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Polygene Risikoscores (PRS) integrieren zahlreiche Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) von meist geringer Effektstärke, um Auskunft über das Erkrankungsrisiko bestimmter Krankheiten zu geben. In dieser Arbeit wurde der PRS zur genetisch generalisierten Epilepsie (GGE) von Leu et al. aus dem Jahr 2019 untersucht, um festzustellen, ob über das Erkrankungsrisiko hinaus noch Korrelationen mit weiteren phänotypischen Eigenschaften von Patienten bestehen. Der Nachweis solcher Zusammenhänge würde eine Prädiktionsfähigkeit des GGE-PRS demonstrieren, die perspektivisch ein Potential für dessen klinische Anwendbarkeit, beispielsweise im Sinne der personalisierten Medizin, aufzeigen könnte.
Die Identifizierung neuer Korrelationen sollte durch Vergleich der Phänotypen von zwei Gruppen von GGE-Patienten mit extrem hohen, beziehungsweise extrem niedrigen PRS-Werten erfolgen. Hierfür wurden von 2256 Patienten aus der Datenbank von Epi25, einem internationalen Forschungskollaborativ zur Erforschung der Relevanz genetischer Faktoren bei der Entwicklung von Epilepsie, die Patienten mit den höchsten (n=59) und den niedrigsten (n=49) GGE-PRS-Werten ausgewählt. Für diese 108 Patienten wurden retrospektive klinische Daten von den jeweiligen Behandlungszentren akquiriert. Hierzu wurde den Studienleitern der Zentren ein Questionnaire mit Fragen zu zahlreichen phänotypischen Parametern der Patienten übermittelt. Die Rücklaufrate war mit 54% gut.
Die so eingeholten Patientendaten wurden anschließend mittels Exaktem Test nach Fisher und Wilcoxon-Rangsummentest statistisch analysiert, um Unterschiede zwischen den Phänotypen beider Gruppen nachzuweisen. Im Falle der Pharmakoresistenz zeichneten sich hierbei zunächst signifikante Unterschiede ab, die ein selteneres Auftreten dieser Eigenschaft für Patienten mit hohen GGE-PRS-Werten implizierten. Diese Ergebnisse waren jedoch nach einer Bonferroni-Korrektur und bei Validierung in einer größeren Kohorte (n=825) nicht mehr signifikant. Für die anderen untersuchten Parameter waren ebenfalls keine signifikanten Unterschiede nachweisbar.
Das Ergebnis, dass für keinen der untersuchten Parameter signifikante Differenzen bestanden, obwohl zwei Kohorten mit extrem gegensätzlichen PRS-Werten untersucht wurden, spricht gegen eine Verwendung des aktuell verfügbaren GGE-PRS als prädiktiver Biomarker über das Erkrankungsrisiko hinaus und somit gegen dessen klinische Anwendbarkeit. Jedoch können die nicht-signifikanten Korrelationen im Falle der Pharmakoresistenz als Hinweis verstanden werden, dass im Bereich der Pharmakotherapie Zusammenhänge zwischen Score und Phänotyp bestehen könnten, die weiterer Untersuchungen in zukünftigen Studien bedürfen. Bei Verwendung eines verbesserten GGE-PRS mit zusätzlichen risikoassoziierten SNP und verfeinerter Wichtung der Effektstärken sowie größerer Kohorten könnten in diesem Bereich möglicherweise auch signifikante Zusammenhänge nachweisbar werden.
Mitochondrial RNA granules (MRGs) are membraneless, highly specialized compartments that play an essential role in the post-transcriptional regulation of mitochondrial gene expression. This regulation is crucial for maintaining energy production, controlling metabolic functions and ensuring homeostasis in cells. Dysregulation of mitochondrial genes has been linked to various human diseases, including neurodegenerative and metabolic disorders as well as certain types of cancer.
MRGs are composed of different RNA species, including mitochondrial precursor RNA (pre-RNA), mature tRNAs, rRNAs and mRNAs complexed with multiple proteins involved in RNA processing and mitoribosome assembly. However, despite the significance of MRGs, their protein composition, structural organization, stability and dynamics during stress conditions remain elusive. In the study reported here, I adopted a three-step approach to address the aforementioned fundamental issues.
First and foremost, I identified the protein composition of MRGs and unveiled their architectural complexity. To characterize the MRG proteome, I applied the cutting-edge TurboID-based proximity labeling approach combined with quantitative mass spectrometry. Proximity labeling was conducted on 20 distinct MRG-associated human proteins, resulting in the identification of more than 1,700 protein-protein interactions. This expansive dataset enabled me to create a comprehensive network, providing valuable insights into both the (sub)architecture as well as the core structure of MRGs in-depth.
