff. Alle anderen Vitriole zersetzen sich erst bei 800-850°C vollständig, d.h. unter Bedingungen, unter denen überwiegend Schwefeldioxid gebildet wird. Die partielle Oxidation von Mangan und Cobalt, durch die Mn3O4 bzw.Co3O4 entstehen, findet ebenfalls bei 600-700°C statt. Die Zersetzung von Aluminium- und Eisen(III)-sulfat beginnt bei niedrigen Temperaturen und ist beim Eisen(III)-sulfat bei 600-700°C abgeschlossen. Aluminiumsulfat wird aber erst bei über 800°C vollständig zersetzt. Die Untersuchung der Zersetzungsreaktionen ließ verschiedene Zwischenprodukte erkennen, insbesondere Oxidsulfate, von denen einige – wie Fe16O9(SO4)15 – näher charakterisiert wurden. Die Schwefelsäure ist wahrscheinlich beim Erhitzen von Eisenvitriol entdeckt worden, der schon seit der Antike bekannt war. Mehrere Vorschriften zum Erhitzen von Eisenvitriol allein oder im Gemisch mit anderen Sulfaten sind aus der arabischen Alchemie des frühen Mittelalters bekannt. In Europa erscheinen solche Vorschriften im 13. Jahrhundert. Auch dem frühen technischen Verfahren seit dem 17. Jahrhundert lag die Zersetzung von Eisenvitriol unter Luftzutritt zu Grunde. Verunreinigungen durch andere Vitriole, insbesondere des Zinks und Mangans, haben vermutlich die Ausbeute verringert. Das neuere technische Verfahren, das bis 1900 betrieben wurde, ging von „Vitriolstein“ aus. Dieses Gemisch von Eisen(III)- und Eisen(II)-sulfat mit wenig Aluminiumsulfat und sehr geringen Mengen anderer Sulfate wurde durch Auslaugen von Vitriol- bzw. Alaunschiefer gewonnen. Welche Eisenverbindungen es enthielt, ist nicht sicher. Ihre Zersetzung lief aber wahrscheinlich ähnlich ab wie die von Eisen(III)-sulfat. Auch bei diesem Verfahren war der Eisensulfatgehalt des Rohstoffes entscheidend für den Erfolg.
In dieser Arbeit wurde die Kinetik von zwei Ca2-plus-aktivierten Membranproteinen untersucht: zum einen des endogenen Ca2-plus-aktivierten Chloridkanals der Xenopus-Oozytenmembran, zum anderen des heterolog in Oozyten exprimierten Na-plus-Ca2-plus-Austauschers NCX1, kloniert aus dem Meerschweinchen-Herzen. Der Ca2-plus-aktivierte Chloridkanal wird durch intrazelluläres Ca2-plus im submikromolaren Konzentrationsbereich (KD = 0.5 µMCa2-plus) aktiviert und hat eine hohe Permeabilität für Chloridionen. In der ausgereiften Eizelle spielt er eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des Fertilisationspotentials und verhindert durch eine Depolarisation der Membran eine Polyspermie. Der Na-plus-Ca2-plus-Austauscher ist in der Herzmuskelzelle für die Ausbildung des Exzitations- Kontraktions-Zyklus von Bedeutung, indem er für die Aufrechterhaltung des Ca2-plus- Gradienten (freies Ca2 intrazellulär ungefähr gleich 100 nm, extrazellulär ungefähr gleich 2 mM) über die Plasmamembran verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen transportiert der Na-plus- Ca2-plus-Austauscher ein Ca2-plus-Ion im Austausch gegen drei Na-plus-Ionen aus der Zelle hinaus, und nutzt somit den Na-plus-Gradienten neben dem Membranpotential als treibende Kraft. Als Messmethode wurde die Patch-Clamp-Technik in der inside-out-Makro-Patch- Konfiguration verwendet. Die Patch-Clamp-Technik erlaubt definierte ionale Bedingungen auf beiden Seiten der Membran. Cytoplasmatische Ca2-plus-Konzentrationssprünge wurden zum einen durch Lösungswechsel, insbesondere aber durch die Photolyse von DM-Nitrophen, einem photolabilen Ca2-plus-Chelator, hervorgerufen. Die Photolyse von DM-Nitrophen erlaubte, im Vergleich zum Lösungswechsel, sehr schnelle Ca2-plus- Konzentrationssprünge (Ca2-plus-Freisetzungsrate mindestens 38000 s-1). Die kinetischen Untersuchungen am Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal haben neue, über bisherige aus dem Lösungswechselexperiment bekannte hinausgehende, Erkenntnisse ergeben: Nach einem schnellen Ca2-plus-Konzentrationssprung geht dem Signalanstieg auf einen stationären Wert eine deutlich schnellere Verzögerungsphase (lag-phase) voraus. Sowohl der Signalanstieg als auch die Verzögerungsphase zeigen eine starke Ca2-plus-Abhängigkeit, sind aber nur sehr schwach spannungsabhängig. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Signalanstieg den spannungsabhängigen Ca2-plus-Bindungs-/Dissoziationsschritt von mindestens zwei Ca2-plus-Ionen widerspiegelt, während das spannungsunabhängige Kanalöffnen/ -Schließen durch die Verzögerungsphase repräsentiert wird. Bei Spannungssprungexperimenten mit hoher Zeitauflösung konnte eine schnelle Inaktivierung nach einer Depolarisation der Membran gesehen werden, die in Gegenwart von sättigenden intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationen zu einer Einwärtsgleichrichtung der Strom-Spannungskennlinie des stationären Stroms führt. Mit diesen Erkenntnissen konnte ein Reaktionsmodell für den Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal aufgestellt werden, mit dem sich die