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Photolabile Schutzgruppen haben sich im Laufe der letzten Jahre als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung und Regulation biologischer Prozesse etabliert. Dabei wird die photolabile Schutzgruppe auf geeignete Weise mit Biomolekülen verknüpft, sodass deren Funktion temporär deaktiviert wird. Durch Bestrahlen mit Licht geeigneter Wellenlängen wird die photolabile Schutzgruppe entfernt und die Aktivität des Biomoleküls bzw. des zu beobachtenden Prozesses wiederhergestellt. Die Grundlagen der Verwendung photolabiler Schutzgruppen im biologischen Kontext wurden in zwei Pionierarbeiten 1977 von J.W. ENGELS und 1978 von J.F. HOFFMAN gelegt. Davon ausgehend haben sich zahlreiche Anwendungen photolabiler Schutzgruppen für biologisch interessante Molekülklassen entwickelt. Auf dem speziellen Gebiet der Nukleinsäuren wurden in den letzten Jahren einige fundamentale Mechanismen entdeckt und aufgeklärt, die nicht zuletzt auch therapeutisch interessante Anwendungsmöglichkeiten für photolabile Schutzgruppen bieten. Hierbei stellt das An-/Aus-Schaltverhalten von Nukleinsäuren jedoch ein nicht-triviales Problem dar. Selbst der gezielte Einbau einer einzelnen photolabilen Schutzgruppe in ein multifunktionales Oligonukleotid führt in der Regel nämlich nicht zu einer vollständigen Deaktivierung dessen. Ein multipler Einbau photolabiler Schutzgruppen entlang der Sequenz eines funktionellen Oligonukleotids schaltet die Hintergrundaktivität im deaktivierten Zustand zwar vollständig aus, allerdings müssen in diesem Fall hohe Bestrahlungsintensitäten bzw. –dauern für das Entfernen aller photolabilen Modifikationen angewendet werden. Dadurch geht zum einen die Zeitauflösung der lichtgeschalteten Prozesse verloren, nicht zuletzt erhöht sich dabei aber auch das Risiko von lichtinduzierten Schäden am biologischen System. Das Kernthema der vorliegenden Dissertation war es daher, neue Architekturen für den Aufbau photoaktivierbarer Oligonukleotide zu entwickeln.
Das erste große Projekt basierte auf der Annahme, dass sich Duplexstrukturen, die für die Funktion vieler Nukleinsäuremechanismen fundamental sind, durch Zyklisierung von Oligonukleotiden global destabilisieren und damit effizienter photoaktivieren lassen, als durch lokalen Einbau einzelner photolabiler Schutzgruppen in Oligonukleotide. Hierzu wurden geeignete Alkin-Modifikationen an photolabile Nitrobenzyl- und Cumarin-Schutzgruppen angebracht und diese an die Nukleobasen verschiedener DNA-Bausteine geknüpft. Es ist daraufhin gelungen, Oligonukleotide mit je zwei photolabilen Alkin-Modifikationen herzustellen und diese intrasequentiell über eine Cu(I)-katalysierte Click-Reaktion mit einem Bisazid-Linker zu zyklisieren. Die so erhaltenen Oligonukleotide wiesen dramatisch erniedrigte Schmelzpunkte gegenüber den nativen Duplexen, sowie gegenüber den zweifach photolabil geschützten Oligonukleotiden auf. Dabei wurde außerdem festgestellt, dass Zyklisierungsparameter wie die Linkerlänge, -polarität und –flexibilität und die Wahl der photolabilen Schutzgruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Duplexstabilität hat. Über einen Bereich von Ringgrößen zwischen ca. 11-21 Nukleotiden wurden die niedrigsten Duplexstabilitäten beobachtet. Sehr kleine, sowie große Ringe ab 30 Nukleotiden wiesen dagegen höhere Stabilität auf.
Da mit dem entwickelten Zyklisierungskonzept auch mehrere Ringstrukturen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz aufgebaut werden können, wurde im nächsten Schritt eine photoaktivierbare Variante des C10-Aptamers hergestellt, welches selektiv gegen Burkitt’s Lymphomzellen bindet. Dieses 90-mer DNA-Oligonukleotid wurde an drei Stellen photolabil Alkin-modifiziert und infolge mit einem Trisazid-Linker zu einer bizyklisierten Struktur verknotet. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten konnte demonstriert werden, dass das durch eine solche „Photo-Klammer“ deaktivierte C10-Aptamer keine Bindungsaffinität gegenüber Burkitt’s Lymphomzellen aufweist, die Bindungsaktivität jedoch nach Belichten wiederhergestellt werden kann. Mit Atomkraftmikroskopie-Experimenten ist es darüber hinaus gelungen, die Photoaktivierung des verknäuelten C10-Aptamers mit molekularer Auflösung abzubilden. Mit diesem Ergebnis können nun lange funktionelle Oligonukleotide auf definierte Weise photoaktivierbar gestaltet werden, insbesondere auch dann, wenn keine (Informationen über) funktionelle Sekundärstrukturen existieren.
