Refine
Year of publication
- 2019 (46) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (46) (remove)
Has Fulltext
- yes (46)
Is part of the Bibliography
- no (46)
Keywords
- EPR (1)
- Medication Appropriatness Index (1)
- Metabolismus (1)
- Multimedikation / Polypharmazie (1)
- Multimorbidität (1)
- Nanotechnologie (1)
- Nukleäre Rezeptoren (1)
- PELDOR (1)
- PRIMUM-Studie (1)
- Paramyxoviruses (1)
Institute
- Biochemie, Chemie und Pharmazie (46) (remove)
Chlorsilane stellen Schlüsselsubstanzen zur Herstellung von elementarem Silicium dar. Zum Beispiel ist HSiCl3 ein wichtiger Ausgangsstoff im Siemensprozess[1, 2]. Chlorsilane werden unter anderem zur Herstellung von Silikonen im Müller-Rochow-Prozess[3-5] verwendet. Bei beiden Prozessen werden Silylene[6-10] als Schlüsselmediate in den Reaktionen angenommen. So auch bei der Bildung von höheren Perchlorsilanen (Reaktion b), die nur in Form komplexer Polymergemischen erhalten werden. In der vorliegenden Dissertation wurde die Plausibilität eines auf Silylen basierenden Reaktionsmechanismus zur Bildung und Reaktivität von Chlorsilanen quantenchemisch untersucht.Mit den Berechnungen aus dieser Arbeit konnten diese molekularen Prozesse aufgeklärt werden[33-35].
Die quantenchemischen Rechnungen aus dieser Arbeit umfassen Kalibrierungsrechnungen an Chlorsilanen, um die Leistungsfähigkeit der quantenchemischen Methoden zu beurteilen.
Hierbei wurden berechnete Strukturen mit den experimentellen verglichen. Zusätzlich wurden Standardbildungsenthalpien berechnet, um diese auch mit den experimentellen Daten zu vergleichen. Nach Prüfung der Validität der Referenzmethoden wurde die Tragfähigkeit der rechengünstigeren Methoden der Dichtefunktionaltheorie evaluiert.
In Vereinbarung von Rechenaufwand und Genauigkeit einer Rechenmethode wurden thermochemische Stabilitäten, Reaktionsenergien zur Bildung von Chlorsilanen aus Schema 1 berechnet. Die Betrachtung der Reaktionsmechanismen erfolgte sowohl in der Gasphase als auch in Lösung. Dabei wurden die Bildung von cyclo-Chlorsilanen, kettenförmigen und verzweigten Chlorsilanen betrachtet. Unterstützend konnten alle Intermediate und Produkte unter Verwendung der ausgewählten quantenchemischen Methode mit 29Si-NMR-Rechnungen begleitet werden. Hierbei wurden auch Vergleichsdaten von nicht literaturbekannten 29Si-NMR Verschiebungen erstellt.
In the recent years, myxobacteria have emerged as a novel source of natural compounds with structural diversity and biological activity for drug discovery. In this work, the two myxobacterial compounds archazolid and vioprolide were characterized for their potential pharmacological effects in vascular endothelial cells. Archazolid is a wellestablished v-ATPase inhibitor found in Archangium gephyra and Cystobacter spec. As the v-ATPase represents a promising target in cancer treatment, the effects of archazolid have been intensively studied in cancer cells, but rarely in endothelial cells. Vioprolide is an antifungal and cytotoxic metabolite obtained from Cystobacter violaceus. There are only few studies on vioprolide, most of them focusing on its biosynthesis. Preliminary studies revealed that it inhibited TNF-induced expression of ICAM-1, indicating possible anti-inflammatory properties. As the endothelium plays an important role in cancer and inflammation, it represents an attractive drug target. Therefore, the archazolid and vioprolide were investigated regarding their effects on endothelial cells.
V-ATPase inhibition by archazolid resulted in anti-tumor and anti-metastatic effects in vitro and in vivo. Archazolid was used to study the consequences of v-ATPase inhibition in endothelial cells that might contribute to the anti-metastatic activities observed in vivo. To analyze the impact of archazolid on the interaction endothelial and cancer cells, in vitro cell adhesion and transmigration assays were performed using primary HUVEC or immortalized HMEC-1 and different cancer cell types (MDA-MB-231, PC-3 and Jurkat cells). For these experiments, only the endothelial cells were treated with archazolid. VATPase inhibition by archazolid led to an increased adhesion of the metastatic breast cancer cell line MDA-MB-231 and prostate cancer cell line PC-3 onto endothelial cells whereas the adhesion of Jurkat cells was unaffected. Interestingly, archazolid treatment of HUVECs decreased the transendothelial migration of MDA-MB-231 cells. Endothelial ICAM-1, VCAM-1, E-selectin and N-cadherin are potential ligands of interacting cancer cells. Therefore, the mRNA and surface protein levels of these cell adhesion molecules were measured via qRT-PCR and flow cytometry, respectively. These adhesion molecules were not responsible for the archazolid-induced cancer cell adhesion, as archazolid treatment of HUVECs did not upregulate their mRNA or surface expression. Instead, cell adhesion assays using a monoclonal antibody against integrin subunit β1 showed that β1-integrins expressed on MDA-MB-231 and PC-3 cells mediated the archazolid-induced cancer cell adhesion. Cell adhesion assays onto plastic coated with ECM components which are the major ligands of β1-integrins, revealed that MDA-MB231 and PC-3 cells preferably interact with collagen. So next, we investigated the influence of archazolid on surface collagen levels in HUVECs by immunostaining, which demonstrated an increase of nearly 50 % upon archazolid treatment. We confirmed the hypothesis that the expression and activity of cathepsin B, a lysosomal enzyme that degrades extracellular matrix components including collagen, was inhibited by archazolid in endothelial cells. Finally, overexpression of cathepsin B reduced the cancer cell adhesion on archazolid-treated HUVECs, but also in control cells, indicating a negative correlation between cathepsin B expression and cancer cell adhesion.
