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Die supratentorielle dekompressive Kraniektomie mit Eröffnung und Erweiterungsplastik der Dura mater ist heutzutage eine wichtige Therapiemaßnahme in der Behandlung des konservativ nicht kontrollierbaren Hirndrucks. Unter Kranioplastik versteht man den chirurgischen Verschluss des entstandenen Knochendefekts zum Schutz des direkt unter der Kopfhaut liegenden Gehirns, zur ästhetischen Wiederherstellung der Konturen sowie zur Verbesserung einer neurologischen Symptomatik („syndrome of the trephined“).
In der vorliegenden Arbeit werden die Daten von insgesamt 242 Patienten, die einer Kranioplastik unterzogen worden waren, retrospektiv analysiert. Die Patienten wurden im Zeitraum 2001-2008 in der neurochirurgischen Abteilung der Städtischen Kliniken Frankfurt am Main-Höchst operiert. Um Aufschluss über das postoperative, funktionelle und kosmetische Ergebnis zu erhalten, wurde im Anschluss an die Aktenauswertung bei diesen Patienten eine telefonische Befragung durchgeführt.
Ziel der Arbeit war es, die bisherigen Erfahrungen der Kalottenplastik und insbesondere der autogenen orthotopen Knochendeckelreimplantation im Hinblick auf die verschiedenen Kranioplastik Zeitpunkte zu untersuchen und unter klinischen Aspekten zu bewerten.
Die Frage des Kranioplastik Zeitpunktes ist essentiell für die Therapieplanung.
Das autologe Schädelknochentransplantat hat bessere Eigenschaften und Qualitäten als alle anderen alloplastischen Materialien. In Anbetracht der perfekten Histokompatibilität, der optimalen biomechanischen Eigenschaften, der guten anatomischen Fusion mit dem umgebenden Knochen und der Möglichkeit der partiellen oder totalen Revitalisation des Transplantats, besteht kein Zweifel, dass der autologe Knochen immer zu verwenden ist, wenn die Möglichkeit dazu besteht.
Die Analyse der Patientengruppen ergab, dass die ultra frühe Kranioplastik der Patienten mit großen Defekten nach dekompressiver Kraniektomie ein besseres Outcome im langfristigen Follow-up hat. Diese Patienten hatten keine gesteigerte Infektions- oder andere Komplikationsraten. Das Timing der Kranioplastik spielt eine Rolle in der Komplikationsrate nur bei den Patienten, die sekundär eine Komplikation erlitten haben. Patienten, die nach der Kraniektomie eine Nachblutung, einen Infarkt oder eine Infektion erlitten haben, hatten eine signifikant höhere Infektionsrate bei ultra früher Kranioplastik. Insbesondere soll betont werden, dass der Trend einer Häufung von Wundheilungsstörungen und Infektionen mit der Folge einer erneuten Explantation des Knochendeckels bei Patienten nach autogener Knochendeckelreimplantation mit mehr als 2 Risikofaktoren und bei Patienten mit kompliziertem Verlauf nach Kraniektomie festgestellt wurde.
Gemäß den Ergebnissen dieser Patientenserie kann die ultra frühe Kranioplastik bei ausgewählten Patienten mittels Reimplantation des Eigenknochens als ein sicheres und hilfreiches Verfahren für die schnellere Rehabilitation und Besserung der neurologischen Funktion und der Prognose bewertet werden. Ähnlich gute Ergebnisse zeigten die Pantienten in der Gruppe 1 der ultra frühen Kranioplastik die aufgrund einer Liquorzirkulationsstörung ein VP Shunt System als kombinierte Therapie in der gleichen Sitzung erhalten haben.
