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1.1 Hintergrund Diese Studie vergleicht in drei Teilen die konservative Behandlung nichtverschobener, nichtdislozierter Unterkiefergelenkfortsatzfrakturen mit der offenen Reposition und Fixierung verschobener und dislozierter Unterkiefergelenkfortsatzfrakturen bei I. Erwachsenen und II. bei Kindern. In einem speziellen III. Teil der Arbeit wird die geschlossene, konservative gegenüber der offenen, operativen Behandlung von nichtdislozierten hohen (Klasse VI nach Spiessl und Schroll1) Gelenkwalzenfrakturen verglichen. 1.2 Patienten und Methodik 1.2.1 Erwachsene 129 Patienten mit 158 Frakturen wurden von 2000 bis 2005 in die Studie aufgenommen. Klassen II bis V, d.h. verschobene und dislozierte Frakturen wurden operiert, also offen reponiert und intern fixiert, fortan als ORIF bezeichnet. Klasse I und VI (nichtverschobene, nichtdislozierte Frakturen) wurden konservativ therapiert und erhielten die geschlossene Therapie, fortan als GT bezeichnet. Nach einem Jahr wurden Gesichtssymmetrie, Schmerz, Fazialisfunktion, Narbenbildung, Reossifikation auf Röntgenkontrollen, Fragmentposition horizontal und vertikal beurteilt sowie inzisale Maximalbewegungen und die Kondylentranslation vermessen. 1.2.2 Kinder 22 Patienten jünger als 14 Jahre wurden von 2000 bis 2005 in die Studie einbezogen. Klasse II bis V nach Spiessl und Schroll, was verschobenen bzw. dislozierten Frakturen entspricht, wurden operiert; Klasse I und VI, entsprechend nicht disloziert und verschoben, konservativ behandelt. In einem Intervall von 1, 2 und 5 Jahren wurde dieses Kollektiv auf dieselbe Art und Weise nachuntersucht wie das Erwachsenenkollektiv. 1.2.3 Klasse VI Es nahmen 22 Patienten zwischen 2001 und 2005 mit 26 Klasse VI Frakturen (4 doppelt) an dieser Studie teil; in randomisiert ausgelegter Weise hatten 9 (41%) ORIF und 13 (59%) GT. Die Nachsorge erfolgte nach einem Jahr auf die bereits beschriebene Art. 1.3 Ergebnisse 1.3.1 Erwachsene Klasse I umfasste 29 Patienten, 37 Frakturen, mit einer relativen Inzidenz von 23%, Klasse II: 23/28/18%, Klasse III: 16/20/13%, Klasse IV: 30/35/22%, Klasse V: 18/23/15%, Klasse VI: 13/15/9%. Klinische Verläufe waren in Klasse I unkompliziert; Klasse II, III und IV erreichten operativ horizontale und vertikale Fragmentreposition mit geringem Knochenumbau. Einzelfälle zeigten persistierenden Schmerz, Dysokklusion und Osteosynthesefrakturen. Die Ergebnisse waren in Klasse V und VI weniger erfolgreich. Obgleich ORIF in Klasse V gute Reposition erreichte, kam es zu ausgeprägtem vertikalen Knochenabbau, Einzelfälle zeigten persistierenden Schmerz, Dysokklusion und Osteosynthesefrakturen. Klasse-VI-Fälle zeigten die schlechteste Translation, ebenfalls ausgeprägten Knochenumbau und gehäuft Dysokklusion. 1.3.2 Kinder 19 (79%) Patienten stellten sich zur Nachsorge vor: Klasse I=8, II=3, III=0, IV=2, V=5, VI=1; 11 Patienten (58%) nach 1 Jahr; 4 (21%) nach 2 Jahren und 4 (21%) nach 5 Jahren. Völlige Symptomfreiheit oder fehlende Motivation war nach telefonischer Aussage der Eltern der Grund für das Nichterscheinen zur Nachsorge. Alle Untersuchten zeigten eine suffiziente Mundöffnung. Ein Klasse-VI-Patient zeigte insuffiziente Kondylentranslation sowie drei Patienten Deflexionen; zwei Patienten partielle Fazialisparesen, die jedoch nach einem Jahr abgeklungen waren; in zwei Fällen wurden gebrochene Osteosynthesematerialien entfernt. Die vertikale und horizontale Kondylenabstützung wurde erfolgreich wiederhergestellt. Nennenswerte Kondylenresorptionen wurden in Klasse V verzeichnet; insgesamt 4 (17%) Misserfolge waren zu verzeichnen, wovon 3 auf Klasse V entfielen. 1.3.3 Klasse VI Insgesamt stellten sich 17 (77%) Patienten zur Nachuntersuchung vor; 8 (47%) wurden geschlossen und 9 (53%) offen therapiert. Alle Patienten zeigten eine normale Mundöffnung. Insuffiziente kondyläre Translation (definiert durch <6mm Translation bei Mundöffnung, Protrusion und Mediotrusion <3mm) trat jeweils bei zwei der ORIF- und GT- Patienten auf. Anhaltender Schmerz bei 2 mit ORIF, Deflexion größer als 4mm ebenfalls bei 2 mit ORIF. Bleibende Nervenparesen wurden nicht verzeichnet. Im Falle eines ORIF- Patienten wurde gebrochenes Osteosynthesematerial entfernt und im Falle eines GT- Patienten war eine starke Dysokklusion erkennbar. Die vertikale Position des medialen Fragments wurde mit ORIF erfolgreich wiederhergestellt, wenn dies auch mit einem beträchtlichen Umbauprozess verbunden war (der laterale Kondylenpol ist bei Klasse VI unverändert). Die geschlossene Therapie versagte in der vertikalen Wiederherstellung des medianen Kondylenpols, zeigte aber weniger Umbauprozesse. Die Winkelabweichung war bei ORIF erfolgreich reduziert, bei der GT konnte eine leichte Winkelvergrößerung verzeichnet werden. 