The influence of vioprolide on the interaction of endothelial cells with leukocytes was analyzed by in vitro cell adhesion assays using HUVECs and primary monocytes, THP-1 or Jurkat cells. Vioprolide inhibited the adhesion of these cells onto TNF-activated HUVECs. In addition, the endothelial-leukocyte interaction was observed in vivo by intravital microscopy in the mouse cremaster muscle. Vioprolide prevented the TNFinduced firm adhesion and transmigration of leukocytes, while leukocyte rolling was not affected. ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin are cell adhesion molecules, which are upregulated by TNF and mediate leukocyte adhesion onto endothelial cells. Therefore, flow cytometric analysis was performed to measure their surface expression. Vioprolide significantly decreased TNF-induced expression of surface ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin, which was in line with the in vitro results. In vivo, vioprolide may act in a different way on E-selectin expression, so that leukocyte rolling, which is governed by E-selectin, remained unaffected. qRT-PCR experiments revealed that the mRNA expression of ICAM-1 and VCAM-1 were also reduced by vioprolide, indicating a regulation on transcriptional level. In contrast, the mRNA expression of E-selectin was not decreased at the timepoint when surface protein expression was diminished. The induction of these cell adhesion molecules is mainly mediated by the transcription factor NFκB. A Dual-Luciferase® reporter assay was used to study the impact of vioprolide on the TNF-induced NFκB promotor activity. Vioprolide blocked the TNF-induced NFκB promotor activity while the TNF-induced IκBα degradation and nuclear translocation of the NFκB subunit p65 was not altered by vioprolide. Western blot analysis revealed that vioprolide had no effect on the activation of MAPK (p38, JNK) and AKT by TNF, which could interfere with the NFκB-dependent gene expression.
Taken together, archazolid and vioprolide are interesting myxobacterial compounds with different modes of actions. The study suggests that the v-ATPase inhibitor archazolid impairs the expression and activity of cathepsin B in endothelial cells, which leads to a higher amount of collagen on the endothelial surface. As a result, the adhesion of β1-integrin expressing metastatic cancer cells onto archazolid-treated endothelial cells increased while transendothelial migration was reduced. Further, archazolid represents a promising tool to elucidate the role of v-ATPase in endothelial cells. Vioprolide was able to prevent TNF-induced endothelial-leukocyte interaction in vitro and in vivo by interfering with NFκB-dependent gene expression. Further research is required to enlighten the underlying mechanism and the direct target of vioprolide.
Entzündungen sind eine Gegenreaktion des Körpers auf einen schädlichen Stimulus. Eine akute Entzündung zeichnet sich durch typische Zeichen wie Schwellung, Rötung, Überwärmung, Schmerz und eingeschränkter Funktionsfähigkeit aus.Findet die Auflösung der Entzündung nur sehr langsam oder nicht statt, entsteht eine chronische Entzündung. Eine chronische Entzündung kann Auslöser vieler schwerwiegender Krankheiten, wie Diabetes mellitus, Krebs oder kardiovaskulärer Erkrankungen sein. Die symptomatische Behandlung einer chronischen Entzündung erfolgt unter anderem durch NSAIDs. Diese haben bei einer Langzeiteinnahme schwere Nebenwirkungen wie gastrointestinale Blutungen oder nephrotoxische Eigenschaften.NSAIDs greifen in den Metabolismus der Arachidonsäure-Kaskade ein. Die Arachidonsäure wird über mehrere Enzyme metabolisiert, die drei Hauptmetabolismuswege erfolgen über die Cyclooxygenase- (COX), 5-Lipoxygenase- (5-LOX) und Cytochrom P450-Enzyme (CYP450). Studien ergaben, dass die Inhibition eines Metabolismusweges eine Verschiebung der Lipidwerte innerhalb des Arachidonsäurestoffwechsels verursacht. Viele dieser Nebenwirkungen bei einer Langzeitmedikation kommen vermutlich durch die Verschiebung der Metabolite zustande.8 Diese Problematik könnte möglicherweise durch eine Inhibition mehrerer Metabolismuswege umgangen werden. Tierstudien belegen eine bessere Wirksamkeit dualer Inhibitoren gegenüber der Einzelverabreichung von „selektiven“ Inhibitoren und zudem wird ein erhöhtes Sicherheitsprofil für duale Inhibitoren postuliert.9,10 Im Rahmen dieser Arbeit wurden einerseits duale Inhibitoren der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) und Leukotrien-A4-Hydrolase (LTA4H) und anderseits der sEH und der 5-Lipoxygenase entworfen, synthetisiert und in vitro gegenüber den betreffenden Enzymen in einem Aktivitätsassay evaluiert.
Es ist gelungen, duale Inhibitoren der sEH und LTA4H mit IC50-Wert im submikromolaren Bereich zu synthetisieren. Dies wurde durch die Erweiterung des Fragments 3-(4-(Benzyloxy)phenyl)propan-1-ol, welches Amano et al. publizierten, bewerkstelligt.11 Die synthetisierten Inhibitoren wurden analytisch charakterisiert und in vitro auf ihr inhibitorisches Potential untersucht. Des Weiteren konnte die Kristallstruktur eines dualen Inhibitors in der Bindetasche der sEH gelöst werden und damit weitere Erkenntnisse über den Bindungsmodus des Inhibitors gewonnen werden. Es konnten auch duale Inhibitoren der sEH und 5-LOX synthetisiert werden und jene auf ihr inhibitorisches Potential untersucht werden. Es wurden einige Inhibitoren mit submikromolaren bis nanomolaren IC50-Werten gegenüber beiden Zielproteinen entworfen, synthetisiert und analytisch charakterisiert. Da mehrere Inhibitoren zwei stereogene Zentren aufweisen, wurde ein Inhibitor mit definierten Stereozentren durch eine asymmetrische Synthese generiert. Ein stereogenes Zentrum wurde über drei Schritte synthetisiert und zum Nachweis der Reinheit des Enantiomeres zum Diastereomer gekuppelt. Per NMR-Spektroskopie wurde das Verhältnis (dr 9:1) der Diastereomere zueinander bestimmt. Das andere stereogene Zentrum wurde mit Hilfe eines Evans-Auxiliar über eine achtstufige Synthese dargestellt und mit dem Enantiomer aus der dreistufigen Synthese verknüpft. Per HPLC konnte ein dr-Verhältnis von 99:1 für den Inhibitor HK330 bestimmt werden. Das andere Diastereomer wurde mittels HPLC aus dem Recemat isoliert. Eine in vitro Evaluation zeigte, dass der Einfluss des stereogenen Zentrums auf das Inhibitionsvermögen marginal ist.