Somit kann zusammenfassend festgehalten werden:
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die Kranioplastik nach einer supratentoriellen dekompressiven Kraniektomie mit Reimplantation des eigenen Schädelknochens zum frühesten möglichen Zeitpunkt ein sicheres und effektives Verfahren darstellt und bei ausgewählten Patienten sogar bessere Ergebnisse als die späte Kranioplastik haben kann. Eine mögliche Erklärung dafür könnte das Auftreten und die Persistenz von neurologischen Defiziten im Rahmen des „syndrome of the trephined“ bei Patienten bieten, bei denen eine späte Kranioplastik durchgeführt wurde. In diesem Patientengut hatten die Patienten mit ultra-früher Kranioplastik das beste neurologische Outcome, die Komplikationsrate war in allen Gruppen vergleichbar.
Um Komplikationen zu vermeiden, sollten Patienten mit einer vorausgegangenen lokalen Infektion spät kranioplastiert werden.
Das neurologische Outcome der Patienten, bei denen ein kombiniertes Verfahren Kranioplastik –VP Shunt durchgeführt wurde, war vergleichbar mit anderen Patientengruppen. Somit ist eine Kranioplastik bei Patienten mit konvexen, über Kalottenniveau prolabierten Kraniektomielappen aufgrund eines Hydrocephalus keine Kontraindikation.
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei motivationale Erklärungsmodelle, Zielorientierungen und das kognitiv-motivationale Prozessmodell, im Rahmen des selbstregulierten Lernens integriert. Selbstregulationsprozesse sind nach Carver und Scheier (1981) zyklisch angelegt. Zu den Bestandteilen der Selbstregulation gehören nach Boekaerts (1999)Regulation der Informationsverarbeitung, Regulation des Lernprozesses und Regulation des Selbsts. Auf dieser Ebene sind die Zielorientierungen angesiedelt. In dieser Arbeit das 2 x 2 Modell von Elliot und McGregor (2001) herangezogen. Es berücksichtigt zwei Dimensionen, die Valenz (Annäherungs- und Vermeidungskomponente) und die Kompetenz (Vergleichsmaßstab intern und extern). Hieraus resultieren: 1) Lern-Annäherungs-Ziele (positive Valenz & interner Vergleich, 2) Lern-Vermeidungs-Ziele (negative Valenz & interner Vergleich), 3) Leistungs-Annäherungs-Ziele (positive Valenz & externer Vergleich) und 4) Leistungs-Vermeidungs-Ziele (negative Valenz & externer Vergleich). Diese vier Zielorientierungen sind der erste Teil des integrierten Modells, der zweite zentrale Teil ist das kognitiv-motivationale Prozessmodell (Vollmeyer & Rheinberg, 1999, 2006). Ausgangspunkt ist die aktuelle Motivation, die aus 1) der Erfolgswahrscheinlichkeit, 2) der Misserfolgsbefürchtung, 3) dem Interesse und 4) der Herausforderung als unabhängige Faktoren besteht. Diese aktuelle Motivation wirkt nicht direkt auf die Leistung, sondern durch kognitive (hier: Metakognition) und motivationale (hier: Flow-Erleben) Mediatoren. Es wurden drei Fragestellungen bearbeitet. Die erste Fragestellung betraf das Zusammenspiel der Zielorientierungen und der aktuellen Motivation. Eine Überprüfung dieses integrierten Motivationsmodell erfolgte mittels Pfadanalyse. Die zweite und dritte Fragestellung befasste sich spezifisch mit dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell. Es wurden Subgruppen auf der Basis der aktuellen Motivation identifiziert und ihre Bedeutung für die Mediatoren und die Leistung untersucht. Die dritte Fragestellung fokussierte den Prozesscharakter des Modells. Hier erfolgten Analysen über den Arbeitsprozess hinweg. Die Fragebögen (Achievement Goal Questionnaire (Elliot & McGregor, 2001), Metakognitionsfragebogen (aufbauend auf LIST (Wild, 2000) und Metacognitive Awareness Inventory (Schraw & Dennison, 1994), Fragebogen zur aktuellen Motivation (Rheinberg, Vollmeyer & Burns, 2001), Flow-Kurz-Skala (Rheinberg, Vollmeyer & Engeser, 2003)) und die Problemlöseaufgaben (Sudokus) wurden in einer Pilotstudie getestet. An der Hauptstudie nahmen 202 Personen teil (73% weiblich). Das integrierte Motivationsmodell geht davon aus, dass eine positiver Effekt der Zielorientierungen als Personenvariable auf die aktuelle Motivation besteht. Die