1.4 Schlussfolgerung Klasse V und VI stellen im großen Kollektiv der Erwachsenen nach wie vor die komplexesten Anforderungen, während die übrigen Klassen nach den Richtlinien dieser Studie gut therapiert werden können. Beim kleineren Kollektiv der Kinder ist das Behandlungsprinzip zu 83% erfolgreich, wobei auch hier die größten Probleme bei Klasse V liegen. Innerhalb der Klasse-VI-Studie ergab die GT 2/8 (25%) und ORIF 2/9 (22%) inakzeptable Ergebnisse und postoperativen Kondylenumbau. Insgesamt erreichte hier die Erfolgsrate 75 zu 78%. Wenn hier also nicht die GT zukünftig vorzuziehen ist, könnten hochfeste resorbierbare Osteosynthesen mit intraossärer Lokalisation ein besseres Ergebnis liefern als die Mikroplatten und Schrauben an der dorsalen Kondylenzirkumferenz, die in dieser Studie verwendet wurden. Insgesamt könnte der Gelenkumbau in Klasse V und VI und die Translation in Klasse VI durch noch vorsichtigere Mobilisation und verbesserte Osteosynthese sowie von einem minimalisierten Operationstrauma profitieren.
Hintergrund: Ziel der vorliegenden Studie war es, die Veränderungen von Hämodynamik und Säure-Basen-Haushalt im Zusammenhang mit einer prolongierten intraperitonealen CO2-Insufflation und Kopftief-Lagerung prospektiv zu untersuchen. Methoden: Zehn Patienten der Risikoklassen ASA I - III, die sich einer roboter-assistierten laparoskopischen radikalen Prostatektomie unterzogen, wurden in die Studie eingeschlossen. Die invasiven hämodynamischen Parameter wurden mittels transpulmonaler Thermodilution unter Verwendung des PiCCO®-Systems mit einem Femoralarterienkatheter gemessen. HF, HZV, HI, dPmax, SV, SVI, SVV, MAD, ZVD, SVR, SVRI, ITBV, ITBVI, EVLW, EVLWI, pH, paO2, paCO2, BE, HCO3-, etCO2, AF und AMV wurden in Rückenlage, nach der Kopftief-Lagerung, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h und 4 h nach Anlage des Pneumoperitoneums, nach Ablassen des Pneumoperitoneums in Kopftieflage und abschließend erneut in Rückenlage gemessen. Ergebnisse: Die Kopftief-Lagerung der Patienten verursachte einen signifikanten Anstieg des ZVD (von 10 (± 3) auf 15 (± 2) mmHg), wohingegen alle anderen hämodynamischen Parameter nahezu unverändert blieben. Die Anlage des Pneumoperitoneums rief einen singulären Anstieg des MAD (von 75 (± 13) auf 95 (± 12) mmHg). Kein anderer hämodynamischer Parameter veränderte sich. Selbst nach vier Stunden waren nur milde hämodynamische Veränderungen zu beobachten. Nach Ablassen des Pneumoperitoneums stiegen HF (49 (± 4) vs. 64 (± 12) /min) und HI (2,4 (± 0,2) vs. 3,4 (± 0,7) l/min/m²) signifikant an, während der ZVD zu seinen Ausgangswerten zurückkehrte. Durch das Pneumoperitoneum wurde eine milde respiratorische Azidose hervorgerufen, die sich nach zwei Stunden stabilisierte (pH: 7,45 (± 0,04) vs. 7,37 (± 0,04)). Die AF wurde während des gesamten Beobachtungszeitraumes kontinuierlich gesteigert, wodurch der paCO2 nahezu zu seinen Ausgangswerten zurückkehrte. Schlussfolgerung: Patienten, die sich einer laparoskopischen radikalen Prostatektomie mit einem mindestens vierstündigen Pneumoperitoneum in Trendelenburg-Lagerung unterzogen, erfuhren keinen signifikanten hämodynamischen Abfall und nur geringfügige Veränderungen des Säure-Basen-Haushaltes während Lagerung und Pneumoperitoneum.