Nach einer Evaluation des Inhibitionsvermögens, der Löslichkeit, der Zelltoxizität, der metabolischen Stabilität und der synthetischen Zugänglichkeit, wurde der Inhibitor HK330 weiter untersucht. In einem Zellassay konnte jener die 5-LOX-Aktivität senken, die 12- und 15-LOX wurde jedoch nicht inhibiert. Des Weiteren wurde der Inhibitor in einer pharmakokinetischen Studie untersucht und erreichte Plasmawerte, die bis zu 4 h in der aktiven Konzentration des Inhibitors lagen. LC-MS/MS Untersuchungen der Plasmaproben ergaben ein erhöhtes EETs/DHETs-Verhältnis, welches die in vivo Inhibition der sEH bestätigt. Die Verbindung HK330 besitzt vielversprechende Eigenschaften und deshalb soll die Wirksamkeit des Inhibitors in einem Tiermodell getestet werden. Geeignete Tiermodelle wie die unilaterale Harnleiterobstruktion (unilateral ureteral obstruction, UUO) in Mäusen könnten Aufschlüsse über die Wirksamkeit von HK330 geben. Denn sowohl die Inhibition der 5-LOX als auch der sEH sind renoprotektiv.12,13 Die profibrinolytischen und anti-inflammatorischen Eigenschaften eines sEH-Inhibitors könnten auch in einem Tiermodell zur gestörten Wundheilung untersucht werden. In einem murinen Ohrwundmodell wurde gezeigt, dass eine Behandlung mit Epoxyeicosatriensäuren (EETs) die Wundheilung signifikant beschleunigte.15 Ramalho et al. zeigten, dass die Leukotriene des 5-LOX-Metabolisimusweges eine verminderte Wundheilung in diabetischen Mäusen (Typ 1) bewirkten.
Hintergrund: Die Komplexität einer medikamentösen Behandlung steigt mit der Anzahl der Medikamente, der Einzeldosen und der Darreichungsformen und bedroht dadurch die Adhärenz der Patienten. Patienten mit Multimorbidität benötigen oft flexible, individualisierte Behandlungsschemata. Häufige Medikationsänderungen im Verlauf der Behandlung können jedoch die Komplexität einer Therapie weiter erhöhen.
Ziel: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Medikationsveränderungen bei älteren Patienten mit Multimorbidität und Multimedikation in der hausärztlichen Praxis zu beschreiben und deren Abhängigkeit von soziodemographischen und weiteren Merkmalen zu untersuchen. Zudem sollten die Medikationsveränderungen in den Daten der cluster-randomisierten kontrollierten PRIMUM-Studie (Priorisierung der MUltimedication in Multimorbidity) analysiert werden, um Effekte der komplexen PRIMUM-Intervention zu untersuchen und damit einen Beitrag zur Prozessevaluation zu leisten.
Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurden Daten der PRIMUM-Studie, die in 72 Allgemeinpraxen durchgeführt wurde, retrospektiv analysiert. Dazu wurde ein Algorithmus entwickelt, der die Wirkstoffe, die Wirkstärke, die Dosierung und die Darreichungsform zur Beurteilung von Änderungen an der von Ärzten berichteten Medikationsdaten während zweier Intervalle (Basiswert bis sechs Monate: Δ1; sechs bis neun Monate: Δ2) untersucht. Diese Veränderungen wurden auf Verordnungs- und Patientenebene deskriptiv sowie auf die Assoziation zu soziodemographischen und Versorgungsmerkmalen uni- und multivariat analysiert und auf Interventionswirkungen überprüft.
Ergebnisse: Von 502 Patienten (im Durchschnitt 72 Jahre, 52% weiblich) beendeten 464 die Studie. Medikationsveränderungen traten bei 98,6% der Patienten auf. Die maximale Anzahl an Medikationsänderungen pro Patient betrug 21 in Δ1 und 20 in Δ2. Die Gesamtzahl der Medikamente pro Patient blieb dabei weitgehend konstant und betrug im Median zu allen drei Messzeitpunkten 8 (IQR an T0 und IQR an T1: 6-9 und IQR an T2: 6-10). Änderungen bezogen auf den Wirkstoff während Δ1 und Δ2 traten bei 414 (82,5%) und 338 (67,3%) Patienten auf, Dosierungsänderungen bei 372 (74,1%) und 296 (59,2%) und in der Wirkstärke bei 158 (31,5%) bzw. 138 (27,5%). Die Darreichungsform wurde bei 79 (16%) der Patienten sowohl in Δ1 als auch in Δ2 geändert. Simvastatin, Ramipril, Metformin und Aspirin waren am häufigsten von Veränderungen betroffen. Am häufigsten verordnet waren ASS, Metoprolol und Bisoprolol sowie Simvastatin. Medikationsänderungen traten häufiger nach vorhergehenden Aufenthalten im Krankenhaus auf und Dosisreduktion war bei männlichen Patienten häufiger zu verzeichnen. In der Interventionsgruppe waren Medikationsänderungen um 19% wahrscheinlicher. Insbesondere waren Dosisreduktionen und das Ansetzen von neuen Medikamenten in der Interventionsgruppe signifikant häufiger.