Secondly, I investigated the spatio-temporal dynamics of MRGs under various mitochondrial stress conditions. To monitor the morphological alterations and compositional changes of MRGs, I utilized time-resolved confocal fluorescence microscopy and proteomics, respectively. In this analysis, I applied IMT1, the first specific inhibitor that selectively targets mitochondrial transcription. Using this methodology, I pinpointed precise conditions that triggered MRGs’ disassembly during stress, followed by their reassembly when nascent RNA production was restored. The results of this examination elucidate that MRGs are highly dynamic and stress adaptive structures, capable of rapid dissolution and reassembly, a process closely connected to mitochondrial transcription.
Thirdly, I aimed to explore the impact of RNA turnover on MRGs’ integrity during stress, employing confocal fluorescence microscopy and quantitative real-time PCR. I observed that depletion of MRG proteins associated with RNA degradation counteracts MRGs’ disassembly under stress conditions, a phenomenon attributed to the accumulation of double-stranded RNA (dsRNA). These results emphasize the critical role of pre-RNA turnover in maintaining MRG integrity and reveal that MRGs can be stabilized by dsRNA.
Taken together, the comprehensive investigation reported in this thesis has substantially broadened and deepened our understanding of MRGs’ complexity. By identifying their molecular structure and dynamics, I have gained significant insights into the fundamental characteristics and biological functions of MRGs in cellular processes. This knowledge contributes to the identification of disease-related pathways linked to mitochondrial gene expression and may inspire future studies to develop novel therapeutic approaches.
Inflammation is a crucial host defense mechanism activated in response to injury or infection. Its primary goal is to eliminate the source of the disturbance, repair the damaged tissue, and restore homeostasis. Inflammatory processes can be recognized through increased blood flow, higher vascular permeability, and the recruitment of leukocytes and plasma proteins to the tissue. A pathogen-induced inflammation triggers various pro- and anti-inflammatory processes. Local tissue cells and Toll-like receptors call upon innate immune cells like neutrophils, dendritic cells (DCs), and monocytes to respond to the intruder. They move across the endothelium and respond to local signals by releasing mediators or cytotoxic compounds, phagocytosing, or polarizing. To study local pathogen-induced inflammation, a zymosan-induced inflammation model was used in the hind paws of mice, which caused a Toll-like receptor 2 mediated inflammation. Multi-Epitope-Ligand-Cartography (MELC) was used for multiple sequential immunohistochemistry with 40 different antibodies on the same tissue. Bioinformatic analysis and graphical representation revealed a specific inflammatory architecture consisting of three major areas based on macrophage polarization and their cellular neighborhoods: a core region containing the pathogen, a pro-inflammatory region containing M1-like macrophages, and a region containing anti-inflammatory cells. This discovery highlights the coexistence of pro- and antiinflammatory processes during an ongoing inflammation and challenges the concept of a gradual temporal transition from pro- to anti-inflammation. Flow cytometry of the whole paw was performed to support and refine the MELC results. Eosinophils were used as a specific immune cell population to investigate their role in the inflammatory structure. They were found to be present in all three inflammatory regions, adapting their cytokine profile according to their localization. Depleting eosinophils reduced Interleukin 4 (IL-4)- levels, increased edema formation, and mechanical and thermal hypersensitivities during inflammation resolution. In the absence of eosinophils, pro- and anti-inflammatory region could not be determined in the inflammatory architecture, neutrophil numbers increased, and efferocytosis and M2-macrophage polarization were reduced. IL-4 administration restored these regions, normalized neutrophil numbers, efferocytosis, M2-macrophage polarization, and resolution of zymosan-induced hypersensitivity. The results show that eosinophils expressing IL-4 support the resolution of inflammation by enabling the development of an anti-inflammatory framework that encloses pro-inflammatory regions.