aktuelle Motivation als Startpunkt des situationalen Geschehens wiederum wirkt positiv auf die Mediatoren Flow-Erleben und Metakognition, hat aber keinen direkten Effekt auf die Leistung. Dieser wird nämlich über die Mediatoren vermittelt. Deswegen wird ein positiver Effekt des Flow-Erlebens und der Metakognition auf die Leistung erwartet. Das Zusammenwirken der beiden Mediatoren kann aus dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell nicht abgeleitet werden. Ob ein Zusammenhang besteht oder nicht wird geprüft. Für das Vorwissen wird ein positiver Effekt auf die aktuelle Motivation und die Leistung erwartet. Die Pfadanalyse zur Überprüfung des integrierten Motivationsmodells zeigte, dass eine Integration nicht nur theoretisch sinnvoll ist, sondern auch empirisch gestützt wird. Die Bedeutung der Metakognition als kognitiver Mediator wurde gezeigt. Die zweite Fragestellung fokussierte auf die aktuelle Motivation. Auf der Basis dieser wurden mittels Clusteranalyse drei distinkte Gruppen identifiziert: hoch Motivierte, niedrig Motivierte und ängstlich Motivierte (vergleichbar zu Vollmeyer & Rheinberg, 2004). Diese Gruppen unterschieden sich hinsichtlich ihres Flow-Erlebens, ihrer Metakognition und ihrer Leistung. Die hoch Motivierten erlebten am meisten Flow, berichteten mehr Metakognition und zeigten bessere Leistung. Der Prozesscharakter des kognitiv-motivationalen Prozessmodells stand im Mittelpunkt der dritten Fragestellung. Diese Analyse über die drei Sudokus hinweg zeigte eine ähnliche Entwicklung des Flow-Erlebens bei den hoch und niedrig Motivierten. Vom ersten zum zweiten Sudoku stieg es an, um dann wieder abzufallen. Dies war bei der Metakognition nicht der Fall. Die hoch Motivierten berichteten einen stärkeren Rückgang der Metakognition beim dritten Sudoku als die niedrig Motivierten. Bei der Leistung zeigte sich für die hoch Motivierten ein Anstieg beim zweiten Sudoku und dann ein Rückgang beim dritten, wohingegen die Leistung der niedrig Motivierten kontinuierlich abfiel. Abschließend wurden die Schwierigkeiten und Grenzen der vorliegenden Arbeit diskutiert und Implikationen der Ergebnisse für die Theorieentwicklung und ihre Bedeutung für den Anwendungskontext aufgezeigt.
Algorithms and data structures constitute the theoretical foundations of computer science and are an integral part of any classical computer science curriculum. Due to their high level of abstraction, the understanding of algorithms is of crucial concern to the vast majority of novice students. To facilitate the understanding and teaching of algorithms, a new research field termed "algorithm visualisation" evolved in the early 1980's. This field is concerned with innovating techniques and concepts for the development of effective algorithm visualisations for teaching, study, and research purposes. Due to the large number of requirements that high-quality algorithm visualisations need to meet, developing and deploying effective algorithm visualisations from scratch is often deemed to be an arduous, time-consuming task, which necessitates high-level skills in didactics, design, programming and evaluation. A substantial part of this thesis is devoted to the problems and solutions related to the automation of three-dimensional visual simulation of algorithms. The scientific contribution of the research presented in this work lies in addressing three concerns: - Identifying and investigating the issues related to the full automation of visual simulations. - Developing an automation-based approach to minimising the effort required for creating effective visual simulations. - Designing and implementing a rich environment for the visualisation of arbitrary algorithms and data structures in 3D. The presented research in this thesis is of considerable interest to (1) researchers anxious to facilitate the development process of algorithm visualisations, (2) educators concerned with adopting algorithm visualisations as a teaching aid and (3) students interested in developing their own algorithm animations.