experimentellen Daten simulieren ließen. Die heterologe Expression des Na-plus-Ca2-plus-Austauschers in Oozyten hat zu einem deutlich verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu früheren Messungen am nativen Austauscher in Cardio-Myocyten-Membranen geführt. Mit Hilfe der Photolyse von DM-Nitrophen konnte erstmals eine vollständige Ca2-plus- und Spannungsabhängigkeit des vorstationären Einwärtsstroms, hervorgerufen durch einen cytoplasmatischen Ca2-plus-Konzentrationssprung, durchgeführt werden. Sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus- Austauschmodus zeigt sich ein transientes Einwärtsstromsignal (Anstieg messtechnisch nicht auflösbar), das sehr schnell relaxiert. Im Ca2-plus-Ca2-plus-Austauschmodus zeigt sich nur ein transientes Stromsignal (kein Nettoladungstransport im stationären Zustand), während im Na-plus-Ca2-plus-Austausch sich ein stationärer Einwärtsstrom einstellt. Das transiente Stromsignal hat eine deutliche Ca2-plus-Abhängigkeit sowohl für den Spitzenstrom (KM = 30.9 ± 3.0 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 57 ± 10 µM im Ca2-plus- Ca2-plus-Austausch) als auch für die Geschwindigkeitskonstante 1/t des Signalabfalls (KM = 98.5 ± 21.3 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 76 ± 11 µM im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch) gezeigt. Die Relaxation des Stromtransienten erfolgt sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus-Austausch mit einer maximalen Geschwindigkeitskonstanten von ungefähr gleich 10000 s -1 nach sättigenden Ca2-plus-Konzentrationssprüngen. Der Signalabfall hat sich über den gesamten untersuchten Ca2-plus-Konzentrationsbereich als spannungsunabhängig herausgestellt, während der Spitzenstrom bei positiven Membranpotentialen deutlich abnimmt. Dies führt zu einer Spannungsabhängigkeit der verschobenen Ladung (Integral des transienten Stromsignals) im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch. Aus diesen Erkenntnissen konnte für den Ca2-plus- Translokationszweig (im Rahmen eines konsekutiven Transportmodells) folgendes Reaktionsschema aufgestellt werden: Einem spannungsunabhängigen, sehr schnellen Ca2-plus- Bindungs/-Dissoziationsschritt (diffusionskontrolliert) auf der intrazellulären Membranseite folgt ein ebenfalls spannungsunabhängiger, aber ratenlimitierender Schritt (intrazellulärer Okklusionsschritt, asymmetrische Raten: 10000 vs. 1000 s-1). Der nachfolgende Ca2-plus-Translokationschritt muss sehr hohe Hin- und Rückraten aufweisen (ungefähr gleich 20000 s-1). Die Ca2-plus-Dissoziation/-Bindung auf der extrazellulären wird als sehr schnell (diffusionskontrolliert) und spannungsunabhängig angenommen. Weitergehende Einblicke haben der Sr2-plus-Ca2-plus- und der Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch geliefert. Während der Sr2-plus-Ca2-plus-Austausch nahezu das gleiche Verhalten wie der Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch gezeigt hat, konnte nach einem intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationssprung im Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch erstmals eine zusätzliche langsame Phase im Abklingen des transienten Einwärtsstromsignals beobachtet werden. Das transiente Signal hat im Vergleich zum Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch eine signifikant höhere Ladungsverschiebung aufgewiesen. Dies deutet auf einen zusätzlichen elektrogenen Reaktionsschritt hin (extrazelluläre Ca2-plus-Okklusion). Weitere elektrogene Schritte müssen im Na-plus-Translokationszweig (Na-plus-Bindungs- und Na-plus-Translokationsschritt) liegen. Mit den aus diesen Erkenntnissen aufgestellten Reaktionsschemata ließen sich die experimentellen Daten erfolgreich simulieren. Die Gesamttransportrate im Na-plus-Ca2-plus- Austausch liegt demnach bei ungefähr gleich 1000 s-1 bei Raumtemperatur und stimmt damit mit Literaturwerten von mehreren 1000 s-1 bei physiologischer Temperatur überein.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient in mehrzelligen Organismen nicht nur als mechanische Stütze, sondern nimmt direkten Einfluss auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration. Die Discoidin-Domain-Rezeptoren (DDR) 1 und 2 sind die bisher einzig bekannten ECM-bindenden Rezeptoren mit einer intrinsischen Kinaseaktivität. Rezeptor- Tyrosinkinasen spielen bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle. Sie nehmen durch Bindung spezifischer Liganden Signale außerhalb der Zelle auf und initiieren eine Signalkaskade, die letzlich zur Transkription oder Repression von Zielgenen führt. Nach Bindung von nativem Kollagen an die Rezeptoren DDR1 und DDR2 kommt es zu einer Homodimerisierung, die zur Autophosphorylierung der Rezeptoren führt. Eine generierte DDR1-Knock-out-Maus zeigt einen Defekt in der Differenzierung der Brustdrüse und ist nicht in der Lage, ihre Jungen zu säugen, die genauen Ursachen