Schlussfolgerungen: Bei älteren Patienten mit Multimedikation und Multimorbidität wurden die Therapiepläne häufig geändert. Auf Verordnungsebene ist dies hauptsächlich auf Absetzen und Dosisanpassungen zurückzuführen, gefolgt von Ansetzen und Wiederansetzen von Medikamenten. Dies kann die (longitudinale) Komplexität der Medikation für Patienten erhöhen und ggf. nachteilige Folgen für Therapieadhärenz und Arzneimitteltherapiesicherheit haben. Zudem wird deutlich, dass die medikamentöse Verordnungsqualität in querschnittlichen Erhebungen nicht zuverlässig beurteilt werden kann. In der PRIMUM-Studie wurden häufiger Änderungen in der Interventions- gegenüber der Kontrollgruppe vorgenommen - hauptsächlich das Ansetzen neuer Medikamente und Dosisreduktion. Damit konnten Effekte der komplexen Intervention gezeigt werden, die im Einklang mit den Zielen der Intervention zur Optimierung von Multimedikation steht.
This dissertation contains two chapters. Each chapter covers a unique topic within RNA sci-ence and is divided in two sub sections, part A and B. Each chapter contains an introduction.
Chapter 1 gives an insight into challenges encountered during sample design and preparation for single molecule Förster energy transfer (smFRET) spectroscopy and offers a solution via a newly establishedestablished workflow to obtain accurate smFRET constructs. Following this workflow, a FRET network could be generated, which allowed a detailed structural dynamics study on H/ACA RNP during catalysis with smFRET spectroscopy. This led to detailed mech-anistic insights into H/ACA RNPs dynamics during catalysis.
Chapter 2 deals with RNA synthetic biology whereby a novel eclectic design strategy for RNA of interest (ROI) release platform is presented, which allows to release a diverse ROI se-quences with single nucleotide precision triggered by an external stimulus. This design strat-egy was used to establish a ROI release system and its powerful performance in in vitro and in vivo applications was shown.
Das Glykoprotein AICL gehört zur Familie der C-Typ Lektin-ähnlichen Rezeptoren und wird nach Aktivierung humaner NK Zellen und Makrophagen auf deren Oberfläche exprimiert. Die Bindung von AICL an den genetisch gekoppelten, aktivierenden NKRezeptor NKp80, der auf allen reifen humanen NK Zellen exprimiert ist, induziert Effektorfunktionen von NK Zellen, wie Zytotoxizität und Zytokinsekretion. AICL Glykoproteine werden in ruhenden NK Zellen intrazellulär zurückgehalten und gelangen erst nach Zellaktivierung an die Oberfläche (Klimosch et al. 2013). Der Mechanismus dieser Regulation ist bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, um weitere Einblicke in die Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares im Rahmen einer Immunantwort zu ermöglichen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Aktivierung von NK Zellen sowohl präformierte im Golgi-Komplex zurückgehaltene als auch de novo synthetisierte AICL Glykoproteine an die Zelloberfläche gelangen. Bei der intrazellulären Retention von AICL handelt es sich um eine intrinsische Eigenschaft von AICL, die auch im ektopen Kontext von Insektenzellen auftritt. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die N-Glykosylierungen von AICL differentiell die AICLOberflächenexpression bestimmen. Die AICL Ektodomäne wird an einer nichtkonventionellen (N-X-C) und an drei konventionellen (N-X-S/T) N-Glykosylierungsstellen glykosyliert, wobei die Glykosylierung an ersterer ineffizient ist, sodass stets zwei Glykoisoformen vorhanden sind. Während die Glykosylierung zumindest einer konventionellen Stelle essenziell für die AICL-Oberflächenexpression ist, und diese mit zunehmender Glykosylierung konventioneller Stellen zunimmt, vermindert die nichtkonventionelle Glykosylierungsstelle die AICL-Oberflächenexpression. Für eine effiziente Oberflächenexpression ist auch die Ausbildung einer nicht-konservierten Disulfidbrücke erforderlich, die im membran-distalen Bereich der C-Typ Lektindomäne AICL-Homodimere miteinander verknüpft. Das Fehlen dieser Disulfidbrücke führt auch zu dem Verlust der NKp80-Bindung. Die intrazelluläre Reifung von AICL Glykoproteinen ist, im Gegensatz zu dem verwandten Glykoprotein KACL, in besonderem Maße abhängig von der Interaktion mit den ER-ständigen Proteinen der Proteinqualitätskontrolle. Insbesondere konnte mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen eine starke Interaktion von AICL mit dem ER Chaperone Calnexin gezeigt werden. Entsprechend ist die zelluläre Expression von AICL in Abwesenheit von Calnexin stark reduziert. Massenspektrometrisch konnte auch eine spezifische Interaktion von AICL mit dem Protein ITM2A gezeigt werden, wobei allerdings eine funktionelle Relevanz in Folgeversuchen nicht bestätigt werden konnte. Schließlich konnte eine zusätzliche Regulation der AICL-Oberflächenexpression durch proteasomale Degradation nachgewiesen werden, die über zwei Lysine im kurzen zytoplasmatischen Bereich von AICL bestimmt wird.
Frühere Untersuchungen hatten eine Bindung von sowohl AICL- als auch NKp80-Ektodomänen an K562 Zellen, eine Erythroleukämie-zelllinie, ergeben. Da K562 Zellen weder NKp80 noch AICL exprimieren, handelt es sich bei der gebundenen Struktur um einen potenziellen weiteren Liganden des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares. Hier konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Bindestruktur um ein Oberflächenprotein der K562 Zellen handelt, das allerdings nicht identifiziert werden konnte.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit mehrere AICL-spezifische, molekulare Mechanismen identifiziert und charakterisiert werden, die die aktivierungsabhängige Oberflächenexpression von AICL regulieren. Offensichtlich unterliegt diese einer strikten Kontrolle auf mehreren Ebenen, was vermutlich mit der Funktion von AICL als Ligand für einen aktivierenden Immunrezeptor auf zytotoxischen NK Zellen erklärbar ist. Weitere Untersuchungen zur AICL-Expressionsregulation und zur Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares in vivo sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der Immunbiologie von NK Zellen zu erreichen.