IL-18, a recently identified member of IL-1 family, is now recognized as an important regulator of innate and acquired immune responses. Therefore, the antitumor activities of IL-18 have been investigated. IL-18 has been shown to induce IFN-γ production by T, B, and NK cells, enhances NK cell activity, activates Fas ligandmediated apoptosis of the tumor cells, and improves the overall antitumor immunity. KG-1 cells were derived from a patient with acute myeloid leukemia (AML). IL-18 has been shown to induce IFN-γ production in those leukemic cells. TLR-3, in addition to its ability to recognize viral double stranded RNA, also can recognize the synthetic analogue poly(I:C) and induces type I IFN, inflammatory cytokine production, e.g TNF-α, and maturation of denderitic cells. In the present work the potential modulatory effect of PIC on IFN-γ and TNF-α production by KG-1 cells treated with IL-18 was investigated. Indeed, PIC strongly amplified the production of IFN-γ induced by IL-18 on mRNA and protein levels via NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Compared to IFN-γ, TNF-α showed different behaviour in KG-1 cells. On mRNA level I found only weak induction of TNF-α by IL-18 which was potentiated in the presence of PIC. Similarly, the release of TNF-α by IL-18 plus PIC required NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Furthermore, in the present work I found that TLR-3 is required for IFN-γ and TNF-α production. In addition, it is demonstrated by immunofluoresence that TLR-3 is localized in cytoplasm but not on the cell surface in KG-1 cells. Recently, it has been demonstrated that IFN-γ shows therapeutic potential as detected in AML blasts, specifically via inhibition of proliferation and induction of apoptosis. Thus our data could serve as a rationale for the clinical use of PIC and IL-18 in combination therapy. In search for new cytokines potentially modulated by the combination IL-18 plus PIC in KG-1 cells, cytokine antibody array analysis was performed. I found an upregulation of expected genes like IP-10 but most interestingly unexpected upregulation of PDGF-AA. Searching for detailed mechanisms of PDGF-AA induction, I found that neither p38 nor JNK is involved in PDGF-AA production but NF-κB is essential for the expression of PDGF-AA. Furthermore, I found that PDGF-AA is not able to increase the proliferation of KG-1 cells. PDGF and TGF-β are examples of signaling molecules which control the growth, survival, motility, and differentiation of cells. Therefore, the release of TGF-β by IL-18 plus PIC was monitored by ELISA. The level of TGF-β in cellular supernatants revealed that neither PIC nor IL-18 was able to significantly mediate release of TGF-β indicating that only PDGF-AA but not TGF-β is induced by PIC and IL-18 in KG-1 cells. To the best of our knowledge this is the first time that IL-18 or PIC is shown to induce the expression of PDGF-AA in KG-1 cells.
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
Acute myeloid leukemia (AML) is a hematopoietic cell disorder characterized by a block in differentiation and increased proliferation and survival of malignant blasts. Expansion of the malignant cell clone effects the normal production of blood cells and – if left untreated – leads to death. Receptor tyrosine kinases (RTKs) play an important role in the pathogenesis of AML, as they are either often mutated or overexpressed. In normal hematopoiesis, RTK signal termination is tightly controlled, and involves ubiquitination, internalization, endocytosis and degradation. Cbl proteins are E3 ligases and have been shown to ubiquitinate several activated RTKs, including