hierfür sind jedoch bislang unbekannt. Ebenso sind die Zielgene der aktivierten Rezeptoren und insbesondere die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse bislang wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde nach Zielgenen, die durch die Signalkaskade von DDR1 und DDR2 in ihrer Transkription beeinflusst werden, gesucht. Außerdem wurde die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse im Detail analysiert. Zur Auffindung von Zielgenen wurden Zelllinien generiert, in denen die Expression von DDR durch Doxycyclin reprimierbar ist und mit Hilfe von Microarrays auf die Deregulation von Matrixgenen sowie Matrix-assoziierten und -modifizierenden Genen untersucht. Agrin und alpha 3-Integrin konnten als gemeinsame, reprimierte Zielgene von DDR1 und 2 identifiziert werden. Der P-Selectin-Ligand PSGL-1 und das Proteoglykan Decorin wurden von beiden Rezeptoren induziert. Weiterhin wurde das Brustdrüsengewebe trächtiger DDR1-Knock-out-Mäuse mit dem Brustdrüsengewebe heterozygoter Mäuse verglichen. Dazu wurden Microarrays verwendet, auf denen 15.000 Gene abgebildet waren. Die Analyse zeigte eine Repression von MDGI (Mammary derived growth inhibitor), Osteopontin und WDNMI in DDR1-Knock-out-Mäusen, während die Transkription des IGF-Bindeprotein IGFBP-5 erhöht war. Die Deregulationen konnten mittels Real-time-PCR verifiziert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von DDR1 in der nichttransformierten Brustepithelzelllinie HC11 und in primären Brustepithelzellen aus DDR1-Knock-out Mäusen untersucht. Dabei konnte ein Defekt von DDR1-Knock-out Zellen in der terminalen Differenzierung beobachtet werden. Im Gegensatz hierzu differenzierten DDR1 überexprimierende HC11-Zellen schneller als HC11-Wildtyp-Zellen und bildeten größere Mengen des Differenzierungsmarkers beta-Kasein. Die Analyse verschiedener Signalwege, die bei der Differenzierung von Brustepithelzellen angeschaltet werden, zeigte, dass DDR1 eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion von Stat5a/b spielt. Die Prolaktin induzierte Stat5a/b-Phosphorylierung war in DDR1 exprimierenden HC11 Zellen stärker und länger anhaltend als in parentalen HC11 Zellen. Dieser Effekt konnte nach Aktivierung von DDR1 durch Typ I Kollagen noch verstärkt werden. In der vorliegenden Arbeit konnten PSGL-1, Decorin, Agrin und Integrina3 als Zielgene in DDR1 und DDR2 überexprimierenden Zellen identifiziert werden. Ferner wurde im Brustdrüsengewebe von DDR1-Knock-out-Mäusen eine Repression von MDGI, Osteopontin und WDNMI sowie eine Induktion von IGFBP-5 gefunden. Die Analyse DDR1 überexprimierender HC11 Zellen und primärer DDR1-Knock-out-Brustepithelzellen zeigte, dass DDR1 eine essentielle Rolle in der terminalen Differenzierung von Brustepithelzellen hat. Dabei konnte erstmals ein Einfluss von DDR1 auf die Prolaktin-induzierte Aktivierung von Stat5a/b gezeigt werden.
Das Rauchen von Kokain („Crack“) hat sich in den letzten Jahren weltweit verbreitet und Crack hat eine wichtige Stellung in der Gruppe der harten Drogen eingenommen. Der inhalative Konsum unterscheidet sich von den anderen Formen der Kokain-Aufnahme durch seine schnelle und intensive Wirkung sowie durch einen sehr starken, unkontrollierten Drang zum erneuten Konsum. Schwere gesundheitliche Schäden sind die Folge sowie auch soziale Isolierung und zwischenmenschliche Konflikte. Da zur Finanzierung der Crack-Sucht häufig Straftaten begangen werden, sind diese Fälle forensisch von besonderem Interesse. Im Gegensatz zum nasalen oder intravenösen Konsum entsteht ausschließlich beim Rauchen das Pyrolyseprodukt Anhydroecgoninmethylester (AEME), welches deshalb als Marker für einen Crack-Konsum angesehen wird. Die toxikologischen Aspekte dieser Substanz sind nicht ausreichend untersucht, um dessen toxikologisches Potential abschätzen zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten analytische Methoden entwickelt und der Metabolismus von AEME untersucht werden, um Daten an authentischen Proben von Kokainkonsumenten erheben zu können.
Durch die beiden Ionisationstechniken Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) und Electrospray-Ionization (ESI) sind Biopolymere für die Massenspektrometrie zugänglich geworden und die Zahl der biochemischen Applikationen ist sprunghaft angestiegen. Dagegen sind die zugrundeliegenden Prozesse der Ionenbildung nur zum Teil bekannt. Bei MALDI wird die Laserstrahlung durch die Matrix absorbiert, wodurch es zur explosiven Auflösung der festen Phase unter Bildung von geladenen Molekülen kommt. Der genaue Mechanismus vom Festkörper zum gasförmigen Ion ist nur teilweise aufgeklärt und Gegenstand vieler Diskussionen. Eine wichtige Funktion der Matrix ist die räumliche Separierung und Isolierung der Analyte beim Einbau in die Matrixkristalle. Während der Einschluß von Molekülen in Wirtskristalle schon früh als wesentliches