Uncontrolled constitutive activation of Wnt signaling is a hallmark of colorectal cancer (CRC), which is responsible for the initiation of the vast majority of CRC cases (Fearon and Vogelstein, 1990; Morin et al., 1997; Wood et al., 2007). Paneth cells support the small intestinal stem cells by providing them with the required niche factors and especially Wnt3. Although the normal colonic epithelium does not contain Paneth cells, Paneth cell metaplasia is frequently observed in human and mouse adenoma (Joo et al., 2009). The occurrence of Paneth cells suggests the presence of high levels of Wnt ligands with unknown function in the tumor microenvironment of Wnt-independent tumor cells. Tumor progression is recognized as result of evolving crosstalk between tumor cells and their surrounding non-transformed stromal cells (Hanahan and Weinberg, 2011; Wang et al., 2017). Although Wnt signaling has been intensively studied in colorectal cancer (CRC) cells (Zhan et al., 2017), it remains unclear whether Wnt activity in the tumor-associated stroma contributes to the tumor malignancy. The present thesis used the organoid 3D cell culture system, genetically modified mouse models as well as next generation sequencing technology to identify and characterise the role of Wnt signaling in the tumor microenvironment of CRC.
Krebs ist und wird voraussichtlich auch in näherer Zukunft eine der häufigsten Todesursachen weltweit bleiben. Trotz vielversprechenden Fortschritten in Therapeutik und Diagnostik bedarf es noch weiterer Forschung, um die vielfältigen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, welche dem Verlauf von malignen Tumorerkrankungen bestimmen und zu beeinflussen vermögen. Das RNA-Bindeprotein Hu antigen R (HuR) reguliert Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene, indem es durch Bindung an Ziel mRNAs Einfluss auf deren Abbau, Lokalisation oder Translationseffizienz nimmt. Darüber hinaus zeigte sich in den letzten Jahren, dass HuR diese Prozesse auch indirekt durch Interaktion mit regulatorischen RNAs beeinflusst. In Krebszellen lässt sich häufig eine erhöhte Aktivität von HuR beobachten, welche in Verbindung mit verschiedenen tumorigenen Prozessen gebracht wird. Unter anderem trägt HuR zur Deregulation des Zellzyklus bei, indem es die Expression der Cycline A2, B1, D1 und E1 erhöht. Weiterhin unterstützt HuR das Tumorwachstum durch Regulation von proangiogenen Faktoren wie VEGF, IL8 und COX2. Da HuR generell eine prominente Rolle bei der Regulation von Immunantworten, sowohl in Immunzellen selbst als auch in solidem Gewebe einnimmt, wurde HuR in der Vergangenheit häufig auch mit der Ausbildung des inflammatorischen Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, jedoch ist die Datenlage in dieser Hinsicht bis heute uneindeutig. Obwohl eine Großzahl an Zytokinen und inflammatorischen Faktoren prinzipiell als HuR Zielgene beschrieben sind, gibt es nur für die wenigsten dieser Proteine entsprechende Untersuchungen in Tumorzellen.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von HuR in Tumoren auf die Rekrutierung von Makrophagen zu evaluieren. Hierfür bot sich als in vitro Modell die Brustkrebszelllinie MCF-7 an, da diese unter entsprechenden Kultivierungsbedingungen dreidimensionale Sphäroide bildet. Solch ein Sphäroidmodell bietet sich als Kompromiss zwischen der klassischen zweidimensionalen Zellkultur an, welche zwar höchst artifiziell, jedoch leicht zu handhaben und zu kontrollieren ist, und den physiologischeren, aber gleichzeitig experimentell unzugänglicheren und speziesfremden Tiermodellen. Mittels lentiviraler Transduktion wurde ein small hairpin RNA (shRNA) vermittelter stabiler Knockdown von HuR in MCF-7 erzielt, welcher zu vermindertem Zellwachstum führte, jedoch keinen weiteren Einfluss auf die Bildung von Sphäroiden hatte. Um die initiale Suche nach HuR-regulierten, potenziell relevanten Faktoren möglichst breit und unvoreingenommen zu halten, wurde die Expression von 174 Zytokinen in Wildtyp- und HuR-knockdown Sphäroiden mittels eines Protein Arrays untersucht. Überraschenderweise zeigte der Großteil der veränderten Proteins einen negativen Zusammenhang mit HuR, welches eigentlich eher als positiv regulierendes Protein beschrieben ist. Bemerkenswerterweise befand sich unter den mit am stärksten regulierten Faktoren das Chemokin CCL5 (auch RANTES genannt), welches einerseits als einer der beiden zentralen Faktoren für die Makrophageninfiltration in Brustkrebs gilt, andererseits bisher noch nicht in Verbindung mit HuR gebracht wurde.