Einleitung Ziel dieser retrospektiven Studie war die Evaluation des Eurotransplant Senior Program (ESP) an unserem Zentrum unter besonderer Berücksichtigung operativer Gesichtspunkte und der Vergleich mit älteren Empfängern aus dem regulären Eurotransplant Kidney Allocation System (ETKAS). Patienten und Methoden Die Daten von 73 Patienten (durchschnittliches Empfänger-/Spenderalter 67,1 Jahre / 71,1 Jahre) aus dem ESP- und 51 Patienten (63,6 Jahre/49,7 Jahre) aus dem ETKAS-Programm, die zwischen den Jahren 1999 und 2006 transplantiert wurden, wurden miteinander verglichen. Das mittlere Follow-up betrug 39,5 ± 23,6 Monate. Ergebnisse Die Nierenfunktion der Spender gemessen an der Kreatinin-Clearance (ESP vs. ETKAS: 81,7 vs. 109,9 ml/min), die kalte Ischämiezeit (10,6 vs. 15,1h), die Dauer der Nierenersatztherapie (42,2 vs. 76,8 Monate) sowie die HLA Mismatches (4,1 vs. 2,4) waren zwischen den Gruppen signifikant verschieden (p<0,001). Die primäre Funktionsaufnahme der Transplantate lag im ESP vs. ETKAS bei 74% vs. 69%, 90% vs. 92% der Patienten wurden mit einem funktionierenden Transplantat entlassen (alle p>0,05). Die chirurgische Komplikationsrate lag im ESP vs. ETKAS bei 47% vs. 28% (p=0,031), die Revisionsrate bei 33% vs. 24% (p=0,259). 18% der Patienten aus dem ESP und 14% aus dem ETKAS sind im Verlauf des Follow-up verstorben (p=0,273), 95% davon mit guter Transplantatfunktion. Das 3-Jahres-Patientenüberleben betrug im ESP vs. ETKAS 84% vs. 92% (p=0,252), das zensierte 3-Jahres-Transplantatüberleben 85% vs. 88% (p=0,757). Schlussfolgerungen Es zeigte sich eine deutliche Erweiterung des Spender- und Empfängerpools durch das ESP. Die Transplantationsergebnisse im ESP waren hinsichtlich Patienten- und Transplantatüberleben durchaus mit den Ergebnissen der ETKAS-Gruppe vergleichbar. Patienten und deren betreuende Ärzte sollten allerdings über eine höhere chirurgische Komplikationsrate im ESP informiert sein. Chirurgische Komplikationen können die postoperative Behandlung der Patienten erheblich beeinflussen, bleiben jedoch meist ohne signifikanten Einfluss auf das Transplantationsergebnis.
Gegenstand dieser Arbeit ist die Entwicklung, der Aufbau und die Charakterisierung sowie Messung einer anwendungsspezifischen integrierten Schaltung (engl.: Application Specific Integrated Circuit, ASIC). Sie dient der Auslese der im elektromagnetischen Kalorimeter des PANDA-Experiments eingesetzten Lawinenfotodioden. Jeder Auslesekanal beinhaltet in der Eingangsstufe einen ladungsempfindlichen Vorverstärker, gefolgt von einem Pulsformer sowie zwei Ausgangstreibern. Am Beginn der Entwicklung steht die Machbarkeitsstudie einer integrierten Ausleseelektronik, welche die anspruchsvollen Anforderungen des PANDA-Experiments erfüllt. Aus rauschtheoretischen Untersuchungen resultieren erste Entwurfsparameter für die Schaltung, die mit Hilfe umfangreicher Simulationen verbessert und ergänzt werden. Die technische Umsetzung der Schaltung erfolgt in einem 0,35 Micrometer-CMOS-Prozess der Firma Austria Mikrosysteme. Die Charakterisierung der integrierten Ausleseelektronik ergibt bei einer Umgebungstemperatur von T = - 20° C eine Shapingzeit des Signalpulses von tr = (124 ± 2) ns. Mit dem äquivalenten Rauschwert von ENC = (4456 ± 35) e- und einer maximal möglichen Eingangsladung von 7,84 pC folgt ein dynamischer Bereich von über 10 000. Der ratenunabhängige Leistungsbedarf eines einzelnen Auslesekanals beträgt P = (52, 4 ± 0, 2)mW. Damit erfüllt der in dieser Arbeit beschriebene ASIC Prototyp alle Anforderungen, die vom Experiment an die Ausleseelektronik gestellt werden.
Das Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA-Virus, das der Virusfamilie Flaviviridae angehört. Fast alle immunkompetenten Patienten bilden während einer HCV-Infektion multispezifische T-Zell-Antworten und neutralisierende Antikörper gegen verschiedene HCV-Hüllglykoproteine. Trotzdem sind sie nicht in der Lage, das Virus erfolgreich zu eliminieren. Etwa 70% der HCV-infizierten Patienten entwickeln eine chronische Infektion, die zu einer progressiven Leberschädigung führen kann. Aufgrund des Fehlens einer geeigneten in vivo oder in vitro Neutralisationsuntersuchung ist wenig über die humorale Immunantwort bzw. die Rolle und Bedeutung der neutralisierenden Antikörper bei der HCV-Infektion bekannt. Ein lang ersehntes Ziel in der HCV-Forschung ist die Entwicklung eines verlässlichen Virus-Systems zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Zielzellen und HCV-Hüllglykoproteinen. In meiner Studie wurde die humorale Immunantwort bei 31 chronisch HCV-infizierten Patienten unter Anwendung von Hepatitis C-Pseudopartikeln (HCVpp) untersucht. Die untersuchten Patienten waren