Merkmal von MALDI erkannt wurde, ist bisher noch nicht systematisch untersucht worden, in welcher Form die Analyte im Kristall vorliegen. Genau diese Information ermöglicht jedoch Aussagen über die Relevanz verschiedener Mechanismen der Ionenbildung bei MALDI. Die Bestimmung des Ausgangszustandes des Analyten im Matrixkristall und die Abschätzung möglicher Reaktionen bei der nachfolgenden Freisetzung der Analytionen ist das zentrale Thema der vorliegenden Arbeit. In dieser wurde insbesondere der Ladungszustand der Analyte sowie der Einschluß von Lösungsmittel untersucht. Des weiteren wurden Experimente zur Zahl und Koordination möglicher Gegenionen, zur Neutralisation dieser Ionenpaare und zur Adduktbildung bei MALDI durchgeführt. Die Ergebnisse erlauben Aussagen über primäre und sekundäre Ionisationsreaktionen, die zu einem stimmigen Bild der Ionenbildung bei MALDI zusammengefaßt wurden. Grundlage des vorgestellten Modells sind bereits veröffentlichte Modelle, deren wesentliche Aspekte teilweise schon in den ersten Jahren nach der Einführung von MALDI, zu einem erheblichen Teil aber erst in jüngster Zeit erkannt wurden. Einen erneuten Anstoß für die Diskussion um den Mechanismus von MALDI gab die Hypothese, daß die Ionisation eng mit der Bildung von Clustern verbunden ist und dabei sowohl eine Freisetzung präformierter Ionen als auch nachfolgende Reaktionen unter Transfer von Protonen und Elektronen erfolgen. Der Ausgangspunkt für all diese Prozesse ist der Analyt im Matrixkristall. Die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente zeigen, daß einige wesentliche Postulate des "Cluster-Modells" richtig sind. Insbesondere konnte der Beweis geführt werden, daß Analyte geladen im Matrixkristall existieren und daß die gelöste Form des Analyten weitgehend im Matrixkristall konserviert wird. Als einfache Testsysteme wurden Matrixlösungen mit verschiedenen pH-Indikatoren versetzt und die Farbe der Kristalle dokumentiert. Dabei zeigte sich, daß in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung sowohl Moleküle mit einer positiven oder negativen Nettoladung als auch neutrale Zwitterionen gleichermaßen effizient in Matrixkristalle eingebaut werden. Die Ladung aller sauren und basischen funktionellen Gruppen des Analyten im Kristall ist damit durch den pH-Wert der Matrixlösung bestimmt. Wenn eine Nettoladung vorhanden ist, muß zudem diese Ladung durch Gegenionen kompensiert sein, so daß Ionenpaare entstehen. Aber auch bei Zwitterionen können Gegenionen vorhanden sein. Darüber hinaus gelang durch 1H-NMR-Spektroskopie der Nachweis, daß Lösungsmittel im Kristall eingeschlossen ist und selbst nach Trocknen der Kristalle bei erhöhter Temperatur oder im Vakuum dort verbleibt. Dies führt zu dem anschaulichen Bild, daß Analyte in Abhängigkeit vom pH-Wert als "Multi-Ionenpaare" und partiell solvatisiert im Matrixkristall konserviert werden. Ausgehend von diesen präformierten, solvatisierten Ionenpaaren wird durch den plötzlichen Energieeintrag des Laserpulses die explosive Bildung von Clustern ausgelöst. Für die Bildung von geladenem Clustern gibt es zwei plausible Erklärungsansätze. Durch die Existenz der geladenen Analyte im Kristall ist eine besonders einfache Ionisation unter Freisetzung "präformierter" Ionen durch die Trennung eines Ionenpaares denkbar. Eine zweite Möglichkeit wäre die Photoionisation eines Matrixmoleküls mit nachfolgendem Protonentransfer. Da aber stets negative Ladungen vorhanden sind (entweder im Analyten selbst oder als Gegenion), wird bevorzugt ein Anion neutralisiert. In beiden Fällen entsteht ein Cluster, der durch ein fehlendes oder neutralisiertes Gegenion geladen ist. Die Freisetzung des Analytions erfolgt durch Verdampfen von Neutralmolekülen (Matrix, Lösungsmittel). Ionenpaare werden durch Protonentransfer neutralisiert, so daß kleine Neutralmoleküle abdampfen und mit Ausnahme von Metallkationen keine ionischen Addukte detektiert werden. Der Protonierungsgrad des Analyten beim Einbau hat einen erheblichen Einfluß auf die detektierten Ionen. Sind bereits in Lösung und damit im Kristall positiv geladene Gruppen vorhanden, werden besonders leicht protonierte Molekülionen gebildet. Dagegen entstehen aus deprotonierten Vorläuferionen (in der Regel negativ geladen) verstärkt kationisierte Molekülionen. Dabei ist nicht die Nettoladung entscheidend, sondern die Existenz und Anzahl positiver und negativer Gruppen im Analyten. Die Kationisierung erfolgt bereits im Kristall, da die Ionen eine hohe, MALDI-typische Anfangsgeschwindigkeit zeigen. Die Koordination der Kationen an der negativen Ladung verhindert die Neutralisation durch Protonierung, die wesentlich für die Freisetzung von protonierter Molekülionen ist. Diese Neutralisation von Ionenpaaren ist auch die Ursache dafür, daß Anionenaddukte normalerweise nicht nachgewiesen werden. Durch Zugabe einer sehr starken