Im Folgenden untersuchte ich zuerst den mechanistischen Hintergrund dieser Regulation. Da diese sich auch in adhärenten Zellrasen zeigte, wechselte ich für die entsprechenden Experimente zu zweidimensionaler Zellkultur. Eine negative regulatorische Funktion von HuR wird meist in Verbindung mit verminderter Translation von Zielfaktoren gebracht. Da die mRNA Level von CCL5 dem Effekt auf Proteinebene entsprachen, konnten entsprechende Mechanismen als Grund für die veränderten CCL5 Level ausgeschlossen werden. Desweiteren blieb die mRNA Stabilität ungeachtet der HuR Level konstant; dabei zeigte sich zudem, dass mRNA Abbau generell keinen relevanten Einfluss auf die Expression von CCL5 in MCF-7 hatte. Da diese Ergebnisse auf eine transkriptionelle Regulation hindeuteten, untersuchte ich im Folgenden den Einfluss von HuR auf die Promoteraktivität von CCL5. Hierfür isolierte ich zunächst die CCL5-Promoterregion aus genomischer DNA von MCF-7 Zellen und inserierte diese dann in einen zuvor promoterlosen Luciferase-Expressionsvektor. In den folgenden Reporteranalysen zeigte sich, dass HuR tatsächlich einen negativen Einfluss auf die Promoteraktivität von CCL5 ausübt. Durch sukzessive Verkürzung ließ sich der entscheidende DNA-Bereich auf die letzten 140 Nukleotide vor dem Transkriptionsstartpunkt eingrenzen. Dieser Bereich enthält vier prominente und sehr gut charakterisierte regulatorische Abschnitte: zwei benachbarte NF-κB Bindestellen sowie je ein Interferon-stimulated Response Element (ISRE) und ein C/EBPβ Erkennungsmotiv. Während das C/EBP Element keine funktionelle Relevanz in den Reporteranalysen hatte, reduzierte sich durch Deletion sowohl der ISRE als auch der NF-κB Elemente die Promoteraktivität um mehr als 50%, allerdings nur im ISRE-Deletionskonstrukt unter Nivellierung des HuR-abhängigen Unterschiedes. Somit ließ sich der Einfluss von HuR auf die CCL5 Promoteraktivität vollständig und ausschließlich auf das ISRE zurückführen. Im Gegensatz zu dem in Tumorzellen häufig basal überaktiven NF-κB Signalweg sind die kanonischen, ISRE-assoziierten Typ I Interferon Signalkaskaden und ihre vermittelnden Transkriptionsfaktoren, die sogenannten Interferon Regulatory Factors (IRFs) nicht konstitutiv überaktiviert. Eine Sonderstellung nehmen dabei die Faktoren IRF1 und IRF2 ein, da sie, für Proteine abseits der Stimulus-getriebenen ISRE-Interferon Achse, auch als konstitutive Transkriptionsfaktoren beschrieben sind, wobei IRF2 in diesem Kontext als IRF1-Antagonist und somit Transkriptionsrepressor fungiert. Überraschenderweise ließ sich mittels Chromatin Immunopräzipitation eine Assoziation von IRF1 mit dem CCL5 Promoter nur in Wildtyp-, jedoch nicht in HuR-knockdown Zellen nachweisen. Im Gegensatz dazu ergaben mRNA Expressionsanalysen der Tumor-relevanten IRFs, dass die CCL5 Induktion in HuR-depletierten Zellen mit einer allgemeinen, jedoch niedrigschwelligen Erhöhung von Typ I Interferon-assoziierten Signalen einhergeht. Interessanterweise korrelierte Interferon β zwar mit CCL5 auf mRNA Ebene, jedoch hatte eine Blockade des Interferon-α/β Rezeptors in HuR-depletierten Zellen keinen akuten Effekt auf CCL5. Umgekehrt zeigte sich auch keine erhöhten CCL5 Level in Wildtypzellen unter Kokultur mit HuR-knockdown Zellen, wie es bei parakriner Induktion durch Interferon β zu erwarten wäre. Ebenso konnte alternatives ISRE Signaling durch einen Komplex aus unphosphoryliertem Stat1 und IRF9, wie es in vitro unter länger anhaltender Niedriglevel Exposition mit Interferon β beobachtet wurde, ausgeschlossen werden. Um sicher zu stellen, dass diese Erhöhung kein sequenzabhängiges off-target Artefakt ist, wie es in der Vergangenheit für einzelne small hairpin RNAs (shRNAs) beobachtet wurde, wurde eine entsprechende Aktivierung von IRF3 und damit des IRF3/IRF7 Aktivierungsweges untersucht und ausgeschlossen. Zusätzlich konnte durch Tests unterschiedlicher shRNA Sequenzen sowie Zellsysteme demonstriert werden, dass die CCL5 Aktivierung tatsächlich ein spezifischer und in einer größeren Bandbreite an Krebszelllinien unterschiedlicher Herkunft, darunter Brust- und Lungenkarzinom, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien, reproduzierbarer Effekt von HuR-Defizienz ist.
Da CCL5 als eines der zentralen Chemokine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen in Tumore beschrieben ist, stellte sich die Frage, ob HuR mit diesem Vorgang in Verbindung zu bringen ist. Brusttumore weisen oft eine hohe Zahl von Tumor-assoziierten Makrophagen auf, welche von eingewanderten Blutmonozyten abstammen. Ein Einfluss von HuR auf diesen Vorgang in vitro konnte mittels einer Kokultur von Sphäroiden mit zuvor frisch aus Humanblut isolierten Primärmonozyten nachgewiesen werden. Hierbei wiesen HuR-knockdown Sphäroide trotz ihres geringeren Durchmessers eine erhöhte Anzahl von Monozyten/Makrophagen auf. Da sich in diesen Zellen weder Proliferation noch relevante Apoptose zeigte, ließ sich die erhöhte Anzahl auf verstärkte Einwanderung in das Sphäroid zurückführen. Hierbei erwies sich der direkte Zellkontakt zwischen Monozyten und Tumorzellen als erforderlich, da Monozyten keine unterschiedliche Chemotaxis gegenüber entsprechenden Sphäroidüberständen zeigten. Dass die erhöhte Infiltration in HuR-defizienten Sphäroiden tatsächlich auf CCL5 zurückzuführen ist, konnte in Kokulturexperimenten durch Inhibierung von CCL5 gezeigt werden. Unterstütztend wurde ein Zusammenhang zwischen HuR, CCL5 und Tumor assoziierten Makrophagen in silico unter Zuhilfenahme des TCGA Datensets für Estrogenrezeptor-positive Brusttumore untersucht. Im Einklang mit meinen Ergebnissen zeigte sich eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5. Außerdem ließ sich ein negativer Zusammenhang zwischen HuR und einer Makrophagensignatur feststellen, während CCL5 wie erwartet mit dieser Signatur positiv korrelierte.
Zusammenfassend zeigte sich in dieser Arbeit, dass HuR eine Rolle bei der zellulären Zusammensetzung des inflammatorischen Tumor-Mikromilieus spielt. Der Verlust von HuR in Tumorzellen führte zu einer erhöhten Expression des Chemokins CCL5. Dies ließ sich in Brust- und Lungenkarzinom-, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien beobachten. In Brustkrebszellen zeigte sich, dass diese Regulation auf verstärkte Transkription, vermittelt durch ein ISRE innerhalb des CCL5 Promoters, zurückzuführen ist. Funktionell konnte die erhöhte CCL5 Produktion in HuR-defizienten Tumorsphäroiden in Verbindung mit verstärkter Infiltration von Monozyten/Makrophagen gebracht werden. Unterstützend zeigte sich auch bei einer in silico Analyse von Estrogenrezeptor-positiven Brusttumoren eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5, was mit einer entsprechend veränderten Makrophagensignatur einherging. Im Hinblick auf derzeit diskutierte Ansätze, das Wachstum von Tumoren mittels HuR Blockade zu inhibieren, sind meine Ergebnisse potenziell von therapeutischer Relevanz. Basierend auf meiner Arbeit sollte dabei in zukünftigen Studien näher untersucht werden, wie sich Inhibierung von HuR in Tumoren auf die Zusammensetzung und Funktion des Tumormikromilieus auswirkt und daraus resultierende Effekte auf das Tumorwachstum in Relation zu der allgemein wachstumsfördernden Rolle von HuR in Tumorzellen gesetzt werden.