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RNA hat neben der Rolle als Informationsüberträger wichtige Aufgaben in regulatorischen Prozessen. Sie kann komplexe Strukturen ausbilden und ähnlich wie Proteine Liganden binden oder enzymatische Reaktionen katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zwei Beispiele von RNA-Liganden-Interaktionen untersucht werden. Im ersten Abschnitt wurde die Interaktion des TetR-bindenden Aptamers 12-1 mit dem Tetracyclin-Repressorprotein (TetR) biochemisch charakterisiert. Über Gelverzögerungs- experimente wurde gezeigt, dass das Aptamer 12-1K delta A TetR mit hoher Affinität und Spezifität bindet. Es wurde ein KD von 22 nM bestimmt. Die Bindung ist dabei ebenso stark wie die Bindung von TetR an die Operatorsequenz tetO. In Anwesenheit von Tetracyclin (Tc) nimmt die Affinität des TetR/Aptamer-Komplexes um das sechsfache ab. Des Weiteren konnten die Bindeepitope des Aptamers durch eine Analyse von verschiedenen TetR-Mutanten im DNA-Bindebereich bestimmt werden. Die Aminosäuren T27, N47 und K48 sind dabei essentiell für die RNA-Bindung und führen bei einem Austausch zum Verlust der RNA-Bindung. Der Bindebereich des Aptamers überlappt mit Aminosäureresten, die für die tetO-Bindung essentiell sind. Die Stöchiometrie der TetR/Aptamer-Bindung wurde durch LILBID-Messungen auf eine molare Verteilung von 2:1 festgelegt. Ein TetR-Dimer bindet dabei ein Aptamermolekül. Durch die umfassende biochemische Analyse der TetR/Aptamer-Bindung kann das Aptamer 12-1 nun als Expressionssonde für RNAs in bakteriellen Zellen genutzt werden. Des Weiteren kann das Aptamer als alternativer, artifizieller Transkriptionsregulator im tet on / tet off-System verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten miRNAs identifiziert werden, die an der posttrans- kriptionellen Regulation der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der Cyclooxygenase-2 (COX-2) beteiligt sind. Mit bioinformatischen Vorhersageprogrammen wurden die 3’-UTR- Bereiche von 5-LO und COX-2 nach putativen Bindestellen abgesucht. Im Fall der 5-LO wurden durch eine zusätzliche Microarray-Expressionsanalyse miRNAs ausgewählt, welche in 5-LO positiven Zellen hoch exprimiert sind und Bindestellen im 3’-UTR aufweisen. Es konnten verschiedene miRNAs detektiert werden, jedoch keine Regulation der 5-LO Aktivität beobachtet werden. Für COX-2 wurde neben der Suche nach putativen miRNA-Bindestellen zudem die Stabilität des 3’-UTR untersucht. Mit Hilfe des auf Perl basierenden Programms SignificanceScoreAssignment (Florian Groher, Diplomarbeit 2011) konnte der 3’-UTR von COX-2 als generell destabilisierend analysiert werden. In Colonkarzinom- spezifischen HT-29-Zellen wurden miRNAs untersucht, welche Bindestellen im 3’-UTR von COX-2 aufweisen. In diesem Kontext sollte der Einfluss einer Interaktion von HT- 29-Zellen mit aktivierten Thrombozyten sowie daraus isolierten Bestandteilen wie Mikropartikeln und PDGF analysiert werden. MiR-16, miR-26b, miR-199a und miR- 199a* konnten in HT-29-Zellen nachgewiesen werden. Bei einer Stimulation von HT-29- Zellen mit PDGF-BB werden miR-16 und miR-26b konzentrationsabhängig stärker exprimiert, während die Expression von miR-199a und miR-199a* signifikant abnimmt. Eine direkte Regulation von COX-2 durch die untersuchten miRNAs konnte durch Überexpressions- und Reportergenanalysen jedoch nicht festgestellt werden. Die Analysen der 5-LO- und COX-2-Regulation durch miRNAs stellen Vorarbeiten dar. Die etablierten Methoden können nun für eine detaillierte Betrachtung weiterer miRNAs verwendet werden.