In Deutschland leidet ca. jeder zehnte Mensch über 40 Jahren an einer chronischen Einschränkung seiner Nierenfunktion. Nicht wenige davon sind im Laufe der Erkrankung auf eine Nierenersatztherapie angewiesen. Die Ursachen für eine Nierenschädigung sind vielfältig. Als neuartiger und vielversprechender Therapieansatz werden aktuell Mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSC) als Therapeutikum für diverse Nierenerkrankungen getestet. Erste Ergebnisse klinischer Phase-I-Studien zeigen, dass MSC sicher als Immunsuppressivum nach Nierentransplantation angewendet werden können. Auch für weitere Erkrankungen der Niere sind erste klinische Studien am Laufen. MSC gelten als regenerativ, immunsupprimierend und antientzündlich. Dennoch gibt es noch einige Limitationen. Nach der Transplantation der Zellen ist das Wachstum der Zellen oft eingeschränkt und es kommt zur vermehrten Apoptose. Auch wird immer wieder ein paradoxes und entzündungsförderndes Verhalten der MSC am Wirkort beobachtet. Ein wichtiger Lösungsansatz ist eine in vitro Vorbehandlung der MSC zur Modulierung der zellulären Eigenschaften. In dieser Arbeit wurden drei Substanzen und Arzneimittel auf ihre Fähigkeit untersucht, die entzündungshemmenden Eigenschaften der MSC zu verbessern und die entzündungsfördernden zu unterdrücken. Der Fokus lag hierbei auf dem Arzneimittel Niclosamid und den beiden bisher noch nicht zugelassenen Substanzen Berberin und Gedunin, die alle in vitro und in vivo bereits erste vielversprechende antientzündliche Wirkungen bewiesen haben. Für diese Arbeit wurden MSC aus Fettgewebe isoliert (ASC) und mit LPS oder einem Cytokin-Mix (Mischung aus TNF-α, IFN-γ und IL-1β) sowie den drei Substanzen stimuliert. Untersucht wurden im Anschluss die mRNA-Expressionen der gängigsten proinflammatorischen (TNF-α, IL-6, TLR-4, ICAM-1, HLA-DR) und antiinflammatorischen Marker (IDO, IL-10), sowie mittels ELISA die Protein-Freisetzung von IL-6 und IL-8. Die vielversprechendsten Ergebnisse ließen sich durch Berberin hervorrufen. Hier zeigte sich eine deutliche Senkung der IL-8-Konzentration im ELISA. Die Anwendung des Gedunin hatte keine signifikante Wirkung auf die ASC. Niclosamid hingegen scheint widererwarten sogar entzündungsfördernd zu wirken, in dem es die IL-6-, ICAM-1-mRNA-Expression steigerte und die IDO-mRNA-Expression absenkte. Unter den drei getesteten Subtanzen hat Berberin die beste Wirkung bewiesen. Nach weiterer Testung könnte eine Anwendung mit Berberin als in vitro Präkonditionierung von MSC vielversprechend sein. Die Verwendung von Niclosamid hingegen sollte vermieden werden, die Wirkung von Gedunin müsste genauer untersucht werden.
Das Schilddrüsenkarzinom (SK) ist die häufigste bösartige endokrine Tumorerkrankung. Während das nicht-metastasierte und nicht-mutierte papilläre Schilddrüsenkarzinom (PSK) und das follikuläre Schilddrüsenkarzinom (FSK) eine gute Heilungschance aufweisen, zeigen die mutierten und metastasierten Varianten des PSK und FSK sowie das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ASK) weiterhin eine schlechte Prognose. Die Entwicklung von Therapieresistenzen stellen hierbei ein Hauptproblem in der Behandlung des fortgeschrittenen Schilddrüsenkarzinoms dar.
In den letzten Jahren wurden in Studien zunehmend Tumor-initiierende Zellen (TIZ) beschrieben, welche eine kleine Subpopulation von Zellen mit der Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Tumorinitiierung und Entwicklung von Therapieresistenzen von Tumoren darstellen. Die Existenz von TIZ wurde auch im SK nachgewiesen. Ein entscheidender Faktor für die Persistenz von TIZ ist die Hypoxie, welche über eine Veränderung des Tumormikromilieus und des Zellmetabolismus zur Entstehung von Therapieresistenzen beiträgt. Ein durch Hypoxie hochreguliertes Enzym ist die Carboanhydrase IX (CAIX). CAIX wird hauptsächlich von Tumorzellen exprimiert und katalysiert die Reaktion von Kohlendioxid zu Bicarbonat und einem Proton und trägt damit zur Säurepufferung der Tumorzelle bei. CAIX stellt somit einen entscheidenden Faktor für das Überleben von Tumorzellen in einem hypoxischen Milieu dar. Des Weiteren ist eine erhöhte Expression von CAIX mit einem schlechten Patienten-Outcome assoziiert, wie z.B. im Brustkrebs. Diese Eigenschaften machen CAIX zu einem attraktiven Angriffspunkt einer zielgerichteten Tumortherapie. Die vorliegende Studie hat zum Ziel, die Expression von CAIX sowie dessen biologische Rolle im Schilddrüsenkarzinom näher zu untersuchen.