Stickstoff (NO), Kohlenmonoxid (CO) und Schwefelwasserstoff (H2S) gehören zur Gruppe der Gasotransmitter. Dabei handelt es sich um kleine gasförmige Signalmoleküle, welche innerhalb des Körpers gebildet werden und dort wichtige physiologische Funktionen bei der Regulation der Apoptose, der Proliferation, der Entzündungsreaktion und der Genexpression übernehmen. Aufgrund ihrer Membranpermeabilität ist die Wirkung der Gasotransmitter nicht an die Interaktion mit spezifischen membranständigen Rezeptoren gebundenen. Je nach Organ, Gewebe und Konzentration können diese Mediatoren unterschiedliche Prozesse beeinflussen und teils sogar gegenteilige Wirkungen hervorrufen.H2S beispielsweise kann im Verlauf der Leukozytenadhäsion im Epithelium anti-inflammatorisch, bei Brandwunden oder rheumatischen Erkrankungen jedoch pro-inflammatorisch wirken. Im Kreislaufsystem hingegen bewirkt H2S durch die Aktivierung von ATP-abhängigen K+-Kanälen und die damit zusammenhängende Vasorelaxion der glatten Muskelzellen einen eindeutig protektiven Effekt.
H2S kann je nach Substrat und Zelltyp durch eines von 3 Enzymen gebildet werden. Die Cystathionin-γ-Lyase (CSE) und die Cystathionin-β-Synthase (CBS) nutzen L-Cystein als Substrat für die Synthese von H2S. Das dritte H2S-bildende Enzym, die 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3-MST) verwendet α-Ketoglutarat als Substrat, welches zuvor von der Cystein-Aminotransferse (CAT) aus L-Cystein synthetisiert wurde. Während die beiden Enzyme CSE und CBS im Zytosol der Zelle zu finden sind, ist die 3-MST hauptsächlich in den Mitochondrien der Zelle zu finden. Im Gegensatz zur CBS, welche eher ein konstitutiv exprimiertes Protein ist, wird die Expression der CSE auf der Transkriptionsebene durch u.a. Entzündungsmediatoren wie TNF-α oder Wachstumsfaktoren wie PDGF-BB induziert.
Ein Ziel der Arbeit war es, die Wirkung von H2S bei der Wundheilung, bei entzündlichen glomerulären Erkrankungen der Niere und beim Schlaganfall zu untersuchen. Für diesephänotypische Analysen stand ein Knockoutmodell für die CSE zur Verfügung.
Zudem wurden in dieser Arbeit Untersuchungen mit einem Knockoutmodell für das zytoskeletäre Protein durchgeführt. Bei Clp36 (PDLIM1) handelt es sich um ein PDLIM-Protein (PDZ and LIM domain protein),welches durch die Gasotransmitter NO und H2S auf transkriptioneller und translationaler Ebene reguliert wird ist und aufgrund seiner Assoziation mit dem Zytoskelett dynamische Vorgänge der Zelle moduliert. Es ist bereits bekannt, dass Clp36 ein negativer Regulator des Glykoprotein VI (GPVI), welches eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten spielt, ist.
Beide Knockoutmodelle wurden in murinen Mesangiumzellen der Niere und in Krankheitsmodellen der Haut (kutane Wundheilung)und des Gehirns (Schlaganfall mit dem MCAO-Modell) analysiert.
Neben nicht signifikanten Effekten im MCAO-Modell, konnten sowohl Effekte des CSE-, als auch des CLP36-KOs auf die Migration und Proliferation und im Falle der CSE auch auf die Adhäsion der murinen Mesangiumzellen beobachtet werden. Die Depletion von Clp36 führte zu einer Verringerung der Migrations- und einer Erhöhung der Proliferationsrate, wohingegen die Depletion der CSE zu einer Erhöhung der Migrations-, Proliferations- und Adhäsionsrate führte. Die vielversprechendsten Ergebnisse konnten im Tiermodell der kutanen Wundheilung generiert werden. Untersucht wurde die Expression der H2S-produzierenden Enzyme CSE, CBS und 3-MST. Alle drei Enzyme zeigten im Tiermodell keine transkriptionelle Regulation und blieben auch während der akuten Entzündungsphase und der proliferativen Phase der Wundheilung unverändert. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Expression der CSE in der späten Phase der Wundheilung signifikant anstieg, wenn die Proliferation innerhalb des Granulationsgewebes und der Neoepidermis geringer wurde. Die Vermutung, dass H2S in dieser Phase eine wichtige Rolle spielt, konnte durch die Analyse der CSE-KO Mäuse bekräftigt werden, da dort der Verlust der CSE offenbar durch die CBS kompensiert wurde.
In immunhistochemischen Untersuchungen konnten insbesondere follikuläre Keratinozyten der Neo-Epidemis als Quelle der CSE-Expression identifiziert werden. Durch in-vitro Studien auf mRNA und Proteinebene in HaCaT Zellen wurde gezeigt, dass H2S die Keratinozyten-Differenzierung beeinflusst. Der langsam freisetzendeH2S-Donor GYY4137 konnte in humanen Keratinozyten zu einer signifikanten Erhöhung der Ca2+- induzierten Expression der frühen Keratinozyten-Differenzierungsmarker Cytokeratin 10 (CK10) und Involucrin (IVN) beitragen.
Im Laufe dieser Arbeit konnte der molekulare Mechanismus hinter diesen Beobachtungen noch nicht geklärt werden.