Flt3 and Kit, targeting them for degradation. Recently, several Cbl mutations have been identified: Cbl-R420Q was identified in an AML patient and Cbl-70Z was identified in a mouse lymphoma model. In this thesis work, the role of these Cbl mutants in Kit signaling and in a mouse transplantation model was studied. Cbl mutants (Cbl-R420Q, Cbl-70Z) have the ability to transform the myeloid 32D cell line in cooperation with Kit WT. Cbl mutants along with Kit promoted interleukin-3 (IL3)-independent proliferation and enhanced the cell survival of 32D cells. In contrast, expression of the Cbl mutants alone did not confer IL3-independent growth. Stem cell factor (SCF, the Kit ligand) dependent growth was enhanced in the presence of Cbl mutants and Cbl mutants promoted colonogenic growth in the presence of Kit. Furthermore, Cbl mutants inhibited the ubiquitination of the activated Kit receptor. In addition, Cbl mutants inhibited the endocytosis of the activated Kit receptor. Retroviral expression of Cbl mutants in transplanted bone marrow induced a generalized mastocytosis, a myeloproliferative disease and, in rare care cases, myeloid leukemia. Splenomegaly was observed in the presence of Cbl mutants. Furthermore, mast cells with variable range of infiltration were noticed in all the vital organs (spleen, liver, bone marrow, lung, kidney, heart) of Cbl (mutant) transplanted mice. Almost all recipients of bone marrow cells transduced with Cbl mutants developed a lethal hematologic disorder with a mean latency of 341 days in the Cbl-R420Q group and 395 days in the Cbl-70Z group. This is the first published report on a hematological disease with Cbl mutants in a mouse model. Co-immunoprecipitation studies indicated that Cbl-70Z binds to Kit, even in the absence of Kit ligand. Cbl-R420Q also bound to Kit in the absence of SCF, albeit to a lesser extent. Association of Cbl mutants to Kit was enhanced in the presence of SCF. Signaling studies demonstrated the constitutive activation of Akt and Erk in the presence of Cbl mutants and Kit. In addition, Cbl mutants enhanced the SCF-dependent Kit, Akt and Erk activation. Cbl-70Z, in association with kinase-dead Kit (Kit-KD) or kinase-dead Flt3 (Flt3-KD), conferred IL3-independent growth and survival to the myeloid 32D cell line. Cbl-R420Q provided only a slight growth advantage in the presence of Kit-KD. As demonstrated by pharmacological inhibition studies, Akt activation was necessary for the transformation mediated by Cbl-70Z and Kit-KD / Flt3-KD. Cbl mutants enhanced the Src family kinases (SFKs) activity. The pharmacological inhibition of SFK activity inhibited the proliferation and colonogenic growth. Interaction was found between Cbl-70Z, SFKs and Kit-KD. The SFK member Fyn was identified to bind to Cbl. In addition, kinase activity of SFKs was necessary for binding to Cbl, since SFKs inhibition by PP-2 abolished the binding between the complex-binding partners. Dasatinib and PP-2, both SFK inhibitors, inhibited the Cbl and Akt phosphorylation indicating that Fyn acts upstream of Akt. Inhibition of Kit with imatinib reduced the proliferation of cells overexpressing Kit WT and Cbl-70Z much stronger compared with cells expressing Kit-KD and Cbl-70Z, but much less than the dual KIT/SFK inhibitor dasatinib. This indicated that Kit kinase activity was required but not essential. The data presented in this thesis work implies that both RTK and SFK inhibition may have to be targeted, in order to effectively prevent transformation. In summary, the present thesis work indicates an important role of Cbl, Kit and SFKs in myeloid transformation and deregulated signal transduction.