Hierzu wurden Proben von 114 SK-Patienten immunhistochemisch auf eine CAIX-Expression untersucht und mit tumorfreiem Schilddrüsengewebe verglichen. Hierbei waren unterschiedliche SK-Subtypen vertreten. Für eine weitere Validierung der Expressionsdaten erfolgte die Auswertung eines Datasets von „The Cancer Genome Atlas“ (TCGA) mithilfe von cBioportal. Da die Hypoxie ein wichtiger Faktor für die Persistenz von TIZ ist, wurde die CAIX-Expression in Tumorsphären, ein in vitro Nachweis von TIZ-Aktivität, mittels der Durchflusszytometrie bestimmt und mit der CAIX-Expression von Monolayern verglichen. Als SK-Zelllinien wurden BCPAP (PSK), FTC 133 (FSK) und 8505 C (ASK) verwendet. Anschließend wurde mithilfe der Polymerasekettenreaktion und Immunofluoreszenzfärbung untersucht, ob eine CAIX-Expression in den Tumorsphären mit der Expression von bereits bekannten Stammzellmarkern, u.a. NANOG, assoziiert ist. Die Unterschiede der CAIX-Expression, nach Inkubation der Monolayer jeweils in Normoxie und Hypoxie, wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Mithilfe eines genetischen CAIX-Knockdowns sowie einer pharmakologischen Inhibition mit dem CAIX-Inhibitor Methazolamid (MZM) wurde die Tumorzellproliferation und -Sphärenbildung unter Normoxie und Hypoxie bestimmt. Zusätzlich wurde der Einfluss von MZM auf die Apoptose und den Zellzyklus untersucht.
Immunhistochemische Färbungen der Gewebeproben von SK-Patienten zeigten, dass die CAIX-Expression sowohl im PSK und FSK als auch im ASK im Vergleich zum tumorfreien Schilddrüsengewebe erhöht war. Des Weiteren zeigte die klinisch-pathologische Datenanalyse, dass eine erhöhte CAIX-Expression mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen im differenzierten SK assoziiert war. Auch die Analyse des TCGA-Datasets bestätigte, dass eine erhöhte Expression der CAIX-mRNA mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium, Fernmetastasen und mit einem kürzeren Gesamt-Überleben von SK-Patienten korrelierte. Die weiteren funktionellen in vitro Untersuchungen ergaben, dass die CAIX-Expression in den Tumorsphären im Vergleich zu Monolayern erhöht und mit einer erhöhten Expression von Stammzellmarkern assoziiert war. Ein genetischer CAIX-Knockdown und eine CAIX-Inhibition mit MZM führten über eine Induktion der Apoptose und eines Zellzyklusarrests zu einer verminderten Tumorzellproliferation und Sphärenbildung.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass CAIX ein vielversprechendes Zielmolekül für eine gezielte Tumortherapie des fortgeschrittenen SK ist. Um diese Hypothese bestätigen zu können, sind jedoch weitere prospektive Analysen von Patientenproben sowie funktionelle in vivo Untersuchungen am SK nötig.
Einleitung: Die Zentrale Notaufnahme (ZNA) stellt eine Schnittstelle zwischen prä- und innerklinischer Versorgung dar. Das Spektrum der Krankheitsbilder erstreckt sich über jegliche Fachrichtungen und variiert von harmlosen Banalitäten bis zu akuten Notfällen. Eine sichere und suffiziente Primärversorgung ist die Basis eines qualitativ-hochwertigen Gesundheitssystems.2 Verspätete oder falsche Diagnosen in der ZNA sind mit 10-30 % keine Seltenheit.
Dies ist nicht nur für den individuellen Patienten belastend, es bedeutet auch einen zusätzlichen Ressourcenverbrauch und eine finanzielle Belastung für das Gesundheitssystem. Clinical Decision Support Systems (CDSS) haben das Potenzial, sowohl professionelle Anwender als auch Laien bei ihrer Diagnosefindung zu unterstützen. Fragestellung: Ziel der Arbeit ist es herauszufinden, welchen Einfluss der Diagnosezeitpunkt auf das Outcome von Patienten mit Abdominalschmerzen in der ZNA hat und inwiefern ein CDSS das Potenzial hat, die genannten Punkte zu beeinflussen.