mit unterschiedlichen HCV-Genotypen infiziert, befanden sich zum Zeitpunkt der Untersuchung (Probeentnahme) in keiner Therapie und wiesen keine HIV- oder HBV-Koinfektion auf. Als Negativ-Kontrolle standen mir die Serum-Proben von 5 gesunden Probanden zur Verfügung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass man durch die Anwendung von Hepatitis C-Pseudopartikeln neutralisierende Antikörper bei chronisch HCV-infizierten Patienten nachweisen kann. Gesunde Probanden hingegen wiesen keine neutralisierenden Antikörper auf. Die zur Untersuchung der humoralen Immunantwort hergestellten HCV-Pseudopartikel hatten den Genotyp 1a. Die Serum-Proben der untersuchten Patienten in meiner Studie waren mit HCV-Genotypen infiziert, die sich zum Teil von dem eingesetzten HCVpp-Genotyp unterschieden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Serum- Proben die Infektiösität der HCVpp mit nahezu gleicher Wirksamkeit reduzierten wie die Serum-Proben von Patienten, die mit dem HCV-Genotyp 1a infiziert waren (kreuzreaktive Eigenschaft der neutralisierenden Antikörper). Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die antikörpervermittelte Virusneutralisation und die CD4+- und CD8+-T-Zell-Stimulation bei 22 chronisch HCV-infizierten Patienten gleichzeitig miteinander verglichen. In meiner Studie zeigten 11 Patienten eine starke, 9 Patienten eine schwache und 2 Patienten keine HCV-Neutralisation. Die Ergebnisse der Virusneutralisation waren unabhängig von den Ergebnissen der T-Zell-Stimulation und den HCV-Genotypen. Auch bei fehlender T-Zell- Antwort konnte eine Neutralisation beobachtet werden. Das untersuchte Patientenkollektiv bestand hauptsächlich aus Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion, die weder zum Zeitpunkt der Untersuchung (Probeentnahme) noch anamnestisch eine Therapie unterzogen waren. Es gab lediglich zwei therapierte Patienten, die HCV-positiv (Non-Responder) waren. Sie zeigten beide eine starke Neutralisation bei starker CD8+-T-Zell-Antwort aber schwacher bzw. fehlender CD4+-T-Zell-Antwort. Andererseits zeigte ein Patient, der unter Therapie initial Responder war, eine starke T-Zell-Antwort in beiden CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten bei schwacher Neutralisation. Vermutlich aufgrund der kleinen Gruppe aber auch in Übereinstimmung mit anderen Studien konnte in meiner Studie keine relevante Korrelation zwischen der Neutralisationsstärke und der T-Zell-Antwort bzw. keine Übereinstimmung der Ergebnisse im Verlauf der Infektion beobachtet werden. Die Ergebnisse meiner Studie haben gezeigt, dass Hepatitis C-Pseudopartikel (HCVpp) geeignete Antigene für die Untersuchung der Aktivität der neutralisierenden Antikörper und die spezifische Stimulation der T-Lymphozyten sind. Die Vorteile dieser Untersuchungsmethode sind ihre leichte Handhabung, die hohe biologische Sicherheit durch replikationsinkompetente und somit vermehrungsunfähige virale Partikel und der eindeutige und schnelle Nachweis durch die standardisierte Durchflusszytometrie. Mit dieser Methode kann eine Untersuchung der HCV-Infektion bzw. -Neutralisation auf reproduzierbare und einfache Weise erfolgen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Nanopartikeln als Trägersysteme für nukleosidische Arzneistoffe. Ihr Einsatz verhindert z.B. die Degradierung der Nukleoside und verbessert ihre Aufnahme in Zellen. Die Partikel wurden aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und mittels Glutaraldehyd stabilisiert. Durch die Kopplung von Trastuzumab an die Partikeloberfläche können HER2-überexprimierende Brustkrebszellen spezifisch erreicht werden. Bindet der Antikörper an den HER2-Rezeptor, kommt es zu einer Internalisierung des Ligand-ezeptorkomplexes und an den Liganden gebundene Partikel werden zusammen mit dem Komplex in die Zellen aufgenommen. Die Kopplung von Trastuzumab an die Oberfläche der HSA-Nanopartikel über eine Thioetherbindung war sehr effizient und stabil.Die Stabilität von Partikelsystemen über lange Lagerzeiten kann durch Gefriertrocknung erhöht werden. Zur Gefriertrocknung trastuzumabmodifizierter Partikel wurden Trehalose, Sucrose und Mannitol in Konzentrationen bis 5% als Hilfsstoffe eingesetzt. Trehalose und Sucrose waren bereits in einer