Zwischen Juni 2006 und Juni 2007 wurde in unserem Zentrum bei 24 Patienten im Alter von 52 bis 86 Jahren und einem durchschnittlichen Alter von 73,9 ± 8,4 Jahren der interventionelle Verschluss des Vorhofohrs mit dem neuen WATCHMAN-Okkluder versucht. 61% der Patienten waren männlich, 39% weiblich. Im Mittel ergab der CHADS₂-Wert 2,6 ± 1,2 bei Werten zwischen 1 und 5. Damit lag das jährliche Schlaganfallrisiko bei 5,6 ± 3,0%. Die Ostienweite der Vorhofohren betrug zwischen 17,6mm und 26,4mm, der durchschnittliche Wert lag bei 21,8 ± 2,2mm. Die Länge der Vorhofohren variierte zwischen 25,0mm und 45,7mm bei einer mittleren Länge des Vorhofohrs von 33,5 ± 5,5mm. Watchman-Okkluder mit einem Schirmdurchmesser von 27mm waren mit 52% die am häufigsten implantierten Okkluder. Die technische Erfolgsrate betrug 95,8%. Die Implantation der Okkluder dauerte 43,9 ± 14,0 Minuten (19,0 bis 70,0 Minuten). Die Durchleuchtungszeiten betrugen 5,7 bis 18,1 Minuten (im Mittel 8,7 ± 3,0 Minuten). Es wurden zwischen 57 und 193ml Kontrastmittel während des Eingriffs benötigt (durchschnittlich 131 ± 44ml). Die postinterventionelle stationäre Krankenhausaufenthaltszeit betrug im Durchschnitt 2,8 ± 4,1 Tage (1 bis 21 Tage). Bei einer technischen Erfolgsrate des Eingriffs von 95,8% (23/24 Fällen) betrug die Verschlussrate 100%, so dass bei allen Patienten Marcumar abgesetzt werden konnte. Auch bei allen nachfolgenden transösophagealen Echo-Kontrolluntersuchungen betrug die Verschlussrate 100%. Der Unterschied der Verschlussrate war im Vergleich zu den Ergebnissen anderer Studien über interventionelle Vorhofohrverschlüsse statistisch nicht signifikant. In der vorliegenden Arbeit lag das nach dem CHADS₂-Score kalkulierte jährliche Risiko für ischämische Schlaganfälle bei 5,6%. Im gesamten Nachbeobachtungszeitraum von 37,6 Jahren bei einer mittleren Nachbeobachtung von 20,8 ± 3,3 Monaten traten in unserem Patientenkollektiv keine ischämischen Schlaganfälle auf. Bei einem Patienten trat nach 22 Monaten eine aphasische Episode mit begleitender Schwäche der rechten Körperseite auf. Bei diesem Ereignis kann eine TIA nicht ausgeschlossen werden. Dieses Ergebnis lässt sich mit den von Sick et al. publizierten Ergebnissen der multizentrischen Watchman-Studie [72] vergleichen. Innerhalb der Nachbeobachtungszeit traten keine Todesfälle und keine Okkluderembolisationen auf. Zwei Ereignisse (8,7%) traten innerhalb des ersten Monats nach der Implantation auf: Ein Patient entwickelte wenige Stunden nach dem Eingriff nach Beginn der Marcumarisierung eine rechtsseitige Kleinhirnblutung. Der INR-Wert einen Tag vor der Implantation hatte 2,0 betragen. Im Verlauf blieb eine leichte Schreibschwäche der rechten Hand zurück. Bei einem Patienten trat ein Perikarderguss auf. Nach einer Perikardiozentese sowie Absetzen von Aspirin und Marcumar war der Patient beschwerdefrei. Nach dem ersten Monat kam es bei mehreren Patienten zu Krankenhausaufenthalten: eine Humerusfraktur nach Sturz, eine gangränöse Pyodermie, eine entgleiste Hyperglykämie, eine Inguinalhernien-Operation, eine hypertensive Krise mit konsekutiver beatmungspflichtiger respiratorischer Insuffizienz, eine Defibrillator-Implantation nach rezidivierenden Synkopen, eine Pneumonie, drei exazerbierte COPDs, drei neu aufgetretene Belastungsdyspnoen, zwei NSTEMIs bei einem Patienten, ein Bänderriss, eine Defibrillatorimplantation, eine operative Spinalkanaldekompression, eine Schrittmacherimplantation, ein epileptischer Anfall, eine Überlaufinkontinenz, eine penetrierende Hornhautverletzung, eine sensorische Aphasie Die Patienten konnten in gutem Gesundheitszustand aus dem Krankenhaus entlassen werden.