Methoden: Es handelte sich um eine prospektive, doppelt verblindete Beobachtungsstudie. Patienten, die sich mit Abdominalschmerzen in der Notaufnahme vorstellten, gaben ihre Symptome in die Ada-App ein. Sowohl die Diagnosevorschläge der App als auch die Verdachtsdiagnosen des behandelnden Arztes wurden dokumentiert und verglichen. Weitere erhobene Parameter waren die Verwendung von apparativer Diagnostik, die vergangene Zeit bis zur endgültigen Diagnosestellung, das Auftreten von Komplikationen, die Komorbidität und Mortalität sowie die Länge des Krankenhausaufenthalts. Das Follow-Up erfolgte zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu Tag 90. Für die Analyse wurden die 450 Patienten anhand des Zeitpunkts ihrer Diagnosestellung in Gruppen "früh" (Tag 0) und "spät" (Tag 1-24) eingeteilt.
Ergebnisse: Im Vergleich zur „frühen“ Gruppe, hatte die Gruppe der „spät“ diagnostizierten Patienten einen höheren Anteil von Männern (45.2% (n=168/372) versus 60.3 % (n=47/78); p=0.018), im Schnitt einen höheren Charlson Comorbidity Index (0.7 versus 1.1; p=0.045) und im Schnitt einen höheren RAI-C Score (8.06 versus 9.9; p<0.001) am Tag ihrer Vorstellung. Bei den „spät“ diagnostizierten blieben weniger Patienten komplikationsfrei (57.0 % 49 (n=212/372) versus 17.9% (n=14/78); p<0.001), es traten mehr Major-Komplikationen auf (8.9% (n=33/372) versus 17.9% (n=14/78); p=0.024), analog dazu war der Comprehensive Complication Index höher (13.1 versus 25.6; p<0.001) und sie verweilten länger im Krankenhaus (2.6 Tage versus 6.7 Tage; p<0.001). Zudem nahmen sie signifikant mehr apparative Diagnostik in Anspruch.
Die behandelnden Ärzte konnten in 82.6% der Fälle (n=372/450) am Tag der Vorstellung die korrekte Diagnose stellen. Die Ada-App konnte in insgesamt 52% der Fälle (n=234/450) die korrekte Diagnose unter ihren Diagnoseverschlägen nennen.
Schlussfolgerung: Multimorbide Patienten scheinen anfälliger zu sein für falsche und verspätete Diagnosen. Ein später Diagnosezeitpunkt korreliert mit der vermehrten Nutzung apparativer Diagnostik, einem komplikationsreicheren Verlauf, einer höheren Komorbidität und einem längeren Krankenhausaufenthalt.
Die Ada-App ist den Ärzten zwar unterlegen, dennoch ist Potenzial vorhanden.
Für Ärzte kann die Ada-App eine Unterstützung im Rahmen der Diagnosefindung darstellen. Neben der Ressourcenentlastung kann sie vor Fehlannahmen und frühzeitigen Schlussfolgerungen schützen und auf weitere mögliche Differentialdiagnosen hinweisen. Die Ada-App stellt für Laien mit Sicherheit eine Weiterentwicklung gegenüber der simplen Symptomsuche über das Internet dar, dennoch sollten weitere Studien den Nutzen und die Sicherheit der App überprüfen.
Weltweit gibt es laut WHO ca. 58 Millionen Menschen mit einer chronischen Hepatitis-C-Virus (HCV) Infektion und jährlich stecken sich ca. 1,5 Millionen Menschen neu mit diesem Virus an (Stand 2019). Da die Folge einer chronischen Hepatitis-C-Virus Infektion eine potenziell tödlich verlaufende Leberzirrhose oder die Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms sein können, ist eine frühe Diagnose und eine adäquate Therapie eine wichtige Aufgabe in der Medizin.
Die bisherige Therapie erfolgte mittels pegyliertem Interferon und Ribavirin und seit einigen Jahren auch interferonfrei mittels Direkter Antiviraler Agenzien (DAA). Vor allem beim älteren Therapieregime konnten viele Nebenwirkungen und häufiger auch ein Therapieversagen auftreten, sodass ein leicht zu gewinnender Biomarker nützlich wäre, der die Patienten mit Therapieversagen frühzeitig und im besten Fall sogar vor Therapiebeginn detektieren kann.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Spiegel von extrazellulär im Blut zirkulierender, leberspezifischer microRNA miR-122 auf Eigenschaften als solche potenzielle Biomarker untersucht. Dazu wurden die Patientenseren von insgesamt 60 Patienten mit chronischer Hepatitis-C-Virus Infektion analysiert, die mittels pegyliertem Interferon und Ribavirin behandelt wurden. Vor, während und nach der Therapie wurden verschiedene Laborparameter sowie die miR 122 in den Patientenseren bestimmt. 20 dieser Patienten zeigten ein dauerhaftes Ansprechen auf die Therapie (sustained virological response = SVR), 20 zeigten nach einem initialen Therapieansprechen ein Rückfall der Erkrankung (Relapse) und 20 Patienten sprachen gar nicht auf die Therapie an (Non-Responder = NR).