Konzentration von 3% in der Lage, die physikochemischen Eigenschaften der Partikel direkt nach der Gefriertrocknung zu erhalten, die Partikel waren aber nicht lagerfähig. Mit Mannitol war dies direkt nach der Gefriertrocknung auch bei einer Konzentration von 5% nicht in gleichem Umfang möglich, die Partikel konnten aber am besten gelagert werden. Als nukleosidische Wirkstoffe wurden In die Matrix von HSA-Nanopartikeln unter anderem Antisenseoligonukleotide (ASOs) eingebettet. Das inkorporierte ASO P12 gehört zur Gruppe der Phosphorothioate (PTOs) und bewirkt eine Reduktion der Polo-like Kinase 1 (Plk1) auf mRNA- und Proteinebene. Plk1 ist wesentlich an der Zellteilung beteiligt und wird in vielen Tumoren überexprimiert, eine Hemmung von Plk1 führt zur Apoptose der Zellen. Damit das PTO eine Wirkung zeigen kann, muss es intrazellulär aus den Partikeln freigesetzt werden. Deshalb wurden die Partikel enzymatisch abgebaut. Die Wiederfindung der PTOs aus der abgebauten Partikelmatrix betrug maximal 30% und war von der Menge des zur Partikelstabilisierung verwendeten Glutaraldehyds abhängig. Je mehr Glutaraldehyd verwendet worden war, desto schlechter war die Wiederfindung. Eventuell werden die PTOs durch Glutaraldehyd inaktiviert, indem es zu einer Quervernetzung untereinander oder mit Albuminmolekülen kommt. Dennoch konnte in Brustkrebszelllinien eine biologische Wirkung der PTO-beladenen Partikelsysteme gezeigt werden. P12-beladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt HER2-überexprimierende Zellen aufgenommen. Die Partikel reduzierten die Menge der Plk1-mRNA signifikant. Dies ging mit einer ebenfalls signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge einher. Die Folge der Plk1-Reduktion war eine Aktivierung der Caspasen 3 und 7, die die Induktion der Apopotose zeigte. Plk1 kann nicht nur durch PTOs, sondern auch durch Plasmid-DNA, die small hairpin RNA (shRNA) gegen Plk1 exprimiert, gehemmt werden. Die Plasmide blieben bei der Einbettung in die Partikelmatrix intakt, allerdings trat eine Umformung von der supercoiled in die lineare und zirkuläre Form auf. Auch plasmidbeladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt in HER2-überexprimierende Zelllinien aufgenommen und führten dort zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge. Als weiterer nukleosidischer Wirkstoff wurde noch eine siRNA gegen Plk1 in die HSA-Partikel inkorporiert. Mit siRNA-beladenen Nanopartikeln konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge beobachtet werden. Partikel aus HSA können nicht nur durch den Einsatz von Glutaraldehyd stabilisiert werden, eine thermische Quervernetzung der Partikelmatrix ist ebenfalls möglich. Die besten physikochemischen Eigenschaften PTO-beladener Partikel wurden bei einer Quervernetzungstemperatur von 105°C über 10 min erzielt. Wurden diese Partikel enzymatisch abgebaut und das PTO aus der Partikelmatrix bestimmt, so konnten bis zu 80% des eingebetteten PTOs intakt detektiert werden. Allerdings waren die Partikel weniger stabil als chemisch quervernetzte Partikel. Bei einer Einlagerung über 6 Wochen stieg der Partikeldurchmesser an, 25% des eingebetteten P12s wurden aus der Matrix freigesetzt und bis zu 20% des Trastuzumabs wurden von der Oberfläche abgelöst. Dennoch war die Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge in der Zellkultur signifikant und mit der von chemisch stabilisierten Partikeln vergleichbar. Trastuzumabmodifizierte HSA-Nanopartikel stellen somit ein geeignetes Trägersystem für nukleosidische Arzneistoffe dar und führen zu einer spezifischen Wirkung in HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine ComZ und PilO wurden als Fusionsproteine mit einem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in denaturierter Form für die Generierung von polyklonalen Antikörpern in Kaninchen eingesetzt. Es konnten spezifische Antikörper gegen PilO generiert werden. 2. Mittels Western-Blot-Analysen subzellulärer Fraktionen des Wildtyps und der pilO::kat-Insertionsmutante konnte das PilO-Protein mit einer molekularen Masse von 21 kDa in der inneren Membran detektiert werden. 