Säure wird jedoch diese Zwischenstufe stabilisiert und erscheint in Form von Anionenaddukten im Spektrum. Dabei zeigte sich, daß die Anzahl der detektierten Addukte mit der Zahl der basischen Stellen im Analytmolekül korreliert, welches den Einbau von (mehrfach) geladenen Analytionen zusammen mit ihren Gegenionen bestätigt. Neben der Koordination der Anionen an positiv geladenen Stellen des Analyten ist die Energiebilanz des Protonentransfers dafür entscheidend, ob die Anionenaddukte den MALDI-Prozeß überstehen, so daß Anionen mit einer vergleichsweise geringen Gasphasenbasizität zur Adduktbildung neigen. Des weiteren kann die Konkurrenz verschiedener Anionen bei der Bildung der Ionenpaare eine Verschiebung der Adduktverteilung bewirken. Aber auch eine höhere Energiezufuhr (z.B. durch höhere Laserenergie) bewirkt eine verstärkte Neutralisation der Ionenpaare, wobei ein erheblicher Anteil metastabiler Fragmentierungen auftritt. Die Koordination von Gegenionen und die "metastabile Neutralisation" führt bei Verbindungen, die zur Ionenpaarbildung neigen, zur Peakverbreiterung und zu einer begrenzten Auflösung. Darüber hinaus sind bei MALDI weitere Sekundärreaktionen beteiligt. Dazu zählt die Übertragung von Wasserstoffatomen, die wahrscheinlich auch die Ursache für prompte Fragmentierungen ist (in-source decay, ISD). Ob eine Ladungsreduktion mehrfach geladener Vorläuferionen durch Elektronen auch bei Biopolymeren eine wesentliche Rolle spielt, bleibt dagegen weiterhin offen. Durch die in Abhängigkeit von der Nettoladung zunehmende Coulomb- Anziehung der koordinierten Gegenionen werden vermutlich erst gar keine hochgeladenen Ionen in die Gasphase freigesetzt. Die vorgestellten Ergebnisse ergeben ein plausibles, qualitatives Bild der Ionenbildung bei MALDI. Es wurde gezeigt, daß die gelöste Form des Analyten inklusive Ladungen, Gegenionen und Solvathülle bei der Kristallisation weitgehend erhalten bleibt, und daß diese Ausgangssituation entscheidend für die Art der letztendlich gebildeten Gasphasenionen ist. Zudem ist nicht die Protonierung neutraler Analyte, sondern eine Neutralisation von Ionen(paaren) durch Protonentransfer ein zentraler Bestandteil von MALDI.
Bei der Expression einer Phospholipase A2 aus Soja in Aspergillus oryzae (Probe PL-1007), Trichoderma viride (Probe PL-1008) und Pichia pastoris (Probe PL-1035) wurde neben der erwarteten Phospholipaseaktivität auch eine deutliche Lysophospholipaseaktivität beobachtet. Eine Trennung dieser Aktivitäten war nur mittels einer Free-Flow-Elektrophorese kurzzeitig möglich, bevor sich in jeder Fraktion wieder das ursprüngliche Aktivitätsverhältnis zwischen Phospholipase und Lysophospholipase einstellte. Zur näheren Untersuchung und Charakterisierung dieser Enzymsysteme wurden für einen gaschromatischen Aktivitätstest hochspezifisch substituierte Substrate eingesetzt, die eine parallele Bestimmung der Phospholipase- und Lysophospholipaseaktivitäten ermöglichten. So konnte gezeigt werden, dass nicht in allen Organismen eine Phospholipase A2 exprimiert wird, sondern es in Pichia pastoris (Probe PL-1035) zur Expression einer Phospholipase A1 kommt. Im Falle der Probe PL-1007 konnte die beobachtete Lysophospholipaseaktivität durch Versuche mit veränderten Substratverhältnissen zwischen Lysophospholipase- und Phospholipasesubstrat einem separaten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Durch elektrophoretische Trennungsversuche konnte gezeigt werden, dass es sich nicht nur um separate aktive Zentren, sondern um verschiedene Enzyme handelt. Die Tatsache, dass sich das Aktivitätsverhältnis nach der Trennung selbständig wieder einstellt, lässt das Vorliegen von Faltungsisomeren vermuten. Bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften weisen alle drei Enzymsysteme eine große Ähnlichkeit auf. Sowohl die Phospholipase- wie auch die Lysophospholipaseaktivitäten sind erst ab einer Reaktionstemperatur von über 70°C nicht mehr nachweisbar. Das Aktivitätsmaximum wurde in allen drei Fallen zwischen 45°C und 55°C beobachtet. Auch die pH-Bereiche in denen eine maximale enzymatische Aktivität zu beobachten ist, liegen mit pH 3,6 (PL-1007) bis pH 4,3 (PL-1035) für die Phospholipaseaktivitäten und pH 4,3 (PL-1007 / PL-1008) und pH 4,6 (PL-1035) in ähnlichen Bereichen. Die Aktivität der untersuchten Enzymsysteme zeigt jedoch im beobachteten pH-Bereich von pH 3 bis pH 5 nur eine geringe pH-Abhängigkeit. Deutlichere Unterschiede konnten jedoch für die Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Die Phospholipasen A2 zeigen tendenziell höhere Umsätze bei Substraten mit C 12:0 bis C 16:0 Fettsäureresten, während die Phospholipase A1 aus Probe PL-1035 maximale Umsätze bei C 18:0 Fettsäureresten aufweist. Bei allen Enzymproben jedoch bleiben die Umsatzraten der ein- bis mehrfach ungesättigten Fettsäurereste hinter denen der gesättigten zurück. Lediglich bei der Probe PL-1007 sind die Aktivitätsunterschiede zwischen gesättigten und ungesättigten Substraten nicht signifikant. Neben der Untersuchung der katalytischen Eigenschaften konnte im Rahmen dieser Arbeit die in der Literatur mehrfach aufgestellte These der Hemmung der Phospholipaseaktivität in Gegenwart von Uteroglobin bestätigt werden. Ein Hemmungsmechanismus aufgrund direkter Wechselwirkung der Enzyme konnte ausgeschlossen werden. Vielmehr konnte zweifelsfrei bewiesen werden, dass der Hemmungsmechanismus bei den hier eingesetzten Enzymsystemen auf einer Bindung des für die Phospholipasereaktion essentiellen Ca2+ durch das Uteroglobin zurückzuführen ist.