The light-harvesting complex of photosystem II (LHC-II) is the major antenna complex in plant photosynthesis. It accounts for roughly 30% of the total protein in plant chloroplasts, which makes it arguably the most abundant membrane protein on Earth, and binds about half of plant chlorophyll (Chl). The complex assembles as a trimer in the thylakoid membrane and binds a total of 54 pigment molecules, including 24 Chl a, 18 Chl b, 6 lutein (Lut), 3 neoxanthin (Neo) and 3 violaxanthin (Vio). LHC-II has five key roles in plant photosynthesis. It: (1) harvests sunlight and transmits excitation energy to the reaction centres of photosystems II and I, (2) regulates the amount of excitation energy reaching each of the two photosystems, (3) has a structural role in the architecture of the photosynthetic supercomplexes, (4) contributes to the tight appression of thylakoid membranes in chloroplast grana, and (5) protects the photosynthetic apparatus from photo damage by non photochemical quenching (NPQ). A major fraction of NPQ is accounted for its energy-dependent component qE. Despite being critical for plant survival and having been studied for decades, the exact details of how excess absorbed light energy is dissipated under qE conditions remain enigmatic. Today it is accepted that qE is regulated by the magnitude of the pH gradient (ΔpH) across the thylakoid membrane. It is also well documented that the drop in pH in the thylakoid lumen during high-light conditions activates the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE), which converts the carotenoid Vio into zeaxanthin (Zea) as part of the xanthophyll cycle. Additionally, studies with Arabidopsis mutants revealed that the photosystem II subunit PsbS is necessary for qE. How these physiological responses switch LHC-II from the active, energy transmitting to the quenched, energy-dissipating state, in which the solar energy is not transmitted to the photosystems but instead dissipated as heat, remains unclear and is the subject of this thesis. From the results obtained during this doctoral work, five main conclusions can be drawn concerning the mechanism of qE: 1. Substitution of Vio by Zea in LHC-II is not sufficient for efficient dissipation of excess excitation energy. 2. Aggregation quenching of LHC-II does not require Vio, Neo nor a specific Chl pair. 3. With one exception, the pigment structure in LHC-II is rigid. 4. The two X-ray structures of LHC-II show the same energy transmitting state of the complex. 5. Crystalline LHC-II resembles the complex in the thylakoid membrane. Models of the aggregation quenching mechanism in vitro and the qE mechanism in vivo are presented as a corollary of this doctoral work. LHC-II aggregation quenching in vitro is attributed to the formation of energy sinks on the periphery of LHC-II through random interaction with other trimers, free pigments or impurities. A similar but unrelated process is proposed to occur in the thylakoid membrane, by which excess excitation energy is dissipated upon specific interaction between LHC-II and a PsbS monomer carrying Zea. At the end of this thesis, an innovative experimental model for the analysis of all key aspects of qE is proposed in order to finally solve the qE enigma, one of the last unresolved problems in photosynthesis research.
A generic drug product (World Health Organization (WHO) terminology: multisource product) is usually marketed and manufactured after the expiry date of the innovator’s patent. Generic drugs are less expensive than the innovator products because generic manufacturers do not have to amortize the investment costs of research, development, marketing, and promotion. Multisource products must contain the same active pharmaceutical ingredients (APIs) as the original formulation and have to be shown to be interchangeable with the original formulation. Multisource products have to be shown bioequivalent to the innovator counterpart with respect to pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Multisource products are therefore identical in dose, strength, route of administration, safety, efficacy, and intended use. Bioequivalence can be demonstrated by in vitro dissolution, pharmacokinetic, pharmacodynamic or clinical studies. Since 2000, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) allows the approval of certain multisource products solely on the basis of in vitro studies, i.e. by waiving in vivo studies in humans (“Biowaiver”), based on the Biopharmaceutics Classification Scheme (BCS). The BCS characterizes APIs by their solubility and permeability in the gastrointestinal tract (GIT). The different BCS Classes I-IV (Class I: high solubility, high permeability; Class II: low solubility, high permeability; Class III: high solubility, low permeability and Class IV: low solubility, low permeability) result from all possible combinations of high and low solubility with high and low permeability. Since the adoption of the BCS by the FDA in 1995, the BCS criteria have been under continuous development. In 2006, the WHO has released