3. Mutantenstudien ergaben, dass in der pilO::kat-Mutante andere Kompetenzproteine in ihrer Lokalisation nicht beeinträchtigt sind und dass die Lokalisation des PilO-Proteins in anderen transformationsdefekten Mutanten nicht beeinträchtigt ist. Einzig eine verringerte Menge des PilF-Proteins in der inneren Membran der pilO::kat-Mutante wurde detektiert. Diese Ergebnisse indizieren eine Interaktion des PilO- und des PilFProteins. 4. Für die Analysen des DNA-Transports wurde ein Testsystem etabliert. 5. Durch DNase-Behandlung konnte zwischen gebundener und aufgenommener DNA differenziert werden. 6. Durch den Einsatz des Komplexbildners EDTA konnte gezeigt werden, dass die DNABindung bzw. auch die DNA-Aufnahme in Thermus von zweiwertigen Ionen beeinflusst wird. 7. Unterschiedliche DNA-Formen, wie z. B. lineare, zirkuläre Plasmid-DNA und chromosomale DNA, werden zu gleichen Mengen gebunden und aufgenommen. Die Transformationshäufigkeiten in unterschiedlichen DNA-Formen jedoch zeigen Unterschiede. Dabei wird lineares Plasmid um einen Faktor von ca. 100 schlechter transformiert als zirkuläres Plasmid. Nukleotide werden von Thermus nicht gebunden und aufgenommen. 8. Kinetische Analysen des DNA-Binde- und -Aufnahmeapparates in Thermus ergaben eine Geschwindigkeit der DNA-Akkumulation von 1,5 μg DNA pro mg Protein und min und einen Km-Wert von 48 μg DNA/ml. 9. Chromosomale DNA aus Vertretern der unterschiedlichen Domänen Archaeen, Bakterien und Eukarya werden von Thermus gleichermaßen gut gebunden und aufgenommen. 10. Entkoppler sowie ATPase-Inhibitoren verhindern DNA-Aufnahme. Dies führt zu dem Schluß, dass DNA-Aufnahme in Thermus energieabhängig ist. 11. Die aufgenommene DNA kann nicht als Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Phosphatquelle genutzt werden, und die Nukleotide werden nicht als Vorstufen bei der Nukleinsäuresynthese weiterverwendet. 12. Durch DNA-Binde- und -Aufnahmestudien unterschiedlicher transformationsdefekter Mutanten konnte die Rolle einzelner Kompetenzproteine bei der DNA-Bindung und/oder -Aufnahme geklärt werden. Die Ergebnisse indizieren, dass PilQ an der DNA-Bindung und -Aufnahme beteiligt ist. 13. DNA-Binde- und -Aufnahmestudien mit comEA::kat-, pilA4::kat-, pilF::kat-, pilD::kat- und pilW::kat-Mutanten indizieren, dass die Proteine an dem DNA-Transport über die äußere Membran beteiligt sind. 14. Mutanten mit Defekten in den Kompetenzproteinen ComEC, DprA, PilA1, PilA2, PilA3, ComZ, PilM, PilN, PilO, PilC akkumulieren DNA im DNase-resistenten Zustand, vergleichbar dem Wildtyp. Dies indiziert eine Rolle dieser Proteine am DNA-Transport über das Periplasma und/oder die innere Membran.
Acetaldehydaddukte an Hämoglobin werden als potentieller biochemischer Marker für Alkoholmissbrauch betrachtet, konnten aber bisher in vivo noch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Es wurden Methoden entwickelt, um Acetaldehydmodifiziertes Hämoglobin sowohl nach Inkubation in vitro als auch in humanen Blutproben nachzuweisen. Verwendung fanden sowohl chromatographische als auch elektrophoretische Trennmethoden in Kombination mit unterschiedlichen Massenspektrometern zur Detektion. Es wurden unterschiedliche Patienten- und Probandenkollektive betrachtet. Aus Blutproben von Patienten aus Alkoholentzugskliniken, von Probanden eines kontrollierten Trinkversuches und Blutproben von Personen mit moderatem Alkoholkonsumverhalten wurde versucht, modifiziertes Hämoglobin mit Alkoholkonsum zu korrelieren. Desweiteren wurden Blutproben von Kindern untersucht, bei denen keine Alkoholexposition zu erwarten war, um eventuell vorhandenes endogenes modifiziertes Hämoglobin nachzuweisen. Zusätzlich zu den Untersuchungen in vitro und in vivo wurden auch post-mortale Proben analysiert, um modifiziertes Hämoglobin mit einem prämortalem Alkoholkonsum zu korrelieren und auf mögliche andere Einflüsse, insbesondere hinsichtlich post-mortaler Parameter zu untersuchen. Modifizierte Globinketten waren nach Synthese aus Hämoglobin und Acetaldehyd zugänglich und konnten in vitro nachgewiesen werden. Hierbei zeigte sich, dass Acetaldehyd auch mehrfach kovalent an beide Hämoglobinketten binden kann. Weder mehr- noch einfach modifizierte Hämoglobinketten konnten allerdings in authentischen humanen Blutproben nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit konnte jedoch nach proteolytischem Verdau so weit gesteigert