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die Synthese, Eigenschaften und Anwendungsmöglichkeiten von Arylalkyl-Rückgrat modifizierten DNA-Oligonucleotiden untersucht. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, lipophile, arylalkylmodifizierte Oligonucleotide zu synthetisieren und die Auswirkungen der absoluten Konfiguration der Modifikationen auf die Eigenschaften der resultierenden Duplexe zu untersuchen. Als zweites sollten die Modifikationen in Antisense-Oligonucleotide eingebaut werden um diese auf ihre Anwendbarkeit für die lnhibierung der HCV Genexpression zu testen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 18 unterschiedliche Rückgrat-Modifikationen synthetisiert. Dabei wurde die Alkylkettenlänge wie auch die Größe des aromatischen Systems variiert. Zudem wurde untersucht, welchen Einfluss Ringsubstituenten auf die Eigenschaften der resultierenden Oligonucleotide ausüben. Die Rückgratmodifikationen wurden über die Festphasensynthese nach der Phosphoramiditmethode in Oligonucleotide eingebaut. Als Ausgangsverbindungen für die modifizierten Phosphoramidite dienten die Arylalkylhalogide. Diese wurden in einer dreistufigen in situ Reaktion - über das Grignard-Reagenz zu der entsprechenden cadmiumorganischen Verbindung und deren weitere Reaktion mit Phosphortrichlorid - zu den Arylalkyldichlorphosphanen umgesetzt. Die als Phosphorylierungsreagenzien fungierenden (Arylalkyl)(diisopropylamin)-chlorphosphane konnten durch Umsetzung mit N,N-Diisopropylamin erhalten werden. Die folgende Reaktion mit den 5'-hydroxyl- und aminogeschützten, natürlichen Nucleosiden führte zu den modifizierten Phosphoramidit-Bausteinen. Diese wurden mittels der OligonucleotidFestphasensynthese selektiv, an verschiedenen Positionen in sehr guten Ausbeuten in ModellOligonucleotide eingebaut und die erhaltenen Diastereoisomeren mittels RP-HPLC getrennt. Die einfach modifizierten, diastereoisomerenreinen Oligonucleotide zeigten eine signifikant erhöhte Lipophilie im Vergleich zu den unmodifizierten Strängen. Die Lipophilie nahm bei der Verlängerung der Alkylkettenlänge und der Vergrößerung des aromatischen Ringsystems pro (CH2)-Gruppe sowie pro weiterem Sechsring in konstanten Schritten zu, wodurch die Lipophilie gezielt gesteuert werden kann. Um den Einfluss der Modifikationen im Doppelstrang zu untersuchen wurden die Tm-Werte der Duplexe bestimmt und diese zudem CD- und Fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Die erhaltenen Tm-Werte variierten sehr stark in Abhängigkeit der Alkylkettenlänge, der Ringgröße und der absoluten Konfiguration. Mit den Rp-konfigurierten benzyl- (B), (naphth-1-yl)methyl- (I) und 2,4-difluorbenzylmodifizierten (M) Oligonucleotid-Duplexen konnte eine Schmelzpunktserhöhung erzielt werden. Auch konnte mit den 3-(Anthracen-9-yl)propylphosphonaten K eine signifikante Tm-Wert Steigerung aufgrund eines "Dangling-End-Effektes" beobachtet werden. Die erhaltenen Tm-Werte korrelierten hervorragend mit den erhaltenen CD- und Fluoreszenz-Daten. Für die Zuordnung der absoluten Konfiguration der Modifikation wurden drei 3-Phenylpropylphosphonat-Dimere E synthetisiert. Die Zuordnung erfolgte mittels der 2D-ROESY-NMR-Spektren und den berechneten Protonenabständen der diastereoisomerenreinen Dimere sowie über empirische Regeln die von den Methylphosphonaten S abgeleitet wurden. Diese Ergebnisse lassen sich auf längere Oligonucleotide übertragen. Neben den Untersuchungen der Charakteristika der Arylalkyl-Rückgrat modifizierten Oligonucleotide wurden während dieser Arbeit einige Modifikationen gezielt auf ihre Einsetzbarkeit für den Antisense-Einsatz getestet. Als RNA-Zielsequenz wurden die Nucleotide 326-342 der 5'-nicht codierenden Region des Hepatitis C Virus gewählt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf unterschiedlich modifizierte Antisense-Oligonucleotide synthetisiert. Die arylalkylmodifizierten Oligonucleotide zeigten gute Hybridisierungseigenschaften gegenüber der sense-DNA bzw. sense-RNA und eine deutlich erhöhte Stabilität gegenüber der Nuclease Pl. Ferner konnte die Lipophilie der Oligonucleotide signifikant gesteigert werden. Die 2-Phenylethylphosphonate (D) und 2,4-Difluorbenzylphosphonate (M) sind zudem in der Lage die RNase H zu aktivieren. Alle dargestellten Antisense-Oligonucleotide wurden in einem zellfreien in vitro- sowie in einem in vitro-Zellkultur-Translations-Assay auf ihr lnhibierungspotential gegen die Hepatitis C Virus Genexpression getestet. Dabei zeigten die Benzylphosphonate (B), Phosphorthioate (Ps) und die 2-Phenylethylphosphonate (D) im zellfreien in vitro Testsystem hohe, spezifische Inhibierungsraten (>87%), bei einer Oligonucleotid-Konzentration von 5 µM. Auch erwiesen sich die arylalkylmodifizierten Antisense-Oligonucleotide, mit Ausnahme der 4-Phenylbutylphosphonate F, als sehr gute lnhibitoren der HCV-Genexpression in CCI13- und HepG2-Zellen.