Zunächst wurden die sogenannten Baseline-Charakteristika der Patienten vor Therapiebeginn untersucht. Dabei konnten wir jedoch keinen Unterschied zwischen den Patientengruppen hinsichtlich der Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST), zwei Laborparameter zur Bestimmung einer Leberschädigung, sowie der HCV-RNA, ein Parameter zur Bestimmung der Viruslast bei Patienten mit einer HCV-Infektion, feststellen.
Auch die miR-122-Spiegel zeigten vor Therapiebeginn keinen signifikanten Unterschied zwischen den drei Patientengruppen. Daraus wurde geschlossen, dass man die miR-122 vor Therapiebeginn nicht als prognostischen Marker für einen Therapieerfolg verwenden kann.
Beim Vergleich der miR-122-Spiegel mit den Laborparametern konnte eine signifikante Korrelation zwischen der miR-122 und der ALT, AST und der Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) festgestellt werden. Die miR-122 scheint somit ähnlich wie die anderen Laborparameter eine Leberzellschädigung widerzuspiegeln.
Nach dem Therapiebeginn konnte bereits ab Woche 4 ein signifikanter Unterschied zwischen den SVR und Non-Respondern sowie zwischen den Relapsepatienten und den Non-Respondern festgestellt werden. Jedoch war der Unterschied zwischen den SVR und den Relapse-Patienten nicht signifikant, sodass man weiterhin keine Unterscheidung dieser beiden Patientengruppen machen konnte.
Auch die ALT- und HCV-RNA-Spiegel zeigten einen ähnlichen Verlauf. In den Gruppen der SVR und Relapse-Patienten zeigte sich im Laufe der Therapie ein Rückgang der Parameter wohingegen die Gruppe der Non-Responder keine signifikante Dynamik aufwies.
Zum Schluss wurden die miR-122-Spiegel 12 bzw. 24 Wochen nach Therapieende bestimmt, dem sogenannten Zeitpunkt des Follow-Up bei dem der Therapieerfolg laut Leitlinie mit Hilfe der HCV-RNA-Messung bestimmt wird. Dabei konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den miR-122-Spiegeln bei den SVR-Patienten und den anderen beiden Patientengruppen festgestellt werden.
In Zusammenschau dieser Ergebnisse kann man sagen, dass die miR-122 gut geeignet ist um ähnlich wie die HCV-RNA den Therapieverlauf widerzuspiegeln. Als prognostischer Parameter bzw. Biomarker für ein Therapieansprechen ist sie jedoch nicht geeignet, da keine Unterscheidung zwischen den einzelnen Patientengruppen vor Therapiebeginn möglich ist und während der Therapie lediglich die Non-Responder und nicht die Relapse-Patienten detektiert werden können.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Fragestellung, inwieweit ORF10 von B. recurrentis, dem Erreger des Läuserückfallfiebers, mit verschiedenen Komplementkomponenten interagieren kann.
Mit funktionellen Komplementtests konnte gezeigt werden, dass ORF10 den klassischen, den alternativen sowie den Lektin-Weg inhibiert, wobei sich die stärkste Inhibition gegenüber dem alternativen Weg manifestierte. Darüber hinaus ließ sich in einem Zell-basierten Hämolyse-Assay eine Inhibition des terminalen Komplementweges durch ORF10 nachweisen.
Die durchgeführten Bindungsanalysen mit verschiedenen Komplementkomponenten führten zu dem Ergebnis, dass ORF10 mit C1q, C1s, C3, C3b, C4b und C5 interagiert und diese Protein-Protein-Interaktion mit den Komplementkomponenten C1q, C3, C3b und C4b durch einen dosisabhängigen Verlauf charakterisiert ist. Eine Bindung von C1r, C2, C4, FB, FH sowie FI konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.
Auf Basis der modellierten Struktur von ORF10 wurden mithilfe der In-vitro-Mutagenese drei verschiedene Varianten generiert, die jedoch nicht affinitätschromatographisch aus E. coli-Zelllysaten isoliert werden konnten und deshalb nicht für weiterführende funktionelle Analysen zur Verfügung standen.
