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Für das Verständnis der Proteinfaltung ist es von Interesse, die phi,psi-Torsionswinkelverteilung und deren Abhängigkeiten innerhalb einer Polypeptidkette zu kennen. Mit der in dieser Arbeit verwendeten Kombination aus MD-Simulation und NMR-Spektroskopie wird die Abhängigkeit der Konformationsverteilung kurzer alaninbasierter Modellpeptide mit einer Genauigkeit von 5 % bestimmt. Die Berechnung der thermischen Populationen der einzelnen Konformationen beruht auf einer Minimierung der Differenz aus experimentellen und berechneten skalaren Kopplungskonstanten. Trialanin populiert überwiegend den Bereich der Polyprolin Typ II Helix (~ 90 %) und daneben den beta-Faltblattbereich mit ca. 10%, jedoch nicht den alphaR-helicalen Bereich. Diese Konformationsverteilung ändert sich nicht signifikant mit zunehmender Kettenlänge in der Peptidreihe Ala3 bis Ala7. Das in der Seitenkette verzweigte Trivalin populiert dagegen alle drei Konformationsbereiche signifikant. Aufgrund der Periodizität der Torsionswinkel populiert Triglycin einen zusammenhängenden Bereich, der sich an den vier Ecken des Ramachandran-Diagramms befindet. Zudem befindet es sich in einem langsamen konformationellen Gleichgewicht zwischen der cis- und trans-Konformation der Peptidbindung. Die Temperaturabhängigkeit der Konformationsverteilung wird am Beispiel von Trialanin untersucht. Die 3J(HN,Ha) Kopplungskonstanten nehmen linear mit der Temperatur zu. Dies ist auf eine Zunahme des beta-Faltblattanteils zurückzuführen und kann theoretisch beschrieben werden. Die Konformationsverteilung der Trialaninsequenz innerhalb einer heteropolymeren Aminosäuresequenz ist von der Kettenlänge der an dem N- und C-Terminus angefügten heteropolymeren Aminosäuresequenz abhängig. Dies wird an zwei Peptiden, abgeleitet von der Sequenz des Proteins Lysozym aus Hühnereiweiß, gezeigt. Das kürzere Peptid hat an beiden Enden jeweils drei Aminosäurereste angefügt, das längere jeweils acht Aminosäurereste. Die Konformationsverteilung der Trialanisequenz des kürzeren Peptids entspricht nahezu der in der Peptidreihe Ala3 bis Ala7. Die Verteilung des längeren Peptids ist dagegen deutlich verschieden (~ 35% alphaR-helicaler Anteil). Die 1HN und 15N chemischen Verschiebungen der Trialaninsequenz des längeren Peptids sind mit denen des entfalteten Lysozym-Proteins identisch und demzufolge aller wahrscheinlichkeit nach auch die Konformationsverteilung. Kurze homopolymere Peptide eignen sich deshalb nicht als Modell für Aminosäuresequenzen in längeren heteropolymeren Peptiden.
Auxiliar-vermittelte Synthese von nicht-natürlichen Aminosäuren als Bausteine für RNA-Liganden
(2005)
In den letzten Jahren wurde deutlich, daß mRNAs regulatorische Elemente aufweisen.Ein Beispiel hierfür ist z. B. die Transkription des Human Immunodeficiency Virus Typ1 (HIV-1). Die Arginin-reiche Domäne des Tat-Proteins interagiert hierbei mit einer Bindungstelle innerhalb der Bulge-Region der TAR-RNA. Das Vorliegen des hochkonservierten Tat-TAR-Komplexes ist die Voraussetzung für die effiziente Transkription viraler Gene. Eine kompetitive Bindung synthetischer Liganden an die Bulge-Region sollte daher den viralen Vermehrungszyklus unterbrechen. Hochspezifische Liganden mit inhibitorischem Potential sind somit von größtem Interesse. Für eine hohe Liganden-Affinität sind neben ionischen Wechselwirkungen und HBrücken-Interaktionen vor allem auch Stapelwechselwirkungen (stacking) von entscheidender Bedeutung. Die Ligandensuche wurde auf Tripeptide fokussiert. Da die Anzahl natürlich vorkommender aromatischer Aminosäuren sehr limitiert ist,erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst eine stereoselektive Synthese von neuen,nicht-natürlichen Aminosäuren mit heteroaromatischen Seitenketten. Um den generellen Einsatz dieser Bausteine in kombinatorischen Bibliotheken zu demonstrieren,wurden zunächst Tripeptide des Musters Arg-X-Arg hergestellt. Bereits diese Tripeptide zeigten in einem Fluoreszenz-Assay inhibierende Effekte auf den Tat- TAR-Komplex von HIV-1 mit IC50-Werten von 2 - 80 µM. Diese vielversprechenden Liganden wiesen auch in einem Tat-TAR kontrollierten Reportergen-Assay stark inhibierende Wirkung in den Zellkulturen auf. Am Beispiel eines Peptides ließ sich mittels NMR-Spektroskopie eine Komplexkonformation bestimmen, die der des bekannten TAR-Argininamid-Komplexes entspricht. Durch den Einsatz von nichtnatürlichen und Standard-Aminosäuren in kombinatorischen Tripeptidbibliotheken (split and combine-Methode) konnte die Suche von potentiellen Peptid-Liganden um ein Vielfaches erweitert werden. Über ein on-bead-Screening ließen sich weitere vielversprechende TAR-bindende Tripeptide identifizieren. Die RNA-Ligandensuche wurde desweiteren auf die psi-RNA (HIV-1) und auf die mRNA des onkogenen bcr-abl Proteins ausgeweitet. Auch hier konnten einige RNA-bindende Tripeptide isoliert werden.