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
Bei der in vitro Rückfaltung von entfaltetem, reduziertem Hirudin entstehen neben dem nativen Protein hauptsächlich zwei nicht-nativ gefaltete Konformere. Das Verhältnis von nativem und nicht-nativem Konformer lässt sich während der Rückfaltung durch verschiedene Parameter beeinflussen. Thiole wie reduziertes Glutathion (GSH), N-Acetylcystein (NAC) und Dithioerytritol (DTE) beeinflussten die in dieser Arbeit untersuchten Rückfaltungen auf verschiedene Weise. Während beim Zusatz von GSH sehr verstärkt die Bildung des nativen Konformers auftrat, wurde bei einem Zusatz von NAC und DTE einerseits ein leicht verbessertes Verhältnis von nativem zu nicht-nativem Konformer festgestellt, andererseits wurde aber eine stark vermehrte Oligomerbildung beobachtet. Die aufgestellte Theorie der Oligomerbildung konnte anhand graphischer Auswertung der zusätzlich auftretenden, im Nativgel höher laufenden Banden bestätigt werden. Bei Zusatz von GSH und GSSG (oxid. Glutathion) als Redoxpuffer im Molekülverhältnis 2:1 (10 mM) wurde bei 4°C eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin erreicht. Der Zusatz von 1 mM GSH bewirkte dagegen bei 28°C (höchste gewählte Temperatur) ebenfalls eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin-Konformer. Die Temperaturabhängigkeit der Rückfaltung zeigte sich auch in weiteren Untersuchungen. So ergaben die Rückfaltungen unter Zusatz von 1 mM DTE, NAC und 10 mM GSH bei 4°C eine wesentlich höhere Ausbeute an nativ gefaltetem Hirudin als bei höheren Temperaturen. Der pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 8,0 veränderte das Rückfaltungsmuster von Hirudin in den durchgeführten Untersuchungen nicht, obwohl Literaturdaten auf ein pH-Optimum von 8-9 für erfolgreiche Rückfaltungen hindeuten. Nativ und nicht-nativ gefaltetes Hirudin sowie die ebenfalls während der Rückfaltung entstandenen Oligomere ließen sich HPLC-chromatographisch trennen. Die in den Nativgelen auftretende, sehr übereinanderliegende Doppelbande des nicht-nativen Hirudins konnte per HPLC in zwei verschiedenen Konformere getrennt werden. Eine positive Beeinflussung der in vitro-Rückfaltung von Hirudin durch einen Zusatz der Oxidoreduktase Thioredoxin konnte eindeutig nachgewiesen werden. Bei einem äquivalenten Gehalt an Tioredoxin wurde die Rückfaltung zum nativen Konformer eindeutig begünstigt. Ein katalytischer Gehalt an Thioredoxin (Thioredoxin:Hirudin im Verhältnis 1:10) bewirkte die Rückfaltung ausschließlich zu nativem Hirudin. Auch bei einem Zwanzigstel Äquivalent Thioredoxin war noch eine positive Beeinflussung feststellbar. Bei einer S. lividans-Expression von Hirudin über ein pAX5a-Derivat wurde fast ausschließlich nicht-nativ gefaltetes Hirudin produziert. Die nicht-native Faltung war in einem Nativgel deutlich von der nativen, aktiven Form des Inhibitors zu unterscheiden. Durch Zusätze von reduziertem (GSH) und oxidiertem Glutathion (GSSG) zum Wachstumsmedium konnte der Anteil an nativem Hirudin erhöht werden. Die Zusätze beeinflussten aber stark die Gesamtausbeute des sekretierten Proteins. So wurden unter Zugabe von 1 mM GSH Ausbeuten von 200 mg/L Hirudin erreicht, davon 2 mg/L natives Protein. Die Gegenwart von verschiedenen Verhältnissen von GSH und GSSG (Gesamtkonzentration 1mM Thiol) reduzierte die Hirudinproduktion auf 20 – 32 mg/L, darunter war kein erkennbarer Anteil an nativem Hirudin. Ein Zusatz von gleichen Verhältnissen von GSH und GSSG in höherer Konzentration (10 mM) resultierte in einer Steigerung des Anteils an nativem Inhibitor auf 14 %, die Gesamtausbeute an Hirudin sinkt aber deutlich (15 mg/L insgesamt, 2 mg/L natives Protein). Die Oxidoreduktase Thioredoxin wurde ebenfalls über ein pAX5a-Derivat in S. lividans-Kultivierungen mit einer Ausbeute von 65 mg/L gewonnen. Eine Coexpression von Thioredoxin und Hirudin über ein bicistronisches Gen in einem pAX5a-Derivat resultierte in einer Proteinproduktion von 4 mg/L Thioredoxin und 20 mg/L Hirudin. Obwohl ein Verhältnis von 0,2:1 Moläquivalenten (Thioredoxin:Hirudin) in den in vitro-Rückfaltungen zu 100 % nativ gefaltetem Inhibitor führte, war in den