Die Ergebnisse der Serumbakterizidie-Tests mit einem „gain of function“-Borrelienstamm, welcher ORF10 heterolog produzieren sollte, ergaben, dass keine erhöhte Resistenz gegenüber Humanserum nachgewiesen werden konnte. Inwieweit ORF10 bei der intrinsischen Serumresistenz von B. recurrentis beteiligt ist, lässt sich abschließend nicht vollumfänglich erklären.
Das Hepatoblastom ist ein embryonaler Lebertumor, dessen Zellen unterschiedliche unreife Stadien aufweisen. Aufgrund dieser Unreife ist die Identifizierung von Krebsstammzellen erschwert, die in diesem Tumor vermutet und für Rückfälle verantwortlich gemacht werden. In Vorarbeiten konnte eine Krebsstammzellpopulation mit der Kombination der hämatopoetischen Stammzellmarker CD90 und CD34 sowie dem „oval cell“ OV-6-Antikörper in den etablierten Hepatoblastomzelllinien HuH6 und HepG2 detektiert werden. Diese CD34+OV-6+CD90+ Zellen wiesen eine erhöhte Expression von Pluripotenzfaktoren auf und zeichneten sich durch ein erhöhtes Migrationsverhalten aus.
In der hier vorgelegten Arbeit wurden zunächst Tumor-Sphäroid-Assays durchgeführt um diese Population als Krebsstammzellen zu bestätigen, da nur Krebsstammzellen unter den gegebenen Umständen wachsen können. Diese waren im Anschluss wieder in der Lage, in „normalem Medium“ zu differenzieren. Des Weiteren wurden die Zelllinien mit dem Standardtherapeutikum Cisplatin behandelt. Da Krebsstammzellen als chemoresistent gelten, konnte in der überlebenden Zellpopulation auch eine Anreicherung der CD34+OV-6+CD90+ Zellen beobachtet werden. Zusätzlich ließ sich eine weitere CD34+OV-6+CD90+ Population identifizieren, deren Expression aller drei Marker schwächer war und die bei steigenden Cisplatin-Konzentrationen den Großteil der CD34+OV-6+CD90+ Population ausmachte.
Neben den erhöhten Transkriptmengen der Pluripotenzmarker Oct4 und Nanog zeichneten sich die CD34+OV-6+CD90+ Krebsstammzellen durch eine verstärkte Expression der aktivierungsinduzierten Zytidin-Desaminase AID aus. AID wirkt induzierend auf die Transkription beider Pluripotenzmarker. Daher könnte es auch bei Krebsstammzellen eine Rolle bei der Induktion von Pluripotenz und bei ihrer langfristigen Erhaltung spielen. Dies unterstützend legten die verminderten Transkriptmengen der Pluripotenzgene nach einem AID siRNA Knock-Down eine Abhängigkeit des Stammzellcharakters von diesem Faktor nahe. Um einen Effekt von Therapeutika, die inhibitorisch auf AID wirken, auf Krebsstammzellen zu untersuchen, wurden die Zellen mit den DNMT-Inhibitoren Decitabine und Zebularine sowie dem HSP90-Inhibitor Tanespimycin behandelt. Tatsächlich konnte vor allem in den HuH6-Zellen ein verminderter Anteil der Krebsstammzellpopulation durch die drei Substanzen beobachtet werden. Wurden die Zellen im Anschluss mit dem Standardzytostatikum Cisplatin behandelt, führte allerdings eine Vorbehandlung mit Zebularine oder Decitabine zu einer starken Anreicherung von Krebsstammzellen. Dies war vor allem auf Zellen mit dem schwach positiven CD34+OV-6+CD90+ Expressionsprofil zurückzuführen, die chemo-induziert zu sein scheinen. Zwar erscheint die Mehrheit der Tumorzellen eliminiert zu werden, jedoch lassen diese Ergebnisse die Entstehung von chemo-induzierten Krebsstammzellen vermuten, die langfristig für einen Rückfall verantwortlich sein könnten. Daher ist von einer Ergänzung der Therapie mit diesen Substanzen abzusehen. Eine Vorbehandlung mit Tanespimycin hingegen konnte im Vergleich zur alleinigen Cisplatin-Behandlung wirksam den Anteil der Krebsstammzellen reduzieren. Interessanterweise war dies nicht auf einen verstärkten Zelltod der Krebsstammzellen, sondern vielmehr auf eine durch Tanespimycin bewirkte Differenzierung derselben zurückzuführen. Diese spiegelte sich auch in einer verminderten Expression von Pluripotenzmarkern auf mRNA-Ebene im Vergleich zur alleinigen Cisplatin-Behandlung wider.