Durch weitere Versuche meiner Arbeitsgruppe konnte jedoch gezeigt werden, dass die GYY4137-abhängige Induktion der CK10-Expression durch eine verstärkte Bindung der RNA-Polymerase II an den CK10 Promotor zustande kommt.
The work of this thesis focuses on the targeting of G-quadruplexes (G4s), wherein several specific and potential ligands were designed, synthesized and characterized for its structural and biological activity. G4s are nucleic acid secondary structures that may form in single-stranded guanine (G)-rich sequences under physiological conditions. Four Guanines (Gs) bind via Hoogsteen-type hydrogen bonds base pairing to yield G-quartets, which in turn stack on top of each other to form the G4. G4s are highly polymorphic, both in terms of strand stoichiometry (forming both inter and intramolecular structures) and strand orientation/topology. The presence of K+ cations specifically supports G4 formation and stability. In the human genome G4 DNA motifs have been found in telomeres, G-rich micro and mini-satellites, up-stream to oncogene promoters and within the ribosomal DNA (rDNA). Human G4 DNA motifs are over-expressed in recombinogenic regions, which are associated with genomic damage in cancer cells.
In the present work, we focus on lead identification with specificity towards the c-MYC promoter G4s. Drug discovery is a highly time consuming and costly process. Lead identification and development are key steps in the drug discovery program. Studies have suggested that a large number of commercially available drugs exhibit deep structural similarity to the lead compounds from which they were developed. Quality lead identification in terms of compounds with high potency and selectivity, favorable physicochemical parameters and in vitro Absorption Distribution Metabolism and Excretion (ADME) parameters are the foremost requirements for the success of the drug discovery process. We herein describe the fragment-based drug design approach for the development of pyrrolidine-substituted 5-nitroindole derivatives as a new class of G4 ligands that exhibit high affinity and selectivity for the c-MYC promoter G-quadruplex. This chapter focuses on the methodology explored whilst finding a suitable hit and its optimization with fragment expansion strategies which undergo efficient G4 binding.
To target G4 DNA, screenings of numerous heterocycles have been reported including indoles, 7-azaindoles, 1H-indazol-3-yl, benzothiazole, imidazo[1,5-a]pyridine, 2,6- diaminopyrimidin-4-ol, 1H-pyrazolo[4,3 d]pyrimidin-7-amine, morpholino, bis-indoles, 2-hydroxynaphthalene-1,4-dione, 1,4-dihydroxyanthracene-9,10-dione, benzofuran and piperonal derived from several alkaloids. In this part of the thesis, we set out to identify new binders targeting the c-MYC G-quadruplex starting from the indole fragment. Several synthetic strategies are reported to optimize and generate best hits starting from 5-nitro indole derivatives by introducing the secondary cationic linked pyrrolidine side chain. Interestingly, all improved versions of G4-indole fragments 5, 7 and 12 contain this 5-nitro functionality, which may aid in the electrostatic binding and contributes to hydrogen binding interactions of the ligands to G4 DNA. In-silico drug design, biological and biophysical analyses illustrated that the substituted 5-nitro indoles scaffolds show preferential affinity towards the c-MYC promoter G-quadruplex compared to other G-quadruplexes and double stranded DNA. In vitro cellular studies confirm that the substituted indole scaffolds downregulate c-MYC expression in cancer cells and have the potential to induce cell cycle arrest in the G0/G1 phase. NMR analysis suggests that 5, 7, and 12 interacts in a fast exchange regime with the terminal G-quartets (5’ and 3’end) in a 2:1 stoichiometry.
To further optimize the fragment generated in chapter II, a novel series of triazole linked indole derivatives as a potential G quadruplex stabilizers have been described in chapter III. The potential ligands can be obtained through an efficient, convergent, synthetic route in moderate to good yields. The synthesized triazole linked indole derivatives are selective towards c- MYC G4-DNA vs. duplex-DNA. The planarity of the aromatic core and its ability to occupy more surface area by stacking over the G4 greatly affect the ability of the compounds to stabilize the G4. Further biophysical and biological studies revealed that the triazole linked nitro indoles are more promising than the amino indole derivatives.
Additionally, the importance of the nitro functional group has been justified by molecular docking studies, where hydrogen-bonding interactions were observed in between the nitro group and the G4 base pairs of the G-quadruplex. In biological findings, most of the synthesized triazole linked nitro indoles has found to be effective against human carcinoma (cervical) HeLa cell lines. Furthermore, western blot and cell cycle analysis confirms that the novel triazole linked 5-nitro indole derivatives (9b) could down-regulate c-MYC oncogene expression in cancer cells via stabilizing its promoter quadruplex structure, arresting cell cycle in G0/G1 phase. NMR analysis suggests that 9b interacts in slow exchange regime with the terminal G-quartets (5’ and 3’-end).
In chapter IV of the thesis, we have developed the synthetic strategies to generate more potent G4 ligands via Knoevenagel condensation. To investigate novel and selective G4 ligands for cancer chemotherapy, we designed and synthesized a series of azaindolin-2-one derivatives (11, 14, 15, 16 and 22) by attaching cationic pyrrolidine side chains and introducing a fluorine atom into the aromatic chromophore (Fig. 3). Fluorine atoms, with high electronegativity and small size, often exhibit unique properties in functional molecules. The electron-withdrawing effect of fluorine could reduce the electron density of the aromatic chromophore, which might favor a stronger interaction with the electron-rich π-system of the G-quartet. In addition, the introduction of fluorine atoms into small molecules might improve lipophilicity and thus the bioavailability. Fluorescent indicator displacement assay (FID) assays suggests that the synthesized azaindolin-2-one derivatives are selective towards c-MYC G4-DNA vs. duplex-DNA and showed potent anticancer activity against human carcinoma (cervical) HeLa cell lines. They down-regulate c-MYC expression in cancer cells via stabilizing its promoter quadruplex structure, arresting cell cycle in G0/G1 phase. Furthermore, NMR spectroscopy suggests that azaindolin-2-one conjugate interacts with terminal G-quartets as well as with the nearby G-rich tract (G13-G14-G15 and G8-G9-G10) of c-MYC quadruplex in intermediate exchange regime.