Kultivierungen kein positiver Einfluß des Thioredoxins auf die Hirudinfaltung erkennbar. Die Expression von Thioredoxin setzte zeitlich sehr viel früher als die Hirudin-Expression. Die Produktion von Hirudin über einen integrativen Vektor erzielte 600 - 700 mg/L Protein. Wie in anderen Hirudinkultivierungen ohne Thiolzusatz wurde Hirudin ausschließlich in der inaktiven, nicht-nativen Struktur produziert. Kultivierungen der mit dem integrativen Thioredoxin-Vektor infizierten S. lividans-Zellen erzielten dagegen kein Protein. Die Coexpression von Hirudin und Thioredoxin scheiterte an dem nicht zu generierenden, bicistronischen integrativen Vektor. Um die Isomeraseaktivität des Thioredoxins zu erhöhen und somit eine größere Beeinflussung der Hirudinfaltung zu erzielen, wurden Thioredoxinmutanten hergestellt. Die redoxaktiven CXXC-Zentren der generierten Thioredoxine enthalten die Aminosäuresequenzen der CXXC-Motive von E. coli DsbA und DsbC und humanem PDI. Die Expression aller Mutanten gelang in zwei verschiedenen Medien. Eine Isolierung und Anwendung der gereinigten Mutanten in der Hirudinfaltung wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt. Die Konstrukte stehen für weitere Arbeiten zur Verfügung. In vergleichenden Expressionen mit fünf verschiedenen Signalsequenzen wurden sowohl das homologe Streptomyces-Protein Tendamistat als auch das heterologe Hirudin über jeweils alle Signalpeptide exprimiert. Tendamistat wurde schon zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase exprimiert Innerhalb der verschiedenen Kultivierungen wurden unterschiedlich hohe Expressionswerte erreicht. Eine ausgeprägte Anreicherung von Vorläufer-Proteinen in der Zelle fand nicht statt. Neben dem vorwiegend nativ prozessierten Tendamiastat zeigte eine Analyse der Massendaten eine teilweise falsche Prozessierung der AxeA-, CelB- und SnpA-Signalpeptide. Hirudin konnte ebenfalls über alle fünf Signalpeptide exprimiert werden. Dabei wurde fast quantitativ nicht-nativ gefaltetes Hirudin sekretiert. Die Höhe der Expression über die verschiedenen Signalpeptiden war unterschiedlich hoch, wobei die Unterschiede geringer als bei der Tendamistat-Expression waren. Die Massenanalytik belegte, dass die Prozessierung des heterologen Hirudins wesentlich uneinheitlicher erfolgte als die Prozessierung des homologen Tendamistats. Ein Zusammenhang zwischen der Expressionshöhe beider Proteine und verschiedener Strukturmerkmale der Signalpeptide konnte nicht festgestellt werden. So wurde die in der Literatur aufgestellte These, dass in der n-Domäne mindestens zwei Ladungen enthalten sein müssen, in dieser Arbeit nicht bestätigt. Weder die Struktur noch die unterschiedliche Ladung der n-Domäne der Signalpeptide zeigten einen eindeutigen Zusammenhang mit der Expressionshöhe der Proteine. Auch eine Verknüpfung zwischen der Länge der h-Domäne und der Expressionshöhe konnte weder für die Tendamistat- noch für die Hirudinexpression erstellt werden. Die Positionierung von Glutamin an Position –2 innerhalb der c-Domäne schien in der Tendamistatexpression bezüglich der Proteinausbeute von Vorteil zu sein. Bei der Expression von Hirudin wurde ein ähnlicher Trend nicht gefunden. Die Proteinproduktion über ein Signalpeptid mit enthaltenem TTALeu-Codon war entgegen Literaturaussagen möglich und verminderte - wie in der Hirudinexpression gezeigt - nicht automatisch die Expressionshöhe. Bei den Tendamistatkultivierungen wurde dieser Einfluss jedoch deutlich. Theoretische Betrachtungen zur Prozessierung anhand von Rechenmodellen waren hilfreich, um Beobachtungen zu erklären oder zu deuten. So wurde eine Erklärung der zusätzlichen falschen Prozessierung der Sigalpeptide vom homologen und auch vom heterologen Protein über theoretische Modelle wie z. B. eine Schnittstellenberechnung teilweise möglich. Die Überlegungen zum Transmembran-Bereich der Signalpeptide zeigen im Vergleich der Berechnungen für Tendamisitat und Hirudin, dass die Ladung des N-Terminus des anhängenden Proteins ein Rolle bei die Positionierung des Signalpaptids innerhalb der Membran spielt und somit auch für die Präsentation der Schnittstelle und eine erfolgreiche Prozessierung verantwortlich ist. Die bisher verfügbaren Literaturdaten lassen darauf schließen, dass es allgemeine Richtlinien in Bezug auf Aminosäurezusammensetzung, sowie Ladung und Länge der Signalpeptide gibt, deren Mißachtung eine Verringerung der Expressionshöhe von Proteinen bewirken. Diese Richtlinien scheinen aber hauptsächlich bei einzeln eingefügten Mutationen zu bestehen. Werden, wie in dieser Arbeit vorgestellt, ganze Signalpeptide ausgetauscht und die resultierende Expression beobachtet, können viele dieser Vorgaben nicht verifiziert werden oder stimmen nur in Einzelfällen überein. Trotzdem zeigt diese Arbeit, dass theoretische Betrachtungen für Vorhersagen zur Proteinexpression unabdingbar sind.