werden, dass Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide nicht nur nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd, sondern auch in authentischen Blutproben sämtlicher untersuchter Kollektive nachweisbar waren. Es wurde gezeigt, dass ein intermolekularer Austausch von Acetaldehyd nach proteolytischem Verdau zur Bildung eines Peptidadduktes am neu entstandenen N-Terminus des jeweiligen Peptides führen kann. Ein Hinweis auf andere mögliche Bindungsstellen ergab die Analyse des in vitro synthetisierten Peptides Hbα(17-31)2Ach mit zwei gebundenen Molekülen Acetaldehyd. Insgesamt konnten in authentischen Proben 10 Peptide mit Acetaldehydmodifikation, welche jeweils als chromatographisch trennbare Stereoisomere auftraten, nachgewiesen werden. Dies geht einher mit einer bereits vorgeschlagenen Bildung diastereomerer Imidazolidinonderivate. Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide waren nicht nur in Proben von Patienten und Probanden mit nachweisbarem Blutalkohol vorhanden, sondern auch in Blutproben von Alkoholikern, Studenten und Kindern ohne akuten Alkoholkonsum. Der Nachweis dieser Addukte auch ohne exogene Alkohol- oder Acetaldehydexposition lässt darauf schliessen, dass diese posttranslationale Modifikation im menschlichen Körper abläuft, Acetaldehydaddukte also auch endogen gebildet werden. Ein erhöhtes Verhältnis von modifizierten Peptiden zu deren unmodifizierten Homologen zeigte sich konzentrationsabhängig nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd in vitro. Langfristiger zurückliegender Alkoholkonsum konnte in Studien mit Patienten einer Rehabilitationseinrichtung und mit Probanden mit moderatem Alkoholkonsum nicht mit Hämoglobinaddukten korreliert werden. Erhöhte Adduktverhältnisse im Vergleich mit Proben ohne Blutalkoholkonzentration des gleichen Kollektivs konnten bei Patienten einer Alkoholentzugsklinik, in post-mortalen Proben und im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches nachgewiesen werden. Die Kinetik der Bildung und Elimination Acetaldehydmodifizierten Hämoglobins wurde sowohl anhand von Blutproben von Patienten einer Alkoholentzugsklinik untersucht, erhöhte Adduktverhältnisse waren hier nur kürzer als 5 Tage nachweisbar. Diese schnelle Elimination wurde im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches bestätigt. Hierbei fand sich ein signifikanter Anstieg Acetaldehydmodifizierter Hämoglobinpeptide bereits nach einmaligem moderatem Alkoholkonsum, welcher bereits bei Blutalkoholkonzentrationen von durchschnittlich 0,12 g/L auftrat und noch mindestens 6 Stunden, aber nicht mehr 24 Stunden nach Trinkende anhielt. Daher liegt die mögliche Anwendung dieses empfindlichen Assays im Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums. Sämtliche Peptide wurden hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität zur Identifizierung eines Alkoholkonsums sowohl in vivo als auch in post-mortalen Proben anhand unterschiedlicher Schwellenwerte untersucht. Desweiteren wurde für diese Peptide die analytische Präzision betrachtet. Als Markerpeptid eines kurzfristigen Alkoholkonsum sowohl in vivo als auch in post-mortalen Blutproben wird hierbei Hbα(32-40)Ach vorgeschlagen. Der mögliche Vorteil bei der Betrachtung dieses Peptids im Vergleich mit anderen bereits etablierten Markern zum Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums liegt in der für den Nachweis benötigten geringen Materialmenge, welche bei der Bestimmung mittels HPLC/TOF-MS 80μg Hämoglobin betrug, was etwa der Hämoglobinmenge entspricht, die in etwa 2,5 Millionen Erythrozyten, entsprechend 0,6 μl Blut enthalten ist. Denkbar ist dadurch die Bestimmung in Blutspuren, aus denen ansonsten kein Nachweis von Ethanol oder anderer Marker eines Alkoholkonsums möglich wäre, z.B. aus getrockneten Blutspuren.