the most recent bioequivalence guidance including relaxed criteria for bioequivalence studies based on modified BCS criteria. According to this guidance, APIs belonging to the BCS classes I – and under defined conditions - II and III – are eligible for a biowaiver-based approval. The principal objective of this work was to characterize the first-line anti tuberculosis APIs, isoniazid, pyrazinamide, ethambutol dihydrochloride and rifampicin, according to their physicochemical, biopharmaceutical, pharmacokinetic and pharmacological properties and to classify them according to the BCS. Ethambutol dihydrochloride and isoniazid were classified as borderline BCS class I/III APIs. Pyrazinamide was classified as a BCS class III and rifampicin as a BCS class II API. Based on the BCS classification and the additional criteria defined in the WHO bioequivalence guidance, the possibility of biowaiver-based approval for immediate release (immediate release) solid oral dosage forms containing the first-line antituberculosis drugs was evaluated. A biowaiver-based approval with defined constraints was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing isoniazid (interaction with reducing sugars), pyrazinamide and ethambutol dihydrochloride (relative narrow therapeutic index). Rifampicin was classified as a BCS class II API, and it was concluded that rifampicin containing solid oral immediate release drug products as well as Scale-Up and Post-Approval Changes (SUPAC) changes should not be approved by a biowaiver on the following basis: (i) its solubility and dissolution are highly variable due to polymorphism and instability, (ii) concomitant intake of food and antacids reduces its absorption and bioavailability, (iii) no in vitro predictive dissolution test has been found which correlates to in vivo absorption and (iv) several publications reporting cases of non-bioequivalent and bioinequivalent rifampicin products have been located in the literature. Thus, it is recommended that bioequivalence of rifampicin containing solid oral immediate release drug products should be established by in vivo pharmacokinetic studies in humans. This risk-benefit benefit assessment of a biowaiver-based approval was presented as a poster at the American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS) 2005 and subsequently published as “Biowaiver Monographs” in the Journal of Pharmaceutical Sciences. Based on the assessment of the dissolution properties of the antituberculosis drugs for a biowaiver approval, quality control dissolution methodologies for the International Pharmacopoeia (Pharm. Int.) were developed, presented at the WHO expert meeting and adopted in the Pharm. Int. (http://www.who.int/medicines/publications/pharmprep/OMS_TRS_948.pdf). Additionally, preliminary biowaiver recommendations were also developed for four firstline antimalarial drugs listed on the WHO Essential Medicines List (EML): Quinine, as both the hydrochloride and sulphate, and proguanil hydrochloride were classified as borderline BCS class I/III APIs. Since quinine is a narrow therapeutic index drug and many cases of non-bioequivalence have been reported in the literature, a biowaiverbased approval was not recommended. For solid oral immediate release dosage forms containing proguanil a biowaiver-based approval was recommended under the condition that they dissolve very rapidly. Primaquine phosphate was classified as a BCS class I API. Therefore, a biowaiver-based approval was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing primaquine phosphate. Mefloquine hydrochloride was classified as a basic, BCS class IV/II API, making it ineligible for the biowaiver. Additionally, reports of non-bioequivalence and a narrow therapeutic index were found in the scientific literature. Consequently, bioequivalence of solid oral immediate release dosage forms containing mefloquine hydrochloride should be established by in vivo pharmacokinetic studies. The results for quinine hydrochloride and sulphate, proguanil hydrochloride, primaquine diphosphate and mefloquine hydrochloride were presented as a poster at the Pharmaceutical Sciences World Congress (PSWC) 2007 and published as a WHO Collaborating Center Report in June 2006. The aim of this project was to collect, evaluate, generate and publish relevant information for a biowaiver-based approval of essential medicines in order to provide a summary to local regulatory authorities. This information complements the selected list of essential medicines by providing information about the biopharmaceutical properties and pharmaceutical quality of solid oral immediate release dosage forms containing these APIs. The aim of the biowaiver project, inspired by the WHO and brought in life by the International Pharmaceutical Federation (FIP), is to enable access to essential medicines in standardized quality at an affordable price. In this work, a significant contribution to this aim in the form of four biowaiver monographs for the antituberculosis drugs and several reports on the antimalarials has been achieved.