Untersuchung der Konformation und Dynamik von RNA mit Hilfe fluoreszierender Farbstoffmoleküle
(2010)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der konformationellen und elektronischen Eigenschaften sowie der Dynamik verschiedener RNA-Systeme. Zur Durchführung dieser Experimente wurde zusätzlich zu bereits vorhandenen statischen und zeitaufgelösten Absorptionsspektrometern im Rahmen dieser Arbeit eine Apparatur zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern entwickelt, die durch die integrative Verwendung zweier verschiedener, etablierter Technologien (TCSPC und Aufkonvertierung) über einen weiten Zeitbereich von 9 Größenordnungen (100 fs - 0,1 ms) operiert. Mit diesem Aufbau konnten neben den RNA-Studien wichtige Beiträge zum Verständnis der Isomerisierung eines Retinalproteins, des Transportprozess des Membrantransportproteins TbSMR und der im Infraroten liegenden Fluoreszenz des Radikalkations von Astaxanthin gewonnen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit liegt auf der Untersuchung verschiedener RNA-Systeme: So werden die optischen Eigenschaften einer 1-Ethinylpyren-modifzierten RNA-Adeninbase allein und in RNA-Strängen eingebunden untersucht. Statische Fluoreszenzmessungen zeigen einen ausgeprägten Ladungstransfercharakter des Chromophors und eine generell große Wechselwirkung zwischen Ethinylpyren und Adenin, die in einer substanziellen Änderung der optischen Eigenschaften des Pyrens resultiert. Die Untersuchung der schnellen Photodynamik von Pyrenadenin zeigt zudem eine Verringerung der Lebensdauer von Pyren um etwa 2 Größenordnungen. Pyrenadenin zeigt sowohl Fluoreszenz eines neutralen (100-200 ps), als auch eines energetisch tiefer liegenden Ladungstransferzustands (1-2 ns). Die Formationszeit des Ladungstransferzustandes fällt mit steigender Polarität des Lösemittels. Eingebunden in Modell-RNA-Stränge ist Fluoreszenzquantenausbeute des Chromophors ein deutlicher Indikator für seine Interkalation. Nur in der stabileren Umgebung von GC-Basenpaaren ist das Pyren in der Lage, sich dauerhaft innerhalb des Duplex aufzuhalten, während in einer flexibleren AU-Umgebung eine Position außerhalb des RNA-Duplex präferiert wird. Transiente Absorptionsmessungen zeigen, dass die Photophysik des in RNA eingebundenen Pyrenadenins nur kleine Variationen im Vergleich zur Photophysik des Labels allein aufweist. Die deutliche Abnahme der Quantenausbeute des interkalierten Chromophors geht hauptsächlich auf Kosten der langlebigeren Ladungstransferfluoreszenz, so dass interkaliertes Pyren insgesamt schneller in den Grundzustand zurückkehrt als nicht interkaliertes. Mit Hilfe eines doppelt modifizierten Duplex, bei dem sich jeweils ein Farbstoff an einem der beiden Stränge befindet, kann nachgewiesen werden, dass aufgrund von Exzimerwechselwirkungen eine Verschiebung des Fluoreszenzmaximums von 35 nm auftritt. Kurzzeitspektroskopische Messungen zeigen Signale, die als Superposition von Monomeren und Exzimeren interpretiert werden können, wobei die Lebensdauer des letzteren mit 18,5 ns die der Monomerkomponente um ein Vielfaches übertrifft. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit einer Studie zur Bindung des fluoreszenten Liganden Tetrazyklin an das Tetrazyklin bindende Aptamer. Hier wird auf Basis verschiedener Mutanten mit Hilfe des TCSPC eine Analyse der Stabilität der Bindetasche sowie mit der Stopped-Flow-Methode eine Beobachtung des Bindungsprozesses durchgeführt. Insgesamt folgt die Bindung des Tetrazyklins an das Aptamer einer zweistufigen Kinetik, deren zweiter Schritt irreversibel ist. Die Bindung läuft, verglichen mit anderen Aptameren, sehr schnell ab. Während die Mutationen von A13 und A50,die direkte Kontakte zum Substrat bilden, nur einen leichten Einfluss auf beide Bindungsschritte ausüben, führt eine Mutation der für die Präformation verantwortlichen Base A9 zu einer Verlangsamung des Bindungsprozesses um mehr als einen Faktor 20 durch eine immens gesteigerten Rückreaktionsrate des ersten Bindungsschritts. Hieraus lässt sich schließen, dass bei fehlender Präformation des Aptamers nur wenige Tetrazyklinmoleküle ein für vollständige Bindung geeignetes Aptamer vorfinden. Die Bindung an A13 und A50 geschieht bereits im ersten Schritt des Bindungsprozesses. Ferner konnte anhand von Lebensdauermessungen gezeigt werden, dass nach dem Wildtyp die Mutante A9G die stabilste Bindetasche aufwies. Das Fehlen eines direkten Kontaktes wirkt sich deutlich stärker aus. Insbesondere führt die Abwesenheit der Fixierung des Gegenions durch A50 zu der instabilsten Bindetasche. Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, ist die zeitaufgelöste optische Spektroskopie insbesondere in Verbindung mit fluoreszierenden Molekülen ein ausgezeichnetes Mittel zur Beobachtung von Struktur und Dynamik von RNA. Die Empfindlichkeit von Fluoreszenz auf die Veränderung der Umgebung des Chromophors erlaubt es, Konformationsdynamik und elektronische Konfigurationen in Echtzeit zu beobachten.