Neben dem zentralen Benzodiazepin-Rezeptor – einer Untereinheit des GABAA-Rezeptors – gibt es den peripheren Benzodiazepin-Rezeptor (PBR), der als Bestandteil der mitochondrialen Permeabilitäts-modulierenden Poren eine wichtige Rolle bei der Apoptose, Zellproliferation, Steroidsynthese, Immunmodulation, des Porphyrintransports, der Hämsynthese, des Anionentransports und der Regulation der Mitochondrienfunktion spielt. Es gibt zahlreiche endogene und exogene Liganden, welche die Aktivität des PBR modulieren können. Zu den exogenen PBR-Liganden zählen u.a. die Benzodiazepine, Isochinolin- und Pyridinoindol-Derivate, zu den endogenen der Diazepam-Bindungsinhibitor (DBI) und dessen Fragmente sowie Porphyrine und Cholesterin. Man findet den PBR im gesamten Organismus, insbesondere in steroidproduzierenden Geweben wie Nebennierenrinde und Ovarien sowie im Immunsystem, und seine Expression ist stark erhöht bei akutem Stress, bei Entzündungen sowie in Tumorzellen. Bei verschiedenen Karzinomtypen ist der PBR überexprimiert und sein Gehalt korreliert mit der Aggressivität, Progression und Metastasierung des Tumors, sowie einer schlechten Prognose. Untersuchungen mit verschiedenen Mammakarzinom-Zelllinien ergaben, dass zwischen der Proliferationsrate und der Konzentration des PBR ein Zusammenhang besteht und dass in rasch proliferierenden, hormonrezeptornegativen Zelllinien (z.B. BT-20) die Expression der PBR erheblich höher ist als in langsamer wachsenden, hormonrezeptorpositiven Zelllinien (z.B. MCF-7). Der DBI ist ein relativ kurzlebiges Polypeptid, bei dessen proteolytischem Abbau verschiedene biologisch aktive Fragmente entstehen. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss von drei Fragmenten des endogenen PBR-Liganden DBI auf den Zellzyklus und die Proliferation der Estrogen- und Progesteronrezeptor-negativen BT20-Mammakarzinomzellen sowie der Estrogen- und Progesteronrezeptor-positiven MCF-7-Mammakarzinomzellen zu untersuchen. Bei den methodisch aufwändigen Experimenten ging es vor allem darum, die isolierten Zellen unter in vitro Bedingungen physiologisch intakt zu erhalten, um den Einfluss der DBI-Fragmente auf die Proliferationsrate unabhängig von störenden äußeren Faktoren untersuchen zu können. Nach Synchronisation der Zellpopulationen in der G0/1-Phase wurden die Zellen mit steigenden Konzentrationen der DBI-Fragmente über verschiedene Zeiträume inkubiert, anschließend wurde die Verteilung der Zellen in den verschiedenen Zyklusphasen durchflusszytometrisch bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass mit allen verwendeten Fragmenten des DBI eine Wachstumshemmung der Karzinomzellen eintrat, wobei anzunehmen ist, dass der Effekt durch die Bindung an den PBR zustande kam. Im Allgemeinen trat diese Wirkung unabhängig von der Hormonsensitivität der verwendeten Zellen auf. Lediglich bei den Zellen in der G2/M-Phase konnte ein Unterschied festgestellt werden, wobei es bei der hormonrezeptorpositiven Zelllinie zu einer Zunahme und bei den hormonrezeptornegativen Mammakarzinomzellen zu einer Abnahme kam. Es zeigte sich, dass zwischen der Wirkung der endogenen PBR-Liganden und der von exogenen Liganden – die in früheren Untersuchungen untersucht worden war - ein auffälliger Unterschied besteht. Unter der Inkubation mit steigenden Konzentrationen der exogenen Liganden kam es zu einem biphasischen Wirkungsverlauf; in sehr niedrigen Konzentrationen kam es zu einer verstärkten Proliferationsrate, während unter hohen Konzentrationen eine Hemmung der Proliferation beobachtet wurde. Möglicherweise ist dieser unerklärliche Effekt der synthetischen Substanzen bereits auf eine zytotoxische Konzentration zurückzuführen. Eine klinische Relevanz der vorliegenden Ergebnisse könnte sich aus dem bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen auftretenden wachstumshemmenden Effekt der endogenen DBI-Fragmente auf Tumorzellen ableiten lassen. Als Optionen kämen entweder eine durch Pharmaka induzierte Stimulation der endogenen DBI-Freisetzung oder der Einsatz von länger wirksamen synthetischen Analoga des DBI in Frage. Alternativ könnte auch die Behandlung mit exogenen Liganden des PBR, z.B. mit Benzodiazepinen oder anderen geeigneten synthetischen Substanzen, als therapeutische Möglichkeit entwickelt werden. Allerdings dürfte der bisher beobachtete biphasische Effekt dieser Substanzgruppe, deren proliferationshemmende und apoptosefördernde Wirkung erst in höheren Dosierungen zum Tragen käme, ein erhebliches Problem darstellen. Als weitere therapeutische Möglichkeiten wurde die Nutzung von anti-inflammatorischen Eigenschaften von PBR-Liganden, ihr Einsatz als Chemosensitizer oder als photosensitivierende Agenzien genannt.