Somit präsentierte sich Tanespimycin als potenter Inhibitor von Krebsstammzellen. Auch wenn weitere vorklinische und klinische Tests und Untersuchungen erfolgen müssen, stellt Tanespimycin bzw. die Substanzklasse der HSP90-Inhibitoren einen interessanten und vielversprechenden Kandidaten für eine Ergänzung der Standardtherapie vor allem bei behandlungsresistenten und rekurrenten High-Risk-Hepatoblastomen dar.
Inflammation is a regulated reaction of the body to control a threat such as infection or injury. An efficient resolution of inflammation is critical to prevent the development of chronic inflammation and to restore tissue homeostasis. Macrophages (Mf) play a crucial role in the onset, but also in the resolution of inflammation, because they phagocytose and eliminate pathogens and tissue debris. Efficient efferocytosis, i.e. the engulfment of apoptotic cells, represents an important trigger for the onset of the resolution response and contributes to the pro-resolving reprogramming of Mf. Despite the importance of post- transcriptional modes of regulation during the resolution phase and translational control as a key node modulating gene expression in immune cells, relevant translational alterations remain largely elusive.
In the present study, I aimed to identify translationally regulated targets in inflammatory primary murine Mf upon resolution-promoting efferocytosis. To this end, I used total RNA-sequencing as well as de novo proteomics analyses to determine global transcriptional and translational changes. Sequencing data confirmed that efferocytosis induced a pro-resolution signature in inflammatory Mf and pointed towards translational regulation because the related integrated stress response was enriched upon efferocytosis. While changes of gene expression between efferocytic and non-efferocytic Mf appeared rather small at the transcriptional level, I observed considerable differences at the level of de novo synthesized proteins. This finding suggests a regulation at the level of translation. Furthermore, the tight connection between translational and metabolic changes was confirmed by enriched metabolism-associated terms of targets upregulated by efferocytosis at both RNA and de novo protein level. Interestingly, analysis of translationally regulated targets in response to inflammatory stimulation showed reduced translation for most targets, with only little impact of efferocytosis. Among those targets, I identified pro-resolving matrix metallopeptidase 12 (Mmp12) as a novel candidate, which showed translational repression during early inflammation and translational increase during the resolution phase. Noteworthy, a first indicator for a potential translation regulatory component of Mmp12 were the extremely high mRNA levels and not overly high de novo protein levels. Validation experiments recapitulated a slight elevation of Mmp12 mRNA expression and a significant downregulation of MMP12 intracellular protein levels in inflammatory Mf, as observed in the RNA-seq and de novo proteomics datasets. To investigate whether the discrepancy in mRNA and protein expression were due to changes in translation, I applied polysomal fractionation analysis to determine the translational status of Mmp12. Inflammatory Mf displayed a significantly lower relative Mmp12 mRNA abundance in the late polysomes compared to naïve Mf, suggesting reduced translational efficiency upon inflammatory stimulation. Consequently, extracellular MMP12 levels in the supernatant of inflammatory Mf decreased, although with a slight delay.
The functional impact of attenuated Mmp12 translation upon inflammatory stimulation was assessed in migration assays. While siRNA-mediated knockdown of Mmp12 did not alter Mf migration on uncoated plates, it increased migration 3-fold on matrigel/elastin-coated plates. Importantly, the increase in migrated distance driven by siMmp12 could be lowered by the addition of exogenous recombinant MMP12 protein. In line with reduced Mmp12 translation and MMP12 protein in inflammatory Mf, I observed a significant increase in cell migration on matrigel/elastin-coated plates, while it remained unaltered on uncoated plates. Consequently, Mf elastase MMP12 degrades elastin, thereby cell migration along elastin fibers is diminished. In inflammatory Mf, Mmp12 is translationally downregulated, thereby enhancing the migratory capacity.
In summary, the present study identifies a substantial contribution of translational regulation in the course of inflammation shown by high changes between inflammatory naïve and efferocytic Mf at the de novo proteomic level. Specifically, I was able to determine the translational regulation of pro-resolving Mmp12, which is repressed during early inflammation and recovers during the resolution phase. Functionally, translational control of MMP12 emerged as a strategy to alter the migratory properties of Mf, enabling enhanced, matrix- dependent migration of Mf during the early inflammatory phase, while restricting migration during the resolution phase.